Recherche fondamentale

63 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis douze perfusions intraveineuses d'une heure par un cathéter alors qu'elles sont éveillées, avant un prélèvement de sang cardiaque terminal, pour tester un candidat médicament anticancéreux dans un modèle de cancer de la vessie. Le porteur annonce un effet "vaccinal" contre les récidives, à partir de résultats antérieurs, et vise des données précliniques pour un futur essai chez l'humain. Il indique que le cathéter peut s'obstruer et que la pousse tumorale peut gêner la locomotion.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur impliqué dans l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce dernier par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales d’une toute nouvelle famille de molécules activant le TLR3 (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, le candidat médicament adapté à une injection dans le système veineux (ici perfusion intraveineuse sur souris vigiles sans contention) va être comparé en doses croissantes sur 63 souris dotées d’un cathéter pour déterminer : (1) l’efficacité antitumorale, (2) la tolérance et (3) les mécanismes d’action (dont l’action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ce candidat médicament puisse être directement comparable aux études précédentes et à venir.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’efficacité du candidat médicament par voie d’administration en perfusion intraveineuse et à trouver sa dose efficace pour une action anti-tumorale. L’hypothèse est également que ce candidat médicament permettra d’éviter les récidives avec un effet vaccinal. Il est testé ici sur un modèle de tumeur de la vessie mais il pourrait avoir des actions sur une multitude de cancer.

Procédures

- Anesthésie pour identification, tonte, injection de cellules tumorales dans le flanc …. (5 min) - Douze traitements (injection intraveineuse lente par le cathéter) d’une heure sur souris non anesthésiées. - Une anesthésie pour prélèvement de sang intracardiaque suivi d’une mise à mort (10-15 min).

Impact sur les animaux

Les animaux sont reçus déjà dotées d’un cathéter dans la veine jugulaire avec un injecteur double qui est susceptible de s’obstruer. Les animaux subiront un stress lors des contentions, mesures, entretien des cathéter, anesthésies et greffe tumorale. L’anesthésie terminale en vue du prélèvement sanguin intracardiaque peut entraîner l’arrêt du cœur. La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort avant prélèvements en point final sans réveil (analyses pharmacocinétiques, biodistribution et biomarqueurs).

Remplacement

Pour cette étude, des souris ayant un système immunitaire complet et dotées d’un cathéter sur la veine jugulaire permettant les injections et les prélèvements seront directement reçues du fournisseur. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent pas être REMPLACEES. Seul un modèle in-vivo, possédant un système immunitaire complet, permet l'étude de l'effet vaccinal thérapeutique et anti-récidives contre les tumeurs. Il en va de même pour les facteurs physiologiques pouvant influer sur l’effet de la molécule testée (biodisponibilité, métabolisation, distribution cellulaire, réponse immunitaire...). Aucune donnée bibliographique n’étant disponible sur ces molécules, seules les expérimentations permettront de disposer de ces données et d'étudier l'efficacité du candidat médicament aux différentes étapes de la progression tumorale. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique chez l’Homme.

Réduction

Une précédente preuve de concept a permis de déterminer que le nombre de souris prévu pour cette expérience était adapté. Ainsi, la REDUCTION du nombre d'animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats sera respectée, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées. Des études statistiques seront effectuées sur les mesures de croissances tumorales et sur le nombre de tumeurs n’atteignant pas une taille critique.

Raffinement

Le RAFFINEMENT sera respecté par la mise en place d’une définition précise des points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 et isolés pendant le temps du traitement dans des cages transparentes et pourront ainsi se voir à travers les parois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’à de l’enrichissement. Un prélèvement de sang aura lieu à la fin de 2 des 12 traitements sans que l’animal s’en rende compte par le cathéter. Les autres prélèvements seront des prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie. Ce modèle se rapproche donc physiologiquement d’une infusion clinique sur l’Homme. Ce dispositif permet aussi de ne pas piquer plusieurs fois dans la même veine, ce qui peut l’abîmer.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les perfusions intraveineuses. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’EU. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ont également été effectuées sur des souris femelles, ce qui permettra de comparer les résultats de cette étude.

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales ou un produit cancérigène suivi d'un agent provoquant une inflammation du côlon, puis sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs organes, afin d'étudier le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les cancers. Le porteur indique un risque de prolapsus rectal et une perte de poids, et renvoie ses retombées thérapeutiques éventuelles chez l'humain à un horizon lointain. Il affirme que la complexité du développement tumoral impose l'animal et revendique une expertise de plus de vingt ans pour fixer les effectifs.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, une injection de Staphylococcus aureus ou de sa toxine, avec des prélèvements de sang, pour tester si l'absence de cavéoline-1 aggrave l'infection. Le porteur indique que les souris peuvent montrer prostration, apathie, hérissement des poils, perte de plus de 20 % du poids et forte variation de température, et que les effets sont irréversibles. Il affirme que la perméabilité vasculaire au cours de l'infection ne peut être évaluée qu'en système intégré chez l'animal.

Objectifs

Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie fréquemment retrouvée dans le nez, le tractus respiratoire et la peau. Dans certaines conditions, S. aureus peut causer un grand nombre de maladies, allant des infections mineures comme des infections superficielles de la peau et des tissus mous jusqu’à des infections mortelles telles que le syndrome de choc toxique, la pneumonie, la septicémie et l'endocardite infectieuse. C'est toujours actuellement l'une des cinq causes les plus fréquentes d'infections acquises dans les hôpitaux et souvent la cause d'infections postopératoires. Chaque année, environ 750 000 patients dans les hôpitaux de France contractent une infection staphylococcique, soit environ 4 000 décès. Par conséquent, il est crucial de définir les facteurs de risque qui contribuent à l'invasion de l'hôte par S. aureus. Les toxines de S. aureus induisent la formation de pores à travers les cellules qui favorisent la perméabilité des vaisseaux sanguins et la dissémination de la bactérie dans les organes. La protéine cavéoline-1 est un régulateur critique qui limite la formation et l’élargissement de ces pores. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine un doublement du nombre de pores et leur élargissement d’un facteur 3. Ces résultats étant basés sur des études in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à l'infection par S. aureus.

Bénéfices attendus

Les travaux préalables ont permis de montrer un lien causal entre la formation des pores induits par S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires (œdème, hémorragie et aggravation de l’infection). Ce projet doit permettre d’apporter un bénéfice à la compréhension de la formation des pores vasculaires et leur importance dans la régulation de la perméabilité vasculaire . Ceci aura en outre des retombées probables dans la compréhension de certaines formes de maladies vasculaires conduisant à des hémorragies spontanées sans diminution du nombre de plaquettes.

Procédures

L'injection des bactéries aura lieu une seule fois sur animaux anesthésiés (durée d'anesthésie 10 min). Des prélèvements sanguins à la queue seront effectués également après anesthésie et la souris maintenue endormie jusqu'à l'arrêt des saignements (anesthésie totale 15 min). Les expériences d'injection de colorant non toxique pour vérifier l'intégrité des vaisseaux seront effectuées sur animaux sous anesthésie, maintenue pendant 20 minutes, jusqu'au prélèvement de sang en aorte qui entraine l'arrêt cardiaque et respiratoire.

Impact sur les animaux

L’ensemble des résultats obtenus in vitro sur cellules concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des pores cellulaires lors de l’intoxication par la toxine EDIN. On peut anticiper que si les effets in vitro sont reproduits chez l'animal, l'absence de cavéoline-1 devrait aggraver les symptomes lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B. Les animaux pourraient ainsi montrer des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection à travers l'augmentation de perméabilité vasculaire, manifestés par un phénotype caractéristique de prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils ou/et perte de poids de plus de 20%. La multiplication des bactéries pourrait entrainer une modification importante de la température corporelle, soit une fièvre, soit une hypothermie en cas de choc septique. Par ailleurs, concernant les nuisances liées aux actes expérimentaux, les animaux vigiles seront soumis à des actes de contentions afin d'injecter un mélange anesthésiant. Toutes les autres manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les prélèvements non terminaux à l'extrêmité de la queue seront effectués par section < à 0.5 mm et les souris réveillées une fois l'hémostase réalisée afin de minimiser les nuisances au réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue du projet car les effets des bactéries et de la toxine sont irréversibles après l’injection et les animaux ne peuvent être ré-utilisés sous peine de créer des biais.

Remplacement

La cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de pores transendothéliaux induits par l’EDIN-B, une toxine produite lors d'une infection par Staphylocoque. La formation de ces pores corrèle avec l’apparition de complications vasculaires. L’évaluation de la pathogénicité vasculaire de l’exotoxine EDIN-B en terme de perméabilité vasculaire au niveau des différents organes ne peut se faire que par une étude chez l’animal en système intégré.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux nous partirons de nos données antérieures sur l’infection bactérienne induite par Staphylococcus aureus. Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives, la première étape étant la comparaison des sensibilités des souris contrôles ou présentant une absence de cavéoline-1 aux souches bactériennes exprimant ou non la toxine. Si une différence est présente, l'étape-2 servira à confirmer le rôle de la toxine Edin avec des souches mutantes contrôles. Enfin, la perméabilité vasculaire sera examinée après injection i.v. de la toxine EDIN purifiée. Les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Sachant que toutes les souris ne développent pas de bactériémie, pour un risque 5% et une puissance de 80%, nous avons calculé des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Les points-limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance, et une surveillance quotidienne des animaux nous permettra de détecter au plus tôt ces points limites. Les souris sont maintenues dans leur groupe, qui aura été mis en place une semaine avant le démarrage des expériences. La cage est enrichie en jouets, et en frisure et coton à déchiqueter pour favoriser la nidation et maintenir la température en cas de refroidissement des animaux. De la nourriture sera systématiquement placée dans le fond de la cage avant le début de l'expérience, et aux premiers signes d'apatie on rajoutera de la nourriture gélifiée, plus apétante et hydratée.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphylococcus aureus. C'est une espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, qui développe des symptomes similaires à ce que l'on observe chez l'homme. De plus dans le cas de cette étude, il s'agit de déterminer le rôle de la cavéoline-1 dans le développement de l'infection, et l'utilisation des souris transgéniques invalidées pour la cavéoline-1, mâles et femelles, nous permettra d'obtenir des conclusions claires.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des antiviraux anti-VIH par gavage ou injection dans l'abdomen cinq jours par semaine, pendant huit à seize semaines, pour créer un modèle de vieillissement accéléré qui n'existe pas encore. Le porteur indique que le protocole peut provoquer perte de poids, chute de poils, lésions au site d'injection et altération de l'état général, et que les animaux trop atteints sont mis à mort. Il affirme que le vieillissement de l'organisme ne peut se réduire à des études in vitro et justifie ainsi le développement du modèle murin.

Objectifs

Le vieillissement est responsable de nombreuses pathologies (Cancer, diabète). De nombreux stimuli sont responsable d'un vieillissement accéléré. Plusieurs études ont montré que certains traitements médicamenteux peuvent induire des effets secondaires induisant un vieillissement accéléré. C'est le cas des antiviraux (notamment utilisées chez les patients atteints du VIH), qui en plus d'avoir des effets secondaires à court terme, accélèrent le vieillissement du sujet (niveau cardiovasculaire, osseux, ...). Toutefois aucun modèle animal de vieillissement accéléré via l'administration de ce type de molécules anti-VIH n'a alors été mis au point. Or cela permettrait de proposer des solutions thérapeutiques pour lutter contre ce vieillissement accéléré. Le but de ce protocole est (1) de mettre au point un modèle de vieillissement accéléré via l'administration d'antiviraux de type antiprotéase utilisés par les personnes atteintes notamment du VIH et (2) dans un second temps de tester des solutions pour éviter ce vieillissement accéléré. Dans cette seconde partie il y a un premier axe dans lequel l'effet de l'induction de la mort des cellules sénescentes sur le phénotype de vieillissement accéléré sera testé. Deux nouvelles molécules induisant la mort de cellules vieillissantes seront testées. Dans un second axe le rôle de gènes pro-vieillissement dans ce modèle sera testé. Cela permettrait alors de proposer des solutions thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra dans un premier temps de mettre au point un nouveau modèle de vieillissement accéléré par administration d'antiviraux anti-VIH, modèle qui n'existe pas à l'heure actuelle et qui mimera ce qui se passe chez l'Homme. Cela permettra également de tester de nouvelles molécules pour voir si elles permettent la réversion de ce vieillissement accéléré et apporter des solutions thérapeutiques à ces patients afin d'améliorer leur confort de vie. De plus l'implication potentiel de gènes pro-vieillissement dans ce modèle pourra être mise en évidence. Les bénéfices attendus sont (1) la création d'un nouveau modèle animal qui n'a pas encore développer et (2) potentiellement l'identification de solutions thérapeutiques pour palier les effets secondaires du traitement du VIH avec les antiviraux.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à différents traitements, administrés soit par gavage (1 gavage par jour, pendant 5 jours, pour une durée de protocole pouvant aller de 8 semaines à 16 semaines maximum. La durée du geste par souris est estimé au maximum à une minute à chaque gavage) soit par injection intra-péritonéale (1 injection par jour, pendant 5 jours, pour une durée de protocole pouvant aller de 8 semaines à 16 semaines maximum. Depuis l'anesthésie locale à base de pommade à la lidocaïne à l'injection en elle-même, le temps est estimé à 5 minutes par souris à chaque fois. Cette durée tient compte du temps entre la pose de la pommade et l'injection pour que l'anesthésie soit effective). Un prélèvement d'urine pourra également être réalisé lors de la mise au point du protocole. Lors de la préhension de la souris on peut récolter de l'urine dans un tube. Le temps maximum entre la prise de l'animal et l'arrêt du prélèvement d'urine est estimé à 1 minute.

Impact sur les animaux

Nous allons développer un nouveau modèle de vieillissement accéléré, et de ce fait cela peut amener des phénotypes de type perte de poids, alopésie, altération de l'état général. C'est pour cela que les animaux inclus dans ce projet seront suivi très fréquemment afin de rapidement identifier ces effets indésirables et apporter des solutions pour les atténuer, et dans le cas où cela n'est pas possible les animaux seront alors mis à mort et sortis du protocole. Des nuisances peuvent également dues à la fréquence de traitement et/ou au mode d'injection. Nous testerons l'injection intra-péritonéale avec une fréquence d'injection de 5 fois par semaine. Nous serons alors vigilant sur la possible apparition de lésion au niveau de la zone d'injection. En cas d'apparition de ce type de lésion le traitement sera stoppé pendant 3 jours, la zone sera alors traitée avec de la Vétédine. En cas d'amélioration le traitement sera repris. En absence d'amélioration l'animal sera mis à mort. Pour palier à l'apparition de lésion au niveau du site d'injection nous chercherons à alterner tous les jours les sites d'injection. Il faut également noter que notre équipe a une expérience importante sur le suivi du vieillissement des animaux, que ce soit du vieillissement "physiologique" ou bien du vieillissement induit par un stress métabolique. Cela permettra une très bonne prise en charge des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes d'intérêt et réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

La sénescence à l'échelle de la cellule peut être bien étudiée via des modèles in vitro. Ainsi des études préliminaires in vitro ont été réalisées en traitant des cellules primaires humaines de type fibroblastiques ou épithéliales avec des antiprotéases, à savoir le mélange Atazanavir et ritonavir (noté ATV/r). Nous avons alors pu montrer l'entrée en sénescence de ces cellules via les tests classiques comme la mise en évidence de l'activité de la Béta-Galactosidase à pH 6 (coloration bleue) dans les cellules sénescentes, l'arrêt de prolifération (comptage cellulaire), la forme des cellules, l'expression de marqueurs de sénescences comme p16, p21 par qRT-PCR et également la sécrétion de molécules dans le milieu de culture (dosage ELISA), spécifique des cellules sénescentes. Le vieillissement au niveau d'un organisme, qu'il soit du à l'âge ou à l'exposition à différents stress comme un stress métabolique, un stress chimique (ingestion de molécules ayant un effet à long terme), est le résultat d'un processus complexe. Son étude ne pouvant malheureusement pas se résumer à des études in vitro et être modélisé, elle nécessite donc l'utilisation de modèles animaux, comme le modèle murin, dans lesquels l'impact global pourra être visualisé. C'est pour cela que nous avons choisi de développer le modèle murin qui est l'objet de ce protocole expérimental.

Réduction

Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans ce protocole la mise au point du modèle (procédure 1) sera réalisée séquentiellement. Plusieurs voies d'administration, plusieurs doses, deux temps seront testés. Si les premiers tests se révèlent concluant toutes les conditions ne seront pas testées. De plus si la procédure 1 ne permet pas de mettre au point le modèle de vieillissement accéléré alors les procédures 2 et 3 ne seront pas réalisées. C'est pour cela que c'est le nombre maximal d'animaux qui est donné et le nombre d'animaux réellement utilisés pourra être inférieur. Dans la procédure 1 la mise au point du modèle ne nécessite pas d'étude statistique, c'est pour cela qu'il y aura 5 souris par groupe. Dans les procédures 2 et 3 des tests statistiques seront réalisés, c'est pour cela qu'il y a 10 souris par groupe. Enfin pour visualiser l'effet sexe des mâles et des femelles seront utilisées. Cela permettra d'éviter de relancer d'autres protocoles pour vérifier le biais lié au sexe et cela renforcera l'analyse statistique de cette étude.

Raffinement

La grande expérience des équipes qui gèrent les protocoles de vieillissement est un gage quant à la garantie du suivi du bien-être animal. Une surveillance adaptée et individuelle des animauix afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance est mise en place. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (traitement antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. En cas de traitement avec un antalgique de la brupénorphine à la dose de 0,05 mg/Kg sera administrée quotidiennement, pendant 3 jours. En absence d'amélioration après 3 jours de traitement l'animal concerné sera mis à mort. Pour les injections intra-péritonéales, pour éviter le stress d'une anesthésie générale à l'animal, une anesthésie locale du site d'injection avec une pommade à base de lidocaïne quelques secondes avant l'injection sera réalisée. Pour éviter également d'injecter plusieurs jours de suite au même niveau sur l'abdomen de la souris le site d'injection sera modifié tous les jours en alternant entre le haut et le bas de l'abdomen et entre le côté droit et le côté gauche de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans les modèles de vieillissement induit par des stress comme le stress métabolique notamment. En effet on peut alors voir l'impact de ce vieillissement au niveau des différents organes de la souris. De plus la souris est un modèle de prédilection dans la réalisation de modèle transgénique avec notamment la perte d'expression de nombreux gènes. Nous pourrons alors utiliser ces modèles transgéniques au sein de notre protocole de vieillissement accéléré et valider ou non l'implication de gènes d'intérêt dans le phénotype observé. Les expérimentations seront réalisées chez des souris adultes d'environ 5 mois. Chez l'Homme les observations initiales à l'origine de notre protocole ont été faites avec des patients âgés en moyenne de 30 à 40 ans. De plus à 5 mois la prise de poids des souris n'est plus très importante, ce qui permet d'avoir un poids plus stable en début d'expérimentation. Cela sera plus simple pour évaluer la perte de poids en cas de douleur chez la souris. Enfin ces animaux auront atteint la maturité, notamment au niveau du système immunitaire et hormonal.

100 chèvres vont être utilisées, réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant sous-cutané et une injection de lipopolysaccharide dans la jugulaire pour déclencher une inflammation qui imite une mammite, avec une fièvre attendue d'environ deux degrés, suivie de onze prises de sang. Le porteur relie ces travaux à la "capacité d'adaptation" dégradée par la sélection sur la production et vise à terme des animaux "plus résilients, productifs et en bonne santé". Il affirme que la réponse inflammatoire du ruminant ne peut être étudiée qu'in vivo.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer les capacités d’adaptation des chèvres à une épreuve inflammatoire, en lien avec leur génotype. Dans le cadre du projet nous produisons et utilisons des chèvres laitières de race Alpine, issues d’une sélection divergente sur le caractère de longévité fonctionnelle (chèvres de génotype Longévité élevée (LGV+) et chèvres de génotype Longévité faible (LGV-). L'ensemble des chèvres est génotypé et caractérisé sur des caractères de croissance, de métabolisme énergétique, de production de lait, de santé et de réponse à des épreuves nutritionnelles afin de mieux comprendre les déterminants de la capacité d'adaptation des chèvres à une épreuve transitoire nutritionnelle. Dans cet avenant, nous proposons de réaliser une épreuve inflammatoire transitoire sur un sous ensemble de 2 groupes chèvres LGV+ et LGV- de ce dispositif afin d’élargir le concept d’adaptation à la réponse anti-infectieuse en relation avec le génotype. En effet, la santé des animaux d’élevage fait partie intégrante de leur capacité d’adaptation et de leur bien-être. Les mammites, en particulier, représentent la maladie infectieuse majeure chez les ruminants laitiers. Pour ce faire, nous proposons une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite afin de doser les cytokines circulantes et caractériser la cinétique de réponse suite à cette stimulation.

Bénéfices attendus

La capacité d'adaptation est une caractéristique qui a été dégradée, chez les animaux de rente, par la sélection pour des niveaux de production élevés. Ce qui a eu des conséquences négatives sur la santé, la reproduction, et la longévité de ces animaux et par conséquent a impacté l'efficacité de production. Les causes du déclin de la capacité d'adaptation sont majoritairement inconnues. La capacité d'adaptation d'un animal est due à des mécanismes adaptatifs opérant à différents niveaux d'organisation physiologique. Ils sont en partie sous le contrôle des conditions d’élevage et de nutrition, du statut physiologique de l’animal, mais aussi de son patrimoine génétique. Nous savons, en particulier, que la longévité fonctionnelle, qui traduit des mécanismes d’adaptation des adultes, est partiellement contrôlé par la génétique. Ce projet doit permettre de mieux comprendre le rôle de la génétique sur les capacités d'adaptation des chèvres adultes. A court terme (durée du projet), il doit permettre de valider l’utilisation d’un ensemble de cytokines sanguines pour caractériser la résilience de la chèvre, dans le cadre d’une épreuve in vivo par du LPS (mimant une mammite). Si cette étape est concluante, cela permettra de tester une procédure équivalente, in vitro, à partir de simples prélèvements sanguins (sans épreuve LPS). A plus long terme, ce phénotypage pourra être utilisé, le cas échéant, pour sélèctionner des animaux plus résilients, productifs et en bonne santé, afin de garantir la durabilité de l’élevage caprin.

Procédures

Les animaux seront soumis à la pose d’un implant sous cutané après contention pour la mesure de la température interne de l’animal. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Utilisation d’une seringue à usage unique qui contient l’implant à injecter (de la grosseur d’un grain de riz). Ensuite les chèvres se verront injecter des lipopolysaccharide (LPS : Escherichia coli ultrapur) réalisée au niveau du cou dans la veine jugulaire. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Enfin des prélèvements de sang seront effectués à l’aide d’une aiguille montée sur un prolongateur à partir de ponctions à la veine jugulaire. Pour la collecte de 11 tubes (volumes de 4ml) maximum pour chacune des 100 chèvres du projet : 1 prélèvement de 4 ml toutes les deux heures avant l’épreuve (J-1), puis toutes les deux heures entre l’injection de LPS et jusqu’à 12h, et ensuite une fois par jour jusqu’à 72heures. Soit un volume total inférieur à 50mL correspondant à moins de 1% du volume sanguin total de l’animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang et la pose d’un implant sous cutané pour le suivi de la température. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang et la pose de l’implant. Une douleur et une inflammation transitoires peuvent apparaitre lors de la pose des implants sous cutanés. Une eventuelle nuisance serait l'apparition d'hematome suite aux prises de sang. Par ailleurs, nous proposons dans ce projet une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite, s. Dans une expérience préalable réalisée sur un petit effectif, l’injection par voie générale (0,5 µg/kg poids vif), de LPS a permis de déclencher une réaction inflammatoire des chèvres qui s'est accompagnée d’une élévation de température réctale moyenne de +1,9°C entre +3 et +6 heures après l'épreuve. Le retour à l’état normal (température et fréquence respiratoire) s’observe entre 12 et 48 heures après l’injection. Ainsi il est attendu que les chèvres impliquées dans cette procédure auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Les nuisances eventuellles en lien avec l'injection de LPS pourraient être une fièvre >40°C, un décubitus prolongé, une perte de poids et efin impliquer une prostration, une cachexie ou alopecie.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Dans le cas, peu probable, d’atteinte des points limites, la mise à mort sera opérée par le vétérinaire sanitaire soit en urgence par un opérateur expérimenté et habilité de la structure, à l’aide d’un matador et suivi d’une saignée. Les animaux pourront être réutilisés selon l’avis du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

La réponse anti inflammatoire du ruminant laitier implique des modifications biologiques complexes, qui incluent également leur impact sur la production de lait et le métabolisme énergétique qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Le nombre d’individus a été défini afin de pouvoir évaluer la réponse à l’épreuve inflammatoire en interaction avec le génotype de la chèvre. Dans l'esprit des 3R, nous avions proposé initialement d’évaluer 80 chèvres primipares, car les données d’héritabilité (h²) des réponses immunitaires etaient élevées dans la littérature . Ces heritabilités sont en moyenne plus de 3 fois supérieures à celle de la longévité (h²=0.08 en race Alpine). Les analyses préliminaires (n = 96 chèvres des cohortes 1 et 2) du projet ont montré que le Beta Hydroxy Butyrate plasmatique du sang discrimine les génotypes longévité. Toutefois, une étude récente dans l’espèce bovine, utilisant le dosage de cytokines après stimulation par LPS montre des héritabilités plus faibles (0.07 à 0.15 dans de nombreux cas, et aucune h²>0.15). Ainsi, afin d’atteindre la puissance statistique espérée, nous proposons donc d’augmenter l’effectif total de 20 chèvres, soit 100 chèvres évaluées au total.

Raffinement

Les chèvres seront hébergées en groupe, sur litière paillée. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention manuelle minimale, les animaux étant habitués à être manipulés par les opérateurs de la structure. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance accrue pendant toute la durée du protocole, selon une grille permettant d’évaluer la température, le poids, le comportement alimentaire, l’anorexie, la présence d’un décubitus latéral et l’apparition de comportements anormaux. Un score sera donné par animal et si il est superieur à 2 alors il est sorti de l'experimentation. La mise en place des implants sous cutané pour le suivi de la température sera réalisée par des opérateurs expérimentés et habilités (animaliers), qui côtoient ces animaux quotidiennement. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant sera appliqué en massage sur la zone concernée après mise en place de l’implant. Ces implants permettent donc de relever automatiquement la température et de supprimer les prises de température par voie transrectale. Un traitement en cas d'hyperthermie prolongée est administré. En cas de non recouvrement de l'etat , une euthanasie sera realisée.

Choix des espèces

L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse immunitaire des ruminants sont particulières à ces espèces. Le choix est d'étudier des chèvres primipares non gestantes en lactation.

1 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent des régimes gras ou déficients pendant une à seize semaines, des prélèvements répétés, un gavage ou une injection, pour étudier une protéine des macrophages dans l'obésité et le diabète de type 2. Le porteur indique que les souris privées de la protéine peuvent développer des lésions cutanées et que celles au régime déficient sont surveillées pour ne pas dépasser 20 % de perte de poids. Il conclut que les cultures cellulaires ne donnent pas un modèle physiologique d'obésité et que la souris est "nécessaire", en vue d'une éventuelle approche thérapeutique chez l'humain.

Objectifs

Le diabète ainsi que l’accumulation de graisse dans un organisme peuvent provoquer une cascade de réactions immunitaires. Ces dernières sont connues comme étant déterminantes dans la survenue d’un diabète de type 2 et les nombreuses complications associées à cette maladie. Les mécanismes impliqués commencent à être connus. Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un modulateur du système immunitaire susceptible d’être impliqué.

Bénéfices attendus

Nous devrions démontrer l'importance de ce modulateur dans la maladie du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences que pourrait provoquer l'absence de cette protéine, uniquement dans les macrophages, et donc de comprendre son rôle dans l’inflammation et la régulation du glucose chez des souris. A terme, influencer l'activité de cette protéine pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique chez l'Homme pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2 et de stéatose hépatique.

Procédures

Selon les groupes, les animaux seront soumis à différents types d'alimentation sur des durées comprises entre 1 et 16 semaines et à des prélèvements répétés (entre 2 et 9 prélèvements par souris) espacés de 2 semaines et qui durent chacun 30 secondes. En fin d’expérience, les animaux subiront une mise à jeun de 16h ou 6h et un gavage ou une injection (10 secondes chacun) suivi de 6 prélèvements de sang. Un groupe d’animaux recevra l’injection d’une molécule pour pouvoir accumuler et récupérer les cellules d’intérêts pour le projet. Cette injection aura lieu une seule fois et durera 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux ne possédant pas la protéine étudiée (uniquement dans les macrophages) peuvent être amenés à développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Pour cette raison aucun animal ne sera étudié au delà de l'âge de 6 mois, de cette façon nous évitons l'apparition éventuelle de ces plaies. Les animaux placés sous régimes enrichis en lipides vont prendre du poids tout au long des semaines de régime et vont devenir un peu moins actifs. Les souris placées sous régime décifient vont perdre du poids, elles seront surveillées de près pour ne pas qu'elles dépassent une perte de poids de 20%.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur procédure afin de prélever différents organes pour les analyser. Nous pourrons ainsi étudier les altérations du foie, des tissus graisseux, et du pancréas par différentes techniques permettant des observations précises au niveau cellulaire, génomique ou protéique et ce afin de bien décrire le processus de la maladie et notamment le rôle de la protéine que nous étudions.

Remplacement

Ce sont des études in vitro, elles même appuyées sur des données issues de cohortes de patients, qui ont déterminé le choix de cette protéine à étudier. Cependant, les études in vitro seules, comme les cultures cellulaires, ne permettent pas d'obtenir un modèle physiologique d'obésité, d'homéostasie glucidique et de stéatose hépatique. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour évaluer in vivo l’effet de l'absence de notre protéine d'intérêt au niveau des macrophages, mais également pour définir la réponse globale d’un animal face à la maladie (obésité, diabète, athérosclérose, stéatose hépathique modérée ou majeure).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est de 1430. Afin de limiter le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé́ des protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple l'évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline successivement. De plus afin de réduire le nombre d'animaux, le groupe contrôle (régime non enrichi ou déficient) servira de comparaison aux cinq types d'alimentation. Pour chaque condition (type d'alimentation et durée), des groupes de 80 souris seront générés (40 qui possèdent la protéine étudiée et 40 qui n'en possèdent pas dans les macrophages), il s'agit du nombre minimal d'individus nécessaire pour analyser correctement les résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés sur des portoirs ventilés et ont un accès libre et illimité à l'eau et la nourriture. Les conditions de température et d'humidité sont contrôlées et monitorées tous les jours pour qu'elles soient optimales pour les souris. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h), les souris étant des animaux nocturnes une période importante d'obscurité est indispensable à leur bien-être. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum, en effet la souris est un animal grégaire, la vie en groupe est un facteur important pour son bien-être. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du confort des souris, elles bénéficieront de coton et de «maisons» afin de les occuper et qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l'équipe professionnelle de zootechnie. En ce qui concerne les procédures expérimentales nous avons mis en place des fiches de suivi permettant la prise en compte de différents facteurs visibles chez l'animal révélant son bien-être (évolution du poids, comportement, aspect physique). Nous avons également veillé à ce que le matériel soit adapté pour les prélèvement ou l'administration. Nous avons également mis en place des mesures en vue de réduire au maximum les douleurs pouvant être dues aux prélèvements (mise sous anesthésie ou application d'une solution antiseptique).

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète, en effet les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète (dont les gènes de l'inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés sont très proches chez la souris et chez l’Homme. De plus la souris est un modèle permettant l'obtention relativement rapide du nombre d'individus suffisant et que nous sommes en capacité d'héberger dans des conditions (surface, température, luminosité) nécessaires à son bien-être. La souris est également un modèle pour lequel il existe beaucoup d’outils disponibles : modification du génome pour créer les meilleurs modèles d'études possible, méthodes n'analyses des tissus prélevés, etc. L'ensemble de ces critères font de la souris le modèle optimal pour répondre aux questions du présent projet. Nous avons choisi de commencer les études sur des souris qui ont entre 8 et 10 semaines. Cela correspond à la maturité sexuelle (stabilisation hormonale) et équivaut à l'entrée dans l'âge adulte chez l'Homme.