Recherche fondamentale

540 poissons, des raies et des requins de six espèces, vont être capturés puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont marqués sous anesthésie par un émetteur acoustique, inséré dans la cavité péritonéale par incision chez les roussettes et les requins taupes, ou fixé par perçage de la nageoire chez les raies, pour suivre leurs déplacements autour des parcs éoliens en mer. Le porteur indique que le marquage peut occasionner des mortalités directes ou indirectes, qu'il présente comme rares, et que les individus sont remis à l'eau à l'endroit de leur capture. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour étudier les mouvements en milieu naturel.

Objectifs

Le développement des parcs éoliens en mer est aujourd’hui en plein essor. Ces infrastructures génèrent des modifications de l’habitat au sein des écosystèmes marins ayant un impact potentiel sur la biodiversité. Ils peuvent agir comme des récifs artificiels pour certaines communautés de poissons avec des espèces présentant une forte résidence pour ces milieux. De plus, les câbles électriques sous-marins qui relient les éoliennes entre-elles et raccordent le parc éolien à la côte, peuvent générer des champs électromagnétiques et affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles, tel que les requins et raies. La croissance de l’éolien en mer risque d’amplifier ces effets, mais les conséquences sur les communautés ichtyologiques restent peu connues. Ce projet de 3 ans, vise à identifier et évaluer les effets des parcs éoliens en mer et leur raccordement sur les peuplements de raies et requins, espèces peu étudiées et à fort enjeu de conservation. Pour cela, ce projet se base sur l’utilisation de la télémétrie acoustique comme méthode de suivi, qui consiste à équiper un animal d’un émetteur acoustique (tag) émettant un signal sonore unique détecté par des hydrophones (récepteurs) placés dans les milieux ce qui permet d’étudier les déplacements et les comportements des individus dans le temps et l’espace. Cela permet de déterminer différents processus écologiques, notamment comment une espèce connecte et utilise les habitats, information essentielle pour mieux comprendre son rôle dans l’écosystème, ainsi que l’effet d’une modification d’habitat comme l’implantation d’un parc éolien en mer. Le projet a pour objectif d’étudier le comportement de raies et requins sur des zones de parc éolien en mer à différent stades de développement (pré-construction à exploitation). Ainsi, 6 espèces seront équipées de tags acoustiques : La raie brunette Raja undulata, la raie bouclée Raja clavata, la petite roussette Scyliorhinus canicula, la grande roussette Scyliorhinus stellaris, l’émissole tachetée Mustelus asterias et le requin taupe commun Lamna nasus. Les individus marqués seront suivis sur différents sites et habitats grâce à des récepteurs placés au sein des parcs éoliens et habitats côtiers. Ce projet servira à évaluer l’effet des parcs éoliens en mer sur le comportement de ces communautés et ainsi permettre de proposer des mesures d’amélioration pour la conservation de ces espèces et le développement des parcs éoliens offshores.

Bénéfices attendus

L’implantation d’un parc éolien en mer entraine des modifications d’habitats. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie des espèces suivies et ainsi répondre à différentes questions telles que : comment ces espèces réagissent-elles à des champs électromagnétiques générés par un câble sous-marin ? Quels sont les profils d’occurrence des espèces à enjeux de conservation dans la zone de parc éolien en mer ? Quel est le degré de connectivité entre les parcs éoliens en mer et les autres habitats marins pour ces espèces? Les individus font-ils preuve d’une fidélité pluriannuelle au site ? Comment les conditions environnementales influencent-elles ces tendances ? Il existe très peu de connaissances à ce sujet sur les raies et les requins. Ces connaissances relatives à l'écologie du mouvement de ces espèces, que le marquage en milieu naturel rend possible, serviront de cas concrets pour la mise en place de suivis pérennes des populations au sein des parcs éoliens en mer afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général.

Procédures

Les petites roussettes, les grandes roussettes et les émissoles tachetées seront marquées chirurgicalement sous anesthésie générale. L'acte d'insertion de la marque acoustique (13mm de diamètre) dans la cavité́ péritonéale est relativement simple et parfaitement maitrisé par les applicateurs du projet. Seule la paroi musculaire de l’individu à marquer est ouverte pour l’insertion de la marque, aucun organe interne autre que la peau et les muscles n'est impacté par cette incision. L'incision est ensuite suturée avec du fil résorbable qui disparait en 3 à 4 semaines. L'acte de chirurgie en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les raies seront marquées sous anesthésie générale pour la pose d’un émetteur externe de 13 mm de diamètre sur la nageoire pectorale de l’individu. Deux aiguilles de 3mm de diamètres perceront la nageoire de la raie pour fixer l’émetteur. Des études précédentes ont montré que ce type de marquage n’altéré pas la nage de l’individu et son comportement. L’acte de pose de l’émetteur en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les requins taupes seront marqués chirurgicalement sous anesthésie locale afin de limiter le temps de la procédure et le stress de l’individu comme il est conseillé par de nombreuses études sur les requins de grande taille (>2m). L'acte d'insertion de la marque acoustique (16mm de diamètre) dans la cavité́ péritonéale est relativement simple et parfaitement maitrisé par les applicateurs du projet. Seule la paroi musculaire de l’individu à marquer est ouverte, aucun organe interne autre que la peau et les muscles n'est impacté par cette incision. L'incision est ensuite suturée avec du fil résorbable qui disparait en 3 à 4 semaines. L'acte de chirurgie en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les individus seront relâchés dans la zone de capture le plus rapidement possible.

Impact sur les animaux

Au niveau individuel, cette étude nécessite un marquage (chirurgical pour les requins, externe pour les raies). Même si cela reste rare, ces procédures peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes. Aucun autre effet du marquage n’est à signaler.

Devenir

Tous les animaux marqués seront replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leur capture.

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser les mouvements individuels en milieu naturel, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. L’apport de la télémétrie acoustique (détection de la présence de poissons marqués à proximité d’un récepteur) devrait permettre l’amélioration de connaissance sur les habitats occupés par les espèces et de leurs mouvements. Pour atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines, l’évaluation de l’état écologique des écosystèmes marins doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie du mouvement des espèces et à la fréquentation des habitats essentiels, que le marquage en milieu naturel rend possible.

Réduction

Le nombre d’individu a été réduit au minimum d’après les préconisations de la littérature pour la télémétrie acoustique. Des tests de puissance préalables ont été́ effectués permettant d'estimer la taille de l'échantillon nécessaire pour confirmer ou infirmer les hypothèses de manière significative. Le fait de marquer 30 individus par espèce et par site, permet la réalisation d’analyses statistiques fiables et robustes permettant d’extrapoler à la population. Ainsi, le comportement des individus et des espèces analysées permettra de refléter un comportement global de la population et ainsi d’évaluer les effets des parcs éoliens sur le comportement de ces espèces.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors du marquage, incluant la capture (engins sélectifs en direct, l’hameçon ou traits de chalut courts), pour limiter au maximum le temps où l’animal est en phase « capture », ainsi que des procédures d’anesthésie optimales durant les phases pré opératoire, opératoire et post opératoire. Le protocole de pêche seront adaptés pour être les moins traumatisants avec notamment la sélection d’hameçons spécifiques et un personnel spécialement formé à ce type de capture. Les individus seront surveillés de manière régulière durant toute la période de détention. Lors de leur manipulation, en plus de l’utilisation d’anesthésiant, les individus seront placés en immobilité tonique afin de limiter le stress et la douleur. Un analgésique sera aussi utilisé conjointement. Les individus seront remis à l’eau le plus rapidement possible (quelque heures maximum). Après implantation, les individus ayant subi une anesthésie générale sont gardés en bassin de réveil et surveillé individuellement au moins 30min. Aucune remise à l’eau ne sera faite avant que l’animal ait retrouvé tous ses réflexes et sa mobilité. Aucune sortie de l’eau sans anesthésie ne sera effectuée de manière prolongée (supérieur à quelques secondes). Lors des sorties de l’eau pour chirurgie, les poissons resteront en permanence en milieu humide (dos dans l’eau, flux d’eau dans la bouche). Les individus seront retirés de la procédure si les points limites préalablement établis sont atteints. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale, absence de réaction) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). La taille et le poids des marques pour chaque espèce sont choisies bien en dessous des critères normalement appliqués (>2% du poids des individus).

Choix des espèces

Les raies et les requins sont des espèces présentes dans les zones d’étude où se situent potentiellement des habitats essentiels pour ces poissons (ex. zone de reproduction, aire de nourrissage). Ces espèces électrosensibles sont aussi susceptibles d’être impactées par les champs électromagnétiques générés par les câbles sous-marins des parc éolien en mer. L’ensemble de ces espèces sont présentes sur les différents sites d’étude et présente des degré de mobilité diffèrent (territoriale/résidentes à fortement migratrice). Les espèces sélectionnées sont exploités ou présentes dans les pêcheries et sont considérées comme robuste avec une capacité de récupération rapide. La méconnaissance sur l’écologie de ces espèces limite notre capacité d’évaluation de leur statut de conservation. Il est important de les étudier en milieu naturel afin d’apporter les connaissances nécessaires permettant d’établir le statu des populations et leur vulnérabilité face aux pressions des activités humaines. Seules les adultes de chaque espèce seront marqués car leurs conditions physiologiques sont jugées plus robuste que le stade juvénile.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie génétique liée au gène Bin1, elles subissent des injections dans le muscle ou l'abdomen, des mesures répétées de force musculaire sous anesthésie et des tests de suspension, pour tester une thérapie génique. Le porteur affirme n'attendre aucune douleur liée au phénotype et décrit une atrophie musculaire légère, tout en précisant que les souris sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et que la maladie deviendrait sévère si elles étaient gardées vivantes. Il conclut que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et juge le modèle murin "essentiel".

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Procédures

Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein ou du poumon, puis un traitement par gavage pendant trois à six semaines, pour comparer un dosage adaptatif des anticancéreux au dosage maximal habituel. Le porteur indique que la greffe provoque une douleur modérée sous anesthésie et que la tumeur sera limitée à 2 000 mm3, toutes les souris étant tuées pour analyser les cellules tumorales. Il affirme avoir déjà travaillé sur cellules en culture et par modélisation mathématique, mais juge le passage à l'animal nécessaire pour reproduire la formation des tumeurs.

Objectifs

Le cancer du sein est la première cause de mortalité des femmes par cancer en France, avec plus de 12.000 décès par an. Chez l’homme, le cancer du poumon est le plus mortel avec > 22.000 décès / an. L’échec thérapeutique dans les deux cancers est causé par le développement d’une résistance cellulaire aux drogues. L'approche conventionnelle d'administration d'anti-cancéreux consiste à donner les Doses Maximales de drogues Tolérées par les patients (MTD). Toutefois, en raison du grand nombre de cellules cancéreuses et de leur hétérogenéité, cela conduit inévitablement à une sélection de cellules qui sont adaptées pour résister aux traitements, et qui sont responsables des rechutes. Cette sélection des cellules résistantes par les thérapies est un problème d’écologie, et les écologistes ont conclu que le meilleur moyen de limiter les effets néfastes des éléments nuisibles est de les contrôler plutôt que de tenter de les éradiquer. Transposé au cancer, cela consisterait à appliquer des régimes adaptatifs de drogues où l'on diminue la dose si la charge tumorale diminue. Cela permettrait de maintenir une compétition cellulaire entre cellules sensibles aux traitements et cellules résistantes, tout en limitant les effets secondaires des drogues. Bien que cette "Thérapie Adaptative" (AT) connait déjà des succès dans la clinique, les paramètres essentiels pour l’implémenter, et les mécanismes cellulaires et moléculaires en jeu, restent inconnues. Nous avons récemment montré par une combinaison de modélisation mathématique et d'expériences à partir de cellules cancéreuses en culture, que la compétition entre cellules sensibles et résistantes est réelle et détermine l’efficacité de l’AT. Dans nos expériences, des régimes avec des faibles doses de drogues contrôlaient mieux la croissance des cellules cancéreuses dans le temps que des doses plus élevées, tout en évitant l'apparition de cellules résistantes. Ces expériences sont publiées dans une revue internationale. Comme il s'agit d'utilisation exclusive de cellules en culture, notre stratégie est conforme à la première règle des 3R (remplacement). Cependant, il est important de maintenant procéder aux expériences chez l’animal pour mieux reproduire la tumorigénèse, afin de mieux comprendre comment implémenter l’AT chez l’homme. Le but de ce projet est de tester les avantages et mécanismes de l'AT in vivo chez la souris dans des modèles cliniquement relevants de cancers du sein et du poumon.

Bénéfices attendus

La réussite de ce projet serait d'une importance majeure, car il permettrait d'envisager des essais cliniques avec des drogues déjà autorisées mais jusqu'à présent inefficaces pour lutter contre la résistance. Les avantages de l'AT seraient un gain de temps de survie des patients et la diminution des effets secondaires. L’AT est potentiellement applicable à n'importe quel cancer et n'importe quelle drogue.

Procédures

Greffes de cellules cancéreuses une fois, et traîtement avec des inhibiteurs de kinases par gavage orale une fois par jour pendant 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales chez la souris engendrait une douleur modérée mais sera réalisée sur souris anaesthésiées. La croissance des tumeurs sera limitée à une taille maximale de 2000mm3, ce qui n'engendre pas de douleur. L'application des drogues par le gavage des animaux implique une nuisance transitoire mas pas de souffrance sévère ni durable. Les drogues utilisées n'ont pas d'effets secondaires chez la souris aux doses utilisées.

Devenir

L'intégralité des animaux sera mise à mort pour éviter de dévélopper des souffrances et pour permettre l'analyse des cellules cancéreuses des tumeurs.

Remplacement

Nous avons déjà analysé in vitro des paramètres relevants des cellules de cancer mammaire (4T1) et du poumon (PC9) sensibles ou résistants aux drogues, et avons également réalisé la modélisation mathématique de ces données. L'ensemble de ces études nous a permis d'identifier et préselectionner les conditions d'intérêt. Mais il n'existe pas d'approches, autre que l'expérimentation in vivo chez l'animal, pour évaluer l'efficacité des différents régimes de drogues sur la diminution de la progression tumorale et de la résistance.

Réduction

Nous avons conçu les expériences pour utiliser le minimum d'animaux permettant de tirer des conclusions statistiquement robustes. Dans chaque expérience, nous comparerons la progression tumorale dans les souris nude entre deux groupes. Chaque expérience prévoit l'utilisation de 10 souris dans le bras AT et 10 dans le bras MTD, à répéter une fois si les résultats sont prometteurs. Ceci donne lieu à 80% puissance pour détecter un effet de différence de 10% avec une confiance p

Raffinement

Les expériences sont conçues pour éviter la souffrance des animaux, selon la règle 3R (raffinement): par exemple en arrêtant les expériences avant les signes de souffrance et en surveillant quotidiennement les animaux pour les points limites correspondant à des signes de souffrance. Les conditions d'hébergements sont les suivantes: 5 animaux par cages (501 cm2) avec pour litière un mélange de sciure de peuplier et de copeaux de peuplier

Choix des espèces

Les modèles choisis (greffe sous cutanées dans des souris nude) sont cliniquement relevants, ayant conduit à des essais cliniques qui ont permi l'approbation des drogues utilisées chez les patients. 8 semaines : il faut des souris adultes jeunes et du même stade pour les expériences de tumorigénèse afin de réduire la variance et diminuer le nombre d'animaux utilisés.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique, une forme agrégée d'alpha-synucléine qui déclenche une maladie proche de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que cette inoculation conduirait de toute façon à la mort par paralysie progressive, et que les souris sont tuées dès l'apparition d'une démarche saccadée et de troubles de l'équilibre, avant la paralysie du train arrière. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de remplacer l'expérimentation animale pour décrire l'extension de ces lésions.

Objectifs

Le projet vise à caractériser la maladie chez la souris génétiquement modifiée M83 après injection dans le cerveau d’une forme particulière d’alpha-synucléine agrégée, non détéctable par les méthodes de laboratoire jusqu'à présent utilisées. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines assocciées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy , atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées chez les souris.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 40 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux conduits jusqu’au stade clinique sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, homozygotes et hémizygotes. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d'incubation de la maladie, de la distribution des lésions dans les différentes régions du cerveau et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle transgénique.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation stéréotaxique des fibrilles dans le striatum, qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques Townes développent une drépanocytose avec anémie et atteintes du foie, des reins et de la rate, et reçoivent des candidats médicaments ainsi que des prélèvements de sang répétés au sinus de l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que la complexité de la maladie impose d'en faire la preuve dans un "organisme intégré" et que le remplacement total par la culture cellulaire est impossible.

Objectifs

Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose, une forme grave d’hémoglobinopathie à transmission autosomique récessive touchant le gène codant pour l’hémoglobine. La drépanocytose se caractérise par une altération de la forme native du globule rouge suite à la formation de polymères d’hémoglobine S mutée. Elle se manifeste des crises vaso-occlusives récurrentes et douloureuses ainsi que par une anémie hémolytique notamment dues à une inflammation vasculaire et un stress oxydant chroniques. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères et multifocaux subséquents rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. Il est donc nécessaire de continuer de développer des médicaments ciblant mieux les mécanismes d'action de la pathologie. Pour cela nous devons évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques pour mieux traiter la drépanocytose. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules sur la physiopathologie de la drépanocytose dans un modèle murin transgénique développant la maladie. Dans ce contexte, nous évaluerons l'impact des molécules à tester sur l'érythropoièse, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'hématocrite, la falciformation des globules rouges, ou encore le dosage de l'hémoglobine. L’utilisation de la souris se fera en accord avec la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer). Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des souris seront mis en place dans chaque procédure afin de veiller à leur bien-être. Une étude préliminaire pilote permettra de s’assurer de la faisabilité des mesures des paramètres listés ci-dessus et sera suivie d’études principales dont l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de futurs candidats médicaments, seuls ou en combinaison avec l’hydroxyurée. Ce projet de recherche nécessitera au total 380 souris sur 3 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, l’hydroxyurée. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression de la drépanocytose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au sinus rétro-orbital, sous anesthésie isoflurane 3% et suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Dans l'étude principale, les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration dépendra de la demande du sponsor (détails dans le rubrique Procédure 2). Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, un prélevement en point final de sang sera effectué au sinus rétro-orbital. Puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.

Impact sur les animaux

Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique ainsi qu'une augmentation de l'érythropoïèse. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester, en les comparant et ou les combinant au traitement de référence, l’hydroxyurée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet du composé testé sur la physiopathologie de la drépanocytose.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire pilote permettra de valider les paramètres à évaluer avant d'administrer les composés à tester dans l'étude principale et de confirmer la robustesse du modèle, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité du modèle transgénique Townes.

Raffinement

Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement. et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur la physiopathologie de la drépanocytose. La souris a été choisie car le modèle Townes a été développé afin de reproduire au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront 7-8 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, puis elles subissent des prélèvements de sang hebdomadaires à la queue et des explorations auditives sous anesthésie, par otoémissions acoustiques et potentiels évoqués, pour mesurer l'atteinte de l'audition. Le porteur indique qu'une souris perdant plus de 20 % de son poids ou montrant un mal-être sera tuée, et que toutes seront tuées en fin d'étude pour prélever les os de l'oreille. Il affirme que ces tests fonctionnels sur l'audition ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche CBA/J Rj (ayant une fonction auditive stable sur près de 2 ans).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives sont effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie de tous les animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez deux souches de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la STZ fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris CBA/J Rj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. Les explorations fonctionnelles seront effectuées sous anesthésie gazeuse. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, -une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence au document « points limites » (The reporting of clinical signs in laboratory animals), tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2. Les animaux seront habitués à la zone d’expérimentation et aux expérimentateurs la semaine suivant leurs arrivées avant la réalisation des tests et des injections. C’est une procédure habituelle avant toute expérmentation.

Choix des espèces

La souris de souche CBA/J Rj est connue pour posséder une fonction auditive stable sur près de 2 ans. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de tumeurs murines ou humaines, sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine MIF dans la réponse à l'immunothérapie anticancéreuse. Le porteur indique que la croissance tumorale sera limitée à 300 mm2 pour les tumeurs solides et que les animaux seront tués lorsque les points limites seront atteints, celles qui n'y parviennent pas étant considérées comme "protégées" et tuées elles aussi. Il justifie le recours à la souris par l'impossibilité de reproduire fidèlement l'environnement tumoral et par l'accès aux modèles transgéniques et humanisés.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur l’inhibition des points de contrôle immunitaires qui permet d’activer le système immunitaire et sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Ce projet est dans la continuité de nos études précédentes au cours desquelles nous avons montré que l’une protéine du système immunitaire, appelée MIF, peut contrôler les réponses anticancéreuses de type immunitaire du patient. Ce projet comporte deux parties : 1) Évaluation de la qualité du système immunitaire dans un contexte d’immunothérapie bloquant les immuno-checkpoints chez des souris avec une expression plus ou moins forte de MIF. 2) Étude de l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient donner des informations pour améliorer les immunothérapies en cancer.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a par objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant l’effet bénéfique de MIF dans l’activité des cellules T . Nos résultats ont démontré que la cytokine pro-inflammatoire MIF est essentielle pour la réponse à l’immunothérapie anti-PD-1 et l’immunothérapie par transfert adoptif en cancer. Nous avons aussi montré que cette réponse est potentiellement dépendante de l’expression élevée de MIF et que la basse expression de MIF pourrait avoir un effet délétère. Nous avons des agents thérapeutiques qui peuvent reverser l’effet d’une basse expression de MIF et potentiellement reverser l’effet délétère. Les résultats qui découleront de ce projet et permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Toutes les procédures seront réalisées lorsque les points limites seront atteints comme décris dans les procédures.

Impact sur les animaux

Les souris seront soit injectées avec des tumeurs murines (MC38,B16) dans les cas des souris 5CATT et 7CATT ou avec des tumeurs humaines (NALM6, Raji ou A549 ) pour les souris NSG. L’injection des tumeurs se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 300 mm2 pour les tumeurs solides et plus de 25% des cellules tumorales dans le sang (~3 semaines) dans le cas des tumeurs sanguines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, lorsque les points limites seront atteints, tous les animaux seront mis à mort. Lorsque l’effet thérapeutique est étudié, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront considérés protégés et seront mis à mort également par anesthésie à l’isoflurane et dislocation cervicale.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’importance de MIF dans notre modèle et le potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats nous devons passer dans un modèle de souris pour étudier notre hypothèse dans l’environnement tumorale

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon univarié en raison de la taille des groupes. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permettant d’avoir une réelle puissance statistique. Les expériences ne seront réalisées que deux fois et les rates, et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les jours pour limiter leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolation du groupe, absence de toilettage). De plus les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également des points limites spécifiques seront appliqués. Ces mesures assureront le raffinement de l’étude

Choix des espèces

Il est impossible de nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique pour améliorer la maladie, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature