Recherche fondamentale

60 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime gras qui les rend obèses et diabétiques, des mises à jeun de douze heures, des gavages de glucose et, pour la moitié d’entre eux, un traitement antibiotique destiné à perturber leur flore intestinale, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier le lien entre microbiote et diabète. Le porteur indique que le gavage et la contention constituent un stress modéré et que les antibiotiques peuvent provoquer des diarrhées. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne rend compte des liens entre alimentation, microbiote et régulation de la glycémie.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte et une grande diversité de microorganismes. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d'un système immunitaire sain. Ainsi un déséquilibre de la composition du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme l’obésité dont l’une des principales conséquences est le diabète. Ces 35 dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre avec 9.3% de la population mondiale souffrant de cette pathologie. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et le rôle que ces interactions pourraient avoir dans des maladies métaboliques telles que le diabète. En cas d'obésité, de nombreux changements se produisent dans l’intestin. Ces modifications intestinales sont maintenant reconnues comme participant à l'auto-aggravation de l'obésité. Parmi les changements qui s’opèrent, la densité des cellules de l'immunité, qui sont nombreuses dans l’intestin, augmentent chez les personnes obèses et leur activation va notamment modifier la régulation de la glycémie. Les mêmes mécanismes sont à l’œuvre dans les modèle de rats rendus obèses par l’alimentation. De nombreuses études suggèrent que les bactéries de l’intestin, dont la composition est perturbée par l‘obésité, sont en partie responsables des changements de fonction des cellules immunitaires. Cette triade (microbiote-cellules immunitaires intestinales-régulation de la glycémie) constitue donc une cible intéressante pour mieux comprendre la mise en place du diabète. Nous souhaitons dans un premier temps caractériser les populations de cellules immunitaires et leurs (dys)-fonctions dans différentes régions de l’intestin chez des rats obèses en comparaison avec des rats non obèses et ceci en présence ou non d’une perturbation majeure du microbiote intestinal. Sur les mêmes animaux un suivi de la glycémie sera réalisé ainsi qu’une analyse fine du microbiote intestinal et des populations et fonction de l’intestin. Des outils de bio-informatique nous permettant de faire des études de corrélation entre ces différents paramètres seront par la suite utilisés dans les analyses.

Bénéfices attendus

Les perspectives de ce travail sont d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques intestinales, donc accessibles par voie orale afin de prévenir ou limiter les effets néfastes de l’obésité sur le diabète. Le diabète est une maladie évolutive qui se caractérise par une hyperglycémie chronique liée à une réponse altérée à l’insuline. Ce déséquilibre du métabolisme glucidique est notamment lié aux déséquilibres nutritionnels et à l’obésité. Le système immunitaire a aussi un rôle dans la mise en place du diabète qui est souvent associé à une inflammation élevée chez les sujets obèses. Le diabète entraine des complications vasculaires graves à long terme et une surmortalité. Son impact sur le budget santé, qui peut atteindre 5 à 20% des dépenses de santé de nombreux pays, est évalué à la hausse pour les décennies à venir. Il est donc important de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche graisses induisant une prise poids et un diabète. Les animaux seront mis à jeun deux fois pour une durée de 12h durant l'ensemble de la procédure. Ils recevront également un gavage de glucose (entrainant une contention de 10 secondes). Un test de tolérance au glucose (appelé OGTT) visant à mesurer la glycémie (via une seule petite piqure à la queue) sera réalisé sur l'ensemble des animaux. Ce test sera réalisé deux fois à 3 semaines d’intervalle durant la procédure. La moitié des animaux recevra un traitement antibiotique pendant deux semaines afin de perturber la flore intestinale. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine en étant placés durant quelques secondes dans un pot individuel. Deux pesés sur l'ensemble du projet nécessiteront une pesée plus longue (de quelques minutes) afin de laisser le temps aux rats d'expulser une crotte qui sera ensuite récoltée dans le pot.

Impact sur les animaux

Le gavage lors de l’OGTT constitue un stress modéré notamment dû à la contention (d'une durée < 10 secondes). La contention et le gavage seront réalisés par un experimentateur expérimenté. Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. la procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie ne présente qu’une douleur très faible car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'espérimentateur lors du premier prélèvement du test. Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. Le traitement antibiotique pourra éventuellement entrainer des diarrhées.

Devenir

Dans ce projet la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des organes.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre l’alimentation, la composition du microbiote, les fonctions immunitaires de l’intestin et la régulation de la glycémie.

Réduction

D’après les études déjà menées, nous estimons que 15 rats par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux hébergés 2 par cage bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront entrainés à la manipulation (notamment à la contention). Afin de limiter le stress lors des mesures de glycémie qui se feront dans une autre salle que la salle d'hébergement, les animaux seront transférés dans la salle expérimentale 1h avant. Un anesthésique local sera appliqué sur la queue avant les prélèvements de sang réalisés pour les mesures de glycémie. Des points limites, décrits dans les procédures expérimentales, seront également mis en place.

Choix des espèces

Les rats utilisés seront des rats wistar RjHan:WI. Cette espèce est choisie car cette étude fait partie d’un projet collaboratif réunissant 2 autres équipes de recherche et nécessitant une harmonisation du modèle rongeur. De plus ce projet repose sur de nombreux travaux préliminaires ayant utilisé des rats wistar RjHan:WI. Ce projet étudie le rôle du microbiote sur le développement du diabète chez l’adulte. Le modèle de rat utilisé est donc un modèle adulte qui aura 7 semaines en début d’expérimentation (le microbiote des rats est stabilisé à partir de 5-7 semaines) et 21 semaines en fin d’expérimentation. 3 mois de régime riche en graisses correspond au temps nécessaire pour rendre les animaux obèses avec une perturbation des fonctions immunitaires et de la régulation de la glycémie.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, 80 d’entre elles recevant en plus un médicament, la tumeur pouvant atteindre deux centimètres cubes et gêner leurs déplacements avant leur mise à mort pour prélèvement, afin de valider le rôle d’un ARN non codant dans le carcinome rénal. Le porteur indique que des métastases pulmonaires peuvent se former et provoquer une perte de poids et d’appétit. Il affirme que les cultures in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la formation tumorale et compte ouvrir une collaboration avec l’industrie pharmaceutique.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (CRCC) est un cancer agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que l'expression d'un ARN long non codant in vivo altère la formation de carcinome des cellules rénales et la progression de métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation d'une cible pour le traitement du carcinome rénal à cellules claires. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant faire l'objet d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le carcinome rénal à cellules claires chez l'homme.

Procédures

Toutes les souris seront injectées avec des cellules tumorales (104). L'injection se fait sous anesthésie gazeuse et dure une dizaine de secondes. Les souris de l'étude expérimentale (80) subiront en plus l'administration de médicament 3 fois à 3 jours d'intervalle. Ce traitement supplémentaire est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et potentiellement la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparataitre à partir de 5 jours suivant injection et croitre assez rapidement. La temps d'atteinte du point limite du volume de 2cm3 est estimé à moins de 3 semaines. Les métastases ne seront pas visibiles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont du être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance d'un ARN non codant dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

L'étude se fera en deux étapes : * la première procédure constitut l'étude-pilote de la tumorigénicité des modèles cellulaires utilisés (12 souris par lignée cellulaire, donc 24 souris). * Si l'étude pilote est concluante (les lignées injectées vont entraîner une croissance tumorale), elle sera suivie de la seconde procédure : l'étude expériementale visant à étudier l'effet du médicament sur la croissance tumorale : 80 souris injectées avec les lignées modifiées pour la surexpression de l'ARN non codant et traitées ensuite soit avec le véhicule, soit avec le médicament. Ce nombre représente le nombre minimal de souris pour obtenir un résultat significatif d’un point de vue statistique en tenant compte de l’éventualité de mort précoce. Le nombre total de souris expérimentales sera de 104. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides).

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance évidente, les souris seront sacrifiées.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Pour cette expérience d’injection de lignées cellulaires murines sur des souris immunocompétentes, nous ferons correspondre la souche d'origine des lignées cellulaires avec celle des souris réceptrices. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 6 semaines. Le médicament à tester étant un inhibiteur des points de contrôle immunitaires, il convient que sa cible, la population de lymphocytes T, soit à son meilleur stade de développement. A 6 semaines, les souris présentent un système immunitaire développé et fonctionnel, que ne présentent pas des souris plus jeunes. Après cet âge, certaines sous-populations de cellules immunitaires ainsi que la fonction immunitaire globale commence à décliner : la diminution des lymphocytes T naïfs, l'augmentation des lymphocytes T à mémoire dont la fonctionnalité est réduite et la diminution de la diversité de la reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T entraînent l'immunosénescence.

80 lézards mâles adultes de deux espèces, capturés dans la nature ou en enclos semi-naturel, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés sur leur site de capture. Chaque animal subit une restriction d’eau poussée pendant huit jours jusqu’à une forte déshydratation, deux prises de sang et des mesures répétées de course et d’endurance, pour décrire l’effet de la déshydratation sur les performances locomotrices. Le porteur situe les retombées du côté de la prévision des effets du réchauffement climatique et de la sécheresse. Il fixe un point limite à 30 % de perte de masse et affirme que ces mesures sur animal vigile ne peuvent être remplacées par des modèles cellulaires ou informatiques.

Objectifs

Chez les ectothermes terrestres, le maintien de performances optimales suppose une régulation fine de la température corporelle et de l’état d’hydratation individuel. D’une part, les performances augmentent généralement avec la température avant de décliner brutalement auprès de la limite thermique critique maximale. La thermorégulation comportementale assure le maintien des températures corporelles autour de la gamme de ces températures optimales. D’autre part, les performances déclinent avec l’état de déshydratation. L’hydrorégulation comportementale assure le maintien d’un état d’hydratation optimal de l’organisme en fonction des besoins saisonniers ou du cycle de vie. Des travaux sur les amphibiens ont démontré que leurs capacités locomotrices chutaient après un seuil de déshydratation de l’ordre de 10-30% de perte de la masse corporelle. De plus, chez certaines espèces, la déshydratation influence la sensibilité thermique des performances en diminuant l’optimum thermique, la largeur de la niche thermique ou la limite thermique critique maximale. Cependant, il reste encore à mieux comprendre tous les facteurs qui expliquent les variations entre espèces et entre traits. Les ectothermes terrestres à peau sèche comme les reptiles sont aussi sensibles à la déshydratation même s’ils sont beaucoup plus résistants que les amphibiens. La déshydratation corporelle peut provoquer chez ces organismes la mort mais peut aussi engendrer des effets sub-létaux comme des réallocations d’énergie. L’analyse des relations entre déshydratation et performance chez ces espèces est encore très parcellaire. Aucune étude n’a quantifié les effets d’interaction de l’eau et de la température sur les performances locomotrices des reptiles. Cependant, une publication récente démontre une baisse de la tolérance thermique chez les lézards déshydratés. Ce projet vise donc spécifiquement à décrire la relation entre déshydratation et courbes de performance thermique de la locomotion chez deux espèces de lézards sensiblement différentes dans leurs adaptations thermiques à savoir le lézard vivipare (Zootoca vivipara) et le lézard des murailles (Podarcis muralis).

Bénéfices attendus

Les espèces sauvages de reptiles sont soumises à un double stress du changement climatique à savoir le réchauffement climatique et des évènements plus fréquents et plus prolongés de sécheresse. La capacité à prédire l’impact de ces changements climatiques dépend d’une bonne compréhension des effets interactifs de l’état d’hydratation et de la température corporelle sur les performances de ces espèces ectothermes. Les capacités locomotrices sont un indicateur des performances des animaux pour s’alimenter, se reproduire ou éviter les prédateurs, et ce projet va donc permettre pour la première fois de (1) quantifier le seuil de tolérance hydrique des capacités locomotrices chez deux espèces de lézards, et (2) de vérifier si une déshydratation impacte la tolérance thermique de ces espèces, en supposant que les animaux tolèreront moins des températures élevées s’ils sont déshydratés. Ces travaux permettront par ailleurs de mieux qualifier les seuils critiques de déshydratation chez ces deux espèces et donc d’améliorer notre suivi du bien-être animal dans les conditions d’élevage dans le futur.

Procédures

L'étude sera effectuée successivement sur 40 mâles adultes de deux espèces de lézards dont une espèce (lézard vivipare) prélevée dans des enclos semi-naturels en captivité et une autre espèce (lézard des murailles) prélevée en milieu naturel, soit 80 animaux au total. Après la capture, les animaux seront maintenus en acclimatation dans des cages individuelles pendant une semaine. Ils seront ensuite mesurés pendant une journée, transférés en habituation dans des grandes cages par paire et maintenus pendant deux jours d'acclimatation puis exposés soit à des conditions d'alimentation et d'eau ad libitum soit à des conditions expérimentales avec restriction de l'eau pendant 8 journées (10 individus dans le lot témoin, 30 dans le lot expérimental par espèce). Au début et à la fin de la période de manipulation, une prise de sang de 20 ul sur animal vigile sera effectuée pour quantifier l'osmolalité plasmatique (geste impliquant une contention de 2-3 minutes). Au début, au bout de 3-4 jours, puis au bout de 7-8 jours de manipulation, les performances locomotrices de sprint et d'endurance seront mesurés sur chaque animal à chaque fois pendant une journée. Après la manipulation, les animaux seront maintenus en cage individuelle dans des conditions d'alimentation et d'eau ad libitum pendant une semaine puis relâchés sur leur site de capture d'origine.

Impact sur les animaux

Nos protocoles sont choisis pour permettre de comparer des animaux dans des lots témoins (nourriture et eau ad libitum) à des animaux soumis à une restriction hydrique forte pendant 8 jours. Il s’agit d’une période courte de déshydratation qui reste écologiquement réaliste à la lumière de nos travaux précédents et des observations en conditions naturelles. Nous anticipons que les animaux soient faiblement déshydratés après 3-4 journées d’expérimentation puis fortement déshydratés après 8 journées, mais cet état est réversible et les animaux seront ensuite tous maintenus avec eau et alimentation ad libitum à la fin de l’étude. L’autre source de nuisance sera les mesures répétées de vitesse de sprint et d’endurance. Ces procédures induisent seulement un stress ponctuel au moment de la manipulation et éventuellement une fatigue des animaux. Les mesures de sprint seront effectuées plusieurs fois la même journée mais espacées d’une heure ce qui est suffisant pour permettre la récupération. Les mesures d'endurance seront effectuées sur plusieurs journées mais très espacées et après les mesures de sprint. Toutes ces procédures expérimentales sont pour l’essentiel non invasives en dehors de deux prises de sang qui sont très bien tolérées par les animaux adultes. Les lézards sont aussi très tolérants à la mise en élevage dans les conditions de captivité de ce projet et à la manipulation par un expérimentateur.

Devenir

Les animaux sont tous relâchés dans les enclos semi-naturels donc replacés en captivité dans des conditions extérieures proches du milieu naturel.

Remplacement

Cette étude consiste à mesurer sur des animaux vigiles les performances locomotrices en fonction de la température et l'hydratation, et elle ne peut donc se pratiquer avec des équivalents cellulaires, des modèles in silico ou des robots.

Réduction

Un échantillon très réduit d’animaux sera utilisé pour quantifier les conséquences de la déshydratation sur les performances locomotrices (40 individus maximum par espèce, 80 individus au total). Afin de réduire le nombre d'animaux, nous effectuerons trois mesures répétées sur chaque animal avant la manipulation, après une déshydratation faible et après une déshydratation plus forte. On exploitera cette gamme temporelle, exprimée à l'échelle individuelle par la perte de masse, pour quantifier la relation exacte existant entre déshydratation individuelle et performances locomotrices. Ainsi, le nombre de lots expérimentaux sera réduit. De plus, un échantillon minimum pourra être utilisé en étudiant uniquement une seule classe d'âge (adulte) et de sexe (mâle) ce qui permettra de réduire la variabilité initiale entre lézards et la prise en compte de covariables associées au plan expérimental.

Raffinement

On raffinera les conditions d'élevage grâce à un enrichissement des cages (utilisation d'abris, de zones de thermorégulation et d'un susbtrat pour les comportements fouisseurs) et à l'utilisation de conditions climatiques optimales du milieu naturel pour l'été (cycle thermique jour et nuit, éclairage optimale pendant la journée avec des conditions de lumières enrichies en UV) en dehors du stress de déshydratation. Des points limites associés à la perte de masse (perte de masse supérieure à 30% de la masse initiale ad libitum) seront appliqués avec arrêt des procédures expérimentales en cas de dépassement du point limite et basculement des conditions d'élevage des animaux vers des conditions d'alimentation et d'eau optimales ad libitum si les points limites sont dépassés.

Choix des espèces

Ce projet vise spécifiquement à décrire la relation entre déshydratation et courbes de performance thermique chez deux espèces de lézards sensiblement différentes dans leurs adaptations thermiques à savoir le lézard vivipare (Zootoca vivipara) et le lézard des murailles (Podarcis muralis). Le lézard vivipare est une espèce typique des milieux froids et humides et présente des taux de pertes hydriques cutanées élevés par rapport aux autres espèces de lézards du même groupe. Le lézard des murailles est une espèce saxicole qui affectionne les milieux plus chauds et plus secs et est plus résistant à la déshydratation. Le comportement des deux espèces est sensible à la déshydration ; notamment, il a été démontré pour le lézard des murailles des effets de la disponibilité en eau de boisson sur les préférences thermiques et les limites critiques maximales. Les animaux utilisés seront des animaux mâles adultes en bonne santé sur lesquels il est possible de faire des prises de sang répétées. En utilisant des adultes plutôt que des subadultes, on aura moins de variation de taille corporelle et on disposera d'animaux de plus grande taille plus faciles à manipuler pour les tests de performance de locomotion.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une polyarthrite leur est provoquée par une injection de collagène, puis ils reçoivent un anticorps trois fois par semaine pendant deux semaines, avant d'être tués pour prélever sang, rate, ganglions et une patte, afin de tester une immunothérapie contre la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que ce modèle entraîne une inflammation des articulations puis une atteinte du cartilage et des os. Il affirme que le produit n'a jamais provoqué d'effet dommageable chez le rat et que la phase préclinique sur l'animal est nécessaire avant un essai clinique.

Objectifs

L'objectif du projet est, dans un premier temps, d'identifier une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ; puis de tester l'efficacité d'un traitement par injection d'anticorps anti-CD45RC et enfin d'optimiser ce protocle de traitement dans l'objectif finale de réaliser une étude pré-clinique chez le rat pouvant aboutir sur un essai clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence le potentiel d'un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde et découler sur un essai clinique dont un grand nombre de patients pourrait bénéficier.

Procédures

Les animaux vont d'abord subir sous anesthésie une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue pour induire l'arthrite (10min de procédure de l'endormissement au réveil). Par la suite, les rats (vigiles) receveront un traitement par injection intrapéritonéale 3 fois par semaines pendant 2 semaines (pour chaque injection, 2min de procédure de la prise en contention à la fin de l'injection) . Deux fois au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés pour effectuer le prélèvement d'une petite quantité de sang dans la veine caudale après anesthésie locale (10min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat est déjà utilisé depuis plusieurs années. Celui-ci se caractérise par une inflammation des articulations avec, sur le long terme, une atteinte du cartilage, des os et l'installation d'une fibrose.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvement (sang, rate, ganglions et patte) et réaliser une analyse immunologique et anatomopathologique.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsque le modèle expérimental existe. Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. L'utilisation de celui-ci est nécessaire pour évaluer de manière exhaustive les effets ciblés, et potentiellement systémiques, du traitement sur les différents organes et fonctions de l'organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement. Par ailleurs, la réalisation d'une première étude pilote sur un faible nombre d'animaux permettra de s'assurer de l'intérêt et de la bio-sécurité du projet avant de faire entrer un plus grand nombre d'individus dans la procédure.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections répétés de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et les symptômes seront évalués 3 fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batôn de bois,...).

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est utilisé dans le modèle d'arthrite induite par injection de collagène depuis de nombreuses années. Ce modèle animal s'avère pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. De plus, nous avons déjà testé notre traitement dans d'autres modèles expérimentaux chez le rat, ainsi nous savons que notre produit n'a jamais induit d'effets dommageable chez cette espèce. Les rats seront utilisés au stade adulte (environ 8 semaines) qui est le stade le plus couramment utilisé pour le modèle d'arthrite induite par injection de collagène.

1176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, jusqu'à seize sur la joue chez l'animal vigile, un prélèvement dans le fémur, des injections et des gavages, certaines lignées développant une leucémie suivie sur environ un an, pour étudier l'effet du vieillissement sur la formation du sang. Le porteur affirme que les points limites précoces font qu'aucun effet indésirable n'est à prévoir, malgré une gravité déclarée modérée. Il indique que la leucémie et le vieillissement forment des modèles intégrés que la culture in vitro ne peut reproduire.

Objectifs

Les deux objectifs de ce projet sont de déterminer l'impact du vieillissement sur l'hématopoïède normale et leucémique

Bénéfices attendus

La détermination de l’impact de l’âge sur la fonction des CSH pourrait aider à comprendre les mécanismes qui induisent la survenue de syndromes myéloïdes chez les sujets âgés et ainsi améliorer la prise en charge et les traitements des patients

Procédures

Prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire, durée 1min, nombre : pour la procédure 3, 16 Prélèvement intrafémoral sur animaux anesthésiés, durée 2min, nombre : 1 fois pour toutes les procédures Injections intrapéritonéales sur animaux vigiles : durée 1 min, nombre : 1fois par expérience pour la procédure 2 Gavages sur animaux vigiles : durée 1min, 1 fois pour toutes les procédures

Impact sur les animaux

Les points limites étant précoces, aucun effet indésirable n'est à prévoir sur les animaux

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de récupérer les échantillons (tissus, sang) nécessaires pour étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu (génétiques, transcriptomiques, étaboliques, protéiques, phénotypiques)

Remplacement

Les leucémies ainsi que le vieillissement sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal. De plus, nos modèles murins permettent de suivre les cellules souches hématopoïétiques donnant la possibilité d’étudier leurs fonctions dans un environnement physiologique natif à la fois au cours du vieillissement mais également lors du développement de leucémies.

Réduction

les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de diminuer le nombre d’animaux utilisés. De plus lors de l’établissement des lignées, l'élevage sera minimisé le plus possible pour ne produire que les animaux nécessaires

Raffinement

les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre à la fois de diminuer le nombre d’animaux utilisés mais également de détecter l’apparition de cellules leucémiques très précocement ce qui permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leurs naissances à leurs morts, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Ainsi, la surveillance des souris sera faite quotidiennement ce qui permettra de prendre des mesures spécifiques pour le bien-être de ces animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. C’est la raison pour laquelle l’ensemble des techniques de la transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. De surcroit, toute la collection des systèmes Cre-lox nécessaires à nos études n’existe que chez la souris. Nous utiliserons des souris jeunes de 8 à 10 semaines lorsqu’elles ont atteint leur maturité sexuelle pour les deux lignées murines. Les souris âgées auront 18 à 20 mois pour la lignée MAP17 Tomato et 12 mois pour la lignée KSB (puisque la cinétique de la maladie est d’environ 1an)