Recherche fondamentale

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une xénogreffe de chondrosarcome humain sous la peau, puis des injections de traitement et des mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur indique que les cultures cellulaires ne reproduisent pas le microenvironnement tumoral et affirme vouloir confirmer in vivo des molécules déjà repérées in vitro. Le projet vise à repositionner des médicaments contre ce cancer des os rare.

Objectifs

Les chondrosarcomes sont des tumeurs osseuses rares qui produisent une matrice cartilagineuse. Ces tumeurs touchent principalement les adultes et sont potentiellement fatales. Elles sont considérées comme résistantes à la radiothérapie et aux chimiothérapies conventionnelles. De ce fait, leur traitement a peu évolué au cours des 40 dernières années. Il repose sur la chirurgie et peut conduire à l’amputation d’un membre du patient. De plus, les options thérapeutiques sont limitées si la tumeur est localisée dans des zones sensibles non résecables telles que la tête et le cou ou le pelvis, ou si la tumeur métastase. C’est pourquoi il est nécessaire d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcomes. Nous avons montré in vitro que des molécules ciblant la voie de l’adénosine réduisent la croissance tumorale et induisent la mort par apoptose dans les chondrosarcomes humains. L’objectif de ce projet est d’évaluer les capacités anti-tumorales de quatre de ces molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle hétérotopique de chondrosarcome humain chez la souris immunodéprimée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité anti-tumorale de quatre molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle animal de chondrosarcome humain. Ainsi, nous identifierons si le ciblage de la voie de l’adénosine pourrait devenir une nouvelle approche thérapeutique pour le chondrosarcome, un cancer des os chimio- et radio-résistant de pronostic potentiellement sévère. Cette information est cruciale pour le développement clinique de cette thérapie qui pourrait à terme améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcome.

Procédures

Les gestes suivants seront réalisés sur l’ensemble des animaux (total 288) : - une implantation de xénogreffe en sous-cutané au niveau du flanc (moins de 2 minutes), sous anesthésie générale et analgésie - une mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse (moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant 12 semaines, sous anesthésie générale - une injection du traitement (la molécule testée ou son véhicule) en intrapéritonéal (moins de 2 minutes), 2 à 4 fois par semaine pendant 12 semaines - un suivi pondéral (pesée, moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (estimée selon notre expérience, à 6 semaines pour le développement tumoral puis 12 semaines de suivi du volume tumoral)

Impact sur les animaux

D’après notre expérience et la littérature, nous ne nous attendons pas à une perte de poids, ni à une gêne lors du déplacement de l’animal, ni à des modifications du comportement, ni à des douleurs spécifiques excepté au moment de l’injection des cellules tumorales. Pour diminuer la douleur, une analgésie sera administrée lors de l’implantation des tumeurs.

Devenir

La procédure est de classe de sévérité modérée, ce qui justifie la mise à mort des animaux à l’issue de la procédure.

Remplacement

Les expériences réalisées in vitro sur des cultures de cellules ne permettent pas de modéliser l’ensemble du micro-environnement cellulaire, connu pour modifier le comportement des cellules et affecter leur réponse aux traitements. C’est pourquoi après avoir mis en évidence in vitro des molécules aux propriétés anti-tumorales, nous souhaitons confirmer ces propriétés in vivo, sur un modèle murin plus proche de la pathologie humaine, afin de faire la preuve de concept de l’efficacité des drogues utilisées en vue de proposer d’éventuels repositionnements de médicaments actuellement utilisés pour le traitement d’autres tumeurs ou maladies.

Réduction

Nous considérons que la molécule testée a un effet anti-tumoral si elle entraine une baisse de volume tumoral d’au moins 20 % en moyenne par rapport au groupe contrôle. Pour cela, le nombre d’animaux par groupe peut être réduit à 12.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux durant toute la durée de la procédure, un suivi individuel et régulier sera effectué afin d’évaluer l’état général des souris. Les implantations de xénogreffes seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les mesures de volume tumoral seront également réalisées sous anesthésie générale. De plus, si la souris présente une perte de poids importante, les traitements seront arrêtés une à deux semaines le temps que les signes cliniques disparaissent. Si les signes cliniques perdurent, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Afin de permettre l’implantation des xénogreffes et le développement tumoral, des souris immunodéprimées (nude) seront utilisées. Les chondrosarcomes humains touchent principalement les adultes. Aussi, d’après notre expérience et les données de la littérature, des souris à un stade adulte seront utilisées.

1 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion puis reperfusion d'une artère cérébrale au moyen d'un filament, suivi d'une IRM et d'une série de tests comportementaux étalés sur trois semaines. Le porteur indique que le modèle reproduit des déficits sensorimoteurs et une désorientation au réveil, et applique des points limites en cas de perte de poids ou d'inactivité. Il présente le rat comme le modèle préférentiel de l'AVC et juge "indispensable" de tester chez l'animal cinq stratégies thérapeutiques financées par l'industrie.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’augmentation de la récupération fonctionnelle et de diminuer la lésion causée par l’occlusion artérielle. L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monofilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirurgical durera 15 minutes. 45 minutes plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirurgical durera 10 minutes. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suivront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post AVC. Un total de 56 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse post chirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 30%) sauf pour les SHAM au nombre de 5 par groupe, ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront 2 par cage avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Le site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, à une désinfection et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, de l'oxygène sera administré pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par une ischémie-reperfusion. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids d’environ 300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

840 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection d'azoxyméthane pour déclencher une cancérogénèse colorectale, puis les animaux ingèrent des additifs alimentaires et passent trois jours isolés en cage à métabolisme individuelle. Le porteur indique qu'aucune étude in vitro n'évalue les effets d'additifs sur le métabolisme et le microbiote d'un "organisme entier", et affirme que les agences de sécurité des aliments ont "besoin" de ces résultats. L'objet reste de tester des additifs déjà autorisés dans l'alimentation humaine.

Objectifs

Des données récentes de la littérature suggèrent que certains additifs alimentaires, retrouvés surtout dans les aliments ultra-transformés pourraient être reliés à des risques associés de cancers. Le but de ce présent projet consiste à analyser certains de ces additifs. Les résultats obtenus avec un seul additif, testé à plusieurs concentrations, sur plusieurs matrices (alimentation, eau de boisson) et sur l'initiation ou la promotion du cancer colorectal, permettra de fournir de nouvelles informations afin de guider les décisions des agences de santé publique et de contribuer à la prévention des cancers.

Bénéfices attendus

Les agences nationales de sécurité des aliments ont besoin de résultats mis à jour sur des molécules alimentaires pour pouvoir établir de nouvelles recommandations nutritionnelles en termes de prévention ou d'interdiction de certains additifs. Ce même type de recherche a déjà permis d'identifier un potentiel nouveau danger pour un additif ce qui a abouti à son interdiction suite à un avis de l’EFSA en 2020.

Procédures

Aucun prélèvement invasif n'est prévu sur les animaux, seulement la récupération des urines et des fèces. En tout début de procédure, certains groupes d'animaux seront injectés avec de l'AOM (azoxyméthane), dans le but d'induire une cancérogénèse. Cette injection unique (quelques centaines de microlitres) est réalisée en moins d'une minute par rat.

Impact sur les animaux

Les additifs testés étant déjà des molécules autorisées pour l'alimentation humaine, le risque lié à leur ingestion reste mineur. Les animaux pour lesquels la cancérogénèse aura été induite chimiquement ne sont gardés que 100 jours, ce qui correspond à un délai suffisant pour qu'il y ait une initiation de la cancérogénèse mais largement insuffisant pour qu'ils développent des tumeurs douloureuses. Les animaux sont gardés 3 jours en cage à métabolisme individuelles, ce qui induit un stress lié à la taille de la cage et à l'isolation. La durée d'hébergement dans ces cages est réduite au plus strict minimum, les cages transparentes permettent un contact visuel et olfactif des animaux et une attention très particulière est portée aux animaux lors de ce passage. Enfin l'injection d'AOM qui peut entrainer un stress pour les animaux est réalisée avec des aiguilles les plus fines possibles afin de minimiser l'impact sensoreil, les animaux seront manipulés la veille pour les habituer à la contention et réduire le stress.

Devenir

A l'issue de la procédure les animaux seront euthanasiés afin que le sang et plusieurs organes soient prélevés pour analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Des études in vitro sur des cellules ont été réalisées en amont afin d'identifier les possibles effets toxiques des additifs qui seront testés. Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de composés issus de l'alimentation comme les additifs alimentaires, sur la physiologie et le métabolisme et le microbiote d'un organisme entier.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été évalué à son minimum afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement fiables. Notre expérience sur le même type études nutritionnelles a montré qu'un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire.

Raffinement

Le bien-être de l'animal est en permanence au centre de nos préoccupations. Les conditions d'expérimentation font l'objet d'une procédure de suivi du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont surveillées quotidiennement, la nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum, la litière changée de manière hebdomadaire. Les rats étant des animaux sociaux, ils seront maintenus à 2 par cage (paroi transparente) pour ne pas souffrir d'isolement, leur environnement enrichi. Avant chaque intervention expérimentale, les animaux seront habitués à être manipulés.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le rat est l’animal dont la physiologie est la plus proche de la situation humaine, tant au niveau digestif que pour les processus de cancérogénèse. Pour éviter les effets hormonaux liés aux cycles des femelles, seuls les mâles seront utilisés. L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes, afin de pouvoir comparer avec nos précédentes données, il est important de ester au même stade de développement.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules humaines de cancer du rein, puis un traitement par gavage et injection cinq jours par semaine, avant d'être tuées pour prélever les tumeurs, afin de tester une combinaison censée lever la résistance au sunitinib. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance importante et prévoit une mise à mort avant l'apparition de nécroses tumorales. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre cellules et vaisseaux au sein de la tumeur.

Objectifs

Malgré une réponse objective ou une stabilisation de la maladie, les patients atteints d’un cancer du rein vont progresser de manière inéluctable et résister au traitement sunitinib après environ 1 an de traitement. Dans ce protocole nous proposons de combiner le traitement sunitinib à un inhibiteur d’une voie métabolique qui semble jouer un rôle majeur dans la résistance au sunitinib. Ainsi, valider l’efficacité de cette combinaison chez l’animal représente un enjeu thérapeutique important pour le cancer du rein. Nous espérons ainsi pouvoir proposer une nouvelle alternative thérapeutique afin de contrecarrer la résistance au traitement sunitinib.

Bénéfices attendus

L'échec thérapeutique auquel font face les patients atteints d'un cancer du rein est inéluctable. Grâce à nos recherches, nous espérons ainsi proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d'offrir une solution pour empêcher les mécanismes à l’origine de la résistance au traitement sunitinib. Un transfert vers la clinique serait donc l'accomplissement de ce projet.

Procédures

Pour mener à bien ce projet, nous injecterons dans le flanc droit de souris jeunes (6 à 8 semaines) des cellules tumorales humaines de cancer du rein (modèle de xénogreffe). Ensuite, lorsque la tumeur atteindra un volume suffisamment important, ces mêmes souris seront traitées soit avec un traitement de référence du cancer du rein (sunitinib), soit avec un composé chimique (le NCT-503 / inhibiteur voie métabolique), soit avec une combinaison des 2 traitements (le sunitinib et le NCT-503). Ces traitements seront réalisés 5 fois par semaine. Ces injections, que ce soit de cellules tumorales ou l’inhibiteur NCT-503 (voie intrapéritonéale), ne dureront que quelques secondes à chaque fois. Le traitement par gavage (sunitinib), réalisé à l’aide d’une canule de gavage est également une procédure très rapide. Enfin, aucune autre intervention ne sera réalisée sur l’animal vigile. Les souris impliquées seront monitorées quotidiennement afin d’assurer une bonne gestion de la douleur. Chacune des 80 souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement puis mise à mort à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite. Avec l’ensemble des procédures comprenant : l’injection de cellules tumorales et les traitements par gavage ou par voie intrapéritonéale, nous classons la procédure en modérée.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les injections sous-cutanées de cellules tumorales, nous n'attendons pas de nuisance importante chez la souris liée à la procédure en elle-même. Celle-ci ne nécessite aucune anesthésie. Ces cellules tumorales ne metastasent pas. Les animaux seront mis à mort suffisamment tôt afin d'éviter l'apparition de nécroses au niveau des tumeurs. S'agissant d'un protocole impliquant l'injection de cellules tumorales et le suivi du développement des tumeurs qui en résulteront, nous classons la procédure en modérée. On rappelle que les souris Nudes ne sont pas à phenotypes dommagables. Le sunitinib et l'inhibiteur NCT-503 ont déjà été utilisés dans des modèles in vivo, par notre équipe et d'autres équipes, respectivement et n'ont pas présenté d'effets indésirables.

Devenir

Le prélèvement des tumeurs pour analyse nécessitera la mise à mort des souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents acteurs cellulaires présents au sein de la tumeur. Le sunitinib est un inhibiteur de l’angiogenèse, il est donc nécessaire de travailler sur un système plus complexe mettant en jeu les vaisseaux sanguins.

Réduction

Avant de passer au modèle in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour être statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d’au moins 20%). Enfin, nous utiliserons un test statistique paramétrique (test Anova) afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de données statistiquement exploitables.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de la douleur ou d’une perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire tri- hebdomadaire puis journalier (à partir du début des traitements) sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de score adapté au modèle (Annexe 1). La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus répandus pour étudier l’effet des drogues sur la croissance tumorale. En effet, la souris constitue un modèle classique pour la validation de l'activité pro/anti-tumorale de protéines et de composés pharmacologiques. De plus, cette espèce animale est un modèle expérimental que nous connaissons parfaitement et qui est couramment utilisé par la communauté scientifique. Dans ces études, nous utiliserons les souris NUDE, qui constituent le meilleur modèle (données publiées). Ces souris sont immunodéficientes ce qui permet de réaliser des xénogreffes de cellules humaines dans un modèle murin (NUDE femelles, agées de 6 à 8 semaines lors de l'injection des cellules tumorales) sans rejet par le système immunitaire. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines. Une fois les groupes expérimentaux réalisés, les animaux seront acclimatés durant une semaine avant de réaliser les différents traitements, ce qui implique de débuter les expériences sur des animaux âgés de 7 à 9 semaines (utilisation de souris jeunes mais ayant déjà atteints leur maturité sexuelle et ayant une courbe de poids stable).

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Toutes reçoivent une greffe de cellules de lymphome puis des cellules CAR-T par voie intraveineuse, avec plusieurs prélèvements sanguins, et 320 d'entre elles sont irradiées, pour étudier comment le métabolisme de la tumeur influence la réponse à cette immunothérapie. Le porteur indique que la croissance tumorale ne provoque des signes de souffrance qu'à un stade avancé, où l'animal est alors mis à mort. Il présente comme bénéfice attendu de mieux sélectionner les patients éligibles, et affirme qu'aucune alternative in vitro ne reproduit ce dialogue immunitaire.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (LDGC-B) est un cancer du sang très agressif et très fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très diverse et hétérogène, ce qui explique qu'environ 40 % des patients ne répondent pas au traitement de référence. S'ils sont éligibles, les patients qui échappent au traitement peuvent bénéficier d'une thérapie innovante appelée "thérapie par transfert de cellules adoptives" (ou cellules CAR-T). Pour cela, un type spécifique de cellules du système immunitaire du patient (lymphocytes) est prélevé puis génétiquement modifié en laboratoire pour leur permettre de reconnaître les cellules tumorales du patient. Une fois ces cellules immunitaires réintroduites chez le même patient, elles peuvent alors reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Bien que très efficace dans le traitement du LDGC-B, environ 50 % des patients ne répondent pas à ce traitement ou rechutent rapidement (dans l'année qui suit). Il est donc important de comprendre comment améliorer la réponse à ce traitement. Les LDGC-B ont différentes façons de produire leur énergie cellulaire, un support essentiel à leur division constante et rapide. En effet, ces cellules tumorales utilisent soit la voie des sucres (glycolyse), soit l'usine de fabrication d'énergie de la cellule (la mitochondrie). Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si la façon dont la cellule tumorale produit son énergie va limiter ou favoriser la réponse des cellules CAR-T.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de mieux sélectionner les patients qui pourraient bénéficier de cette thérapie innovante.

Procédures

Toutes les souris (640) seront injectées par voie intra-veineuse dans la veine caudale 2 fois au cours de l’expérience pour 1/ recevoir les cellules de lymphome (allogreffe) puis 2/ 7 jours plus tard les cellules T (contrôle ou CAR-T). Chaque injection prendra environ 5 min par souris et sera réalisé sur souris vigile. Un prélèvement de sang (100 µl) sera effectué sur souris vigile 2-3 jours avant l’injection des cellules CAR-T puis une fois par semaine dans la veine caudale de la souris ou en sub-mandibulaire à l’aide d’une aiguille 25G (le volume maximal qui sera prélevé à chaque fois est de 100 µl). Ainsi chaque souris aura entre 4 et 6 prélèvements sanguin sur l’ensemble de la durée de l’expérience. Les souris de la procédure 2 (320) seront irradiées à une dose sublétale (4 Gy). Pour cela elles seront placées 5 par cages (cage spéciale pour l’irradiateur) et seront irradiées pendant 206 secondes (3 min et 26 secondes) pour atteindre 4 Gy (notre irradiateur dispense 1,16 gray par 60 secondes). Cette irradiation ne sera réalisée qu’une fois par souris.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les souris pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des cellules immunitaire (CAR-T), soit par l'irradiation modérée. Nous avons une grande expertise de ce modèle. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation) qu’à un stade avancé de la maladie. Cependant en cas de persistance des signes décrits ci-dessus, l’animal sera mis à mort. Les sites d’injections seront surveillés attentivement.

Devenir

mise à mort et mesure du poids des organes, analyses métabolomiques, cytométrie de flux, analyses moléculaires et immuno-histochimiques

Remplacement

Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement par les CAR-T. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.

Réduction

Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre minimum de souris à utiliser afin d’être statistiquement significatif.

Raffinement

Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En terme de raffinement, les souris sont hébergées par groupe de 5 avec un milieu enrichi. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Finalement, en absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.

561 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale d'environ une heure pour électroporer le cerveau des embryons in utero, les embryons étant ensuite prélevés et les mères tuées, afin d'étudier le rôle de micro-ARN dans le développement du cortex cérébral. Le porteur indique que la laparotomie peut provoquer douleurs, infection de la plaie ou rupture des sutures, et justifie la mise à mort des mères par des "raisons éthiques" les empêchant de générer d'autres portées. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas la complexité du cortex et que seule la souris permet cette approche transgénique.

Objectifs

Le cortex cérebral est organisé en 6 couches de neurones qui sont générées successivement entre les stades embryonnaires E12 et E16 (12 et 16 jours de vie fétale). Les neurones des différentes couches présentent une grande variabilité de morphologie, de connectivité et de propriété physiologique, alors qu’ils sont issus du même pool de progéniteurs. Ce projet s’inscrit dans la thématique de recherche générale visant à comprendre les bases génétiques permettant à une même population de progéniteurs de générer des neurones très différents entre eux en fonction du stade de développement de l’embryon. Dans ce projet nous nous intéresserons en particulier au rôle des micro-ARNs. Les micro-ARNs sont de petites molécules d’ARN de 21-24 nucléotides capables de réguler l’expression des gènes. Il est couramment admis qu’un même micro-ARN peut réguler plusieurs centaines de gènes et qu’inversement un gène peut être régulé par de nombreux micro-ARNs. Ainsi nous pensons que, compte tenu de leur mode d’action, des changements subtils dans l’activité des micro-ARNs sont susceptibles de modifier significativement la compétence neurogénique des progéniteurs. Pour confirmer ou infirmer cette hypothèse, nous allons mener cette recherche en 4 objectifs successifs : - 1/ Etudier l’expression des micro-ARNs dans les progéniteurs au cours du temps entre les stades E12 et E16 - 2/ Déterminer parmi le pool des micro-ARNs exprimés, la fraction réellement engagée dans une activité de régulation - 3/ Déterminer les gènes dont l’expression est régulée par ces micro-ARNs actifs - 4/ Valider expérimentalement le rôle fonctionnel de certains micro-ARNs actifs, en manipulant leur expression et en analysant les conséquences de ces manipulations sur la morphologie et la physiologie des neurones générés.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux ont montré que l'expression des gènes au sein des progéniteurs des neurones corticaux varie en fonction du stade de développement embryonnaire. Cette variation d'expression des gènes dans les progéniteurs selon le stade de développement induit une grande diversité morphologique et physiologique des neurones corticaux générés à partir de ces progéniteurs. Cette dynamique d'expression génique est encore mal comprise. Nous pensons que les micro-ARNs, parce qu’ils sont capables de réguler simultanément de nombreux gènes et donc de modifier en profondeur l’expression des gènes d’une cellule, peuvent jouer un rôle dans cette dynamique. Le projet présent va permettre de confirmer ou d’infirmer cette hypothèse ce qui présente un intérêt non seulement pour comprendre comment la structure spécifique du cortex cérebral se met en place mais également d’une manière générale pour appréhender comment une cellule souche initiale va évoluer et se renouveler au cours du développement pour générer l’ensemble des tissus qui composent un organisme.

Procédures

Chirurgie abdominale sur 80 souris gestante sous anesthésie générale (environ 1h par souris). Prélèvement de 241 embryons à un stade supérieur ou égal à E14,5 (10 mn par embryon).

Impact sur les animaux

L’électroporation corticale in utero aux stades embryonnaires entre E12,5 et E16,5 est une technique bien établie pratiquée par de nombreux laboratoires. Les nuisances attendues sur les animaux sont les suivantes. Chez la mère : - L'anesthésie, - La laparotomie, - Des injections intra-péritonéale et sous-cutanée, - D’éventuelles problèmes postopératoires comme des douleurs (associées à une perte de poids ou un état de prostration), l’infection de la plaie, ou une rupture des points de suture. Chez le foetus - L'injection d’acide nucléique intra-ventriculaire suivi d’une électroporation

Devenir

Pour les objectifs 1 à 4, les analyses seront réalisées post-mortem sur les cellules de cerveaux d’embryons électroporées. Pour des raisons éthiques, les mères gestantes dont seront issus ces embryons, ne peuvent être réutilisées pour générer de nouvelles portées et seront donc euthanasiées à l’issue de la procédure. Pour l’objectif 5, les analyses seront réalisées post-mortem sur le cerveau d’animaux de 14 jours issus d’embryons électroporés. Les mères de ces animaux seront également euthanasiées à l’issue de la procédure pour les mêmes raisons que précédemment.

Remplacement

L’option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait la culture in vitro de cellules souche de souris. En effet, il a été montré que la différenciation in vitro des cellules souche génère au cours du temps une succession de sous-types de neurones glutamatergiques qui mime la génération des différentes couches du cortex. Cependant, la culture in vitro ne permet pas de récapituler l’ensemble de la complexité du cortex cérebral. Par exemple, il n’est pas possible de recréer la segmentation du cortex en aires fonctionnelles, ni d’aboutir à une maturation totale des neurones en boite de petri. D’autre part, si la culture in vitro de cellules souche semble maintenir l’existence des facteurs intrinsèques impliqués dans la régulation de la dynamique de différenciation des neurones corticaux, d’autres facteurs de régulation extrinsèques, encore mal connus, ne peuvent pas être maintenus in vitro.

Réduction

Les procédures que nous allons mettre en œuvre visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Elles font appel à certaines techniques délicates à réaliser, c’est pourquoi nous avons recruté pour ce projet un chercheur contractuel ayant une longue expérience dans l'utilisation de ces techniques et de ce fait les maitrisant parfaitement. Le nombre d’animaux par expérience a été estimé au plus juste de façon à répondre aux exigences pratiques et statistiques de chaque expérience. L’objectif final du projet vise à identifier le rôle de micro-ARNs particuliers dans les cellules souche neurales du cerveau d'embryons de souris pour générer de nouveaux neurones. Cette recherche impliquera de manipuler l'expression de ces micro-ARNs et d'observer l'effet de ces manipulations en comparaison avec une condition témoin (sans traitement). Pour chaque micro-ARN étudié les deux conditions « traitement » et « témoin » seront réalisées dans des embryons de la même souris gestante. Ceci permet de limiter le nombre d’animaux utilisés par rapport à des procédures où la même condition seraient appliquées à tous les embryons d’une même portée. De plus, le fait d’avoir les 2 conditions à comparer dans la même souris gestante permet également d’augmenter la solidité des résultats et donc finalement de réduire le nombre d’animaux utilisés. Enfin, l’utilisation de coupes fines de cerveau permet d’étudier tous les paramètres pertinents nécessaires à la caractérisation des conséquences d’un traitement à partir d’un seul individu.

Raffinement

L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. Les cages sont enrichies et les animaux sont hébergés en groupes sociaux. Les animaux ayant subi une procédure sont surveillés et observés régulièrement. Une grille de score a été définie pour chaque procédure pour l’application de points limites précis et adaptés, avec des actions et des prises de décisions définies grâce à un arbre décisionnel. Des soins spécifiques seront apportés à la mère gestante qui subira l’électroporation in utero. En particulier nous aurons pour impératif de réduire au maximum la douleur induite par les procédures, qui seront réalisées par des personnes très expérimentées. Ainsi, des analgésiques seront injectés avant et après la chirurgie qui se déroulera sous anesthésie. De même des actions spécifiques seront entreprises pour contrecarrer les effets induits par l’anesthésie et la chirurgie. Les animaux ayant subi la chirurgie seront hébergés dans une salle de stabulation spécifiquement dédiée.

Choix des espèces

Chez les mammifères, l’espèce souris est la seule pour laquelle nous pouvons réaliser ce projet, et ce pour des raisons techniques et de connaissances théoriques. En effet, notre projet est basé sur l’utilisation d’une lignée transgénique de souris exprimant T6B de façon conditionnelle. Or, la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle la fabrication de lignée transgénique est faisable facilement. D’autre part, l’électroporation in utero est une technique qui n’est réellement bien maitrisée chez les mammifères que chez la souris. Enfin, chez les mammifères non humains, c’est chez la souris que les connaissances génétiques sont les plus développées. Ce projet cherche à comprendre comment la variabilité morphologique et physiologique des neurones du cortex cérebral de souris est codée dans les progéniteurs neuronaux. Comme la différenciation des neurones corticaux s’initie entre 12 et 16 jours de vie fétale, les expériences de ce projet seront réalisées sur des embryons entre E12,5 et E16,5.