Recherche fondamentale

600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur injecte dans un œil, puis dans l'autre une semaine plus tard, une solution salée concentrée qui fait monter la pression intraoculaire pendant près de quatre heures, pour tester des molécules candidates contre le glaucome. Le porteur mesure la pression au tonomètre et pose un cathéter dans l'artère de l'oreille pour des prises de sang, et affirme que la hausse de pression 'ne devrait pas' provoquer de douleur. Il décrit l'œil du lapin comme le 'modèle de référence' et conclut qu'aucune méthode in vitro ne peut le remplacer.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester chez le lapin les effets de nos molécules sur une hypertension intraoculaire transitoire provoquée par une injection dans l'oeil d'une solution saline hypertonique.

Bénéfices attendus

La cause principale du glaucome (diminution irréversible du champ visuel, 2ème cause de cécité) est une augmentation de la pression intraoculaire à l’origine de la destruction des cellules du nerf optique. Les traitements existants (bêta-bloquants, analogues des prostaglandines…) ont une efficacité limitée et peuvent présenter des effets indésirables. Ainsi, le bénéfice attendu de ce projet est le développement d’une nouvelle classe thérapeutique pour traiter le glaucome qui touche plus de 800 000 personnes en France.

Procédures

Les lapins vont recevoir sous anesthésie locale une injection d'une solution saline concentrée dans un seul oeil qui va être à l'origine d'une augmentation de la pression dans le globe oculaire. Cette augmentation de pression intraoculaire va durer moins de 4 heures. Plusieurs mesures de la pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre vétérinaire vont être effectuées : 5 avant l'injection et 6 durant les 4 heures suivant l'injection. Ces mesures sont non invasives et indolores. Le lapin recevra avant l'injection intraoculaire une administration (par gavage, par application locale sous forme de collyre, par injection intrapéritonéale) des molécules à tester. Après une semaine de récupération, une autre session pourra être réalisée en utilisant le 2ème oeil. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à des fins de pharmacocinétique. Un cathéter sera mis en place au niveau de l'artère centrale de l'oreille. Sur une durée de 24 heures maximum, pas plus de 8 prélèvements de 1 mL seront effectués.

Impact sur les animaux

Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -Le stress lié à la contention et à la réalisation des mesures de pression intraoculaire (geste non invasif et non douloureux) : pour limiter cet effet, les animaux auront une période d’habituation à la préhension, manipulation des yeux et des mesures de pression -L’augmentation de la pression intraoculaire : selon la technique utilisée, l’augmentation de la pression devrait être modérée (aux alentours de 40 mmHg) et ne devrait pas générer de douleur. Cependant, nous avons mis en place un protocole de suivi et d’identification de points limites permettant de mettre en place un traitement en cas d’apparition de douleurs ou d'anomalies oculaires.

Devenir

Après que chaque œil a fait l’objet d’une injection intraoculaire de solution saline hypertonique, les animaux sont mis à mort. En effet la procédure ne peut pas être répétée plusieurs fois sur un même œil. De plus au sein du laboratoire ces lapins ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.

Remplacement

L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de nouvelles molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. De plus il n’existe pas actuellement de méthode alternative.

Réduction

L'amplitude et variabilité des réponses obtenues sur le(s) paramètre(s) d'intérêt selon des résultats précédemment publiés indiquent un effectif compris entre 5 et 8 lapins par groupe expérimental comme étant raisonnable et suffisant pour effectuer une analyse statistique pertinente des données. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, l'expérimentation sera réalisée sur un oeil puis sur l'autre oeil du même lapin à une semaine d'intervalle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour de l'expérimentation. Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une balle en plastique, une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Du foin est mis à disposition de manière journalière ce qui permet de créer un contact régulier avec le lapin et de le familiariser avec l'expérimentateur. Sans traitement particulier, les animaux ne doivent pas présenter de signes de douleur à ce stade expérimental. Toutefois, le personnel zootechnicien est sensibilisé pour communiquer directement à l’expérimentateur tout comportement « suspect » d’un animal anxieux, soit observé durant la période d’acclimatation (un animal qui tape systématiquement fortement du pied lors d’une entrée dans la pièce ou lorsque l’on s’approche près de sa cage), soit le jour même de l’expérimentation au moment de sa manipulation pour la sortie (comportement excessif de fuite, vocalisation…). Une semaine avant l'injection intravitréenne, des mesures journalières de pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre seront effectuées afin de familiariser l'animal avec le dispositif et l'expérimentateur. Les mesures de la pression intraoculaire sont effectuées à l'aide d'un tonomètre "à rebond" qui n'engendre aucune souffrance chez l'animal. Chaque mesure de la pression intraoculaire sera associée à une récompense (friandise "mini treats" goût fruité, Plexx, Hollande). La souffrance liée à l'injection intravitréenne d'une solution saline hypertonique va être limitée par l'administration sous forme de gouttes d'un anesthésique local chez un lapin au préalable sédaté.

Choix des espèces

Les modèles in vitro modélisant la chambre oculaire et la physiopathologie des hypertensions oculaires ne permettent pas de tester les efficacités des molécules thérapeutiques. L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. L'expérimentation sera réalisée sur des lapins adultes. Le glaucome est une pathologie apparaissant avec l'âge, il n'y a aucune raison de travailler sur des individus en cours de développement.

70 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix tués à l'issue pour distribuer leurs tissus et soixante gardés vivants comme reproducteurs. Dès le lendemain de leur naissance, une puce télémétrique leur est implantée sous anesthésie, à différents emplacements testés, pour mesurer leur température à distance et la comparer à la mesure rectale. Le porteur signale que l'implant peut provoquer une inflammation locale, des infections et des coups de bec entre animaux sur la zone d'implantation. Il présente la mesure à distance comme plus 'éthique' que la voie rectale, et affirme qu'aucune méthode hors animal vivant ne permet ce suivi.

Objectifs

Dans les études physiopathologiques chez les animaux, le premier signe clinique mesurable est la température. Afin de bien connaitre ce paramètre en fonction de l'espèce animale, il est nécessaire de collecter des données zootechniques sur des sujets sains pendant une longue période. Chez la volaille, les données sont manquantes. Le premier objectif du projet sera de définir la meilleure zone d’implantation d’une puce télémétrique chez le poulet, parmi plusieurs zones préselectionnées. Ces mêmes puces sont déjà utilisées chez les rongeurs et ce système s’est avéré efficace pour suivre la température corporelle. Le second objectif sera d’obtenir un nombre conséquent de mesures qui valideront l’utilisation de ce système en expérimentation. En expérimentation, cela permettra d’augmenter le nombre de données chez les volailles, en ajoutant la température, paramètre peu exploiter aujourd’hui.

Bénéfices attendus

Il est attendu du projet qu’une zone d’implantation de puce télémétrique soit sélectionnée ce qui permettrait de disposer d'un moyen d'obtenir des mesures fiables de la température corporelle des poules au cours du temps. L’injection induira une légére douleur locale et la puce ne causerait pas de gêne importante à l’animal. Ainsi, il est attendu que les animaux soient moins importunés par cette méthode (mesure de température à distance) comparativement aux mesures rectales, ce qui serait plus éthique.

Procédures

L’anesthésie de l’animal et la pose d’une puce télémétrique sera effectuée une fois et durera environ 5 minutes. Après cela, seule une mesure de la température avec le matérial adéquat sera effectuée. La mesure rectale de température est la référence et la zone d'implantation retenue sera dépendante de la pré-expérimentation (en sous-cutanée ailaire, en intra-péritonéal (dans la cavité thoraco-abdominale) et en intramusculaire au niveau du bréchet. L’animal pourra être maintenu en place s’il bouge trop pour que la mesure puisse être effectué, mais n’aura pas besoin d’être soumis à une contention.

Impact sur les animaux

Il est possible que les animaux ressentent une gêne au niveau de la zone d’implantation de la puce télémétrique (légère inflammation) et se « piquent » entre eux (c’est-à-dire se donnent des coups de becs), par exemple s’ils remarquent la zone d’implantation de la puce sur un autre animal dans les 24-48h. Une infection au niveau du site d’implatation pourrait éventuellement être observée.

Devenir

Les 10 poussins de l'étude pilotes seront euthanasiés et les tissus distribués et optimisés par la communauté scientifique. Les 60 autres poussins de l'étude seront gardés en vie et introduit au sain de l'élevage pour faire de futurs reproducteurs.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car la mesure de température d’une autre manière qu’in vivo est impossible. Nous avons besoin d’animaux vivants pour évaluer s’il est possible de mesurer la température au cours du temps. Ces puces ont été utlisées avec succès sur modèle rongeur.

Réduction

Une étude pilote est réalisée sur 10 animaux pour choisir le meilleur emplacement de la puce télémétrique et limiter le nombre de possibilités de localisation pour la seconde partie du projet. Pour cette seconde partie, le nombre d’animaux utilisés (60 animaux) pour obtenir un nombre de mâles et femelles est basé sur l’expérience des animaliers et la littérature. Pas d’analyses statistiques sur l’étude pilote, car l’un des objectifs est de valider le positionnement de la puce chez le poussin. Cependant, les données obtenues sur cette étude pilote pourront rentrer dans la banque de données télémétriques obtenues dans la seconde étude. Il pourrait être envisagé, sur la seconde étude, en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des utilisateurs, de faire une étude statistique simple basée sur un test non paramétrique pour déterminer un éventuel effet sexe.

Raffinement

Pour l’étude pilote, comme il n’y a pas de restriction concernant leur statut sanitaire, les poussins seront hébergés au sol sur paille dans des conditions environnementales contrôlées, et disposeront d’un enrichissement social et comportemental (petites rondelles en inox suspendues ce qui permet aux animaux de piquer, de se percher). Pour la seconde étude en élevage à statut sanitaire EOPS (Exempt d’organismes pathogènes spécifiés), les animaux seront hébergés hors-sol en cage dans des conditions environnementales contrôlées, chauffées, avec un accès à un perchoir, un nid, de la paille broyée.

Choix des espèces

Trop peu de données zootechniques sur la température chez les volailles saines comme malades sont recensées alors que pourtant, la température est un paramètre important en expérimentation animale dans le cadre des modèles infectieux. Utiliser ces puces télémétriques en expérimentation animale permettrait à la fois d’identifier les animaux et d’obtenir des données pertinentes pour les études, tout en raffinant nos pratiques. Les puces seront implantées 1 jour après la naissance. En expérimentation animale pour l’étude des maladies infectieuses aviaires, il est fréquent que les protocoles commencent à la naissance (1 jour) et ne dépassent pas 35 jours d’âge. Ce choix a été effectué pour se rapprocher le plus possible des conditions expérimentales.

20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes pour de futures expériences. Ces souris porteuses d'une mutation sont placées dans des cages métaboliques pendant vingt-quatre heures pour recueillir leur urine, puis maintenues dans des tubes de contention sous une lampe chauffante pour mesurer leur pression artérielle, une méthode présentée comme non invasive. Le projet cherche à savoir si la mutation d'une protéine des vaisseaux perturbe le rein, dans l'optique de la néphropathie diabétique. Le porteur affirme que des organoïdes ne permettraient pas d'observer les effets de la mutation en conditions physiologiques.

Objectifs

Les cellules endothéliales tapissent les vaisseaux sanguins. Elles sont essentielles pour permettre le maintien et la formation des vaisseaux sanguins. Pour cela elles doivent être jointives entre elles grâce à une protéine : la VE cadhérine. Les cellules endothéliales sont par conséquent indispensables pour le bon fonctionnement des organes richement vascularisées comme le rein. De nombreuses études ont démontré que la dysfonction endothéliale était un marqueur pronostique validé pour la survenue des pathologies comme les néphropathies Les néphropathies sont des affections rénales qui touchent plusieurs millions de personnes dans le monde. Elles peuvent être causées par des troubles fonctionnels tels que le diabète, l’hypertension ou à des défauts de la filtration. Notre équipe a démontré qu’une mutation dans une protéine d’adhésion des cellules endothéliales pourrait être une cible potentielle pour la néphropathie diabétique. Comment cette mutation peut jouer un rôle dans ces pathologies ? Nous voulons déterminer si cette mutation affecte les effets physiologiques du rein.Nous allons donc déterminer si la composition de l’urine et si la pression artérielle sont anormales chez les souris mutées, signe de la néphropathie diabétique.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, nous pourrons valider ou non si la proteine d'intérêt exprimée par les cellules endothéliales pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour traiter les néphropathies.

Procédures

20 souris seront mises dans les cages métaboliques, collecte de l’urine au bout de 24h pour étudier le fonctionnement rénal. Expérience répétée 3 fois. Ces 20 souris seront utilisées pour la mesure de la pression artérielle. Ces 20 souris placées dans des tubes de contention pendant la mesure de la pression sous une lampe chauffante. Méthode non invasive. Expérience répétée 1 fois par jour à la même heure pendant 15 jours (week-end inclus) 30 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux pourraient être essentiellement lié au stress que pourrait générer l’acclimatation des animaux aux cages métaboliques ou aux tubes de contention pour la mesure de la pression artérielle.

Devenir

Les souris participant à la pression artérielle ou l’analyse de l’urine via les cages métaboliques seront gardées vivantes après l’expérience pour de futures expériences

Remplacement

L’utilisation de ce modèle est requis pour voir les effets de la mutation in vivo au niveau fonctionnel et phénotypique des organes L’utilisation d’organoïdes ne nous permettrait pas de voir les effets de la mutation en condition physiologique et pathologique.

Réduction

Les groupes ont été calculés pour faire les validations statistiques nécessaires pour répondre à l'objectif scientfique du projet.

Raffinement

Pour l’étude du fonctionnement rénal, les souris seront placées dans des cages métaboliques pendant 24h. Les cages métaboliques sont des cages conçus pour récupérer le fèces et l’urine de la souris sans interférer dans la vie de l’animal notamment dans l’accès à l’eau et la nourriture. Pour réduire leur stress, les souris seront entrainées pendant une semaine à être placées dans ces cages une fois par jour pendant 30 minutes. L’expérience sera répétée trois fois avec un intervalle de trois jours pour laisser les souris récupérer. Pour la prise de la pression artérielle, les souris seront également entrainées à être placées dans les tubes de contention sous une lampe chauffante avec la mise en place du brassard pour la prise de mesure pendant une semaine chaque jour pendant 40 minutes. L’expérience sera répétée une fois par jour pendant 15 jours pour diminuer la variabilité entre les mesures sur une même souris. La prise de la mesure durera 30 minutes par souris. Toutes les souris impliquées dans les procédures classées légères, seront surveillées avant, pendant et après les expériences. Les signes de douleurs seront évalués par une grille de score.

Choix des espèces

Nous avons choisi un modèle murin porteur de la mutation sur la protéine d'intérêt pour nous permettre d’étudier les impacts de cette mutation sur le fonctionnement du rein et sur la pression artérielle. les souris seront âgées de 8-12 semaines car c’est à cet âge-là que des dysfonctionnements du rein ont été observés. Les souris utilisées pour ces procédures seront des souris âgées de 8-12 semaines car c’est à cet âge-là que des modifications rénales ont été observées par nos collaborateurs.

1 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une uvéite ou une inflammation sous la rétine par injections et photocoagulation au laser sous anesthésie, avec un suivi par imagerie de l'œil, pour étudier deux récepteurs immunitaires dans la DMLA et l'uvéite. Le porteur qualifie l'atteinte visuelle de légère au motif que la vision ne serait pas 'indispensable à la souris pour se déplacer'. Il affirme que ces mécanismes d'inflammation ne peuvent être étudiés que dans un 'organisme entier'.

Objectifs

La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la macula, partie centrale de la rétine. Il existe deux formes de DMLA : atrophique et exsudative. Les traitements existants permettent seulement de ralentir l’évolution de la formation et la croissance de nouveaux vaisseaux et donc uniquement la forme humide de la pathologie alors qu’aucun traitement n’est disponible pour la forme sèche de la DMLA. Les uvéites sont des maladies inflammatoires oculaires d’étiologie diverse, principalement auto-immune, pouvant être très invalidantes voire cécitantes, généralement traitées par des corticoïdes responsables de nombreux effets secondaires au long cours. Les causes précises de ces maladies ne sont pas connues et les mécanismes peu compris. Cependant, dans ces 2 pathologies, un processus inflammatoire est présent, caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Notre projet vise à étudier le rôle de 2 récepteurs surexprimés sur les macrophages activés qui infiltrent la rétine au cours de ces pathologies oculaires : les « paired Ig-like receptors » PIR-A et PIR-B.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle des récepteurs PIR-A et PIR-B comme potentiels cibles thérapeutiques chez l’Homme dans le traitement de l’inflammation liée à l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis aux interventions suivantes afin modéliser une uvéite expérimentale ou une inflammation sous-rétinienne. Toutes les injections (1 injection par animal) sont rapides (moins d’une minute). La photocoagulation laser dure moins de 5 minutes par animal sous anesthésie générale. Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). Le suivi de l’évolution de l’inflammation est réalisé sous anesthésie générale par des actes non invasifs (donc pas de douleur ou de détresse) : imagerie rétinienne (fond d’œil – 5 min - quotidiennement 5 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 15 examens au maximum) et OCT (tomographie en cohérence optique – 5 min - 1 fois par semaine pendant 3 semaines, soit un maximum de 3 examens par animal). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie de l’animal par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet. La totalité des procédures sont de gravité légère. Les modèles expérimentaux n’entraînent seulement qu’un phénotype léger : nuisance visuelle mais vision non indispensable à la souris pour se déplacer. Aucune douleur perceptible n’est à prévoir. Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’études des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes d’inflammation sous-rétinienne qui impliquent l’interaction de nombreux types cellulaires qui ne peut être étudié qu’au sein d’un organisme entier et ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Les souris PIRA et PIRB KO seront étudiées en comparaison avec des souris sauvages dans des modèles d’inflammation sous-rétinienne. Nous devons induire plusieurs expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot (sévérité de l’inflammation plus ou moins importante). Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 10 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation et seront hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Nous avons fixé des points limites appropriés au-delà desquels des mesures sont prises pour minimiser ou arrêter le processus faisant souffrir ou stresser l’animal. Tout signe d’inconfort, de détresse, ou de comportement anormal fera l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lors de chaque manipulation, un gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant les anesthésies.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour la l’inflammation liée à l‘accumulation de cellules immunitaires dans l’espace sous-rétinien. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée les modèles PIRA et PIRB. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale, âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel l’animal est susceptible de développer la maladie.