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Analyse de la réponse immunitaire innée mise en place lors d’infections respiratoires chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de la grippe ou le pneumocoque par voie nasale sous sédation, à des doses conçues pour reproduire une infection sévère qui, non contrôlée, entraîne la mort des animaux en quelques jours. Le porteur indique que les souris perdant 25 % de leur poids ou devenues léthargiques sont tuées, et que toutes sont euthanasiées pour prélever poumons et rate. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de la réponse immunitaire d'un "organisme entier".
Objectifs
Les pathologies respiratoires ont un impact médical et socio-économique très important. L’organisation mondiale de la santé classe ainsi les pneumonies et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) parmi les dix principales causes de décès au niveau mondial. En particulier, les infections respiratoires représentent plus de 2 millions de décès par an. Ces chiffres soulignent la limite des traitements anti-infectieux actuels, comme l’absence de traitement efficace sur la plupart des virus respiratoires ainsi que la résistance aux antibiotiques des bactéries qui atteint désormais des proportions dangereuses dans toutes les régions du monde. Par exemple, l’efficacité du vaccin contre le virus influenza a été démontrée depuis de nombreuses années mais les perpétuelles mutations de ce virus obligent une nouvelle vaccination chaque année. Ainsi, le virus de la grippe provoque toujours des épidémies saisonnières avec une forte morbidité et plus occasionnellement des pandémies de grande envergure. Un autre exemple est la recrudescence de pneumonies dues à la bactérie Streptococcus pneumoniae. L’immunité innée joue un rôle clé dans la réponse de l’hôte contre le pneumocoque permettant le confinement de l’infection et la destruction de la bactérie. Néanmoins, dans certains cas, le système immunitaire peut être dépassé aboutissant à une pneumonie, une méningite et/ou une septicémie. Bien que des traitements aient été développés (vaccins polysaccharidiques multivalents, antibiotiques), les pneumonies à pneumocoques restent à très forts risques de mortalité. Ainsi, les infections respiratoires ne sont actuellement en aucun cas sous contrôle. Ces données soulignent donc le besoin urgent de développer une recherche innovante visant à mieux comprendre la physiopathologie des pathologies respiratoires. Les progrès dans les années à venir devront venir de la découverte de nouvelles cibles et/ou de molécules anti-infectieuses mais également par une régulation des réponses immunitaires de l’hôte. Cette dernière approche présentant l’avantage de ne pas cibler directement l’agent infectieux et donc de s’affranchir des problèmes de variabilité des pathogènes décrits ci-dessus. L’objectif des projets de recherche que nous développons est ainsi de caractériser le rôle et les mécanismes d’activation des cellules du système immunitaire inné au cours des infections pulmonaires afin de permettre le développement de molécules immunomodulatrices ciblant ces cellules.
Bénéfices attendus
Comme décrit précédemment, d’autant plus souligné par la récente pandémie lié au pathogène respiratoire SARS-COV2, les pathologies respiratoires infectieuses sont une préoccupation majeure mondiale. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc essentielles pour améliorer le pronostic vital des personnes infectées. Une des pistes est de pouvoir optimiser notre système de défense, mais cela nécessite une meilleure connaissance de ce dernier. Dans ce contexte, notre objectif vise à mieux comprendre le rôle du système immunitaire inné dans les mécanismes de défense liés à ces infections respiratoires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur la mise en place de la réponse immunitaire pulmonaire suite à des infections d’origine virale et microbienne. Plus particulièrement, nous travaillons sur des populations de cellules découvertes récemment et résidentes dans le poumon. Cette localisation leur permet de s’activer très rapidement lors de l’arrivée d’un pathogène dans le tissu pulmonaire. Une meilleure connaissance de ces cellules pourrait permettre de 1) comprendre des différences de susceptibilité de certains patients aux infections respiratoires, 2) identifier des biomarqueurs cellulaires ou moléculaires de susceptibilité et 3) identifier des cibles thérapeutiques afin de moduler la réponse immunitaire de l’hôte et non pas en ciblant le pathogène.
Procédures
Toutes les hypothèses, issues de la littérature, seront évaluées, au préalable, sur des modèles in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (cellules issues de donneurs de sang humains). Seuls les paramètres d’intérêts seront sélectionnés afin d’être testés in vivo chez la souris. En effet, il n’existe pas de modèles in vitro ou ex vivo capables de reproduire la complexité d’une réponse immunitaire d’un organisme vivant. Afin de reproduire les infections par des pathogènes respiratoires, les souris seront infectées par des suspensions contenant soit le virus de la grippe soit la bactérie pneumocoque. Pour cela, les souris seront sédatées par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine puis quelques gouttes (40µL) de la suspension contenant l’agent pathogène ou de la solution contrôle seront déposées sur les narines des animaux afin qu’ils les respirent. Cette intervention dure quelques secondes puis les souris seront surveillées jusqu’à leur réveil (15-20 min). Ainsi les pathogènes se déposent dans les voies aériennes supérieures et peuvent infecter les cellules pulmonaires, à l’image d’une infection chez l’homme lorsque les microbes sont transmis dans des gouttelettes projetées lors d’un éternuement ou d’une toux. Deux différentes doses seront testées : une dose modérée mimant une infection modérée et une dose forte permettant de reproduire une infection sévère. Sur les animaux de la procédure 1, trois prélèvements sanguins seront réalisés en submandibulaire (1 avant l’infection et 2 à différents temps après l’infection) afin de suivre certains paramètres inflammatoires systémiques. Cette procédure dure quelques secondes. Les souris seront toujours anesthésiées avant de procéder au prélèvement sanguin. Tout au long des expériences, les souris seront soigneusement surveillées quotidiennement pour détecter les changements physiques ou comportementaux. Ainsi, le poids et les comportements, seront relevés chaque jour. La réponse immunitaire pulmonaire sera analysée à différents temps : deux temps (précoce et tardif) lors des infections par le virus de la grippe et par le pneumocoque. Pour cela, les animaux seront euthanasiés par une injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (doléthal). Après la mort de l’animal, différents fluides biologiques (sang et lavage broncho-alvéolaire) et organes (poumons et rate) seront collectés pour analyser les réponses immunitaires mises en place.
Impact sur les animaux
Dans les cas les plus graves, la mort d’un patient suite à une infection respiratoire est la conséquence soit d’un défaut de contrôle du pathogène, soit d’une inflammation massive des voies respiratoires induite par le pathogène, provoquant un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Notre modèle d’infection par le pneumocoque chez la souris est représentatif de la 1ere catégorie. En effet, il provoque une infection très aiguë et rapide qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit à la mort des animaux en quelques jours. A l’inverse, le modèle d’infection grippale reproduit très bien la seconde catégorie où les mécanismes inflammatoires sont dérégulés et aboutissent à la mort des animaux à des temps plus tardifs. Ces infections entrainent donc des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal et provoquer des troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité. Afin de mimer une infection pulmonaire par voie aérienne, les souris seront infectées par voie intranasale. Cette procédure nécessite une anesthésie générale qui peut provoquer une nuisance à l’animal (refroidissement, stress). Cette instillation pulmonaire des pathogènes entraine également l’arrivée de liquides dans les poumons. Cette procédure provoque un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. Par ailleurs, chaque injection intrapéritonéale pour réaliser les anesthésies provoque un stress et une douleur au point d’injection (piqûre).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. En effet, concernant la procédure 1, l’ensemble des animaux auront été euthanasiés lors de la procédure afin de collecter la rate et les poumons pour analyser les réponses immunitaires se développant dans ces organes. Il ne restera donc pas d’animaux vivants en fin de procédure. Concernant la procédure 2, les animaux qui survivront à l’infection seront conservés jusqu’à ce qu’ils aient récupérés entièrement leur poids. Les animaux seront alors euthanasiés car ils ne peuvent être ni replacés ni adoptés car ce sont des animaux transgéniques infectés en confinement A2. De plus, la réutilisation de ces animaux n’est pas possible car la procédure subie pourrait drastiquement modifier les résultats d’une étude ultérieure.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de mimer la complexité des réponses immunitaires à l’échelle d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe et par le pneumocoque est bien établi et maîtrisé par les expérimentateurs. Cependant, nous utilisons au laboratoire, des systèmes de culture in vitro (hybridomes de cellules immunitaires), pour étudier certains paramètres avant de réaliser des expériences in vivo. De plus, nous avons développé des modèles d’analyses des cellules humaines issues de donneurs sains ou de patients atteints par des infections respiratoires et hospitalisés dans des services de pneumologie (pathologie modérée) et dans des services de réanimation (pathologie sévère). Ces modèles nous permettent d’analyser et d’affiner certaines hypothèses avant de les tester in vivo chez la souris. Ils permettent également de confirmer chez l’Homme, les résultats obtenus chez la souris.
Réduction
Tout d’abord, nous tenons à souligner que les expériences in vitro et ex vivo chez l’Homme, limiteront le nombre d’hypothèses et donc le nombre de souris à utiliser. De plus, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Lors de nos expérimentations, nous comparerons les souris traitées aux souris non traitées, en utilisant un test statistique pour échantillons indépendants. Nous estimons à 15 % minimum la différence de nos moyennes et nous souhaitons une puissance de test de 90% minimum. Pour chaque condition, 16 souris infectées (8 mâles et 8 femelles) et 16 souris non infectées (8 mâles et 8 femelles) seront nécessaires. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée de façon pluriquotidienne par toujours les mêmes expérimentateurs afin d’habituer les animaux et pour détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. De plus, une pesée quotidienne des animaux sera effectuée. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi les points limites suivants: - Perte de 25% de leur poids initial -Etat général indiquant une douleur (animal léthargique, ne répondant plus aux stimuli externes, prostré, fermeture totale ou partielle des yeux). Les souris présentant un de ces critères seront euthanasiées.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons des souris consanguines. Nous avons choisi la souris (Mus musculus), car elle offre les avantages suivants : - La souris est l’espèce la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires limitant de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. - Les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Les résultats obtenus ex vivo sur les cellules humaines pourront être mieux extrapolés aux expérimentations in vivo. - Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. - Notre laboratoire dispose de différentes lignées de souris transgéniques adaptées à l’analyse de la réponse pulmonaire anti-infectieuse. De plus, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant.
Role de l’environnement des nerfs périphériques dans leur développement et régénération chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
2 900 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les adultes sont génotypés jusqu'à deux fois par prélèvement d'un morceau de nageoire sous anesthésie, et des alevins subissent une ablation d'un nerf moteur au laser suivie d'une observation par fluorescence, pour étudier la régénération nerveuse. Les adultes sont tués par surdose d'anesthésiant une fois la génération suivante obtenue, les alevins par anesthésie puis commotion cérébrale pour l'histologie. Le porteur affirme à plusieurs reprises que la douleur est "minimisée", en s'appuyant sur le stade précoce des alevins et la rapidité de régénération de l'espèce.
Objectifs
Les motoneurones qui résident dans la moelle épinière constituent le relai final entre le système nerveux central et le muscle squelettique, responsable du mouvement. Au cours de leur différenciation, les motoneurones émettent des axones qui sortent de la moelle épinière pour suivre une trajectoire stéréotypée pour atteindre leur cible musculaire. Ce processus est orchestré par tout un répertoire de molécules présentes dans l’environnement des axones. Après lésion des nerfs moteurs, l’environnement va à nouveau servir pour le guidage des nerfs afin qu’ils puissent retourner vers leur cible musculaire initiale. L'importance de l'environnement au cours de la régénération des nerfs moteurs sera étudié chez des jeunes alevins de poissons zèbres dont deux gènes de molécules de guidage ont été mutés. Les mutations ne devraientt pas induire de phénotype dommageable permettant l’élevage des poissons. Afin de visualiser les nerfs moteurs et les cellules impliquées dans le processus de régénération, ces poissons auront préalablement été croisés avec 5 lignées transgéniques fluorescentes. Les nerfs sont lésés par ablation laser chez les jeunes alevinsde 4 jours post-fécondation (stade non couvert par la loi sur l'expérimentation animale). Le processus de régénération sera ensuite suivi in vivo par fluorescence, de manière non invasive pendant 2 jours.
Bénéfices attendus
Depuis plus de 40 ans, le poisson zèbre a été un modèle très utilisé pour comprendre la fonction des gènes. Il a même permis de corréler entre un locus donné et une pathologie humaine. Notre étude permettra de comprendre l’importance des deux protéines de l'environnement dans le développement et la régénération des nerfs moteurs et pourra apporter des arguments supplémentaires sur leur implication potentielle dans les maladies neuro-musculaires. En effet ll'une d'entre elle a déjà été mentionné comme candidat potentiel pour des neuropathies bien qu’aucune maladie humaine n’ait été associée avec une mutation dans ce gène pour l’instant. Chez l'homme, les nerfs périphériques sont aisément lésés et leur régénération est lente et souvent incomplète. En fait, moins de la moitié des patients qui subissent une réparation après lésion récupèrent de bonnes fonctions motrices et sensorielles. L’amélioration des connaissances fondamentales dans les molécules impliquées dans la régénération des nerfs moteurs est donc essentielle et ces données auront une application dans la médecine régénérative
Procédures
Les poissons seront génotypés au maximum 2 fois durant leur vie à partir de 3 mois (âge adulte) par prélevement d'un petit échantillon de la nageoire caudale afin de déterminer les poissons homozygotes à l'aide de ciseaux stérilisés à l'alcool 70% puis rincés à l'eau stérile. Le prélèvement se fait sous anesthésie et la procédure totale dure trois minutes. L'animal est immédiatement transféré dans le bac de réveil dont l'eau est correctement aérée jusqu'à la reprise totale de ses capacités soit 1 à 2 min. La nageoire régénère naturellement en 10 jours sans que cela n'impacte sur la nage du poisson.
Impact sur les animaux
Compte tenu des données obtenues chez les souris invalidées pour les deux gènes et du fait de leur faible fonction chez l'organisme adulte, les poissons adultes homozygotes ne devraient pas présenter de phénotype dommageable. En revanche, les poissons doublement mutants pourraient être plus sensibles aux conditions d'élevage avec un vieillissement plus précoce consistant en une baisse de la reproduction et des animaux amaigris. Concernant les alevins subissant une ablation du nerf moteur, la douleur devrait être minime compte tenu du stade auquel l'expérimentation est effectué : 4 jour post-fécondation alors que le poisson est hors cadre de la législation. A ce stade, le système nerveux central n'est pas encore mature et les comportements complèxes ne sont pas encore présents. De plus la lésion d'un seul nerf moteur dans le tronc correspond à 1,7% des nerfs totaux. Des études ont aussi montré que chez des alevins de 5 jours post-fécondation (stade couvert par la législation), les marqueurs de la douleur revenaient rapidement à la normale en 24 h suivant le stimulus nociceptif. Aussi, les alevins agés de 5 jours-post fécondation ne devraient pas non plus ressentir de douleur puisque cela correspond à 24 h suivant l'ablation. Enfin, le poisson zèbre est un modèle animal qui a une forte capacité de régénération de nombreux organes comme le coeur et le cerveau. Une complète régénération du nerf moteur est observé 48 h après ablation chez le jeune alevin wt.
Devenir
Les animaux d’environ 1 an et 4 mois sont mis à mort par surdose d'anesthésiant quand ceux de la génération suivante atteignent la maturité sexuelle et sont capables de se reproduire afin de donner de nouveaux embryons, et donc alevins qui serviront à l’étude de la régénération. Tous les alevins pour l’étude de la régénération seront mis à mort par anesthésie suivie d'une commotion cérébrale afin de pouvoir réaliser des études histologiques.
Remplacement
Le processus de régénération des nerfs intervient dans un environnement complexe qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro. Nous utiliserons le poisson zèbre plutôt que le modèle de la souris déjà établi car il permet de visualiser in vivo le processus de régénération par fluorescence de manière non invasive.
Réduction
La capacité de fécondation externe du poisson zèbre permet d'obtenir facilement des embryons sans mise à mort des parents et donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre de poissons a été réduit au minimum de deux lots de 20 pour chaque lignée. Ce nombre est nécessaire à la fois pour assurer la pérénité de chaque lignée et pour permettre aux poissons de se développer correctement et d'avoir correctement accès à la nourriture. Contrairement à la souris, chez le poisson zèbre il est nécessaire d'effectuer un brassage génétique en utilisant suffisamment de couples pour obtenir une nouvelle génération. De plus, il n'y a pas de chromosome sexuel, aussi il est difficile de contrôler le ratio mâles/femelles. Enfin ce nombre de 20 poissons par bac est important pour le bien être de l'animal puisque le poisson zèbre est un animal grégaire il est nécessaire de l'élever en un nombre suffisamment important pour permettre les interactions sociales.
Raffinement
Des points limites adaptées à la procédure et suffisament prédictifs et précoces ont été établis pour éviter tout mal être de l'animal. Au cours de l'élevage, le bien être des poissons sera vérifié de manière hebdomadaire tout au long de la vie des animaux. Les animaux qui présentent des phénotypes tels que animaux ne se nourrissant pas, animaux amaigris, animaux présentant des défauts musculo-squelettique (scoliose, lordose, ...), animaux présentant un comportement indicatif d'un stress chronique (animaux isolés au fond d'un bac, décolorés, ...) seront mis à mort afin d'éviter toute souffrance. Après ablation d’un nerf moteur, le réveil des alevins sera surveillé. Un retour à l'activité motrice en absence d'anesthésiant apparait en quelques minutes. Puis l’état des alevins sera suivi quotidiennement sous stéréoscope (soit à 5 et 6 jours post-fécondation). Tout alevin présentant un défaut de flotabilité, restant au fond du puit dans la boîte 12 puits sera mis à mort.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un bon modèle pour l'étude du développement des nerfs moteurs. Le développement du système nerveux périphérique moteur est relativement simple. Concernant l’étude de la régénération des nerfs périphériques, grâce à l'utilisation de lignées transgéniques fluorescentes la régénération des nerfs peut être suivie in vivo en temps réel par fluorescence donc de manière non invasive chez les alevins. Les embryons sont obtenus sans souffrance après accouplement naturel de poissons adultes puisque la fécondation se fait ex utero. De plus chez les alevins de type sauvage, les nerfs régénèrent rapidement, en 48 h après ablation. Enfin, lorsque le nerf est sectionné par ablation laser, l'alevin est âgé de 4 jours post-fécondation, il peut encore se nourrir à partir de son sac vitellin et est ainsi indépendant. Il ne devient sous la dépendance de la loi qu’à partir de 5 jours post-fécondation alors que le phénomène de régénération a déjà commencé, ce qui signifie que la condition de souffrance est minimisé Des poissons adultes de 4 à 16 mois homozygotes et hétérozygotes adultes seront utilisés pour obtenir des embryons homozygotes ou hétérozygotes par accouplement naturel puisqu'à ce stade, ils sont pleinement fertiles. Des alevins de 4 à 6 jours post-fécondation seront utilisés pour étudier le processus de régénération. Tandis que les organes se développent rapidement chez les embryons et alevins de poisson zèbre; le système nerveux central reste encore primitif jusqu'à 5 jours post-fécondation. De plus il a déjà été montré que la régénération s'effectuait de manière rapide : en 2 jours il y a régénération complète ce qui signifie que la douleur ressentie est minimisée.
Réponse de l’épithélium broncho-alvéolaire lors d’une irradiation pulmonaire en conditions stéréotaxiques chez la souris : focus sur les cellules club
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 168 dans des procédures de gravité sévère et 576 de gravité modérée. Elles reçoivent une irradiation pulmonaire de 80 Gy sous anesthésie et des injections de naphtalène destinées à détruire un type de cellules pulmonaires, pour mesurer leur rôle dans la fibrose radique. Le porteur indique n'avoir aucun recul au-delà d'un mois sur cette association et que les lésions pourraient provoquer des difficultés respiratoires, les prélèvements étant réalisés post-mortem à un et six mois. Il reconnaît que des organoïdes pulmonaires pourraient remplacer en partie les animaux mais que le laboratoire n'est "pas armé" pour les mettre en place.
Objectifs
La qualité de la prise en charge thérapeutique du cancer inclut la qualité du contrôle tumoral et la qualité de vie des patients, avec une espérance de vie de plus en plus longue c. La radiothérapie est très efficace mais génère des séquelles pouvant compromettre sévèrement la qualité de vie. Nous étudions les effets des rayonnements ionisants sur les poumons qui sont des organes à risque pour le traitement des tumeurs thoraciques (e.g. poumon, sein). La réponse pulmonaire aux rayonnements ionisants fait l’objet de nombreuses publications, mettant en avant le rôle de plusieurs types cellulaires dans le développement des dommages radio-induits, dont les pneumocytes de type I et II et les cellules endothéliales de la microvascularisation pulmonaire. Nous avons pu identifier un type cellulaire, les cellules club, comme candidat intéressant dans la cinétique de développement de la fibrose pulmonaire. Ce sont des cellules situées sur l’épithélium bronchiolique et qui sont impliquées dans la protection de l’épithélium bronchiolique et dans la détoxification pulmonaire. Ce sont également des cellules souches potentielles, capables de se diviser et se différencier pour reconstruire l’épithélium endommagé. La protection épithéliale passe entre autres par la synthèse et la sécrétion d’une protéine (dont la diminution a été associée au développement de certaines pathologies comme la broncho-pneumopathie obstructive chronique). Dans nos travaux sur l’effet de la dose, du volume et du protocole de fractionnement sur les lésions pulmonaires, nous avons remarqué que les conditions d’irradiation aboutissant à de la fibrose pulmonaire étaient systématiquement associées à une diminution sévère du nombre de cellules club dans les bronchioles. Dans les schémas ne générant pas de fibrose, les cellules club n’étaient pas déplétées. L’objectif du projet est d’utiliser un modèle de déplétion transitoire des cellules club afin de déterminer l’impact de ce type cellulaire sur le développement des lésions radiques pulmonaires. La déplétion des cellules club est induite par injection unique de naphtalène par voie intra-péritonéale. La déplétion par le naphtalène est transitoire. Ce modèle est très utilisé dans la bibliographie et ne provoque pas de conséquence clinique notable chez les animaux.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle des cellules club dans la réponse aux rayonnements ionisants, et globalement de la réponse de l’épithélium bronchiolique, peut permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires.
Procédures
Tous les animaux : Irradiation 80 Gy, sous anesthésie (durée max 40 min) Selon les procédures et lots : - Injection intra-péritonéale sur animal vigile (unique ou répétée, jusqu’à une injection par semaine pendant 24 semaines) - Instillation nasale sous anesthésie (1 fois par semaine pendant 3 semaines) - Scanner sous anesthésie (4 minutes, max 4 fois)
Impact sur les animaux
D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation focale pulmonaire à une dose de 80 Gy ne génère pas de conséquences cliniques notables jusqu’à 6 mois post-irradiation. L’absence de cellules club au moment de l’irradiation pourrait aggraver la sévérité des lésions. Sur l’association naphtalène/80 Gy nous avons un recul d’un mois, sans effet clinique notable. Aucune donnée n’est disponible pour le point 6 mois. Si les lésions sont fortement aggravées, les animaux pourraient développer des difficultés respiratoires.
Devenir
Tous les prélèvements aux points d’étude 1 et 6 mois seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré. Il existe des modèles in vitro pouvant remplacer en partie l’utilisation d’animaux, à savoir les organoïdes pulmonaires. Ces modèles sont complexes à mettre en place et le laboratoire n’est pas armé à ce jour pour construire de tels modèles.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer les tests statistiques requis, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 8 animaux pour chaque groupe irradié pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées. Pour les groupes contrôles, 6 animaux sont suffisants. Pour les analyses en single cell RNA seq, le nombre d’animaux sera réduit à 3 à 4 par groupe, nombre suffisant pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (mise en place de grilles de score, suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, hébergement en groupe avec enrichissement).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 8 et 34 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Rôle de TRPV3 et de l’innervation sensorielle dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
360 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées sont exposées à une chaleur croissante de 33 à 44 °C mimant une canicule et à des mesures cutanées sous anesthésie, pour étudier le rôle du récepteur TRPV3 dans les défauts de thermorégulation au cours du vieillissement. L'exposition à la chaleur est arrêtée si la température rectale monte de 4 °C, et les souris sont tuées par dislocation cervicale pour des prélèvements terminaux. Le porteur qualifie ses techniques d'indolores et annonce, "à terme", des pistes de traitement pour les personnes âgées vulnérables aux vagues de chaleur.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la thermorégulation vasculaire de la peau. Avec le réchauffement climatique et le vieillissement de la population, les vagues de chaleur vont avoir un effet critique grandissant sur notre système de santé. En effet, la population âgée est particulièrement vulnérable aux épisodes caniculaires dû à une altération de la thermorégulation conduisant à une incapacité à dissiper la chaleur et pouvant entraîner de graves complications voire un décès. Bien que ces défauts soient rapportés au cours du vieillissement depuis longtemps, les mécanismes qui sous-tendent ces défauts fonctionnels ne sont pas encore connus, ce qui limite fortement les approches thérapeutiques envisageables pour les personnes âgées. Les thermorécepteurs TRPV3 exprimés dans la peau sont mis en jeu dans les processus de sensation de température et dans la thermorégulation vasculaire cutanée. Ce projet vise à caractériser le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de l’épiderme (couche superficielle de la peau) dans les mécanismes neurovasculaires cutanés de la thermorégulation au cours du vieillissement, en utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de bloquer la fonction de TRPV3 ou ayant un défaut d’innervation cutanée.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de la thermorégulation au cours du vieillissement permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de thermorégulation qui peuvent affecter la population âgée.
Procédures
Les lignées de souris nécessaires pour ce projet sont déjà disponibles et présentent à l’âge adulte jeune un défaut de réponse vasculaire au chauffage local mais ne présentent pas de trouble susceptible d'affecter leur bien-être dans les conditions d’hébergement standard. Les souris seront anesthésiées (durée environ 45 minutes) afin d’effectuer des mesures non invasives pour caractériser la fonction barrière et leur capacité vasculaire cutanée lors d’une exposition à un chauffage local ou un chauffage global mimant un épisode de canicule. Une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) sera également envisagée chez des souris vigiles afin de mesurer leur capacité à maintenir leur température interne stable dans ces conditions thermiques mimant une canicule. Les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de la peau au cours du vieillissement nous étudierons des souris d’âge différents (jeunes, matures et âgées).
Impact sur les animaux
Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Pour les mesures sur souris vigiles, l’utilisation de tubes de contention peut générer un stress qui sera minimisé grâce à une habituation préalable. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention pendant 10 minutes, deux jours différents dans les 7 jours précédents. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 des pattes ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. L’exposition à un chauffage globale de la souris va déclencher des mécanismes de thermorégulation périphériques et centraux, induire une sudation afin de préserver une température interne le plus stable possible. Notre étude précédente a montré que les souris exposées à un chauffage passif de 33 à 44°C à raison de +1°C/min induisait une augmentation de la température rectale d’environ 3°C (en vigile et sous anesthésie). Afin de limiter les effets indésirables, l’exposition à la chaleur sera immédiatement arrêtée si l’augmentation de la température rectale atteint +4°C (en vigile ou sous anesthésie). Les souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.
Devenir
Mise à mort par dislocation cervicale. Cette étude vise à comprendre le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet du vieillissement sur la réactivité vasculaire (mesures ex vivo sur vaisseaux isolés) et l'expression de TRPV3 dans la peau.
Remplacement
Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la réactivité vasculaire cutanée en réponse au chauffage qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 360. Ce nombre maximal inclut la possibilité de reproduire les expériences en cas d'imprévu, donc il est très vraisemblable que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée hebdomadaire). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les même approches (laser Doppler, iontophorèse), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique au cours du vieillissement, les souris seront utilisées à 3 âges différents (18 mois).
Caractérisation du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate dans l’enthésopathie des souris TgA86
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ce sont des souris transgéniques qui développent spontanément une arthrite touchant les quatre membres et la queue, avec gonflement articulaire, ankylose et un poids réduit d'environ 20 %, et qui reçoivent un inhibiteur dans leur eau de boisson. L'intervention décrite se limite à un prélèvement de sang à la queue sous anesthésie, les animaux étant tués pour analyse du sang et histologie des pattes. Le porteur revendique une bonne "transférabilité" de ses résultats obtenus in vitro et vise à comprendre l'ossification pathologique de l'articulation.
Objectifs
Les spondyloarthrites (SpA) touchent préférentiellement les enthèses, zones où les ligaments, les tendons et les capsules articulaires s’insèrent dans l'os via une zone cartilagineuse. Périphériques et/ou axiales, elles sont caractérisées par des enthésopathies. Elles présentent deux manifestations cliniques majeures : des enthésites et la formation d’enthésophytes périphériques et/ou syndesmophytes vertébraux, consécutive à l'ossification cicatricielle de l'enthésite et pouvant aboutir à une ankylose. Nous souhaitons valider in vivo les hypothèses émises à partir de nos résultats récemment publiés suggérant une implication du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate (S1P) dans l’inflammation et l’ossification ectopique de l’enthèse. Le premier objectif de ce projet est de caractériser les modulations du métabolisme de la S1P dans un modèle murin d’enthésopathie, au niveau systémique et au niveau local dans l’enthèse d’une articulation atteinte. Le deuxième est d’évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur l’ossification ectopique de l’enthèse. Nous utiliserons à ces fins un modèle transgénique de souris présentant des enthésopathies de type SpA et un inhibiteur pharmacologique général de la voie S1P.
Bénéfices attendus
La zone de transition entre l'os et les tendons est susceptible de pathologie frequente nommée enthésopathie c'est à dire des rhumatismes inflammatoires chroniques (SpA). Un lipide d'interet appelé sphingosine 1 phosphate (S1P) pourrait être impliqué dans ces pathologies articulaires. Notre but est de determiner son role sur un modele de souris exprimant cette pathologie articulaire. Notre objectif est d’apporter une contribution importante dans la compréhension de la physiopathologie des enthésopathies, l’axe S1P étant potentiellement impliqué dans la formation d'os dans les zones articulaires ce qui rigidifie l'articulation et la rend douloureuse à la mobilisation . La physiopathologie des rhumatismes inflammatoires chroniques est toujours méconnue et peu de données sont disponibles sur les mécanismes de la néoformation osseuse, en particulier. Aussi, nous allons évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur l’enthésopathie dans notre modèle et particulièrement sur l’ossification de la zone d'insertion ligament - os . Ce blocage pourrait à la fois favoriser la restauration de l'homéostasie osseuse et agir en tant qu'agent immunosuppresseur. A terme, nos données pourraient fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients, qui n’est actuellement pas entièrement satisfaisante, en particulier sur l’ankylose.
Procédures
Un prelévement de sang quelques gouttes au niveau de la queue sur animal anesthésiée et sous analgésie une fois dans le protocole.
Impact sur les animaux
• Les manifestations axiales et périphériques apparaissent dès l'âge de 3/4 semaines puis s'aggravent graduellement jusqu’à la semaine 12/16, où un plateau est atteint. Les signes cliniques d'arthrite sont développés dans les quatre membres et la queue, sans distinction de sexe. Les signes cliniques périphériques consistent en un gonflement articulaire et une déformation généralisée des membres et des doigts. L’atteinte axiale, plus sévère, est caractérisée par une queue courbée et, plus tardivement, par une ankylose. Les déviations apparaissent dès l'âge de 4 semaines et leur nombre augmente progressivement. • Les souris TgA86 présentent un poids corporel et une longueur de corps significativement réduits par rapport aux souris WT (environ -20% et -10% à 15 semaines, respectivement).
Devenir
Euthanasie pour analyse de sang et histologie
Remplacement
Notre équipe travaille sur les mécanismes d’ossification pathologique. Nous nous intéressons en particulier à l’ossification de l’enthèse arthritique dans le cadre des spondylarthrites et autres enthésopathies. Nous avons obtenu des résultats prometteurs in vitro démontrant l’implication du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate (S1P) dans l’inflammation et l’ossification ectopique de l’enthèse. Nous avons jusqu’ici utilisé des modèles murins de culture organotypique et cellulaire, ce qui laisse supposer une bonne transférabilité de nos résultats in vivo chez la souris. Nous avons montré que la voie métabolique de la S1P est cruciale dans le processus de minéralisation cellulaire en utilisant différents inhibiteurs pharmacologiques : PF-543, K-145, SKi, W146, BML-241, VPC 23019 et finalement FTY720. In vitro, l'inhibition générale de la voie métabolique de la S1P par cette molécule FTY720 a donné les résultats les plus interessants. Notre objectif est à présent de valider nos hypothèses in vivo.
Réduction
• L’étude principale ne sera réalisée que si l’étude préliminaire donne les résultats attendus, c’est-à-dire que la présence de FTY720 dans l’eau de boisson ne modifie pas la prise d’eau/croquettes quotidienne par les animaux et n’induit pas une trop forte lymphopénie. • Un total de 30/36 animaux sera nécessaire pour réaliser l'analyse statistique de notre étude principale (10/12 animaux par groupe). Pour chaque animal, le sang sera prélevé et les deux pattes postérieures seront analysées. Une patte sera dédiée à l’histologie, l’autre à l’analyse en imagerie (micro tomographie). Pour les mesures quantitatives, les comparaisons de moyennes seront réalisées - Pour l'analyse du sang : lors du sacrifice, le sang sera systématiquement prélevé pour obtenir 10/12 échantillons par groupe. D’après des données antécédentes du laboratoire, le taux de S1P a une grande variabilité interindividuelle (SD estimée à 45%). Pour observer une augmentation d’un facteur 2, un minimum de 11 animaux par groupe est requis. - Pour la mesure de la tomographie - imagerie : 10/12 échantillons de chaque groupe seront collectés. D’après des données antécédentes du laboratoire, le volume osseux des os longs des souris est relativement homogène (SD estimée à 10%), mais les variations entre les conditions sont faibles. Pour observer une augmentation de 15%, un minimum de 11 animaux par groupe est requis.
Raffinement
• Réduire l’angoisse des animaux : dans toutes les cages, la litière sera composée d’un mélange de 2 sciures (BK8-15 + Flake). L’enrichissement sera composé d’un igloo en cellulose et du papier absorbant. Le bien-être des animaux sera vérifié quotidiennement. Les animaux seront placés en acclimatation pendant une semaine entre leur livraison et le début de la procédure expérimentale. • La consommation d’eau et d’aliments sera enregistrée. Si le traitement par FTY720 dans l’eau de boisson entraine une diminution dans la prise d’eau (suivi bihedomadaire), un peu de sucrose sera ajouté pour améliorer le goût. • Un suivi hebdomadaire de la courbe de poids sera réalisé individuellement. Les souris TgA86 présentent un poids corporel significativement réduits par rapport aux souris WT (environ -20% à 15 semaines). Cependant, elles doivent suivre une croissance régulière. Une perte de poids sur deux pesées consécutives sera considérée comme suspecte et la surveillance sera accrue. • Les atteintes arthritiques des souris TgA86 seront surveillées et scorées précisémment chaque semaine. Si les animaux montrent des signes de souffrance, un traitement analgésique pourra être envisagé. Une inflammation sévère est attendue à partir de 12/16 semaines, conduisant à un gonflement articulaire qui ne devrait pas s’aggraver par la suite. Une ankylose de la queue peut apparaitre précocément, mais devrait pas nuire au déplacement des animaux. L’ankylose des membres postérieures, qui peut apparaitre tardivement (après 20 semaines), sera particulièrement surveillée. • La lymphopénie potentiellement causée par le traitement par FTY720 sera vérifiée à deux temps intermédiaires : 10 et 20 semaines. Les résultats seront connus immédiatement après les prélèvements. S’ils montrent une réduction trop importante du taux de leucocytes sanguins (supérieure à 50%), la dose de FTY720 sera aussitôt réduite.
Choix des espèces
• Choix du modèle animal : Les souris transgéniques TgA86 Comme mentionné précédemment, actuellement, aucun modèle animal ne permet de reproduire fidèlement les SpA humaines, mais une dizaine de modèles sont disponibles pour étudier certaines de leurs manifestations, dont les enthésopathies . Nous avons choisi comme critères de sélection la présence d’enthésite et de spondylite, c’est-à-dire d’atteintes périphériques et axiales, l’apparition d’ossifications ectopiques et l’absence de maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Le modèle retenu est donc les souris surexprimant la forme transmembranaire du TNF-α : TgA86. Ces souris présentent une pathologie articulaire périphérique et axiale avec 100% d'incidence. Elles développent des enthésites et des zones d’ankylose. Leur phénotype de ces souris et l’évolution de la pathologie ont déjà été finement caractérisés. Le phénotype des souris TgA86 apparaît normalement à ce moment-là (vers l’âge de 3-4 semaines) Elles recevront ou non le traitement par FTY720 dès l’apparition des symptômes.
lmpact de la consommation de farines produites à partir de graines de blé et de lentilles germées et non germées sur le métabolisme musculaire et le microbiote intestinal du rat âgé.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Hébergés seuls puis placés en cage métabolique, ils subissent des gavages de glucose suivis de six prélèvements sanguins à la queue, des tests de force et de locomotion et une injection sous-cutanée juste avant la mise à mort, pour évaluer l'effet de farines de blé et de lentilles germées sur le muscle vieillissant. Arrivés à 14 mois, ils sont tués à 24 mois pour prélever muscles, tissus adipeux, cœur et foie. Le porteur affirme que le recours à des rats âgés est "absolument nécessaire" et ne peut être remplacé par de la culture cellulaire.
Objectifs
Le maintien d’un apport protéique suffisant et de bonne qualité nutritionnelle apparaît nécessaire pour lutter efficacement contre la perte de masse et de fonction musculaires, appelée sarcopénie. Les protéines animales, pourtant digestibles et de bonne qualité sont délaissées par la population âgée, nécessitant ainsi la recherche de nouvelles stratégies alternatives. Du fait de leur complémentarité en acides aminés indispensables (AAi), l’association de céréales et de légumineuses permet un apport protéique journalier de qualité et durable, pouvant répondre aux besoins nutritionnels des séniors. Cependant, ces protéines végétales restent moins digestibles que les protéines animales et la consommation des légumineuses est souvent limitée en raison de leur contenu en facteurs antinutritionnels (FAN). Il devient alors nécessaire de développer de nouveaux procédés de transformation pour la production d’aliments destinés à l’alimentation humaine. Aussi, l’utilisation de bioprocédés tels que la germination permettrait de lever ce verrou tout en respectant le concept de « Naturalité » inscrit dans la transition alimentaire à laquelle nous faisons face actuellement. De nombreux travaux montrent que la germination (processus biologique commençant à l’imbibition d’une graine quiescente non-dormante et s’achevant au moment de l’émergence de l’embryon) diminue le contenu en FAN et améliore l’accessibilité aux protéines stockées dans la graine, la teneur en microconstituants et les capacités anti-oxydantes des graines ainsi que des farines qui en résultent. Ces graines germées apportent également des fibres et des bioactifs végétaux qui pourraient prévenir les dysbioses du microbiote intestinal observées au cours du vieillissement. La dysbiose ou modification de la composition du microbiote intestinal et de ses fonctions, conduit notamment à une perméabilisation de la barrière intestinale provoquant une augmentation de la translocation bactérienne et une sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et probablement d’autres métabolites bactériens qui participeraient au développement de la sarcopénie. Jusqu’à présent, peu de travaux se sont intéressés à l’impact de la consommation de ces produits germés sur l’axe intestin-muscle lors du vieillissement. Dans ce contexte, le projet présenté ici vise à étudier l’impact de farines germées blé/lentilles sur le métabolisme et la fonction musculaires, le statut inflammatoire ainsi que sur le microbiote intestinal du rat âgé.
Bénéfices attendus
Le vieillissement est associé à une perte de masse et de fonction musculaires, appelée sarcopénie fortement liée à l’alimentation. Les personnes âgées sont confrontées à des problèmes de mastication, à une perte d’appétence pour les produits carnés et à l’apparition d’une moindre réponse aux effecteurs anaboliques du repas pouvant conduire à un état de dénutrition. Il est donc important de maintenir chez la personne âgée un apport protéique suffisant, varié et de bonne qualité. La composition en acides aminés indispensables (AAi) des protéines végétales est moins bien équilibrée que celle des protéines animales mais une complémentarité entre 2 espèces végétales différentes peut permettre d’obtenir un apport adéquat en AAi. C’est notamment le cas lorsque l’on associe céréales et légumineuses. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels (FAN) dans les aliments végétaux ainsi qu’une réticulation importante des protéines végétales les rendent moins digestibles pour l’Homme. L’utilisation de la germination pourrait permettre de lever ce verrou. La germination est un processus de développement de la plante contenue dans sa graine qui débute par une étape de reprise de l’activité métabolique après une période de dormance, ces graines sont alors dites « germées ». Ce bioprocédé est à la fois respectueux de l’environnement mais également simple à mettre en place, et peu coûteux. Il diminue le contenu en FAN, augmente l’accessibilité et la teneur en protéines et en micronutriments (sodium, magnésium, fer, zinc) ainsi que les capacités anti-oxydantes des graines (polyphenols). La modification du comportement alimentaire des sujets âgés affecte également l’écosystème intestinal. En effet, il apparait avec l’âge une dysbiose du microbiote intestinal, c’est-à-dire une modification de sa composition et de ses fonctions, qui participerait au développement de la sarcopénie. Les teneurs en fibres, en microconstituants et en protéines des aliments d’origine végétale, pourraient prévenir ces dysbioses liées à l’âge. La consommation de produits à base de céréales et de légumineuses germées pourrait présenter un intérêt chez la personne âgée à la fois en terme d’homéostasie protéique mais aussi en augmentant la densité nutritionnelle et la digestibilité des protéines d’origine végétale. Ce projet pourrait donc conduire à la formulation de nouveaux aliments particulièrement pertinents pour les personnes âgées dont la proportion dans la population ne cesse d’augmenter.
Procédures
Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation. Les rats auront des contacts acoustiques et olfactifs avec leurs congénères. Les cages seront adaptées aux poids des rats et contiendront des objets d’enrichissement. Les rats subiront diverses interventions au début, au milieu et/ou à la fin du protocole. Elles auront pour but de : -mesurer la composition corporelle sur animal vigile via une technique non invasive peu stressante réalisée 3 fois et d’une durée de 1 minute 30 à chaque fois. -mesurer la fonctionnalité musculaire de façon non invasive et sur animal vigile. Cette mesure fait intervenir 4 appareils. Ces mesures seront réalisées sur la base du « volontariat » car il est impossible d’obliger les animaux à réaliser les exercices. L’appareil 1 servira à mesurer la force et sera utilisé 3 fois pour une durée de manipulation de l’animal de 30 secondes à chaque fois. L’appareil 2 permettra d’évaluer l’équilibre et la coordination motrice et sera utilisé 3 fois. La durée dépendra de l’endurance et de la volonté du rat à réaliser l’exercice (5 minutes au maximum). L’appareil 3 permettra d’évaluer des paramètres statiques (surface des empreintes…) et dynamiques (temps de contact de chaque patte…) de la locomotion. Il sera utilisé 3 fois et l’exercice durera moins de 7 secondes à chaque fois. Enfin, l’appareil 4 permettra d’appréhender l’activité ambulatoire totale et ne sera utilisé qu’à la fin du protocole. L’expérience dure 10 minutes et est non stressante pour les animaux. -mesurer la tolérance au glucose. Les animaux subiront un gavage avec une solution de glucose puis 6 prélèvements de sang de 300µl chacun seront réalisés au niveau de la queue. Ces prises de sang interviendront à T0 (juste avant le gavage) puis 15, 30, 60, 90 et 120 minutes après. Ce test sera réalisé 2 fois: au milieu et à la fin du protocole. -mesurer la rétention azotée (azote ingérée – azote excrétée) au niveau corps entier. Cette mesure nécessite la récupération de la totalité des fèces et de l’urine produits. Les rats seront hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite au maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet. -mesurer la synthèse protéique musculaire qui nécessitera l’injection d’une molécule non toxique et n’induisant pas de douleur en soi diluée dans du sérum physiologique, par voie sous cutanée 50 minutes avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
A leur arrivée, les animaux seront âgés de 14 mois. A la fin du protocole, ils seront mis à mort à l’âge de 24 mois. Au cours de cette période de 10 mois et en raison de l’avancée en âge, les rats auront pris du poids et de la masse grasse et perdu de la masse maigre et de la mobilité. Les différents régimes devraient moduler toutes ces modifications. L’hébergement des rats leur occasionnera un léger stress. En effet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de contrôler précisément leur consommation. De plus, la moitié des rats sera hébergée les 4 derniers jours du protocole dans une cage métabolique afin de récupérer l’ensemble des excréments. Durant le protocole, les animaliers observeront quotidiennement le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôleront la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Plusieurs mesures de composition corporelle et de fonctionnalité musculaire seront réalisées. Ces mesures seront effectuées sur animal vigile mais sont peu stressantes. Deux mesures de tolérance au glucose seront réalisées et nécessiteront à chaque fois un gavage (solution de glucose) à l’aide d’une sonde et 6 prélèvements sanguins au niveau de la queue de l’animal. Pour réduire le stress des animaux induit par la contention et le gavage, et la douleur liée aux prélèvements sanguins, les gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés. A la fin de ces tests, une attention particulière sera portée aux animaux de retour dans leur lieu d’hébergement notamment au niveau de leur posture et de leur alimentation. Enfin, une mesure de synthèse protéique musculaire sera réalisée chez les rats. Cette mesure nécessite l’injection d’une molécule non toxique et n’induisant pas de douleur en soi diluée dans du sérum physiologique, par voie sous cutanée 50 minutes avant la mise à mort. Les injections seront réalisées sur le dos de l’animal. Pour limiter le stress et la douleur induits par l’injection, il ne sera jamais injecté plus de 10ml de la solution à un animal et il ne sera jamais injecté plus de 2ml de solution en un même point. La première injection sera effectuée entre les omoplates.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses qui permettront de répondre aux objectifs du projet. Ainsi, juste avant la mise à mort des rats, sera prélevé la totalité du sang puis juste après la mise à mort, seront prélevés les muscles squelettiques des pattes arrière (plantaris, soleus, tibialis anterior, gastrocnémius et quadriceps), les tissus adipeux sous cutané et rétro-abdominal, le coeur et le foie.
Remplacement
Le projet vise à étudier l’impact de la consommation de mélanges de farines de blé et de lentilles germées sur le métabolisme musculaire, le statut inflammatoire et sur le microbiote intestinal dans un contexte de vieillissement. L’utilisation d’animaux, et qui plus est âgé,s dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire ne permettant pas de mesurer simultanément : - La digestibilité des différentes sources de protéines - L’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité des animaux - Le métabolisme protéique musculaire - L’évolution du métabolisme glucidique - Le statut inflammatoire circulant de l’animal - L’évolution du microbiote intestinal. En l’état, ce projet ne peut pas non plus être mené directement chez l’Homme. En effet, actuellement, la production de graines germées reste très limitée en France à cause des contraintes sanitaires extrêmement strictes afin de limiter les contaminations bactériennes. En effet, les graines peuvent contenir des micro-organismes pathogènes qui sont principalement des bactéries Escherichia coli pathogènes, et Salmonella. Aussi, depuis 2013, la réglementation européenne à renforcer la traçabilité et les garanties sanitaires des graines germées (règlement d’exécution (UE) no 208/2013) et les opérateurs produisant ces graines doivent donc désormais s’efforcer de mettre en place des mesures additionnelles de gestion de sécurité des denrées alimentaires. Ainsi, à cause de ces contraintes sanitaires lourdes, peu de produits germés sont présents sur le marché national. Mais par contre, ce projet pourrait promouvoir auprès des entreprises agro-alimentaires la production ainsi que l’utilisation de graines germées pour la confection de différents produits de panification et de pâtisserie par exemple.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Le nombre de rats nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour la synthèse protéique musculaire entre les rats nourris avec les régimes à base de protéines laitières et ceux nourris avec le régime à base de farines issues de graines germées. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de rats nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la durée totale du protocole (9 mois) et surtout à l’âge des animaux à la fin de l’expérimentation (24 mois), nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 rats. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 96.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.
Choix des espèces
Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi le rat comme modèle animal et plus particulièrement le rat Wistar car ces animaux présentent différents avantages pour les études de vieillissement, notamment au niveau des modifications métaboliques et nutritionnelles. Le rat Wistar a une prévalence de développement tumorale et d’insuffisance d’organe (rein, foie, cœur) plus faible que les autres souches de rat, le rendant plus adapté à l’étude du vieillissement. De plus, ces vieux animaux présentent des modifications anthropomorphiques et morphologiques proches de celles observées chez l’Homme avec l’avancée en âge (augmentation de la masse grasse, diminution de la minéralisation osseuse et réduction de la masse musculaire squelettique). Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de farines germées blé/lentilles sur le métabolisme musculaire, le statut inflammatoire ainsi que sur le microbiote intestinal dans un contexte de vieillissement. Les animaux seront livrés à l’animalerie à l'âge de 14 mois. Après 2 à 4 semaines d'acclimatation, ils seront soumis à différents régimes pendant 9 mois et auront donc 24 mois à la fin du protocole.
Preuve de concept d’un modèle de glioblastome chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
30 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de glioblastome humain leur sont implantées dans le cerveau selon trois techniques comparées, avec des chirurgies sous anesthésie, deux scanners et la pose d'électrodes intracrâniennes lors de la dernière intervention. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer une atteinte des fonctions cérébrales et, rarement, une paralysie d'une patte, les animaux étant tués en fin de protocole pour prélever les tissus. Il qualifie l'usage d'animaux d'"indispensable" et présente ce modèle comme un futur outil pour la recherche translationnelle et la formation des neurochirurgiens.
Objectifs
Les glioblastomes constituent des tumeurs cancéreuses cérébrales ayant un potentiel d’infiltration agressif, qui sont à l’origine d’une véritable problématique en thérapeutique humaine. Ces tumeurs sont difficiles à extraire totalement en chirurgie, ce qui entraîne généralement une survie limitée. Le projet consiste en la création d’un modèle de glioblastome chez le lapin, à partir de cultures primaires de cellules issues de tumeurs fraiches humaines de glioblastome. Afin de déterminer la meilleure méthode d’implantation, 3 techniques seront évaluées dans ce protocole. Étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle sur le gros animal de tumeur gliale avec les caractéristiques du glioblastome, la possibilité d’utiliser un tel modèle pourrait permettre à l’avenir d’améliorer les méthodes diagnostiques (imagerie, électrophysiologie), afin d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’améliorer les existantes.
Bénéfices attendus
Fournir un modèle de glioblastome issu de culture primaire de cellules extraites de tumeur fraiche humaine avec une voie d'implantation validée permettant : • De servir de modèle pour les projets de recherche translationnelle sur les glioblastomes • De valider de nouvelles approches thérapeutiques, notamment la chimiothérapie intra-artérielle (seule ou en association à la chirurgie) • D’évaluer de nouvelles techniques diagnostiques • D’enseigner la chirurgie d’exérèse aux neurochirurgiens en formation Dans un même temps, ce projet permettra pour la première fois sur un modèle animal d’identifier certains marqueurs de l'invasion cérébrale par la tumeur.
Procédures
La première session chaque animal aura la procédure chirurgicale adaptée à son groupe de voie d’implantation sous anesthésie générale (60 à 120 minutes environ). Une deuxième anesthésie générale sera effectuée au jour 10pour le contrôle scanner (30 min environ). Le dernier contrôle au jour 30 demandera également une anesthésie générale pour le contrôle scanner, et une chirurgie pour l’implantation d’électrodes sEEG et la pose de grille mini-ECoG permettant les mesures électrophysiologiques, pour laquelle l’animal ne sera pas réveillé à son terme (1 h environ).
Impact sur les animaux
L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque procédure/prélèvement. Après mise en place des abords vasculaires des douleurs peuvent survenir suite à l’intervention. Il existe également une possibilité, très rare, de paralysie de la patte arrière du lapin en cas de lésion du nerf fémoral. L’étude portant sur des tumeurs cérébrales, une possible atteinte fonctionnelle du cerveau pourrait survenir en cas de croissance rapide.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les pièces anatomiques à des fins d’analyse en histologie.
Remplacement
Ce projet vise à concevoir un modèle de glioblastome chez le gros animal permettant la recherche pré clinique (diagnostique, thérapeutique). L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est indispensable.
Réduction
Un contrôle intermédiaire effectué par scanner à 10 jours après l’implantation tumorale permettra de confirmer la croissance tumorale sans sacrifice. Pour chaque voie d’implantation étudiée, il a été décidé de n’utiliser que deux lapins par culture cellulaire pour diminuer le nombre d’animaux utilisés dans cette étude pilote.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale, et leur première entrée en procédure. Leur environnement comportera un enrichissement (bûchettes à ronger...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque procédure opératoire. Le comportement des lapins sera particulièrement suivi pour mettre en évidence une éventuelle atteinte des fonctions cérébrales, qui traduiraient une croissance rapide de la tumeur. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés. Si une infection survient, un traitement antibiotique adapté au lapin pourra être mis en place. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort. Par ailleurs, la décision a été prise d’effectuer un premier test d’implantation sur un nombre réduit d’animaux avec une lignée cellulaire connue moins agressive afin d’obtenir des informations sur le processus et d’améliorer la prise en charge.
Choix des espèces
Les modèles petits animaux (souris, rats) ne permettent pas d’utiliser les outils d'imagerie cliniquement disponibles en raison de leur petite taille et ne permettent pas le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques telles que le traitement par voie endovasculaire (chimiothérapie intra-artérielle) en raison de la limitation de la navigation distale des cathéters dans le réseau vasculaire. Le lapin possède une anatomie vasculaire intra crânienne se rapprochant de celle de l’Homme avec un polygone vasculaire à la différence du porc. Enfin, la taille des vaisseaux du lapin permet une navigation endovasculaire avec les micro-cathéters utilisés en neuroradiologie interventionnelle chez l’humain. Le poids des lapins New-Zealand adulte est supérieur à 3.5kg, soit autant qu'un nouveau-né, ce qui permet d'utiliser les appareils d'imagerie disponibles en clinique et d’évaluer des stratégies chirurgicales ou endovasculaires. Les animaux utilisés seront des adultes de plus de 3kg500 pour la taille des artères.
Etude des conséquences du blocage fonctionnel postnatal du cortex préfrontal sur les réponses comportementales et dopaminergiques striatales lors de l’administration d’un cannabinoïde (le THC) chez le rat adulte
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale à la naissance puis, à l'âge adulte, une seconde intervention et une mesure par voltamétrie sous anesthésie, avant de recevoir du THC pour modéliser l'effet du cannabis sur la schizophrénie. Les rates nouveau-nées sont tuées dès le sevrage à 21 jours, les mâles gardés pour la suite puis tués pour contrôle histologique. Le porteur affirme que l'étude de la maladie chez des patients non traités est difficile sur les plans éthique et pratique, ce qui rendrait la modélisation chez le rat "irremplaçable".
Objectifs
La schizophrénie est une maladie neuropsychiatrique complexe qui apparaît à l'adolescence et au début de l'âge adulte, avec un risque plus élevé d'apparition chez les individus de sexe masculin. La schizophrénie est une maladie mentale très invalidante (1ère source de handicap et de suicide des 25-35 ans) touchant environ 1% de la population, évoluant dans +60% des cas vers un état chronique. Son coût global pour la société est considérable. Les causes et les mécanismes biologiques mis en jeu dans la schizophrénie ne sont pas entièrement compris. Actuellement, on considère que la schizophrénie résulterait de connexions défaillantes entre différentes régions cérébrales ayant pour origine une perturbation du développement cérébral, notamment au niveau du cortex antérieur. Ces connexions défaillantes pourraient contribuer au dysfonctionnement des neurones dopaminergiques ; il s’agit d’un groupe de neurones dont l’implication dans l’expression des symptômes schizophréniques est communément acceptée. Récemment, un certain nombre de travaux laissent penser que l’usage du cannabis peut précipiter l’apparition de la schizophrénie ou aggraver les symptômes caractéristiques de cette maladie aussi bien lors d’une consommation chronique, qu’aigüe. Il s’agit non seulement d’un problème de société actuel de première importance, mais aussi d’un problème de santé majeur en raison de la consommation croissante du cannabis dans la population des adolescents et jeunes adultes. L’abord de cette question chez les malades atteints de schizophrénie non-traités par des antipsychotiques, est très difficile à mettre en œuvre, tant sur le plan éthique que pratique, en raison même de la nature de la pathologie, ce qui rend la modélisation chez l’animal tout à fait irremplaçable. Le projet proposé a pour but de mieux comprendre l’impact de l’inactivation néonatale de la partie antérieure du cortex cérébral sur les réponses comportementales et dopaminergiques lors de l’administration du principal composé du cannabis pouvant induire des troubles psychotiques, le delta-9 tétrahydrocannabinol (THC), chez l'animal (rat mâle) jeune adulte.
Bénéfices attendus
Le projet proposé se situe dans le cadre d’une modélisation chez l’animal de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait permettre de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait contribuer in fine au développement de nouvelles approches thérapeutiques ; les traitements existants n’étant pas totalement satisfaisants.
Procédures
Les interventions prévues sont les suivantes : 1)Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né (intervention unique ~15 min); 2) Intervention chirurgicale chez l’animal adulte (intervention unique 1h30 à 2h00); 3) Etude pharmacologique à l’aide de la voltamétrie in vivo (intervention unique~3h).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de la réalisation de ce projet, les animaux sont soumis à deux interventions chirurgicales à l’issue desquelles ils peuvent ressentir de la douleur. Pour ce qui est de la chirurgie réalisée chez l’adulte, les animaux peuvent présenter une légère perte de poids variable selon les animaux. Pour la majorité d’entre eux le retour vers des valeurs normales s’observe au bout de 7jours. Lors de l’étude pharmacologique les animaux peuvent ressentir une légère douleur transitoire au niveau du site d’injection, due à l’aiguille, lors de l’administration de THC. Par contre, le THC lui-même n’est pas décrit comme induisant de douleur, ni de détresse. Les réponses comportementales mesurées sont les réponses spontanées de l’animal. Il n’y a donc aucun effort à fournir par l’animal lors de cette étude.
Devenir
Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né : Les nouveaux-nés femelles sont mis à mort lors du sevrage au 21ème jour, puis soumis à un contrôle histologique. Lors du sevrage, tous les animaux mâles sont gardés en vie pour être soumis à l’Intervention chirurgicale chez l’animal adulte, puis à l’étude pharmacologique. A l'issue de cette étude, tous les animaux adultes implantés sont mis à mort, puis soumis à un contrôle histologique.
Remplacement
La schizophrénie étant une maladie mentale se traduisant notamment par des troubles comportementaux, il n’y a pas de méthodes alternatives permettant de remplacer les protocoles mis en œuvre chez l’animal vivant, en situation comportementale, et en interaction avec l'environnement. En particulier, l’étude de l’apparition ou l’aggravation de symptômes schizophréniques suite à la consommation de cannabis (notamment de THC) sont très difficiles à étudier chez des malades non-traités, pour des raisons non seulement pratiques, mais surtout éthiques.
Réduction
Dans ce projet, le nombre total d’animaux, maintenu aussi faible que possible, est contraint par le nombre des animaux mâles nécessaires pour réaliser l’étude pharmacologique à l’âge adulte. En effet, pour des raisons de reproductibilité de l’expérience, et d’application du principe de réduction chez les animaux adultes, seuls les animaux mâles sont utilisés. L'utilisation des femelles nécessiterait l'utilisation d'un nombre d'animaux beaucoup plus important que celui proposé. Un nombre de 12 rats mâles par groupe a été déterminé à partir de travaux publiés concernant des études pharmacologiques du même type. Ce nombre apparaît nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment robustes d’un point de vue statistique. L’analyse statistique des résultats sera réalisée en prenant en compte la répétition des mesures dans le temps pour un même animal. Cette stratégie de mesures répétées, conduit grandement à réduire le nombre d’animaux mâles utilisés et, en déterminant le décours temporel des réponses, permet de raffiner l’analyse de celles-ci.
Raffinement
Dans le cadre de la réalisation de ce projet, plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre. Ainsi, les interventions chirurgicales chez le rat nouveau-né et chez le rat adulte sont réalisées à l’aide d’une anesthésie gazeuse ce qui permet de contrôler au mieux la profondeur de l’anesthésie. Des analgésiques sont aussi utilisés pendant la phase chirurgicale. Pendant la phase post-opératoire, chez le nouveau-né, la bonne cicatrisation de l’incision est suivie quotidiennement en même temps que la pesée des animaux. Chez l’animal adulte, pendant la phase post-opératoire d'au moins 7j, l'eau et la nourriture sont placés dans des récipients adaptés situés directement sur le fond de la cage afin de faciliter la récupération des animaux. Pendant cette phase de récupération post-opératoire les animaux recoivent un traitement analgésique. Les animaux sont aussi habitués à être manipulés. Des points-limites permettant de soustraire les animaux à une éventuelle souffrance ont été établis et feront l’objet d’une attention quotidienne (voire 2 à 3 fois par jour). Un suivi régulier de la littérature sera effectuée tout au long de ce projet pour identifier l’émergence de nouvelles procédures permettant de raffiner celles mises en œuvre dans le projet.
Choix des espèces
Une grande part, pour ne pas dire la majorité des études visant à modéliser chez l'animal la physiopathologie de la schizophrénie ont été réalisées chez le rat, notamment en raison de la grande homologie qui existe entre les réponses comportementales et pharmacologiques observées chez le rat et chez l'homme. L'ensemble des données acquises chez le rat constitue donc un cadre de référence justifiant le choix de cette espèce pour conduire notre projet. Les animaux (rats) nouveau-nés subiront une première intervention chirurgicale au 8ème jour postnatal qui représente un moment crucial du développement cérébral chez le rat, comparable à la fin du second trimestre de gestation chez l’homme, période qui est considérée comme une période de grande vulnérabilité au développement de la schizophrénie. Dans la mesure où la modélisation animale proposée concerne une pathologie (la schizophrénie) ayant une origine neurodéveloppementale, s’exprimant chez le jeune adulte, les animaux mâles ayant subi l'intervention néonatale seront ensuite utilisés à l'âge adulte (11 semaines) pour tester leur réactivité au THC.
Hyperactivité amygdalienne induite par injection virale : Etude des mécanismes cellulaires de l’apprentissage émotionnel
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le stade juvénile ou adolescent, ils subissent une chirurgie d'injection d'un lentivirus dans l'amygdale, puis des tests comportementaux d'anxiété et de comportement social et un apprentissage de la peur par "légers chocs électriques", certains recevant des électrodes implantées, avant d'être tués. Le porteur veut comprendre comment une hyperactivité de l'amygdale à l'adolescence modifie durablement les comportements émotionnels, avec en vue le stress post-traumatique chez l'humain. Il affirme que ces réseaux neuronaux ne peuvent être étudiés ni in silico, ni sur cellule isolée, ni chez les invertébrés.
Objectifs
L’amygdale, une structure cérébrale située en profondeur du lobe temporal, est composée de plusieurs noyaux, chacun jouant un rôle différent dans la fonction amygdalienne et possédant ses propres projections vers des structures cérébrales différentes. Le noyau basolatéral (BLA) est la principale zone d’entrée des informations provenant du système sensoriel et des structures plus intégrées telles que le cortex préfrontal. Les neurones du BLA projettent aussi bien en dehors de l’amygdale que vers la circuiterie intra-amygdalienne. Au cours du développement postnatal, les connexions neuronales entre les structures des circuits de la peur (comme l’amygdale et le cortex préfrontal médian) sont modelées selon leur état de maturation et l’expérience de l’animal. Chez l’humain, l’hyperactivité amygdalienne est souvent corrélée avec des dysfonctionnements sociaux et émotionnels. De plus, l’adolescence correspond à une période du développement particulièrement sensible au stress dont l’impact pourrait être observable chez l’adulte. Vu son rôle primordial dans les comportements émotionnels et le fait que l’amygdale arrive tôt à sa maturité fonctionnelle, il est suggéré qu’un dysfonctionnement de l’amygdale à l’adolescence pourrait être à l’origine d’un développement altéré de sa connectivité avec, entre autres, le cortex préfrontal médian, ce qui pourrait avoir des conséquences sur des comportements émotionnels à long terme (chez l’adulte). Nous chercherons à perturber l’activité de l’amygdale chez le rat aux stades de l’adolescence et la préadolescence (juvénile) grâce aux injections d’un lentivirus qui a pour but d’augmenter l’activité d’une voie de signalisation ubiquitaire, exclusivement dans les neurones principaux de cette structure. Nous étudierons l’impact de cette sur-activation sur les propriétés membranaires des neurones principaux du BLA et des neurones du cortex préfrontal médian, sur la plasticité synaptique de la voie mPFC-BLA, ainsi que sur les comportements de type anxieux et émotionnels chez les jeunes animaux et chez les adultes, ainsi que sur l‘activité du réseau pendant les comportements de peur. Le but de notre recherche à long terme est donc de comprendre les mécanismes impliqués dans des dérèglements émotionnels déclenchés pendant l’adolescence et ayant des conséquences importantes chez l’adulte.
Bénéfices attendus
Nous avons précédemment montré que la modification de l’amygdale (par l’injection d’un virus) lors de l’adolescence réduit l’extinction et augmente la généralisation de la peur chez l’adulte dans un protocole de conditionnement aversif. La quantification d’un marqueur de l’activité neuronale dans les structures du circuit lié à la peur montre que les modifications comportementales sont associées à une augmentation de l’activité neuronale des neurones du cortex préfrontal. Ce projet vise à comprendre comment le virus modifie l’activité électrique des neurones principaux de l’amygdale et comment cette modification peut impacter la connectivité du circuit neuronal sous-tendant le comportement de la peur. Concernant des bénéfices du projet à court terme, il semble fondamental et essentiel de connaitre les effets sur les propriétés électriques et la plasticité des neurones de l’amygdale. Une hyperactivité ou une hyper-réactivité de ces neurones pourrait conduire à des changements durables dans la connectivité des réseaux neuronaux connectés à l’amygdale et contribuer aux modifications comportementales observées chez l’adulte. A long terme, des connaissances apportées par ce projet nous aideront à mieux comprendre comment la modulation de l’amygdale pendant la période critique de l’adolescence pourrait conduire aux effets durables sur la cognition émotionnelle et sociale, qui persistent jusqu’au stade adulte. Nos résultats nous permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la prédisposition à certains syndromes psychiatriques chez l’Homme tel que le stress post-traumatique (PTSD).
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie pour injection virale chez le jeune (préadolescent ou adolescent) dans l’amygdale, procédure invasive qui nécessite une anesthésie générale (~1h) et un suivi post-opératoire après réveil. Quatre séries expérimentales sont ensuite planifiées : (1) 2-3 semaines plus tard, les animaux sont profondément anesthésiés pour l’extraction et analyse du cerveau frais. (2) A l’âge adulte, les animaux seront à nouveau anesthésiés pour la totalité de l’expérimentation sous anesthésie (~4h) puis mis à mort sans réveil. (3) Les animaux adolescents seront soumis à des tests comportementaux (anxiété, stress, comportement social ; 1 semaine), puis à un apprentissage de peur à l’âge adulte (1 semaine). (4) Une fois adultes, les animaux sont anesthésiés pour l'implantation d'électrodes suivi de réveil pour enregistrement de l’activité neuronale chez l'animal éveillé pendant qu’il est soumis à un apprentissage de peur (4-5 semaines). Ils sont tous euthanasiés sous anesthésie, suivi d’une exsanguination pour certains afin de réaliser une perfusion intracardiaque permettant de fixer le cerveau.
Impact sur les animaux
Tous les animaux subissant une chirurgie pourraient potentiellement montrer des signes de douleur ou d’infection : perte rapide de poids > 15%; forte réactivité à la manipulation ou posture anormale (dos rond, yeux mi-clos, tête basse). Dans ce cas, l’animal sera traité (selon conseils du responsable de l’animalerie ou du vétérinaire) et placé sous surveillance maximale durant 48h. S’il n’y a pas de signes d’amélioration, l’animal sera euthanasié avec accord du responsable de l’animalerie. Selon nos études antérieures, le virus injecté dans l’amygdale n’entraine pas d’effets comportementaux majeurs, à part lorsque les animaux sont soumis à des tests particuliers pour produire un état légèrement anxieux (espace éclairé) ou émotionnel (légers chocs électriques). Ces états ne perdurent pas en dehors des tests. En dehors de ces cas, aucun effet indésirable n’est prévisible.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort , soit pour l'expérimentation, soit pour analyse histologique.
Remplacement
Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences Cellulaires et Comportementales. L’évaluation des réseaux neuronaux et comportementale d’une modification cérébrale au cours du développement post-natal jusqu'à l'adulte nécessite l’utilisation d'animaux vivants possédant les structures et les connectivités cérébrales requises. Cela ne peut donc pas être réalisé in silico ou en cellule isolée ou chez les invertébrés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera le strict minimum permettant un analyse statistique valide des expériences. Les analyses statistiques seront celles classiquement utilisées dans la littérature (voir Joly et al, 2022), incluant, après vérification de l'homogénéité des variances et la normalité des données, des analyses de variance à un ou plusieurs facteurs en fonction des expériences, suivies d'analyses post-hoc appliquant une correction pour la répétition des comparaisons (ex. Bonferroni ou False-Discovery-Rate). Il est à préciser que les femelles et les mâles issus de la colonie de reproduction seront utilisés dans cette étude.
Raffinement
Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes, et utiliserons de l’anesthésie combinée quand approprié à une analgésie pendant les chirurgies et la mise à mort des animaux. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, une surveillance accrue permettra de détecter tous signes de douleur ou stress induit et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques et antibiotiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les animaux seront hébergés par groupes (2 à 4) avec de l’enrichissement autant que possible. Les animaux en situation comportementale seront habitués à l’expérimentateur par manipulation au cours des jours précédents.
Choix des espèces
Le rat est le modèle du choix du laboratoire. En raison de la cohérence avec nos études précédentes, nous poursuivons ce projet sur Rattus norvegicus. La littérature scientifique pertinente à ce projet, en particulier les analyses des comportements sociaux et anxieux, est riche en études réalisées sur le rat. Nous bénéficierons et nous contribuerons donc d’une base de donnés importante. Il est connu que la période de l’adolescence est associée à une susceptibilité au stress et un développement important des structures impliquées, notamment l’amygdale, dans les réponses à la peur. Toutefois de nombreuses structures impliquées dans les comportements émotionnels sont encore immatures à l’adolescence. Nous voulons modifier l’activité de l’amygdale à deux stades du développement, le stade de préadolescence (juvénile) et le stade d’adolescence, qui correspondent à des périodes critiques dans le processus de connectivité de l’amygdale avec d’autres structures du réseau. Les expériences commenceront donc dès l’âge préadolescence jusqu’à l'adulte.
Evaluation de l’effet d’une supplémentation de fructo-oligosaccharides à chaîne courte (« FOS ») sur la force musculaire et la microbiote intestinal, chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mâles logés seuls, elles fournissent trois prélèvements de fèces et passent des tests d'effort sur tapis roulant et de force de préhension, avant une anesthésie sans réveil pour prélever leurs muscles. Le porteur teste l'effet d'un complément, les fructo-oligosaccharides, sur la performance musculaire et le microbiote, et vise des "allégations pour valoriser les produits" d'un industriel. Il reconnaît qu'aucun effet nocif n'est attendu de cette molécule déjà autorisée chez l'humain, mais affirme que le recours à l'expérimentation in vivo est "incontournable".
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une supplémentation avec un produit naturel, la fructo-oligosaccharides à chaîne courte (FOS), sur la force musculaire et la nature du microbiote intestinal chez la souris. Ces effets peuvent être à l'origine d'une modulation de la performance sportive chez l'homme. Pour cela, nous allons mesurer la Vitesse Maximale Aérobie (VMA), le temps limite au seuil anaérobie (CMA) et la force maximale d’agrippement (Grip Strength) chez une population saine de souris mâles. Nous allons également observer si les changements des capacités musculaires peuvent être en relation avec un changement dans la composition du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront d'envisager d'autres analyses qui pourront conduire à des évaluations chez l'homme. Dans ce sens, les résultats vont permettre des allégations pour valoriser les produits naturels commercialisés par l'industriel.
Procédures
1. Trois prélèvements de Fèces à réaliser la semaine 8, la semaine 12 et la semaine 16, pour chaque souris : Pendant le déroulement du protocole, 3 échantillonnages de fèces seront réalisés pour chaque animal. Nous récoltons les fèces des animaux, au moment où ils sortent de l’orifice du rectum. Les échantillons sont congelé -80°C pour analyse et caractérisation du microbiote intestinal. 2. Evaluation de la Vitesse Maximale Aérobie (VMA), sur tapis roulant. C'est la vitesse à partir de laquelle la consommation d'oxygène est considérée maximale. Il s'agit d'une course réalisée 3 fois /16 semaines et avec une durée de 15-40 min environ. 3. Une fois la valeur de la VMA connue, nous ferons l'évaluation de la capacité maximale aérobie (CMA), également sur tapis roulant. Il s'agit du temps que la souris est capable de passer à courir à sa VMA. C'est une course réalisée 3 fois /16 semaines et avec une durée de 15-40 min environ. 4. Test pour mesurer la force musculaire : Grip Strength : 3 fois /16 semaines et avec une durée de 0-5 min.
Impact sur les animaux
Compte tenu que le produit que nous testons est une molécule qui est déjà autorisée et utilisée chez l’homme, aucun effet nocif, toxique ou secondaire n’est attendu. Les rongeurs sont des animaux naturellement coopératifs pour faire de l'activité physique. Si un problème survient pendant les tests d'évaluation ou une perte de poids supérieure à 20% sur la durée du protocole, ils seront considerés dans le point limite. Si ces changements sont observés, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
A l'issue de la fin du projet, une anesthésie sans réveil est prévue pour la totalité des animaux. En fait, nous avons besoin de prélever des échantillons de muscles pour les analyses ultérieures. Ces analyses nous permettrons d'identifier les acteurs moléculaires qui vont participer dans les changements observés.
Remplacement
Dans ce projet, nous cherchons à identifier les effets d’une molécule (FOS) sur la performance musculaire . Pour cela nous avons besoin de mesurer la performance lors d'une activité physique. Il n'existe donc pas d'alternative in vitro pour ce type d'évaluation (activité physique). La nécessité de la recherche rend incontournable le recours à l'expérimentation in vivo.
Réduction
Les cohortes seront constituées de 16 souris, afin d’obtenir un nombre d'animaux suffisant pour juger du caractère significatif des résultats. Nous avons calculé le nombre d'échantillon nécessaire par groupe pour pouvoir juger de l'effet du produit. La taille correspond à 16 animaux/groupe. Nous avons conclu que 16 doit être le nombre d'animaux par groupe. Cela représente désormais 48 animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour juger la significativité des donnés.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable de mesurer la consommation quotidienne de nourriture et eau mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, côte à côte et enrichies avec de jouets et du matériel adapté ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel des animaux. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à une injection intra-péritonéale d'anesthésiant en surdose.
Choix des espèces
La souris est très similaire à l’homme : 99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain. Elle possède un développement rapide et une taille réduite. Nous avons choisi les BALB/c, mâles, car nous avions besoin d'un modèle de souris sain, robuste et avec une bonne disposition pour l'activité physique. De plus, ce sont des lignées consanguines ce qui reduit les écarts des réponses individuelles. Mâles, agés de 8 semaines, âge de maturité sexuelle et développement musculaire.
Évaluation d’extraits végétaux sur la prévention de maladies chroniques de l’intestin (MICI) dans différents modèles murins.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par un traitement chimique ou par une modification génétique, pouvant entraîner perte de poids, saignements et diarrhées, avec administration orale quotidienne d'extraits végétaux et deux prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. Le porteur veut formuler une association d'extraits végétaux à visée commerciale contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Il affirme que l'évaluation de ces maladies "ne peut pas être réalisée in vitro".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de formuler une association d’extraits végétaux permettant de limiter le développement de maladies chroniques de l’intestin (MICI) chez la souris. La formulation sera validée sur un modèle MICI pharmacologique induit par un traitement au dextran sulfate de sodium (DSS) puis la dose optimale sera déterminée dans une nouvelle étude sur ce même modèle. Afin de renforcer les résultats, la formule sera également évaluée sur un 2eme modèle MICI génétique faisant intervenir des souris IL10 KO. Ce projet a également pour objectif de renforcer les connaissances sur les bienfaits des extraits végétaux dans la prévention des MICI et d’identifier les mécanismes d’action mis en jeu.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de formuler une association d’extraits végétaux pouvant avoir une action bénéfique sur la prévention d’inflammation / dysbiose intestinale. Cette formulation pourra être portée au niveau clinique chez l’homme et permettre à terme d’aider les personnes souffrant de MICI. Ce projet permettra également de renforcer les connaissances sur les MICI et d’identifier les mécanismes d’actions apportés par certains actifs végétaux sur la prévention de ces maladies.
Procédures
Les animaux recevront une adminiastration orale d'extraits végétaux quotidiennement du début à la fin de l'étude. Cet acte a une durée de moins de 10 seconde, contention comprise. Deux prélèvements de faibles volumes sanguins (en début et fin d'étude) sont également prévus. Cet acte a une durée de moins d'une minute, contention comprise.
Impact sur les animaux
L’utilisation de souris IL10 KO et le traitement au DSS auront pour objectif de développer une dysbiose intestinale et une inflammation du colon. Cette dysbiose si elle est trop importante pourrait entrainer une perte de poids, des saignements ou des diarrhées.
Devenir
À la fin de chaque procédure, les tissus seront prélevés pour permettre la réalisation d'analyses complémentaires. Les animaux seront donc euthanasiés.
Remplacement
L’évaluation des MICI dans leur contexte global ne peut pas être réalisée in-vitro. Le recours à l’animal ne peut donc pas être remplacé.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux dans ce projet, une procédure de validation de modèle est mise en place. Cette validation permettra de réduire le nombre de conditions des procédures suivantes visant à évaluer l’efficacité des différentes formulations et des différentes doses. Cela réduit globalement le nombre d’animaux dans le projet. La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique suffisante pour les paramètres clés.
Raffinement
Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation d’au moins une semaine avant de commencer les procédures, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques.
Choix des espèces
La souris B6.129P2-Il10tm1Cgn/J est une souris mutante qui développe spontanément une maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI). Cette souche est adaptée à l’objectif recherché et est décrite dans la littérature. La souris C56BL/6 est largement utilisée dans la recherche sur les maladies métaboliques. Lorsque ces animaux sont exposés à du DSS dans de l’eau de boisson, ils développent également une inflammation de l’intestin. Ce modèle est également bien décrit dans la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes (6-8 semaines en début de procédure). Pour les souris DSS c’est à cet âge que les animaux sont classiquement utilisés dans la littérature en début d’induction. Pour les souris IL10 KO, l’inflammation apparait au cours du temps. En intervenant sur des jeunes adultes on intervient en amont de la maladie ce qui est l’objectif recherché dans ce projet.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection sous pression de plasmides dans la veine de la queue pour induire un cancer du foie, certaines recevant des drogues anticancéreuses, avec un suivi par imagerie jusqu'à un volume tumoral de 1 500 mm³. Le porteur qualifie la nuisance de l'injection de "temporaire" et inférieure à trente minutes, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut faire souffrir les souris. Il affirme que la validation in vivo est "indispensable" après les tests sur cultures cellulaires et organoïdes.
Objectifs
La grande complexité du carcinome hépatocellulaire (CHC) est liée à plusieurs caractéristiques influençant leur évolution et leur résistance au traitement, notamment son hétérogénéité moléculaire intra- et inter-tumorale. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de tumorigenèse est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin génétiquement modifié qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de coopérants pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Ces objectifs seront réalisés en utilisant la technique d'injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris (IH) qui permet de transfecter des plasmides dans une certaine proportion d'hépatocytes (0.1% - 1% d'hépatocytes).
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue. La durée est très courte (inférieure à 5 secondes). Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue, par voie orale (per os), intrapéritonéale ou intraveineuse (veine de la queue). Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance, induite par l'injection IH, n'est que temporaire (inférieure à 30 minutes). Pendant cette période, les souris seront suivies constamment par les expérimentateurs. Au delà de cette période, les souris ne montrent plus aucun signe de souffrance. A ce stade initial de la tumorigenèse, aucun signe de souffrance n'est détecté chez les animaux. Cependant, la formation des tumeurs pourra induire chez certaines souris des souffrances que nous évaluerons et que nous essaierons de minimiser grâce à des stratégies d’optimisation de bien être animal couramment utilisées dans l'ensemble de nos projets de recherche (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d'hébergement). A la fin de l'expérience (entre 2-5 mois et/ou lorsque les tumeurs atteignent au volume total maximal de 1500 mm3), les souris seront euthanasiées. Le volume des tumeurs étant évalué par imagerie non invasive.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, ce qui est le cas lors d’expériences réalisées avec les animaux. Cet outil d’analyse statistique nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires, selon la variabilité des réponses obtenues. En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères: poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation).
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.