Recherche fondamentale

375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées reçoivent un traitement déclenchant une inflammation du foie, avec des prises de sang obtenues par une entaille au scalpel de la veine de la queue étalées sur six heures, avant la mise à mort pour prélèvements. Le projet étudie le rôle de cellules immunitaires dans les maladies chroniques du foie. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ne peut être utilisée et que les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent la principale cause de développement du cancer du foie et sont souvent associées à des problèmes de diabète, d'obésité. Ces complications hépatiques vont d’un foie gras jusqu'au cancer. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires suite à divers signaux de danger. Ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Afin de répondre à notre problématique, nous utilisons des animaux qui n’expriment une molécule présente à la surface des cellules immunitaires et qui est connue pour contrôler les fonctions de ces cellules. Ces souris seront soumises à un traitement favorisant l’apparition d’une inflammation au niveau du foie mimant celle observée au cours des maladies chroniques chez l’homme. Nous espérons ainsi démontrer le rôle exact des cellules immunitaires dans ces maladies et pouvoir proposer des stratégies thérapeutiques les ciblant. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage, d’hébergement et de soins afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, d’une part, d’apprécier la contribution exacte des cellules de l'immunité dans la mise en place de l’inflammation hépatique et d’autre part de définir le rôle de notre molécule d’intérêt dans ce contexte pathologique. Ainsi, notre étude permettra de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression d’une inflammation au niveau du foie qui est un évènement crucial dans le développement et la progression des maladies chroniques du foie. Nous espérons pouvoir proposer de cibler les fonctions des cellules immunitaires comme nouvelle stratégie thérapeutique pour ces maladies qui actuellement ne disposent pas de traitements pharmacologiques.

Procédures

Un prélèvement de sang de 200µl sera réalisé aux temps T0, 2H, 4H et 6h. Les souris seront placées brièvement (5minutes) sous une lampe chauffante afin de dilater la veine caudale. Une entaille à l'aide d'une lame de scalpel sera réalisée à T0 (1 à 2 secondes). Aux temps suivants (2H, 4H et 6h), un simple passage bref (moins de 30 secondes) sous la lampe chauffante suffira pour récupérer les 200µL de sang.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs : modification de l'état de la fourrure, prostration, difficulté de déplacement, respiratoire et d'ouverture des yeux, absence de réponse aux stimuli. Le protocole expérimental durera 6h maximum et de ce fait il n’est pas attendu de perte de poids. Les souris seront sous surveillance toutes les heures jusqu’à la fin de l’expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec un nombre minimum d’animaux. Cette approche est basée sur des groupes de 10 animaux avec la réalisation des tests statistiques suivants : ANOVA ou Student ou Mann-Whitney si la distribution des valeurs ne suit pas une distribution gaussienne. Nous utiliserons des souris mâles ou femelles permettant ainsi d’utiliser l’ensemble des animaux de notre élevage. Il est prévu 3 séries d’expériences mais si dès la deuxième série les résultats sont significativement significatifs, nous ne réaliserons pas la dernière série. Nous prévoyons d'utiliser 375 souris maximum sur une période de 5 ans. Les souris sous fond génétique C57BL/6 proviendront de notre élevage pour les deux procédures (souris invalidées pour notre molécule d'intérêt et souris contrôles issues de notre élevage). Nous utiliserons la technique de cytométrie spectrale dans notre étude qui présente l’avantage de nécessiter moins de cellules pour l’analyse et donc in fine moins d’animaux.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). Nous utiliserons la technique de cytométrie spectrale dans notre étude qui présente l’avantage de nécessiter moins de cellules pour l’analyse et donc in fine moins d’animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Les souris seront traitées au lipopolysaccharide (LPS) entre 6 et 10 semaines d’âge

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une obésité et un diabète leur sont induits par un régime gras et des injections de streptozotocine, avec tests de tolérance au glucose, prises de sang répétées et densitométrie, avant l'euthanasie pour prélever leurs os et d'autres organes. Le porteur indique que la streptozotocine peut provoquer douleur transitoire et hypoglycémie, et que l'excès de poids peut gêner la mobilité des souris obèses. Il affirme qu'un modèle cellulaire isolé ne peut rendre compte des interactions entre tissus recherchées ici.

Objectifs

Ce projet a pour objectif principal de mettre en place un modèle animal atteint d’obésité et de diabète de type 2 (DT2), afin d’étudier in vivo les altérations de fragilité osseuse liées à l’obésité et au diabète. En France 56 % des hommes et 40 % des femmes souffrent de surpoids ou d'obésité, un problème de santé publique qui favorise l’apparition de diabète et d’hypertension artérielle, responsables de complications rénales et cardiovasculaires. Selon des études cliniques et fondamentales, l’obésité et sa complication en diabète (hyperglycémie), sont aussi associées à une fragilité exacerbée des os et un risque de fracture augmenté. Ces anomalies osseuses s’accompagnent d’une augmentation de graisses qui s’acumulent dans la moelle osseuse, ainsi que d’altérations inflammatoires dans la moelle osseuse et dans les tissus périphériques. Cela suggère des effets délétères de l’accumulation de graisses sur le renouvellement de l’os et sa résistance. Cependant, les mécanismes par lesquels l’obésité et le diabète amplifient l’accumulation de graisses dans la moelle osseuse n’ont pas été identifiés. De plus, le rôle de ces graisses dans la fragilisation des os chez les individus obèses/diabétiques, reste à élucider. Le présent projet vise à évaluer chez la souris obèse diabétique : 1) l’accumulation et la distribution des graisses de la moelle osseuse, 2) l’impact de ces graisses sur la masse et la qualité du tissu osseux, 3) l’effet de l’obésité et du diabète sur la capacité de transformation des cellules stromales/précurseurs de la moelle osseuse en cellules graisseuses, et 4) à analyser la production de molécules immunoinflammatoires et leur rôle dans la formation de graisses et dans la fragilisation de l’os. Le modèle d’obésité induit chez les rongeurs à l’aide d’un régime alimentaire riche en graisses, est décrit comme un modèle de choix pour l’étude des conséquences de l’obésité sur la santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la relation physiopathologique entre les désordres métaboliques liés à l’obésité et au diabète, et les maladies de fragilité osseuse. Il vise à générer des données à fort potentiel translationnel pouvant conduire au développement d’outils novateurs pour la prédiction, la prévention et la prise en charge des pathologies osseuses chez l’Homme. A court terme, ce projet permettra de valider la mise en place d’un modèle animal d’obésité et de diabète, représentatif de la pathologie humaine. Les études proposées apporteront des informations précieuses quant aux conséquences de l’obésité et du diabète sur la fragilisation des os. Elles pourraient éclairer le rôle précis de l’élévation de la graisse médullaire et de ses facteurs sécrétés, dans l’apparition d’altérations de la structure et de la microarchitecture des os. Les analyses prévues portent sur différents sites osseux afin d’apprécier la sensibilité spécifique de chaque site aux effets de l’obésité et du diabète. Le suivi longitudinal non invasif par densitométrie in vivo, permettra de corréler l’apparition des atteintes de masse osseuse avec la sévérité de l’obésité et du diabète. Des molécules liées à l’immuno-inflammation seront également mesurées dans les tissus et dans le sang circulant prélevés sur les animaux. Les résultats attendus pourraient permettre l’identification de biomarqueurs circulants et/ou tissulaires pour une évaluation précose et prédictive des atteintes ostéomédullaires et osseuses dans le contexte de l’obésité et du diabète. Si les résultats s’avèrent concluants, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles études translationnelles et cliniques, pour évaluer l’intérêt de l’adiposité médullaire et de molécules immuno-inflammatoires séléctionnées dans des stratégies de prise en charge des pathologies de fragilité osseuse. De plus, compte tenu de la prévalence croissante de l’obésité et du diabète et leurs conséquences multiples sur la santé humaine, la validation du modèle animal peut à terme, ouvrir la voie vers de nouvelles collaborations avec des partenaires qui s’intéressent à d’autres complications du diabète.

Procédures

La procédure proposée dans le présent projet implique plusieurs gestes expérimentaux appliqués aux groupes d’animaux utilisés. Dans un premier temps, les souris seront mises sous régime alimentaire contrôle (LFD) ou riche en graisses (HFD) pour induire une obésité. Après 4 semaines de régime alimentaire contrôle ou gras, les souris maintenues vigiles recevront 3 injections intrapéritonéales de solution de streptozotocine (STZ) (groupes HFD/STZ) ou de tampon (groupes HFD et contrôle LFD) ; une injection par jour pendant 3 jours consécutifs. Pour vérifier la mise en place de la pathologie du diabète (hyperglycémie) dans les groupes HFD/STZ, des mesures de glycémie à jeun et des tests de tolérance au glucose (IPGTT) et à l’insuline (IPITT) seront réalisés sur tous les groupes d’animaux maintenus vigiles. La glycémie sera mesurée sur une goutte de sang prélevée dans la veine de la queue après ponction à l’aide d’une aiguille. Elle sera mesurée au début du protocole puis toutes les 4 semaines. Les tests IPGTT et IPITT sont prévus à deux temps, aux semaines 7 et 15 du protocole. Après une injection intrapéritonéale d’une solution de glucose (pour IPGTT) ou d’insuline (pour IPITT), une série de 5 mesures de glycémie seront réalisées à des intervalles de 15-30 minutes. Un temps de récupération de 3-4 jours est prévu entre le test IPGTT et le test IPITT. Les animaux de la cohorte 3 (60 souris) recevront aussi 3 injections intrapéritonéales de marqueurs fluorescents dont la sécurité est validée. Les 3 injections sont prévues sur les animaux maintenus vigiles aux semaines 12, 14 et 16 (la veille de la mise à mort). Enfin, tous les groupes d’animaux du projet (180 souris/3 cohortes) subiront des mesures par densitométrie (scanner) pour évaluer la composition corporelle en fonction du régime appliqué. Trois mesures de densitométrie (semaines : 0, 8 et 16) seront réalisées sur les souris sous anésthésie générale au gaz d’isoflurane ; chaque mesure dure 4-6 minutes d’acquisition. Deux prises de sang sont également prévues (aux semaines 8 et 16) sur tous les animaux. La première sur les souris vigiles, est prévue par ponction de la veine latérale de la queue et à l’aide d’un capillaire après application locale d’un gel anesthésique. Le second prélèvement est prévu par ponction cardiaque sur les souris sous anesthésie générale terminale à l’isoflurane, juste avant mise à mort (semaine 16) pour prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront utilisés comme modèle pathologique d’obésité et de diabète, induit par un régime alimentaire gras avec ou sans injections de streptozotocine (STZ). Le modèle est largement décrit dans la littérature, les principales nuisances / effets indésirables inhérents aux procédures expérimentales prévues sont les suivants : - Pendant les injections IP de solution de STZ ciblant les cellules du pancréas, comme déjà obsevé dans un protocole du laboratoire (n°2021060316221938), les animaux peuvent manifester un stress limité dans le temps voire une douleur transitoire (12-24 heures) dus au pH acide de la solution de STZ. Un risque de prostration de l’animal peut être aussi observé pendant 30 à 60 minutes post-injection en raison d’un risque d’hypoglycémie consécutive à l’injection de STZ. Une surveillance renforcée sera mise en place jusqu’à rétablissement complet de l’animal puis 2 surveillances par jour au minimum. - Lors des injections IP de solutions de marqueurs fluorescents, ou de solution de glucose/insuline pour les tests de tolérance au glucose/insuline, les animaux pourraient subir un stress limité dans le temps. Lors des prises de sang pour les mesures de glycémie, la ponction de la veine caudale pour le prélèvement sanguin peut induire une douleur localisée et ponsctuelle. Pour la prise de sang prévue à la 8ème semaine du protocole, un gel de pramocaïne 1% (anesthésique local) sera appliqué préalablement à la ponction. - Une prise de poids qui pourrait provoquer une gêne limitée à la mobilité des animaux obèses (HFD) à partir de la semaine 12 du protocole. Après installation d’une hyperglycémie diabétique chez les animaux traités avec la STZ (groupes HFD/STZ), la prise de poids peut s’inverser par comparaison aux animaux des groupes HFD. Le poids des animaux sera donc contrôlé de manière hebdomadaire et son impact sur le bien-être des animaux sera pris en compte dans la surveillance des points limites.

Devenir

Le présent projet vise à étudier l’impact de l’obésité et du diabète de type 2 (DT2) sur l’accumulation de graisses dans la moelle osseuse, et les conséquences de ces graisses sur le tissu osseux qui augmenteraient la fragilisation des os et le risque de fracture. Ainsi, à la fin de la procédure expérimentale proposée, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse.

Remplacement

Le projet proposé vise à étudier in vivo les mécanismes physiopathologiques qui expliqueraient les relations observées entre accumulation d’adiposité médullaire (graisse de la moelle osseuse) et développement de fragilités osseuses dans le contexte d’obésité et de diabète. Ce contexte de pathologies métaboliques, complexes et multifactorielles, et ses conséquences systémiques nécessitent une approche d’étude intégrée, qui tient compte des interactions multiples entre tissus et entre tissus et facteurs moléculaires circulants. Ainsi, le modèle de souris obèse/diabétique constitue un modèle de choix et bien établi pour mimer la pathologie humaine. De plus, ce projet s'intéresse à l’implication de facteurs métaboliques et des molécules immuno-inflammatoires circulantes dans le sang, dont l’étude requiert un modèle d'étude chez l’animal vivant. L’utilisation d’alternatives basées sur des modèles cellulaires isolés in vitro ne pourra répondre à ces objectifs. Les hypothèses et les objectifs de ce projet s’appuient sur des études complémentaires déjà réalisées in vitro sur des modèles de cellules souches de la moelle osseuse, exposées à des stimulations métaboliques et immuno-inflammatoires. Ces études in vitro ont permis d’identifier des molécules qui pourraient impacter le tissu osseux et dont l’évaluation nécessite un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité à un maximum de 20 par groupe pour assurer des résultats statistiquement comparables. Ce nombre tient compte des données de la littérature, et des analyses prévues devant faire l’objet de tests statistiques. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans le présent projet, plusieurs analyses sur plusieurs sites osseux seront regroupées dans la même étude et sur les mêmes groupes d’animaux. Les mêmes prélèvements osseux (e.g. le même tibia) serviront à la fois pour des analyses par histologie et par immunohistochimie. Le deuxième tibia de chaque animal servira pour des analyses par microtomographie (microCT). Ce même tibia (comme tous les autres prélèvements osseux) sera scanné par microCT, une première fois pour analyser la microarchitecture osseuse, et une seconde fois pour évaluer la graisse de la moelle osseuse après un traitement spécifique de l’échantillon. Pour réaliser un suivi de l’apparition des atteintes osseuses et de la composition corporelle au cours du temps, et en conformité avec le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures (scans) à l’aide d’un densitomètre sont prévues sur les mêmes souris in vivo. Outre la réduction du nombre de groupes d’animaux utilisés à différents temps de suivi, cette approche permettra aussi de réduire les biais expérimentaux liés à la variabilité interindividus des mesures réalisées. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les projets du laboratoire, d’autres organes seront récupérés et utilisés dans un autre projet collaboratif qui s’intéresse à l’étude des dysfonctions vasculaires et rénales liées au diabète.

Raffinement

Les animaux, hébergés par groupes de ~4-6 souris/cage, seront inclus dans le protocole après 1-2 semaines d’acclimatation dans l’établissement d’expérimentation. Avant injection intra-péritonéale de la solution de streptozotocine (STZ), les souris seront prélablement habituées à des injections de sérum physiologique afin de prévenir/réduire le risque de stress. Après injection de la STZ, une surveillance renforcée sera mise en place pendant au moins une heure puis au minimum 2 fois par jour. La surveillance portera sur des signes relatifs au bien-être et l’état général de l’animal, son comportement et son alimentation. En cas de mal-être persistant, une eau de boisson à 10% de sucrose sera fournie à l'animal pendant 24 heures, et des aliments hydratés seront déposés au fond de la cage. Le poids corporel sera également mesuré une fois par semaine. Une perte de poids excessive (>15% du poids initial avant injection STZ) et persistente pendant 3 jours consécutifs, entraine une sortie du protocole et la mise à mort de l’animal. Pour préserver la qualité de l’alimentation, les aliments sont entièrement remplacés 2 fois par semaine. Lors de la ponction de la veine caudale pour prélèvement sanguin, un gel anesthésique sera préalablement appliqué localement. Les mesures in vivo de la composition corporelle à l’aide d’un scanner (densitomètre ou microCT) seront réalisées sur les animaux sous anesthésie gazeuse, ce qui garantit une sédation rapide et un réveil rapide des animaux. Enfin, après développement d’une hyperglycémie, la litière sera changée plus fréquement (~2 fois/semaine) en raison d’un risque d’augmentation de la fréquence/volume d’urines.

Choix des espèces

La souris et particulièrement la souche C57BL6J est largement reconnue pour sa sensibilité à la prise de poids sous régime gras, et à l’action de la streptozotocine-STZ ciblant les cellules du pancréas pour induire une défcience de sécrétion d’insuline à l’origine d’hyperglycémie. La souris C57BL6J présente aussi un fond génétique largement exploité en recherche sur des modèles génétiquement modifiés des pathologies d’intérêt (maladies osseuses et métaboliques). Ainsi, l’utilisation de cette souche de souris présente un intérêt pour permettre des analyses comparatives et complémentaires des données expérimentales obtenues sur des modèles pathologiques induits par des méthodes différentes sur la même souche Des souris jeunes adultes (âgées de 6 à 7 semaines) pour pouvoir les suivre durant un protocole expérimental relativement long (16 semaines après inclusion). Le protocole s’appuie également sur des données de la littérature issues de protocoles ayant validé des modèles similaires (obèses et/ou diabétiques) avec des souris C57BL6J dont l’âge d’inclusion varie de 6 à 12 semaines.

3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées portant une mutation du gène ARID1A sont gavées quotidiennement pendant deux mois, certaines recevant une injection sous-cutanée, avant d'être tuées pour exploration anatomique et histologique. Le projet porte sur les syndromes d'hypercroissance, avec l'espoir d'identifier des traitements. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro adapté et que la souris est le seul mammifère chez qui la protéine concernée a été mutée.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance en mosaïque sont causés par des variants somatiques affectants différents acteurs génétiques causant une croissance anormale des organes et/ou tissus. Récemment, grâce aux progrès de la génétique de nouveaux gènes ont été identifiés comme potentiellement impliqués dans les syndromes d’hypercroissance. Parmi eux, un gene en particuliers semble un candidat idéal. Notre objectif est de développer des modèles de souris porteurs de mutations de ce gene dans différents tissus de manière spécifique afin de comprendre la physiopathologie des syndromes d’hypercroissance en lien avec ce gène là et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume des malformations. Le volume administré sera de 100ul. Celui-ci sera effectué par un technicien expérimenté. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Le gavage dure environ 15 secondes par animal. Les souris seront gavées pendant 2 mois. Un groupe de souris recevra une injection sous cutané unique de 100ul. Cette injection sera réalisée par un technicien expérimenté.

Impact sur les animaux

Le risque de fausse route au cours des gavages sera particulièrement surveillé. L'injection (unique) sous cutanée peut entrainer une douleur transitoire. Les tuméfactions peuvent être responsable d'un inconfort. Cet inconfort corrèle avec le volume de la malformation et sera particulièrement surveillé (points limites).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance liés à des mutation du gène ARID1A. Les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances impossible à récapituler in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée

Réduction

Utilisation d’un nombre minimal d'animaux pour avoir la puissance statistique. Nous avons défini statistiquement la puissance et le risque en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique par un test ANOVA. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 4 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter pylori puis gavées d'un composé nommé EX-01, jusqu'à deux fois par jour pendant quatorze jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur vise un médicament contre l'infection à H. pylori, associée aux cancers de l'estomac, et renvoie cette retombée à terme. Il affirme que des expériences chez la souris sont "indispensables" pour confirmer l'activité du composé, jugée impossible à modéliser in vitro.

Objectifs

Le cancer gastrique est actuellement la 4e cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection chronique par Helicobacter pylori est considérée comme étant reponsable dans plus de 93% des carcinomes gastriques. Le composé EX-01, naturellement présent dans l’alimentation, dont l’inocuité a été montrée mais dont la composition est actuellement confidentielle car en instance de brevetage, a montré des effets antibiotiques in vitro sur Helicobacter et Campylobacter. Il a également montré des effets anti-cancéreux dans les cancers de la prostate et du pancréas mais son action n’a pas encoré été étudiée dans le cancer de l’estomac. Nous souhaitons donc à présent étudier in vivo les effets de ce composé, l’objectif à terme étant la création d’un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo chez la souris les effets du composé EX-01 sur la colonisation de l’estomac par la bactérie Helicobacter pylori.

Bénéfices attendus

L’objectif à terme est de développer un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori.

Procédures

Gavage sur animal vigile: 20 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Gavage sur animal vigile: 40 souris, 1 fois par jour sur 3 jours puis 2 fois par jour sur 14 jours

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au stress du gavage 2 fois par jour, et à l’infection à H. pylori. L’infection à H.Pylori peut induire une légère inflammation au niveau de l’estomac au bout de 5 semaines

Devenir

Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.

Remplacement

L’effet antibactérien du composé EX-01 sur la croissance de H. pylori a été montré in vitro (dépôt de brevet en cours). L’absence de toxicité chez la souris a été démontrée. Des expérimentations chez la souris avec ce composé sont indispensables afin de confirmer sa biodisponibilité et son activité in vivo dans la muqueuse gastrique (environnement acide susceptible d’affecter l’activité de la molécule), éléments qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.

Réduction

Le modèle d’infection à H. pylori est connu et maitrisé par notre équipe. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des analyses biologiques de H. pylori à partir de la muqueuse gastrique des souris infectées, et l’analyse histopathologique pour quantifier l’inflammation gastrique. Des études statistiques seront réalisées : d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. pylori, qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de litière). Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs. Si l'animal commence à perdre du poids, de la nourriture humidifiée sera mise dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement euthanasié. Si l'animal présente des signes de souffrance trop importants il sera euthanasié sans attendre. Les souris seront pesées deux fois par semaine, si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

Le modèle d’infection à H. pylori a été mis au point chez la souris C57BL6J et est maitrisé au laboratoire. Les souris seront utilisées à un âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. pylori. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.

6 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendues à l'élevage. Chacune subit une ovariectomie d'environ une heure sous anesthésie, l'ablation des ovaires les empêchant d'être gestantes tout en conservant un comportement d'oestrus. Le porteur décrit ces brebis comme des femelles "boute-en-train" destinées à stimuler les béliers pour la collecte de semence, une fois toutes les trois semaines. Il affirme qu'il n'est pas possible de collecter les béliers sans recourir à des femelles.

Objectifs

L'objectif est de réaliser une ovariectomie chez la brebis pour permettre la collecte de semence de bélier. Les brebis ovariectomisées ne présentent plus de risque de gestation non désirée et peuvent exprimer un comportement d'oestrus lorsque la collecte de semence est souhaitée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer de brebis ovariectomisées permettant la collecte de la semence de béliers, sans risques de gestation indésirable, et sans utilisation de traitements hormonaux pour synchroniser les brebis.

Procédures

Les animaux seront soumis une fois à une procédure chirurgicale : ovariectomie. La durée totale de l'intervention, anesthésie comprise, est d'environ une heure. Si des injections post opératoires s'avèrent nécessaires, les animaux seraient contentionnés à peine 2 ou 3 minutes, injection comprise.

Impact sur les animaux

Le statut ovariectomisé n'entraine pas d'effet indésirable au cours de la vie de l'animal. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais c'est rare.

Devenir

Les animaux retournent en élevage.

Remplacement

La collecte de la semence de bélier requiert l'utilisation de femelle boute en train. Il n'est pas possible chez les ovins de collecter les mâles sans une autre méthode.

Réduction

Le nombre d'animaux a été choisi pour réduire au maximum l'utilisation des femelles pour les collectes , soit une fois toutes les 3 semaines pour chaque brebis.

Raffinement

Afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. La douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivi du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours ou avec perte de poids par rapport au poids initial malgré le traitement sera mis à mort. Une fiche de suivi individuel est mise en place, renseignée tous les jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement sur 6 paramètres. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante : en ce cas ces animaux recevront des injections sous cutanées de morphine - Fièvre, abattement, en cas d’infection post opératoire : en ce cas, les animaux recevront des antibiotiques et des anti inflammatoires non stéroïdien en fonction de la gravité des symptomes.

Choix des espèces

La collecte de béliers est possible uniquement par l'utilisation de brebis pour stimuler le comportement reproducteur. Brebis adultes et matures sexuellement, de façon à pouvoir répondre au traitement hormonal appliqué après l'ovariectomie.

48 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont réparties entre sédentarité et accès à une roue, suivies par IRM et mesure de la respiration en cage individuelle, avant une prise de sang sous anesthésie puis l'euthanasie pour prélever leurs articulations. Le projet vise à décrire l'effet de l'hygiène de vie sur le vieillissement des articulations, un champ que le porteur présente comme peu étudié. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut répondre à la question car il faut maintenir la communication entre organes au cours du vieillissement.

Objectifs

Nous savons peu de choses sur la façon dont les tissus articulaires réagissent au vieillissement naturel. Or la réduction de mobilité est sans aucun doute l'une des conséquences les plus débilitantes du vieillissement. Cette réduction de mobilité devient également un problème croissant avec l’augmentation de l’inactivité physique et de la sédentarité des enfants et adolescents, souvent associés à des risques de surpoids et d'obésité. Il y a actuellement une littérature abondante sur l’impact bénéfique de l’exercice physique (et délétère de la sédentarité) sur la qualité de l’os chez les sujets jeunes ou âgés (humains et murins). Il est par exemple reconnu que la pratique régulière de l’exercice physique pendant la croissance permet d’optimiser le capital osseux pour toute la vie. En revanche, on ne sait rien quant à son impact sur l’articulation et sur la façon dont les différents types cellulaires composant les 3 tissus de l’articulation (membrane synoviale, cartilage et os sous-chondral) sont modifiés chez le sujet jeune et âgé en fonction de son hygiène de vie. Nous faisons donc l’hypothèse que 1) le vieillissement normal modifie l'écosystème ostéoarticulaire, 2) la sédentarité du jeune adulte induit un vieillissement accéléré des articulations et 3) l’exercice physique a un effet bénéfique sur le vieillissement des articulations.

Bénéfices attendus

- Impact scientifique et technologique : Identification de nouveaux gènes jouant un rôle clé dans la longévité et la bonne santé des articulations, acquisition de nouvelles connaissances dans le domaine de la biologie ostéoarticulaire qui seront mises à disposition de la communauté scientifique internationale et pouvant servir à d’autres disciplines de la biologie. - Impact sociétal et économique : ce projet peut déboucher sur l’identification de gènes candidats qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques intéressantes pour développer des traitements agissant contre le vieillissement des articulations et/ou des marqueurs de la qualité de la membrane synoviale, du cartilage et de l’os sous-chondral utilisables en cliniques.

Procédures

Aucun prélèvement ne sera effectué sur animal vigile. Les tests que nous réaliserons sont non invasifs : activité physique si l’animal le souhaite ; mesure de la composition corporelle par IRM (2 minutes 1 fois semaine); mesure du métabolisme par analyse de la respiration (animal placé en cage individuelle, deux fois 48h) . En fonction des lots, les animaux pourront être placés en cage avec des roues leur permettant de retrouver une activité physique spontanée pendant 8 semaines ou tout au long du test. En fin de protocole, les animaux recevront une injection intra-péritonéale d'anesthésique. Nous effectuerons alors un prèlèvement de sang sur l'animal endormi et il sera euthanasié.

Impact sur les animaux

Les 2 effets indésirables majeurs attendus sont le stress lié à l’hébergement ponctuel en cage individuelle et à la sédentarité. Afin de limiter ces effets, nous proposons de réaliser un enrichissement avec un tunnel en plexi rouge pour toute la durée de l’expérimentation, d’héberger les animaux par cage de 4, et de n’isoler que les animaux inclus dans les groupes « activité physique volontaire » uniquement pendant la période où ils sont dans les cages avec roue connectée. Par ailleurs, la température d'élevage ayant un impact sur le métabolisme, celle-ci sera de 22 à 23°C pour améliorer le confort des animaux.

Devenir

Euthanasie pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses moléculaires.

Remplacement

Il est actuellement impossible de répondre à notre question scientifique par le biais d’approches in vitro car il est nécessaire de maintenir la communication entre tous les organes au cours du vieillissement pour vérifier l’impact de l’activité physique sur le cartilage et l’os.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment dans notre laboratoire et dans des publications utilisant des modèles expérimentaux similaires pour estimer le nombre d’animaux nécessaire. Compte tenu des données de la littérature montrant un dimorphisme sexuel de l’activité physique sur le remodelage osseux et une moindre variabilité inter-individuelle chez les femelles, nous n’utiliserons que des femelles. Compte tenu de l’expérience que nous avons sur les variabilités individuelles et le nombre de genoux requis pour obtenir une quantité suffisante de cellules pour les analyses transcriptomiques, nous réaliserons donc des expériences avec des lots de 8 souris. Ces expériences ne seront pas répétées. Nous nous sommes rapprochés des équipes qui étudient l’impact de l’âge et de l’exercice physique sur le métabolisme musculaire pour optimiser l’utilisation de ces animaux. Leur expertise nous a permis de choisir convenablement les paramètres du protocole expérimental. De plus, ils prélèveront lors de l’euthanasie finale les muscles squeletiques afin de compléter une étude en cours (analyses histologiques et tri cellulaire) et de constituer une banque de données.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours y compris le weekend et les jours fériés et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés. En cas d’apparition, ces manifestations cliniques seront scorées suivant une échelle prenant en compte plusieurs de ces paramètres, avec établissement de points limites entrainant euthanasie des animaux si nécessaire en accord avec la SBEA. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des tunnels de plexiglass rouge de façon à diminuer le stress des animaux et à les habituer aux mesures de composition corporelle qui sont réalisées dans un tube de contention similaire. La température de thermoneutralité pour les souris est proche de 30°C et il est bien documenté qu’il y a un impact de la température sur le métabolisme des tissus musculaires et adipeux. Nous maintiendrons les animaux pendant toute la durée de l’expérience entre 22-23°C pour nous approcher de cette température idéale tout en permettant de recouper nos résultats avec les données existantes.

Choix des espèces

La fonction musculaire chez la souris est similaire à celle de l'homme et nous permettra de transposer facilement nos résultats précédemment obtenus sur le modèle souris. De plus, l'utilisation de la souris nous permet également d’avoir accès à une bibliographie riche et d'utiliser un large panel de réactifs de biochimie et de biologie moléculaire. Dans cette étude nous utiliserons des souris standard (non génétiquement modifiées). Pour étudier l’effet de l’activité physique et du vieillissement, nous prévoyons de comparer des animaux jeunes adultes (âgés de 4 mois) et des animaux de 15 mois (« âgés »). Les animaux seront sédentaires ou auront la possibilité de courir sur des roues s’ils le souhaitent.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un abcès septique est provoqué sous leur peau, puis leur glycémie est mesurée avant l'injection d'un sucre radioactif et un examen d'imagerie TEP, pour évaluer l'intérêt de ce traceur dans le suivi de l'inflammation. Le porteur indique que l'abcès peut évoluer vers une nécrose profonde des tissus ou une septicémie, et que les rats sont ensuite tués pour analyse des tissus. Il affirme qu'une évaluation objective d'une lésion infectieuse ne peut se faire que sur un modèle animal, et retient le rat Wistar comme modèle de référence.

Objectifs

Evaluer l'intérêt du [18]F-FDG (faux sucre radioactif utilisé en routine clinique chez les patients) dans le diagnostic, et l’analyse du processus de formation et de développement de l'infection et de l'inflammation dans un modèle expérimental d’abcès sous-cutané chez le rat.

Bénéfices attendus

Faire un schéma de l’évolution de l’inflammation aigue, subaiguë à chronique afin de déterminer l’intervention des cellules immunitaires dans l’évolution de l’abcès.

Procédures

Induction d'abcès sous-cutané (20 rats, 30 min maximum), mesure de la glycémie des animaux (20 rats, 15 à 30 sec, avant d'injecter le produit radioactif, examen d'imagerie (20 rats, 30min,1h après injection du produit radioactif).

Impact sur les animaux

Risque d’évolution de l’abcès vers une nécrose profonde des tissus adjacents, ou risque de souffrance liée à une septicémie. Ces 2 risques seront particulièrement surveillés tout au long de l’étude pour chaque rat, et des points limite précoces seront définis

Devenir

les animaux seront mis à mort pour faire des analyses en autohistoradiographie et immunohistologie

Remplacement

l'évaluation objective d’une lésion infectieuse avec un examen d’imagerie ne peut être réalisée que sur un modèle animal permettant par la suite d’analyser le mécanisme physiologique global, à l’image des examens chez l’Homme ce qui permettra de mieux coller à la réalité lors d’administration de traitements thérapeutique.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux a été réalisé en amont en prenant en compte un paramètre essentiel de réponse à l’induction de l’abcès. En effet, l’abcès fistule très précocement à J3 (5%), à J4 (20%), ou tardivement à J10 (5%), et ce malgré une reproductibilité du geste expérimental par le même opérateur.

Raffinement

Les animaux seront transportés dans des cages de transport dédiées, avec une litière enrichie avec du papier absorbant autoclavé et avec des bouillotes chauffantes pour éviter l’hypothermie si besoin. Les abcès, les examens de tomographie par émission de Positrons (TEP) et les mises à mort seront induits sous anesthésie générale pour éviter un stress inutile à l’animal. Pour éviter toute souffrance de l'animal la taille maximale des abcès ne dépassera pas 800 mm^3 à J2, bien inférieure aux tailles limites de tumeurs chez le rat qui sont de 1000 mm^3. Après induction de l’abcès, les animaux seront examinés de façon très soutenue durant les 48h en surveillant leur état général, en mesurant (i) leur poids, (ii) leur température, (iii) l’état du gonflement de l’abcès, les animaux recevront également un antalgique (buprénorphine), tous les 6, 8h ou 12h (si nécessaire) durant 48h. De plus, cette surveillance se poursuivra quotidiennement durant toute la période du l’étude pour chaque animal.

Choix des espèces

Les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre de pathologies inflammatoires sont des modèles murins (souris et rats). Pour nos expérimentations, nous utilisons comme modèle le rat « WISTAR ». Cette souche est très largement décrite dans la littérature et son utilisation reste la plus appropriée à ce type de recherche (modèle de référence). En outre, cette souche de rat a été largement utilisée au sein de notre plateforme et permet de confronter nos résultats à des analyses antérieures effectuées sur rats sains. Les rats seront âgés de 9 semaines lors de l’initiation du protocole. Ce stade correspond à un état adulte pour lequel le système immunitaire est bien établi. En outre, le poids intermédiaire des animaux permettra d’imager des organes intéressants comme la rate ou le rachis qui interviennent dans la réponse immunitaire.