Recherche fondamentale

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit de la lidocaïne et de l'ibuprofène puis est posée sur une plaque chauffée à 55 °C jusqu'à une réaction d'évitement, et reçoit une injection de carraghénane provoquant un œdème, pour tester une libération contrôlée de ces molécules encapsulées. Le porteur reconnaît que les souris témoins, privées d'anesthésique et d'anti-inflammatoire, ressentent une douleur de brûlure plus vive et une gêne à l'oreille. Il affirme que ces systèmes biologiques complexes ne peuvent pas être reproduits in vitro ou in silico.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de concevoir des objets macroscopiques permettant la libération d’une molécule « active » encapsulée dans une matrice de biopolymère mise en forme par un procédé thermomécanique, tel que l’impression 3D, avec une quantité et une vitesse personnalisée à l’utilisateur. L’un des principaux leviers sera la structure poreuse de l’objet qui lui sera attribuée par le procédé. Cette approche ouvre la voie à l’impression -dite 4D- d’objets biopolymères 3D pour une libération de petites molécules en temps contrôlé (4ème dimension), avec des applications possibles dans divers domaines, comme l’ingénierie tissulaire, ou la galénique. En effet, dans le domaine pharmaceutique, la délivrance contrôlée de médicaments constitue un enjeu thérapeutique de première importance. Actuellement, la tendance forte est d’utiliser des polymères naturels pour atteindre ces objectifs

Bénéfices attendus

Les travaux réalisés antérieurement au laboratoire ont montré que des compositions à base de zéine, principale protéine de stockage du maïs, présente un potentiel important, notamment grâce à leur mise en œuvre possible à l’état fondu et aux capacités d’interaction de la zéine avec des molécules d’intérêt thérapeutique. Par ailleurs, les Principes Actifs pharmaceutiques - Liquides Ioniques (PA-LI) sont très prometteurs pour de futurs médicaments, car ils peuvent être facilement dosés et transformés afin d’obtenir des produits pharmaceutiques présentant un franchissement rapide des parois cellulaires et une stabilité importante. L’inclusion d’un PA-LI dans une matrice biopolymère, telle que la zéine plastifiée, permet non seulement de faciliter sa mise en forme, mais aussi d'assurer sa conservation et ensuite sa libération. Parmi eux, le [Lidocaïnium][Ibuprofénate] (LidIbu), présente un triple intérêt : (i) un effet plastifiant sur les biopolymères et deux rôles thérapeutiques, avec (ii) le cation, Lidocaïnium, comme anesthésique local et (iii) l'anion, Ibuprofénate, en tant que composé anti-inflammatoire

Procédures

Pour chacune des souris 2 procédures seront réalisées à deux jours d'intervalle. Pour la première, après injection de la lidocaïne et de l'ibuprofène (soit par gavage soit par voie intrapéritonéale) la souris sera déposée sur un tapis chauffé à 55°C, jusqu'à ce qu'elle manifeste un signe d'évitement à 30min, 60min et 2H. Il y aura donc une injection par souris et puis 3 positionnement sur plaque chauffée à 55°C. Pour la deuxième procédure, après injection de la lidocaïne et de l'ibuprofène (soit par gavage soit par voie intrapéritonéale) la souris est anesthésiée et reçoit une injection de carraghénane avant la mesure de l'oedème à 30 min, 60 min et 2h. Il y aura donc deux injections et une anesthésie sur chaque souris lors de cette procédure.

Impact sur les animaux

Pour les souris contrôles, une douleur plus aigûe de brûlure pourra être ressentie lors du test de la plaque chaude car elles n'auront pas eu l'anti-inflammatoire ni l'anesthésiant. Egalement elle ressentiront une gêne et douleur à l'oreille plus grande que leur congénère lors du test de l'inflammation induite par le carraghénane.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la deuxième procédure car elles ne peuvent plus être utilisées pour un autre protocole car elles ont reçu en injection des molécules pharmaceutiques.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement car on ne peut pas reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes uniquement par des systèmes in vitro ou in silico, notamment la réaction à la douleur lors de tests de molécules pharmaceutiques.

Réduction

Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques adaptés.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 4 ou 5 par cage selon les groupes dans un environnement enrichi ( 2 enrichissements) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences

Choix des espèces

Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire uniquement par des systèmes in vitro ou in silico. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Les souris seront au stade de jeunes adultes (6 semaines), âge auquel leur système immunitaire est mature et pleinement fonctionnel

3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en fer, une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie et, pour certaines, des injections d'un anticorps d'immunothérapie, les tumeurs étant laissées à croître jusqu'à un point limite de taille. Le porteur met à mort toutes les souris deux à treize semaines après la greffe, quand ce point limite est atteint. Il affirme que la complexité du microenvironnement tumoral ne peut pas être reproduite in vitro, ce qui obligerait à recourir à l'expérimentation animale.

Objectifs

Le développement de tumeurs chez des individus immunocompétents reste un paradoxe. En effet, chez les patients atteints de cancer, on détecte fréquemment des réponses immunologiques spontanées dirigées contre la tumeur mais qui malheureusement ne se traduisent que trop rarement par des réponses cliniques efficaces (destruction de la tumeur/guérison). Le principal frein est l’existence de points de contrôles négatifs du système immunitaire correspondant entre autres à l’expression par certains acteurs de l’immunité de molécules inhibitrices bloquant leurs fonctions. Pour remédier à ce problème, des protocoles “d’immunothérapies” anti-tumorale se sont développés avec succès permettant de réactiver la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond au traitement et développe une réponse anti-tumorale efficace. Nos résultats préliminaires montrent que le fer augmente significativement les réponses des lymphocytes T in vivo et in vitro. Cet effet “adjuvant” se traduit par un fort ralentissement de la croissance de lignées tumorales transplantées chez la souris. Au regard de ces résultats, nous souhaitons poursuivre et approfondir notre étude en associant notamment supplémentation en fer et immunothérapie anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Au terme de ce projet, nous pourrons déterminer si l’association d’une supplémentation en fer aux stratégies d'immunothérapie actuelle pourrait être bénéfique pour la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces. Chaque traitement, séparément, augmente les réponses immunes anti-tumorales, provoquant un ralentissement voire un arrêt de la croissance tumorale. Nous espérons que les effets de ces 2 traitements, non seulement s’additionnent, mais également qu’une synergie puisse être observée, càd que l’effet anti-tumoral des 2 traitements ensemble soit supérieur à la somme des effets des 2 traitements appliqués séparément. En conclusion, ce projet vise à montrer l’effet bénéfique d’une supplémentation en fer pour la mise en place de réponses anti-tumorales plus efficaces et devrait confirmer le bénéfice de l’associer aux immunothérapies actuelles.

Procédures

-Régimes alimentaire contrôle ou enrichie en fer (de l'âge de 8 semaines jusqu'à la fin de l'expérimentation) -Injection sous-cutanée de cellules tumorales, sous anesthésie générale par isoflurane (10-15min par souris) - Certains animaux seront également injectés à 5 reprises par voie intra-péritonéale avec un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse (30secondes/injections/souris). Les injections seront toutes espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées pour ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le régime enrichi en fer peut induire au cours de la première semaine une perte de poids des animaux n'excédant pas 10%. Cependant, celui-ci n'induit pas de pathologies sur la durée des procédures de ce projet. Le stress et les douleurs pouvant être occasionnés lors des injections sous-cutanées et intra-péritonéales sont à proprement parlé légers. La croissance tumorale peut occasionner encore une fois un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort 2 à 13 semaines après l’injection sous-cutanée en fonction de la vitesse de croissance des différentes lignées tumorales car le point limite de taille de la tumeur sera atteint.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro pour évaluer nos hypothèses. Ces expériences nous ont permis, par exemple, de confirmer que le fer permet l'activation, la prolifération et la différenciation de certaines cellules du système immunitaire, cruciales pour la mise en place de réponses anti-tumorales.

Réduction

Des lots d’un nombre adapté d’animaux seront utilisés en anticipant la validité statistique des données obtenues. Les tumeurs transplantées sont très majoritairement de type “mâle”. Nous utiliserons donc des souris mâles pour notre étude. De plus, les expériences de la première procédure nous permettrons de réduire le nombre d'animaux utilisés lors de la seconde.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en cartons. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux au cours de chaque procédure grâce à l’utilisation d’anesthésie générale sous isoflurane lors des injections sous-cutanées et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. En effet, il est important de maintenir les animaux immobiles pour pouvoir les raser et procéder aux injections sous-cutanées sans risque de les blesser. Nous avons défini des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie. A partir du 4eme jour suivant l’injection de cellules tumorales les animaux seront suivi 4 à 5 jours par semaine par le responsable du projet pour notamment mesurer la croissance des tumeurs. Les souris seront également pesées une fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en oeuvre (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral car de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques, déficientes pour l'expression de tel ou tel gène, nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques comme le fer in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 20 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet du fer sur celui-ci.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer des lésions précancéreuses de la prostate, elles reçoivent des injections de tamoxifène et des prélèvements de sang répétés, les tumeurs pouvant grossir jusqu'à un point limite fixé à 2 000 mm³ ou une perte de poids de plus de 20 %. Le porteur met à mort les animaux à différents temps pour prélever la prostate et d'autres organes. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité de la formation des lésions, ce qui rendrait l'expérimentation in vivo nécessaire.

Objectifs

Le cancer de la prostate ( CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin de d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme. L'objectif de ce protocole est le suivi et caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera suivie pendant un délai suffisant à l'apparition des formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène réalisés au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, 100 µL du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après injections du tamoxifène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection en intra péritonéale prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale à l'isofluorane, une injection en retro-orbitale suivi du sacrifice. (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse)

Impact sur les animaux

Suite à l'injection du tamoxifène, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur sera donc un point limite clé(2000 mm3). Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate est supérieur à 2000 mm3, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes Pten et Trp53 le plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 100 d'entre elles tuées à l'issue et 30 remises en élevage pour la reproduction. Chaque souris reçoit une injection d'un produit convulsivant dans la veine de la queue et subit une crise, pour préciser la position d'un gène soupçonné d'être impliqué dans l'épilepsie. Le porteur décrit le stress de la contention et de la crise ainsi que la douleur possible d'une mauvaise pose de l'aiguille. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible, seul le test sur l'animal révélant selon lui la sensibilité aux convulsions.

Objectifs

Une étude réalisée par nos soins a permis de révéler que la partie distale du chromosome 4 de la souris est impliquée dans le contrôle des convulsions liées à l’épilepsie. Ce travail a permis de réaliser qu’il existe probablement un gène, nommé Bis1, dans la partie terminale du chromosome 4 comme impliqué dans les convulsions, sans être pour autant capable de l’identifier ni même connaitre sa position. Dans le but de préciser sa localisation, nous avons développé par croisements élaborés, des souris qui permettront, après tests de convulsions, de renseigner sur cette position aujourd’hui inconnue. Le projet présenté ici recouvre l’ensemble des expériences qui seront menées pour informer sur la position de ce gène. A terme, il est envisagé de rechercher chez l’homme, s’il existe un gène équivalent dans la région homologue à la région chromosomique de la souris.

Bénéfices attendus

Plusieurs études chez l’animal ont montré qu’il existe un gène impliqué dans l’épilepsie dans une région particulière du chromosome 4 de la souris. Il reste maintenant à identifier quel est ce gène. Les stratégies d’identification d’un gène nécessitent que la région chromosomique où on soupçonne la présence du gène soit relativement restreinte. Dans ce but, nous avons créé des lignées de souris particulières qui permettront de réduire la taille de ce fragment chromosomique après que les lignées seront testées pour leur capacité à manifester des crises.

Procédures

Contention et infusion dans la veine de la queue, 1 fois par souris sur d’une durée maximale de 5 min.

Impact sur les animaux

La contention de l’animal ainsi que la crise convulsivante peuvent entraîner un stress. La pose de l’aiguille peut entraîner une douleur.

Devenir

En fin de procédure une partie des animaux sera remise en croisement dans le système d’élevage (30/130) et l'autre (100/130) sera mise à mort ne pouvant pas être réutilisée pour une autre procédure car les effets d’une deuxième injection aurait un effet contraire, protecteur contre les crises d’épilepsie.

Remplacement

Seule une approche empirique et expérimentale en testant l’animal, permettra d’identifier quelles lignées présentent une sensibilité à la convulsion. Il n’y a donc pas de remplacement possible.

Réduction

Par expérience, nous savons que des tailles de groupe de 12 souris permettent d’estimer si ce groupe diffère d’un groupe de référence ou pas. Nous testerons donc 12 souris pour chacune des 4 lignées appelées à permettre un positionnement plus précis du gène. Nous testerons 20 souris pour chacune des 3 lignées de référence auxquelles les 4 lignées précédemment mentionnées seront comparées. Effectivement, une meilleure estimation de la capacité à présenter des crises chez les lignées de référence est nécessaire pour obtenir la puissance statistique requise pour atteindre les objectifs de l’étude. La statistique réalisée reposera sur l’emploi du t de Student.

Raffinement

Dans notre situation, seule de la douleur pourrait être induite durant le test par une mauvaise pose de l’aiguille à ailettes dans la veine de la queue de la souris. Deux techniques expérimentales seront engagées pour minimiser le risque de mauvaise pose de l'aiguille à ailette. D’une part, la veine de la queue sera dilatée par immersion de la queue durant 2 min dans un bain à 45°C. D’autre part, nous utiliserons un illuminateur de queue permettant de mieux visualiser la veine de la queue. L’expérimentation sera arrêtée après 2 tentatives de pose infructueuse de l’aiguille à ailettes. On s’attachera par une observation visuelle attentive, à vérifier qu’aucune boursouflure de la queue n’apparaisse durant le test. Auquel cas, le test serait arrêté et l’animal exclu et mis à mort. Lorsque la pose de l’aiguille à ailettes sera réalisée, le volume disponible pour la mobilité de la souris dans le tube de contention sera augmenté pour favoriser le confort de l’animal. Enfin les expériences seront réalisées par des expérimentalistes aguerris à la technique de l’infusion par la veine de la queue chez la souris. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel et des critères d'arrêt ont été définis en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

L’espèce souris est l’espèce retenue pour la raison unique que ce travail prolonge un travail initial réalisé sur la souris. La souris et le rat sont les deux espèces majoritairement retenues pour l’étude des épilepsies et des convulsions car elles représentent un compromis optimal lorsqu’on prend en compte l’homologie avec l’homme, le coût de l’élevage, les aspects éthiques incitant à employer des espèces dites « inférieures », la rapidité de reproduction. L’intérêt supérieur de la souris sur le zebra fish réside dans la faculté de la souris à supporter la consanguinité. Les souris seront testées à l’âge de 11±1 semaines lorsque les souris, mâles comme femelles, auront acquis leur pleine sensibilité au convulsivant utilisé. Fortuitement, cet âge correspond aussi à un stade de développement corporel favorisant le taux de réussite de l’infusion par la veine de la queue.

12 rats vont être utilisés, tous tués sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de 24 heures, chaque rat subit une chirurgie de pose de trois cathéters dans une veine, une artère et la veine mésentérique, puis reçoit du malate radiomarqué au carbone 14 pendant près de trois heures d'anesthésie avant la mise à mort, pour mesurer la production de sucre par l'intestin. Le porteur indique des risques d'hypoglycémie, de saignements, de détresse respiratoire et d'hypothermie. Il affirme que cette mesure n'est pas réalisable sur des cellules ou des organoïdes en culture et que seul le rat convient à la technique.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique qui est un facteur de risque majeur du développement de nombreuses complications. Dans ce contexte, la production intestinale de glucose (PIG) (qui correspond à la capacité qu’à l’intestin de produire du sucre (glucose) en dehors des périodes de repas), est une fonction qui exerce des effets anti-obésité et anti-diabète. De plus, les régimes riches en protéines et en fibres, sont responsables d’effets bénéfiques impliquant la PIG. De plus, les fibres alimentaires peuvent être digérées par l’intestin et les bactéries intestinales en différentes molécules, susceptibles d’activer la PIG. De ce fait, dans un projet précédent, nous avons émis l’hypothèse que d’autres molécules issues de la digestion des aliments pourraient induire la PIG. Les résultats issus de ce projet ont permis d’identifier le malate comme un activateur de la PIG (molécule qui active la production de glucose par l’intestin). En effet, l’apport de 5% de malate à une alimentation riche en gras et en sucres de souris contrôles pendant 4 semaines, limite la prise de poids alors que la prise alimentaire reste inchangée. De plus, nous observons également des effets bénéfiques protecteurs du malate sur la glycémie (taux de sucre dans le sang) et l’accumulation de graisses dans le foie (stéatose hépatique). De façon intéressante, l’ensemble de ces effets bénéfiques ont déjà été décrits lors d’une activation génétique de la PIG chez la souris. Enfin, alors que le niveau d’expression des protéines clés dans la production de glucose est augmentée, ces effets ne prennent pas place chez des souris où la PIG est non fonctionnelle. Montrant ainsi le rôle crucial de la PIG dans l’obtention des effets bénéfiques du malate. Néanmoins, ces travaux ne nous permettent pas de comprendre comment le malate active la PIG, et donc la production de glucose (sucre) par l’intestin. Ainsi, l’objectif de ce projet est donc de déterminer si le malate agit en tant que substrat de la PIG (s’il est directement transformé en glucose). Plus précisément, nous souhaitons déterminer si les carbones du malate sont intégrés dans le glucose produit par l’intestin. Grâce à ces résultats, le malate pourra alors être envisagé comme une nouvelle cible de traitement de l’obésité et ses complications.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet nous permettrons de compléter nos travaux sur les capacités de molécules à activer la PIG et ses effets bénéfiques. En effet, nos travaux issus d’un projet précédent ont permis de montrer que le malate exerce des effets bénéfiques sur l’obésité, le diabète (trop de sucre dans le sang) et la stéatose hépatique (trop de graisses dans le foie). De façon intéressante, ces effets bénéfiques ne prennent pas place chez des ayant une PIG non fonctionnelle. Néanmoins ces travaux n’ont pas permis de montrer précisément les mécanismes impliqués. Plus précisément, nous ne savons pas si le malate est directement transformé en glucose (sucre) par l’intestin. Ce projet, qui viendra finaliser notre projet précédent, nous permettra de comprendre les mécanismes mis en jeu dans l’activation de la PIG par le malate. Ainsi, grâce à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, l’activation de la PIG par le malate pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

Les rats seront soumis à une mise à jeun pendant 24h, puis recevront un traitement antidouleur adapté 30 minutes avant le début de la chirurgie. Ensuite ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) afin de mesurer l’incorporation du malate [qui a été modifié pour contenir du carbone 14 (C14), qui est une forme radioactive du carbone], dans le glucose (sucre produit par l’intestin). Lors de la privation de nourriture de 24h, les rats conserveront un accès à l’eau, leur enrichissement et l’hébergement en groupe. Les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, le foie, les reins et l’intestin vont produire du glucose et maintenir un taux de sucre dans le sang stable. La mise à jeun est effectuée à 9h du matin, soit 3h après la fin de la phase nocturne, qui est la phase pendant laquelle les animaux consomment 80% de leur ration quotidienne. La mesure de l’incorporation du malate radiomarqué (C14) dans le glucose produit par l’intestin de rats nécessite une chirurgie d’environ 45 min afin d’insérer 2 cathéters dans une veine (jugulaire) et une artère (carotide). Ensuite, le malate C14 est perfusé en veine pendant 90 minutes, puis un cathéter est introduit dans la veine mésentérique supérieure (point de convergence du sang provenant des différentes veines de l’intestin) afin de collecter simultanément du sang provenant de l’intestin et de la circulation sanguine générale. Au total, le temps d’anesthésie par rat est d’environ 2h45 à 3h. A la fin de la procédure, les rats sont mis à mort par injection intraveineuse d’une dose létale d’un euthanasiant chimique (sans réveil de l’animal).

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite une mise à jeun (privation de nourriture, mais pas de l’eau de boisson) des rats pendant 24h avant la chirurgie et la perfusion de malate radiomarqué (C14) pour la mesure de la production de sucre par l’intestin. Pendant cette phase de privation de nourriture, les rats peuvent avoir des épisodes d’hypoglycémie (taux de sucre trop bas), une modification de leur comportement (absence de déplacement dans la cage, absence de toilettage, grimaces). Néanmoins, les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, l’activation de la production de sucre par le foie, les reins et l’intestin, va permettre de maintenir un niveau de sucre dans le sang suffisant (glycémie). De plus, la participation de l’intestin et du rein au maintien de la glycémie augmente lorsque la privation alimentaire se prolonge. A l’issu de ces 24h de privation alimentaire, les animaux recevront un traitement anti-douleur adapté à la chirurgie et seront anesthésiés (anesthésie gazeuse). Lors de la pose des cathéters, il est possible de provoquer des saignements. De plus, l’anesthésie est susceptible de provoquer une détresse respiratoire ou une hypothermie. Des moyens seront mis en place afin de prévenir ces nuisances.

Devenir

Dans ce projet, la procédure comporte une chirurgie et une injection de traceurs radioactifs (malate C14). La chirurgie doit permettre l’implantation de 3 cathéters (en veine jugulaire, en artère carotide et en veine mésentérique supérieure). Il n’est pas possible, ni nécessaire de réveiller les rats ayant subi l’implantation de 3 cathéters et l’injection de composés radioactifs. D’autre part, à l’issu de la procédure (tout de suite après la mise à mort des rats), le contenu intestinal sera prélevé. Ces prélèvements nous permettrons de déterminer si une partie du glucose-C14 produit par l’intestin (qui est issu du malate-C14) a pu être libéré dans la lumière intestinale (et non dans la circulation sanguine).

Remplacement

La PIG exerce un contrôle sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. La mesure de l’incorporation des carbones radioactifs du malate (C14) dans le sucre (glucose) produit par l’intestin dépend de plusieurs paramètres, dont le déstockage du glucose, la production de glucose par le rein, et la consommation de glucose par l’ensemble des tissus de l’organisme. Ainsi, cette mesure nécessite de reproduire les conditions physiologiques d’un jeûne de 24h (nécessaire à l’activation de la PIG) et une circulation sanguine préservée. En effet, la mesure de la production de glucose à partir du malate nécessite des prélèvements de sang simultanés dans l’artère carotide et la veine porte. Cette mesure n’est donc pas réalisable avec des cellules ou des organoïdes d’intestin en culture (groupement de cellules en culture qui modélise un tissu et donc les interactions entre cellules).

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dont nous avons besoin, nous avons calculé le nombre de rats au plus juste à partir de notre connaissance de la technique utilisée, soit au maximum 12 rats. Néanmoins, pour limiter au maximum le nombre de rats nécessaires, l’étude sera menée avec une première cohorte de 6 rats, et en fonction des résultats obtenus, nous augmenteront l’effectif pour atteindre 12 rats au maximum. Ainsi, cette étude nécessitera au minimum 6, et au maximum 12 rats. D’autre part, le principe de réduction a été appliqué dès la conception de ce projet. En effet, nous avions choisi de réaliser ce projet en plusieurs étapes (les 2 premières faisant partie d’un projet précédent, actuellement terminé): - Etape 1 : Afin de déterminer si les molécules d’intérêt (dont le malate) exercent des effets bénéfiques chez des souris sauvages/contrôles, nous les avons ajoutés à l’alimentation des souris. - Etape 2 : Seulement pour les molécules ayant montré des effets bénéfiques chez les souris sauvages, nous avons cherché à déterminer si ces effets étaient médiés par la PIG. Pour cela, les métabolites ont été ajoutés à l’alimentation de souris chez lesquelles la PIG est non fonctionnelle . L’absence d’effets, traduisait alors de l’importance de la PIG dans ces effets bénéfiques. - Etape 3 : Lors des étapes 1 et 2, nous avons montré que le malate est capable d’induire des effets bénéfiques via la PIG. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre les mécanismes impliqués. Plus précisément, nous souhaitons déterminer si le malate est transformé en glucose par l’intestin. Grâce à cette stratégie, l’étude de molécules qui paraissaient intéressants au départ, mais qui n’ont pas induits d’effets bénéfiques lors de l’étape 1, a été abandonné et a donc limité le recours à l’animal lors des étapes 2 et/ou 3. D’autre part, à l’issu de la procédure (tout de suite après la mise à mort des rats), le contenu intestinal sera prélevé. Ces prélèvements nous permettrons de déterminer si une partie du glucose-C14 (radioactif) produit par l’intestin (issu du malate-C14) a pu être libéré dans la lumière intestinale (et non dans la circulation sanguine). Dans ce cas, nos travaux montreraient pour la première fois que la PIG est capable de fournir du sucre/glucose aux bactéries du microbiote intestinal. Enfin, il n’est malheureusement pas possible de constituer une banque de tissus radioactifs pour une utilisation ultérieure.

Raffinement

Les rats seront commandés à l’âge de 5 semaines et une phase d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début de la procédure. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les rats seront hébergés par groupe de 2, dans des cages adaptées et avec un enrichissement adapté dans la cage. Lors de la mise à jeun (pour 24h), les rats conserveront un accès à l’eau, leur enrichissement et l’hébergement en groupe. La surveillance des animaux et de leur comportement permettra de déceler toute souffrance de façon précoce. Néanmoins, les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, l’activation de la production de sucre par le foie, les reins et l’intestin, va permettre de maintenir un niveau de sucre dans le sang suffisant (glycémie). De plus, la participation de l’intestin et du rein au maintien de la glycémie augmente lorsque la privation alimentaire se prolonge. Concernant la mesure de la production de glucose à partir du malate C14, les animaux recevront une analgésie adaptée 30minutes avant la chirurgie. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Au cours de l’opération, nous surveillerons les paramètres cardio-respiratoires et la température de l’animal (maintenue stable par une couverture chauffante thermorégulée). Les chirurgies seront réalisées par des personnes qualifiées, et l‘intérieur des cathéters seront recouverts d’un anticoagulant pour éviter la formation d’un caillot sanguin. Les cathéters utilisés sont en matériaux biocompatibles et de diamètre adapté. A la fin de l’anesthésie ou en cas d’arrêt de la procédure pour souffrance (ils ne seront pas réveillés à l’issu de la procédure), les rats seront mis à mort par injection par injection d’une dose léthale d’un euthanasiant chimique.

Choix des espèces

Le rat, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de sa taille, il s’agit d’un animal où la chirurgie est facile et adaptée à la pose de cathéters. De plus, la mesure de l’incorporation du malate radioactif C14 dans le sucre produit par l’intestin est une technique qui n’est fiable que chez le rat. En effet, contrairement à la souris, le rat est peu sensible à la perturbation des flux de glucose qui peut intervenir lors du prélèvement de sang en simultané dans 2 cathéters. Sachant que la perturbation des flux de glucose est susceptible de moduler la fiabilité de la mesure. Les rats (mâles) seront commandés à l’âge de 5 semaines (environ 200-220g) et la procédure sera réalisée 2 semaines plus tard, soit à l’âge de 7 semaines (environ 300g). Les rats adultes sont sevrés et ont donc une alimentation indépendante, ce qui justifie leur utilisation comme modèle en nutrition humaine.

2 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès un à deux jours après la naissance, elles reçoivent une injection de virus dans le cerveau ou dans une veine, puis, adultes, subissent des tests de mémoire reposant sur des chocs électriques aux pattes et des tests d'anxiété, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Wolfram. Le porteur met à mort tous les animaux pour prélever le cerveau et divers organes. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" car il serait le seul mammifère non humain à reproduire les signes neurologiques de la maladie dans un délai court.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de la maladie n’existe et seul le traitement des symptômes (diabète principalement) permet d’améliorer l’espérance de vie des patients. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique d'une thérapie génique via l'injection de particules virales. Cette injection devrait restorer les déficits de mémoire et d'anxiété chez un modèle souris du syndrome de Wolfram. Cette étude permettra la validation de notre stratégie de thérapie génique chez le modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Touchant plusieurs organes, le syndrome de Wolfram est une maladie complexe qui nécessite des approches combinées. En développant une thérapie génique unique, qui sera délivrée de manière intra-cérébrale ou via la circulation sanguine, nous espérons arrêter la progression de la maladie. L'efficacité de notre thérapie génique dans notre modèle souris du syndrome de Wolfram permettra, à terme, le développement clinique de la thérapie génique chez les patients.

Procédures

Les nouveaux nés, 1 à 2 jours après la naissance, seront exposés à différentes procédures: anesthésie, administration cérébrale ou intraveineuse de vecteurs viraux. Cette injection sera unique, et n'excèdera pas 15 secondes. Suite à ce traitement, des analyses comportementales de la mémoire et de l'anxiété de ces animaux seront testées (6 à 8 tests de 30min maximum).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront soit "légers" soit "modérés" suivant les actes. Les animaux auront, 1 à 2 jours après la naissance, une chirurgie, associée à une anesthésie, permettant l'injection de virus dans le cerveau ou dans une veine de la tête. Cette intervention pourra engendrer un léger stress chez l'animal. Afin de tester leur mémoire, les souris, à 3 mois, recevront un choc éléctrique de faible intensité et de courte durée au niveau des pattes pouvant engendrer un léger stress.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter les structures du cerveau ainsi que divers organes. Cela permettra des analyses approfondies pour comprendre l'efficacité de notre traitement.

Remplacement

L'utilisation de modèles souris du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes neurologiques du syndrome de Wolfram dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet, les animaux utilisés en comportement seront ensuite euthanasiés et leurs organes périphériques et centraux collectés, complétant ainsi les groupes de souris pour les analyses tissulaires. Les croisements entre males et femelles seront optimisés afin de limiter le nombre d'animaux générés.

Raffinement

Au quotidien, nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Lors des tests comportementaux, les animaux ne seront pas séparés de leurs congénères et placés 20min avant le début du test dans la pièce d'expérimentation afin de leur permettre une habituation au nouvel environnement. Après les tests comportementaux, les animaux seront directement remis dans la cage d'origine à l'écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Durant les périodes de tests comportementaux, les animaux seront pesés avant chaque test afin de permettre un suivi du poids, toute perte de poids supérieure à 15% entrainant la sortie de l'animal de la procédure. Une grille de scorage définissant les points limites sera mise en place suite à l'injection des particules virales sur nouveau né. Un antalgique sera administré avant toute procédure afin de limiter la douleur des animaux.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie touchant de nombreux organes, pour laquelle les altérations auditives et visuelles s'accompagnent de signes neurologiques et cognitifs. Seul un modèle robuste qui mime la pathologie humaine permet de tester et caractériser, au niveau fonctionnel et biologique, l'efficacité de notre traitement par thérapie génique. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement. Les procédures d'injection de particules virales seront effectuées 1 à 2 jous après la naissance afin de garantir une dissémination efficace. Les tests comportementaux ainsi que l'euthanasie des animaux se feront à 1mois, 3 mois et 6 mois pour permettre une vision de l'évolution du traitement dans le temps.

3 778 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à quatre chirurgies, injections dans la moelle ou un nerf et lésions par pincement du nerf sciatique et de la colonne dorsale, suivies de tests comportementaux nommés, test de Von Frey et test de l'autocollant, pour étudier la régénération nerveuse. Le porteur prévoit d'euthanasier les animaux qui s'automutilent ou se paralysent, signes qu'il désigne comme points limites, et met à mort l'ensemble pour prélever les tissus. Il affirme que le recours à des "organismes entiers" est "non remplaçable" et que la souris est le "standard international" du domaine.

Objectifs

Les maladies du système nerveux représentent plus de 35% de la totalité des maladies en Europe et ce chiffre est en augmentation constante en partie dû à l’allongement de la durée de vie. Toute atteinte au système nerveux central, à la différence des neurones du système nerveux périphérique, conduit à des pertes de fonctions vitales. Les patients doivent endurer une perte irréversible de ces fonctions puisqu’aujourd’hui encore aucun traitement ne permet de guérir ces lésions et de permettre la reformation d’un circuit fonctionnel. La compréhension des mécanismes moléculaires des maladies neurodégénératives et des lésions du système nerveux représente donc un défi majeur en biologie dans le but de développer des médicaments et traitements pour les patients. La principale cause de ces maladies l’incapacité des neurones de régénérer leurs axones après une lésion conduisant dans la plupart des cas à la mort des neurones concernés. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération axonale et à la survie neuronale est donc une étape clef dans le traitement de ces maladies. Le projet a pour but d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires qui peuvent expliquer la perte de capacité de croissance des neurones adultes et leurs susceptibilités à la mort neuronale. Ainsi, nous focalisons sur les neurones eux-mêmes et nous proposons de caractériser le rôle d’une nouvelle famille de protéine dans la régénération du système nerveux périphérique et central

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont extrêmement importants d’un point de vue fondamentale et appliqué. En effet, nos travaux vont permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent la survie des neurones et la régénération du système nerveux centrale. Notre projet va permettre de caractériser en détail une nouvelle voie et de définir précisément les acteurs importants pour la régénération du système nerveux. Non seulement nous allons identifier et valider de nouvelles cibles qui permettront de faire régénérer, mais nous allons aussi mettre en évidence la formation de nouveau circuit après une lésion. Ces données seront essentielles dans une optique de développement thérapeutique. En effet, nos travaux permettront le développement de thérapie innovante dans le domaine des maladies neurodégénératives mais aussi en cas d’atteinte traumatique.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à 4 procédures chirurgicales qui sont de classe modérée. Les souris peuvent subir une ou plusieurs chirurgies (selon la procédure). L'accumulation des chirurgies n'induit pas une gravité supplémentaire. Les animaux subiront: -l’injection intra-thécal : les souris sont endormies environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, injection et suture) est de 5 min, l’injection en elle-même durant 5 secondes - l’injection intra-nerveuse : les souris sont endormies pour environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, injection et suture) est de 10 min, l’injection en elle-même durant 5 minutes - la lésion du nerf sciatique : les souris sont endormies environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, lésion et suture) est de 5 min, la lésion correspondant à 2 pincements de 15 et 10 secondes. - la lésion de la colonne dorsale : les souris sont endormies pour environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, lésion et suture) est de 20 min, la lésion correspondant à 3 pincements successifs de 10 secondes. Les animaux subiront les désagréments liés à l’anesthésie et à la plaie qu'implique les injections et/ou les lésion qui se caractérise essentiellement par une douleur modérée. Les souris participeront à deux tests de comportement pour analyser le retour sensitif. Pour le test de Von Frey, les souris sont acclimatées durant 1h dans la pièce et 10min dans la cage pour le test. Les souris sont testées durant 5min. Pour le test de l’autocollant, les souris sont acclimatées durant 1h dans la pièce, 5min dans la nouvelle cage et elles sont testées 2 fois 5min. Elles sont testées durant 6 semaines avec une fréquence de une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Toutes les chirurgies pratiquées dans le cadre de ce projet sont de classe modérée. Les souris subiront les désasgrements liés à la présence d'une souture qui sera refermée avec des agrafes, potentielles source de stress. Une legère perte de mobilité est observée dans les premières heures suivant le réveil après la lésion du nerf sciatique et/ou de la moelle. Cette diminution ne doit pas excéder les 6h post traitement sinon elle sera comptée comme point limite de la procédure. Une légère douleur est à prévoir pour les injections et la lésion du nerf sciatique. On anticipe une douleur plus importante immediatement après reveil suivant la lésion de la moelle. Les deux cas sont traités de manière spécifique dans chaque procédure. Les tests de comportement sont des tests sensitives qui n'induisent pas de douleurs. Un léger stress peut etre occasionné lors du changement de pièce ou de cage pour les tests.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer les structures d'intérêt. De ce fait, les animaux ne peuvent pas être réutiliser.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les modèles murins sont essentiels et non remplaçable car i) les paradigmes de lésion chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, ii) un très grand nombre de lignées de souris transgéniques sont déjà disponibles pour nos recherches et iii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents acteurs (neurones, cellules gliales, environement de la lésion…) et ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle murin est le standard international reconnu dans le domaine.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : -La validation systématique de toutes nos préparations de matériel biologique pour s’assurer de leur efficacitées avant les manipulations -L’entrainement systématique de toutes personnes qui pratiquent les experiences pour ne pas perdre d’animaux du à de mauvaise chirurgie. -L’utilisation de test statistique optimal pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Enfin, seules les candidats validés dans les procédures in vitro seront testés in vivo.

Raffinement

Les animaux qui auront subi une intervention chirurgicale seront observés quotidiennement et seront pesés aux moins deux fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, le poids des souris sera vérifié dans la phase chronique de la lésion soit pendant une semaine post-chirurgie. Si une perte de poids est constatée ou que les souris explorent peu l’environnement, nous fournirons les croquettes de nourriture, de l’eau gélifiée ainsi que de la nourriture enrichie (boost) directement dans la cage. Si la perte de poids excède les 20% la souris sera alors euthanasiée. Nous serons attentifs à leur comportement : pour l’entretien du poil en cas de doutes, nous en discuterons avec le vétérinaire réfèrent. En cas de prostration des souris, nous euthanasierons les animaux. Nous serons vigilants au bien être des souris : elles recevront du paracétamol (4mg/mL) dans leur eau de boisson 24h avant l’intervention et ce pendant 48h. Dans les expériences de lésion du nerf sciatique, notre protocole expérimental prévoit de sacrifier les animaux 3 jours après la lésion du nerf sciatique. Ce délai court ne permet pas de voir les signes d’allodynie. Néanmoins, nous appliquerons les procédures de prise en charge de la douleur et du bien-être animal décrits ci-dessus. Pour les lésions de moelle épinière (pincement de la colonne dorsal), immédiatement après la chirurgie, les souris recevront une injection sous cutanée de buprenorphine (0.05mg/kg) et les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température au niveau de la cage. Les yeux des souris seront protégés tout au long de la procédure par ajout de gel (ocry-gel). Si l’animal s’automutile (cas rares) au niveau des pattes, l’animal sera euthanasié. Dans le cas où les sutures sont effectuées avec des agrafes, une attention particulière sera apportée au suivi de la suture. Si les animaux arrachent et/ou déplacent les agrafes, les animaux seront endormis, la suture sera nettoyée et désinfectée et de nouvelles agrafes seront mis en place. Les interventions sur la moelle (injection et lésion) sont superficielles. Dans ce contexte, nous n’induisons pas de paralysie des pattes arrière, de la queue ou de l’inhibition des fonctions urinaires. Après chirurgie, si nous constatons une paralysie, cela suggère que nous avons touché la mauvaise partie de la moelle épinière et cela représente un point limite où les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le projet consiste à comprendre les mécanismes liés aux maladies neurodégénratives et aux lésions traumatiques de la moelle épinière chez l'homme dans le but de développer de nouveaux traitement. De nombreuses études ont été menées in-vitro dans des modèles de cultures cellulaires primaires. Ces études ont identifié un certain nombre de facteurs avec un potentiel dans pousse axonale. Malheureusement, la plupart des études basées sur ces données ont été un échec une fois testées in-vivo. Ainsi l’utilisation d’organismes entiers est nécessaire. La souris représente le standard dans la communauté scientifique pour étudier les mécanismes de régénération in-vivo avec une grande similitude par rapport à l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autre modèle telle que le poisson zebre dont le système nerveux central régénère spontanement ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les paradigmes scientifiques que nous utilisons. La souris permet aussi l’utilisation de test de comportement pour analyser le retour fonctionnel. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles telle que le rat.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle dès l'âge de 20 jours, elles subissent une batterie de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, un placement en obscurité constante pendant deux à trois semaines et des chirurgies cérébrales avec ou sans réveil, injection d'un traceur dans l'œil ou d'un virus dans le cerveau, pour étudier les effets d'une exposition lumineuse à l'adolescence. Le porteur nomme l'isolement, la privation de lumière et la chirurgie comme sources de stress et de douleur. Il affirme que ces tests ne peuvent pas être menés in vitro et exigent des expériences à l'échelle de l'animal entier.

Objectifs

Depuis un siècle, l'éclairage environnemental est passé d'un rythme solaire naturel à un cycle lumineux artificiel et souvent irrégulier. Les sources d'éclairage moderne (LED) sont de plus en plus répandues et sont utilisées dans de nombreux appareils électroniques de notre vie courante (smartphone, tablette, etc...). Selon la fondation nationale du sommeil, 75% des enfants laissent un appareil électronique dans leur chambre quand ils dorment, et 60% des adolescents déclarent interagir avec leur écran durant l’heure précédant leur coucher. L’exposition à la lumière le matin a un effet bénéfique en synchronisant le système circadien avec le cycle environnemental jour/nuit, en augmentant la vigilance et la cognition et dans le traitement de la dépression. A l’inverse, une exposition anormale à la lumière (ALE), la nuit, altère nos rythmes biologiques, la cognition et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'Homme. Cet effet est médié par une cellule photosensible spécifique de la rétine : la cellule ganglionnaire à mélanopsine. Les adolescents sont très sensibles à divers facteurs de l’environnement, y compris la lumière. Ils représentent donc une population particulièrement à risque car 1) l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et 2) ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Ce projet propose une analyse multidimensionnelle allant de la cellule au comportement de l’animal. Nous proposons d'étudier si l'exposition anormale à de la lumière, pendant la période de l'adolescence, contribue à l’altération des fonctions circadiennes (rythmiques), affectives et cognitives à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet aura des résultats déterminants tant au niveau fondamental que clinique. Il permettra tout d'abord de décortiquer la relation entre une exposition aberrante à la lumière à l’adolescence et le développement des troubles circadiens / affectifs / cognitifs à l’âge adulte. A plus long terme, de nouvelles stratégiespourront être élaborées et proposées pour limiter les effets négatifs d’une surexposition à la lumière chez les adolescents.

Procédures

Les interventions prévues sont listées ci-dessous : 1) Tout d'abord, les animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de 20 jours d’âge et jusqu’à la fin de l’expérimentation (P20 à l'âge adulte, procédures 1-4). 2) Ensuite, à l'âge adulte, les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests seront réalisés d'un degré de sévérité légère à sévère et séparés les uns des autres d'au moins 48 h (procédure 1). 3) Les animaux subiront une chirurgie avec (procédures 2 et 4) ou sans réveil (procédure 3) . Différents groupes d'animaux seront définis. Un groupe d'animaux recevra une injection intraoculaire d’un traceur antérograde (procédure 2) sous anesthésie générale et locale renforcée si besoin et l'expérimentation durera environ 30 min ). Un second groupe d'animaux recevra, sous anesthésie générale, l’injection d’un virus en intracérébral (30 à 45 min) pour activer spécifiquement les neurones d'intérêt (procédure 4). Enfin, un dernier groupe sera anesthésié par voie générale afin de mesurer l’activité neuronale par éléctrophysiologie dans les structures cérébrales d’intérêt. Cette intervention durera entre 2 à 2h30, et est sans réveil (procédure 3).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Stress lié à l'isolement des animaux en cage individuelle à partir de 20 jours d'âge et jusqu’à l'âge adulte afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Stress lié à la réalisation d'une batterie batterie de tests comportementaux permettant d'évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests, réalisés chez les souris adultes, seront espacés les uns des autres de 48 h minimum et réalisés d'un degré de sévérité moindre à élevé. 3) Stress lié au placement des animaux adulte à l’obscurité constante pendant 15-20 jours . Le placement de l’animal en condition constante (obscurité constante) est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien (période endogène, décalage de phase comportemental). 3) Douleur éventuelle liée à la réalisation d'une chirurgie avec ou sans réveil et qunatifiée à l'aide d'une grille de score de la douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements de tissus post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d'évaluer l'impact d'une exposition aberrante à la lumière durant l'adolescence sur le système circadien, la cognition et l'humeur. Ces études ne pouvant êre reproduites in vitro, le projet nécessite la réalisation d'expériences dans un environnement intégral, à l'échelle de l'animal. De plus, ce projet fait appel à des modèles murins sauvages et transgéniques sélectionnés car ils permettent d'aborder différents aspects scientifiques de notre projet.

Réduction

Pour réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons des approches non invasives (comportement) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Les animaux utilisés lors des approches non-invasives seront utilisés dans le cadre d'une procédure ex-vivo. - Plusieurs prélèvements de tissus sont réalisés chez le même animal, et certaines mises au point techniques seront réalisées en utilisant le même animal.

Raffinement

Durant toute la durée des procédures et afin de mesurer le rythme de l'activité locomotrice, les souris,à partir de 20 jours d'âge, seront placés individuellement dans des cages et mis dans une armoire avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent voir leurs congénères et ont aussi accès à leurs odeurs et bruits. De plus, pour palier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Un igloo ne peut être mis car il interfère avec le signal enregistré par les capteurs infrarouges pour mesurer l'activité. Les procédures utilisées sont de sévérité légère à sans réveil. Une grille de score de la douleur sera utilisée.

Choix des espèces

L’objectif du projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition aberrante à de la lumière bleue chez l’adolescence sur le système circadien, l’humeur et la cognition. Cette période de stimulation lumineuse aura lieu entre 20 à 40 jours d'âge (stades postnataux P20 à P40). L’impact de cette exposition sera ensuite évalué chez des animaux au stade adulte (entre 2 à 4 mois). Ce projet fait appel à un modèle murin sauvage et un modèle murin transgénique déficient en une opsine, la mélanopsine (Opn4-/-). Cette espèce a été sélectionnée car 1) elle est nocturne et sera comparée à une espèce de rongeur diurne et 2) elle permet d'accéder à un modèle transgénique déficient en mélanopsine, photorécepteur connu pour son implication dans le traitement de l'information lumineuse. Elle représente donc un modèle privilégié pour notre projet.