Recherche fondamentale

1 820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une fixation crânienne ou un dispositif optique implanté sous anesthésie, puis un entraînement de plusieurs semaines à des tâches de mémoire spatiale dans un environnement virtuel, crâne immobilisé, avec enregistrement des neurones. Le porteur indique que les souris peuvent être soumises à un contrôle de la consommation de liquide, l'entraînement s'arrêtant si la perte de poids dépasse 20 %, et que tous les animaux sont tués faute de pouvoir être réutilisés ou adoptés. Il revendique le recours à l'animal comme "nécessaire", la modélisation informatique ne suffisant pas à étudier les mécanismes de la mémoire.

Objectifs

Comment le cerveau peut-il distinguer entre des souvenirs qui se ressemblent ? L’hippocampe est censé servir cet objectif en générant des représentations de mémoire qui ne se chevauchent pas. Au cours de la vie adulte, l’hippocampe est constamment alimenté avec de nouveaux neurones, ajoutant de nouveaux éléments qui s’intègrent dans le réseau existant. Comment les activités des neurones nouvellement produits et matures sont reliées au stockage et au rappel des traces mémorielles distinctes n’est pas bien compris. Lors du stockage de traces mémorielles, l’hippocampe est activé par des entrées synaptiques qui sont induites par les événements et les objets de l’environnement actuel. Pour créer une trace mémorielle de cet environnement, l’hippocampe doit sauvegarder ce motif d’activité. La théorie prévalente suggère que ceci est accompli en renforçant la puissance des synapses entre les neurones hippocampiques qui font partie de ce motif d’activité, créant ainsi un ensemble de neurones fortement connectés. Par conséquence, quand la mémoire doit être ravivée, l’activation même d’une petite partie de cet ensemble entrainera tous les neurones de l’ensemble. Une mémoire complète peut être reconstituée même par une petite partie de l’environnement original. Plusieurs niveaux neuronaux sont engagés dans ce processus. Les neurones individuels doivent correctement sélectionner les entrées synaptiques auxquelles ils répondent. Ensuite, les populations de neurones qui répondent à différents motifs synaptiques ne doivent pas se chevaucher. Il n’est pas bien compris comment ces processus sont réalisés à ces niveaux différents. De plus, nous ne savons pas quel rôle est joué par les cellules nouvellement produites lors du stockage et du rappel de traces mémorielles. Pour répondre à ces questions, nous allons combiner des nouvelles méthodes qui nous permettront d’enregistrer et manipuler l’activité neuronale lors de tests comportementaux. Ces expériences ont pour objectifs scientifiques de répondre aux questions suivantes : 1. Quels sont les comportements et les entrées sensorielles qui activent les neurones nouvellement générés et matures ? 2. Comment les souvenirs distincts sont-ils représentés au niveau des entrées synaptiques des neurones ? 3. Peut-on manipuler sélectivement l'activité des neurones nouvellement générés et matures pour établir un lien de causalité avec la formation, la consolidation, et le rappel de souvenirs distincts ?

Bénéfices attendus

Le rôle des circuits neuronaux dans le stockage et le rappel des souvenirs épisodiques a été largement étudié au cours des dernières décennies. Cependant, la manière dont l'activité des neurones et des circuits neuronaux assure une récupération robuste des souvenirs familiers tout en permettant un encodage flexible des informations nouvelles n'est toujours pas claire, en particulier lorsque les informations familières et nouvelles se ressemblent. Nous abordons ici cette question en utilisant une approche expérimentale et computationnelle combinée. L'originalité de notre proposition est que nous n'établirons pas seulement des corrélations entre l'activité neuronale et le comportement, mais que nous fournirons des liens de causalité en manipulant l'activité de populations neuronales fonctionnellement identifiées. Nos résultats fourniront également des prédictions vérifiables pour les études humaines et aideront à mieux comprendre comment le cerveau stocke les souvenirs épisodiques dans la santé et la maladie. La mémoire, élément fondamental de l'être humain, est tragiquement perturbée dans de nombreuses pathologies neurologiques, notamment dans la maladie d'Alzheimer. Les théories sur la façon dont les souvenirs sont formés et rappelés par les circuits neuronaux dans la santé et la maladie sont largement basées sur des preuves corrélatives. Notre projet fournira des preuves causales sur la façon dont l'activité neuronale dans les systèmes de mémoire du cerveau entraîne un comportement guidé par la mémoire. Ces données fondamentales sont essentielles pour comprendre comment ce processus est perturbé dans des états pathologiques tels que la maladie d'Alzheimer, où notre approche mécaniste peut aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Après publication, nos données seront mises à disposition dans un dépôt ouvert et publique afin que d'autres chercheurs puissent également bénéficier de nos résultats expérimentaux.

Procédures

Implantation d’une plaque crânienne ou d’un dispositif optique intracrânien d’une durée typique de 1h ; 1–2 gestes chirurgicaux par animal. Ces gestes chirurgicaux sont suivis d’une récupération de 1–2 semaines. Ensuite, entrainement des souris pendant 1—4 semaines dans un espace virtuel, composé de 5–10 séances d’enregistrement ou d’entrainement de typiquement 30–90 minutes (rarement jusqu’à 3 heures) par jour. Après l’entrainement, 1–3 séances d’enregistrement de l’activité neuronale jusqu’à 3 heures par jour pendant une période de 2–5 jours.

Impact sur les animaux

Ce projet peut rarement (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire car nous n’avons pas suffisamment d’informations pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la mémoire avec de la modélisation informatique. Pour obtenir ces informations, il nous faut donc employer des animaux qui effectuent des tâches de mémorisation. Les souris sont un modèle approprié pour ce projet, car elles peuvent être entrainées à des tâches de mémoire spatiale, elles produisent de nouvelles cellules nerveuses dans l'hippocampe, et elles sont accessibles à des techniques avancées d'enregistrement.

Réduction

Nous visons à utiliser le nombre minimal d'animaux qui sera suffisant pour obtenir des résultats expérimentaux valides. Les données d'une expérience peuvent être utilisées pour différents projets, par exemple, les données produites par des expériences d'intégration synaptique peuvent fournir des contraintes pour la construction d'un modèle informatique ; et les expériences électrophysiologiques in vivo peuvent à leur tour être suivies par des analyses morphologiques de la connectivité synaptique dans le même tissu in vitro. Nous allons utiliser des tests statistiques appropriés afin d'utiliser un nombre minimal de points de données pour fournir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux se justifie du fait de la faible taille des effets expérimentaux étudiés (nécessitant donc un nombre d’observations conséquent) et de la difficulté des manipulations réalisées (pertes techniques). L’environnement virtuel nous permet de finement et instantanément contrôler et adapter l’environnement suivant le comportement des animaux, ce qui n’est que difficilement possible dans des environnements réels. En plus, comme le crâne de l’animal est fixé, nous n’aurons pas besoin de miniaturiser les instruments d’enregistrement, ce qui nous permettra d’obtenir des enregistrements de haute définition avec peu de perturbations causées par le mouvement. Cela réduit la variabilité de nos données, nous permettant de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire. Les approches patch-clamp et l’imagerie calcique nécessitent une excellente stabilité et un mouvement minimal du cerveau pour pouvoir extraire des signaux qui sont près du seuil de bruit. Pour cette raison, la plupart des essais seront effectués sur les animaux à crâne fixé. Cela nous aidera également à réduire le nombre d’animaux, car nous augmenterons la fraction de données utilisables.

Raffinement

Nous avons mis au point des procédures de surveillance accrue, de soins post-opératoires, de mesures de gestion de la douleur, et d’entrainement des animaux qui ont été développées et raffinées pendant plusieurs années. Pendant les procédures chirurgicales, la profondeur de l’anesthésie sera surveillée en testant les réflexes et en enregistrant la fréquence de respiration. Un tapis chauffant sera utilisé tout au long de la chirurgie. Si possible, une chaufferette est positionnée en contact de sa cage d’hébergement pendant les premières 24 heures suivant la chirurgie. Des analgésiques pré-opératoires seront administrés. Du gel ophtalmique est appliqué. Des anti-inflammatoires oraux sont mélangés à du gel alimentaire et placés dans la cage de l’animal durant au moins 3 jours après la chirurgie. Pour les souris montrant des signes de douleur après la chirurgie, l’administration de l’analgésique sera renouvelée. Selon notre expérience, nous n’observons pas de douleurs au-delà de 3 jours après la chirurgie. Le comportement des animaux sera surveillé régulièrement après la chirurgie, en faisant attention à une activité réduite, une posture voûtée, une démarche anormale, ou une agressivité accrue. Les animaux seront observés durant les 48h qui suivent l’opération. Si les animaux sont soumis à un contrôle de la consommation de liquide, ils seront pesés régulièrement, et la restriction sera interrompue si la perte de poids dépasse 20% par rapport au poids pré-chirurgical. Les souris seront hébergées avec une litière appropriée et des matériaux de nidification dans un environnement enrichi avec des roues, des tunnels et des maisonnettes. Bien que les réponses sensorielles puissent être testées sous anesthésie, les médicaments d'anesthésie affectent l'activité dans les circuits neuronaux et peuvent fournir des résultats trompeurs. De plus, la majorité des expériences nécessite que l’animal effectue une tâche. Pour cette raison, les expériences se feront sur l’animal éveillé.

Choix des espèces

Les rongeurs sont probablement les espèces les plus éloignées phylogénétiquement pour lesquels une comparaison directe peut être faite avec la structure et le fonctionnement du cerveau humain. Notre modèle expérimental est la souris (C57B/6J wild type), qui est actuellement l'espèce de choix dans la plupart des domaines de la recherche biomédicale, car elle permet l'utilisation de techniques moléculaires puissantes. Cela a permis l'expression sélective de molécules, telles que des protéines fluorescentes, pour identifier des populations de neurones spécifiques au lieu d’enregistrer l’activité de neurones choisis au hasard. Ceci est un raffinement de nos méthodes qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Souris adultes, parce que nous nous intéressons à la neurogenèse dans l’organisme adulte, et au comportement dans l’organisme adulte. La croissance du crâne est alors largement terminée.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats de souche ZSF1, sélectionnés pour développer une insuffisance cardiaque, sont anesthésiés deux heures pour recevoir un produit de contraste et une imagerie du cœur par ultrasons, avant d'être euthanasiés pour prélever le cœur. Le porteur décrit surtout un stress léger à l'introduction en chambre d'induction et situe les atteintes du côté de la pathologie développée par les animaux. Il affirme que la complexité du système vasculaire empêche de mettre au point cette méthode sans rats, et présente ce marqueur d'imagerie comme un futur outil clinique.

Objectifs

La circulation coronarienne est responsable de la perfusion du myocarde. Les modifications du débit coronarien ont des conséquences graves sur les performances du cœur, comme dans l’infarctus du myocarde. À ce jour, seules les grosses artères épicardiques de l’ordre du millimètre peuvent être visualisées in vivo chez l'homme et l’animal par les techniques d'angiographie telles que les rayons X, la tomodensitométrie ou l’IRM. Ces dernières années, nous avons démontré au laboratoire la faisabilité de la microscopie ultrasonore de localisation. Cette technique d’imagerie permet de visualiser en profondeur dans les organes les flux sanguins dans les micro-vaisseaux de quelques dizaines de microns de diamètre. Au-delà de la simple visualisation,d'autres nouvelles techniques échographiques de mesure des flux sanguins permettent de quantifier les vitesses de flux dans les vaisseaux, ce qui est crucial pour évaluer la fonction des micro-vaisseaux. Nous avons récemment amélioré cette technique pour faire de l’imagerie 3D, ce qui permet de visualiser et de quantifier les flux au niveau d'un organe entier tel que le cerveau et le cœur. Une première étude sur des rats témoins a démontré la faisabilité de la mesure des diamètres et des flux des vaisseaux de la microcirculation ainsi que leur réactivité au cours d’une vasodilatation. Nous voudrions maintenant mettre en évidence une différence de réactivité et d’anatomie de ces vaisseaux dans l’insuffisance cardiaque. Cette pathologie a touché 40 millions de personnes en 2015 dans le monde. La moitié des patients sont atteints d’une forme appelée insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICEP) très difficile à diagnostiquer. Cependant, des altérations de coronaires apparaissent très tôt et pourraient être un marqueur précoce de l’ICEP car Il est maintenant bien établi que la dysfonction de la microvascularisation coronarienne est un marqueur pronostique des altérations du muscle cardiaque. Nous utiliserons une souche de rats mutants ZFS1 obèses développant cette pathologie au cours de leur croissance. Avec ce modèle d’imagerie microscopique non invasif, nous pourrons mettre en évidence les effets précoces du développement de l’insuffisance cardiaque sur la microcirculation dans le cœur. Pour ce projet nous prévoyons d’utiliser 20 rats sur une durée de 5 ans. Il est important de noter que le projet s'inscrit dans la démarche des 3R.

Bénéfices attendus

Il est maintenant bien établi que la dysfonction de la microvascularisation coronarienne est un marqueur pronostique de l’insuffisance cardiaque. Nous pensons que cette technologie permettant l’exploration des flux myocardiques des petits vaisseaux de quelques dizaines de micron mettra en évidence des différences significatives chez les animaux insuffisants cardiaques. Ces données recueillies sur l’animal entier présentent un intérêt thérapeutique majeur qui pourront être utilisées en clinique dans le futur comme un marqueur précoce du développement de l’insuffisance cardiaque.

Procédures

Les interventions auront toutes lieu sous anesthésie générale pendant 2 heures. Pour chaque animal, Il y aura : - Injection intraveineuse de produit de contraste et d'adénosine ou de sérum physiologique. -Tonte de la peau au niveau de la cage thoracique. - Positionnement d'une sonde échographique en contact de la peau sur la cage thoracique. - Euthanasie à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Au cours des expérimentations, une manipulation pour introduire le rat dans la chambre d’induction peut engendrer un léger stress de l’animal. Un soin particulier sera donné dans la surveillance des rats pendant leur hébergement notamment pour les rats développant une insuffisance cardiaque. A part cela, les opérations auront lieu sous anesthésie générale. Les prélèvements de coeur seront réalisés après euthanasie du rat.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés a la fin de la procédure. Un prélèvement de cœur sera effectué afin de réaliser une analyse quantitative du degré de l'insuffisance cardiaque de l'animal.

Remplacement

Cette étude a déjà été mise au point au cours de l’étude coronarographie 3D. La complexité du système vasculaire ne nous permettait pas de mettre au point cette méthode sans utiliser des rats. Dans cette étude des mécanismes de développement de l’insuffisance cardiaque nous sommes obligés d’utiliser des modèles qui sont très spécifiques. Seule L’application de cette méthode qui est nouvelle sur ce modèle nous permettra de découvrir les mécanismes du développement de la maladie.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de cette étude dans la mesure où nous utiliserons les mêmes conditions expérimentales que l’étude « Coronarographie par ultrasons en trois dimensions ». Les conditions expérimentales sont parfaitement maîtrisées et nous n’aurons donc pas besoin d’animaux pour la mise au point. Pour cette étude, une comparaison entre deux groupes sera effectuée. Un groupe témoin composé de 10 rats sains et un groupe composé de 10 rats insuffisants cardiaques. Une deuxième comparaison sera effectuée entre les résultats avant et après ajout d’agents pharmacologiques sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront reçus au moins une semaine avant la procédure et seront manipulés régulièrement afin de les habituer et éviter le stress le jour de la procédure. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 rats pour favoriser leurs comportements sociaux dans un environnement enrichi (tunnel en carton et bâton en bois) avec un accès illimité en eau et nourriture. Durant l’opération sous anesthésie générale, la température et les constantes de l’animal (température corporelle, fréquences respiratoire et cardiaque et saturation d’oxygène) seront contrôlés et toute anomalie conduirait à l’ajustement immédiat des paramètres de l’anesthésie, si les modifications n’amélioraient pas l’état de l’animal, la procédure serait arrêtée et l’animal serait euthanasié.

Choix des espèces

Les développements effectués sur les coronaires de rats dont la structure est élaborée et complexe pourront être utilisés de façon fiable sur les études futures chez l’homme. La souche de rats ZSF1 répond aux critères d’exploration de la méthode, il n’y aura pas de mise au point supplémentaire à effectuer. Des rats adultes seront utilisés afin de s’assurer que l’imagerie est faite sur des cœurs pleinement développés.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du foie, par injection simple ou par chirurgie dans le foie, la rate ou la veine porte, puis des traitements testés et un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que le développement de la tumeur peut entraîner des effets délétères encadrés par des points limites, les animaux étant tués pour prélever organes et fluides. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'évalue un médicament sur le cancer du foie et que l'animal reste un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de cancer du foie. Ces modèles devant être représentatifs des tumeurs humaines et permettre d’évaluer au mieux l’effet bénéfique de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les stratégies thérapeutiques testées sont actives dans un modèle expérimental et également d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Ainsi, à long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers hépatiques, une pathologie humaine touchant plus de 10 000 personnes par an en France.

Procédures

Les animaux recevront 1 greffe de cellules tumorales soit par voie peu invasive (sc, ip, iv - durée max 1 min) soit par chirurgie (injection dans le foie, la veine prote ou encore la rate - durée de la chirurgie estimé à 5-10 min). Dès lors, des essais de traitements seront menés Le schéma thérapeutique sera adapté en fonction de la nature du traitement testé. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères. Dans ce contexte, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter ces signes au plus tôt et donc de garantir le bien-être animal. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Encore une fois, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter les signes de mal être au plus tôt et donc de pouvoir agir rapidement et ainsi de garantir le bien-être animal. Les procédures chirurgicales d’implantation intrahépatique, intrasplénique et veine porte repose sur la mise en place de protocoles chirurgicaux incluant une analgésie maitrisée ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet donc de réduire les contraintes potentielles pour l’animal à leur minimum.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du foie. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6 à 10 / par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse,

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement .

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une fenêtre d'observation implantée dans le crâne sous anesthésie, puis jusqu'à neuf séances d'habituation à la contention et cinq à sept séances d'imagerie maintenues de une à trois heures, pour former une quinzaine d'étudiants par an à la technique. Le porteur revendique qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'il est "essentiel" que la formation implique des animaux vivants. Les bénéfices évoqués contre les pertes sensorielles restent lointains, l'objet réel du projet étant l'apprentissage d'un outil d'imagerie.

Objectifs

Le but général du projet est d’entrainer annuellement une quinzaine d’étudiants, sous supervision d’un spécialiste, à mesurer de manière extensive et précise les représentations sensorielles de stimuli complexes dans le cerveau de souris vigiles. Ces mesures extensives sont rendues possibles par l’utilisation de techniques d’imagerie à haute densité permettant l’enregistrement simultané de plus de 1000 neurones par expérience. La formation d’étudiants dans ce domaine permettra la généralisation de cette méthodologie qui permet d’obtenir beaucoup plus de données cruciales pour la compréhension des circuits neuronaux du cerveau pour un nombre réduit d’animaux utilisées. Dans ce projet, nous mettons en place une procédure expérimentale permettant aux étudiants, sous la supervision d’un spécialiste de prendre en main les instruments nécessaires à la réalisation de l’expérience en situation réelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’acquisition par une quinzaine d’étudiant annuellement d’une méthode qui représente une nouveauté technologique pour l’observation de l’activité cérébrale à la résolution neuronale. Le développement de cette méthode permettra de progresser dans la compréhension des mécanismes de la perception sensorielle et ainsi de pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques dans le domaine des pertes sensorielles.

Procédures

Les animaux sont soumis à 1 chirurgie d’implantation d’une fenêtre d’observation permanente sous anesthésie et analgésie puis à 9 séances maximum d’habituation à la contention (0.5 à 3h par séance). Enfin 5 à 7 séances d’imagerie en contention de 1 à 3 heures sont réalisés.

Impact sur les animaux

Ce projet inclut une préparation chirurgicale des souris occasionnant des douleurs et un inconfort modéré dans la période de récupération de 2 jours. Par la suite les souris sont habituées à la contention ce qui entraine un stress et un inconfort qui s’amenuisent après 3 jours d’habituation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour accéder à l’activité de milliers de neurones opérant le traitement de l’information sensorielle. Dans ce projet l’utilisation d’animaux est nécessaire pour permettre aux étudiants d’apprendre la méthodologie d’imagerie et la manipulation de l’équipement en conditions réelles. Cela permet d’éviter par la suite de nombreuses erreurs qui peuvent se faire parfois au détriment du bien-être animal. Il est donc essentiel que la formation à cette méthode implique des animaux vivants.

Réduction

Grâce à l’utilisation des méthodes d’imagerie optiques modernes permettant d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, le nombre d’animaux utilisés est minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal, et ainsi atteindre des échantillons de plusieurs milliers de neurones, permettant une précision statistique jamais atteinte. Il est donc important de développer ces techniques pour améliorer la réduction des nombres d’animaux utilisés en neuroscience. 20 animaux sont nécessaires par ans pour obtenir les dix animaux nécessaires pour le cours (4 à 5 animaux utilisés par jours et repos de 2 jour) en comptant 50% d’animaux non utilisables du fait d’aléas expérimentaux, soit 100 animaux par an.

Raffinement

La procédure expérimentale de ce projet implique une antalgie et des temps de repos appropriés pour minimiser la souffrance, un suivi quotidien des animaux, et la définition de points limites précis basés sur des indicateurs de poids, (toute perte de poids >20% est un point limite), d’aspect général et de comportement, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort s’il n’est pas possible de pallier immédiatement la souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle animal en raison de l’ensemble des outils génétiques (souris transgéniques, injections virales AAV) qui sont bien établies chez cet animal, et qui permettent d’une part de manipuler différents éléments du système nerveux de manière ciblée, d’autre part de garantir une expression large et stable de certaines protéines, comme des senseurs calciques fluorescents ou des opsines (par ex. channelrhodopsin). Dans ce projet nous utiliserons les lignées GAD2-Cre, AI14D-TDT et leur croisement qui permet le marquage spécifique des interneurones dans le cortex. Pour toutes les expériences, nous utiliserons des souris adultes (de 3 à 6 mois) afin d’étudier la perception sensorielle dans un système nerveux mature.

212 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation de plutonium dans la trachée sous anesthésie, provoquant une irradiation pulmonaire chronique, puis des traitements par inhalation, injection ou gavage et des séjours en cage métabolique, pour tester des associations destinées à éliminer le radioélément. Le porteur indique que des signes précurseurs de fibrose devraient apparaître et que les animaux sont tués après six semaines ou trois mois pour prélever leurs organes. Il justifie le recours à un "organisme entier" par la biocinétique complexe du plutonium, difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’améliorer la prise en charge thérapeutique suite à une contamination interne avec du plutonium (Pu). Ces situations peuvent se rencontrer dans les domaines civil et militaire (travailleur du nucléaire, accident, acte de malveillance etc.). Les traitements utilisés actuellement consistent à favoriser l’élimination du radioélément (décorporation) avec une molécule capable de le piéger (chélateur), tel que l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA) dans le cas du plutonium. Cependant, ce traitement a une efficacité limitée sur les formes peu solubles de plutonium et son effet sur les conséquences biologiques induites à long terme par la contamination n’a pas été étudié à ce jour. Notre approche innovante consistera donc à combiner ce traitement de référence avec des molécules possédant des mécanismes d’action complémentaires afin de favoriser l’élimination du plutonium et de limiter ses effets biologiques. Deux molécules candidates ont été retenues pour ce projet : un anti-inflammatoire, qui devrait permettre de limiter l’inflammation résultant de la contamination et les pathologies associées (fibrose pulmonaire notamment) et un mucolytique, qui devrait favoriser l’élimination du plutonium en fluidifiant les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux. L’association de ces molécules avec le DTPA permettra, en cas de libération de Pu à partir des lésions inflammatoires par exemple, de favoriser son élimination sous forme de complexe Pu-DTPA et d’empêcher sa fixation à d’autres organes. Des expériences préliminaires prometteuses avec ces associations thérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires in vitro. Dans ce projet, nous étudierons l’influence de ces associations thérapeutiques sur la biodistribution du plutonium dans l’organisme et sur les effets biologiques induits, tels que l’apparition de fibroses pulmonaires dans le cas de contaminations pulmonaires.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu suite à ce projet porte sur l’amélioration de la prise en charge thérapeutique en cas de contamination pulmonaire par du plutonium. Cette nouvelle stratégie thérapeutique aura pour objectif de limiter les conséquences biologiques de la contamination à moyen et long terme, au premier rang desquelles l’apparition de fibroses pulmonaires. Les résultats obtenus pourront, à terme, contribuer à l’élaboration de nouvelles recommandations thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront contaminés, sous anesthésie, par une instillation intra-trachéale unique (durée maximale 5 secondes). Les traitements seront délivrés par inhalation (bi-hebdomadaire, durée 15 minutes) et/ou injection (hebdomadaire, durée maximale 5 secondes) et/ou gavage gastrique (administration unique après la contamination, durée maximale 10 secondes) après induction d’une anesthésie générale puis per os (dans l’eau de boisson) durant 6 semaines ou 3 mois.

Impact sur les animaux

Les séjours en cage à métabolisme, d’une durée de 1 à 5 jours maximum, génèreront du stress et de l’inconfort pour les animaux. Les cages à métabolisme sont des hébergements individuels permettant le recueil des excrétas (urines et selles) des animaux en vue d’analyses futures (mesures de la radioactivité par exemple). Les animaux sont placés sur des grilles sous lesquelles un système de séparation et de collecte des excrétas est installé. Ces effets indésirables seront temporaires et disparaitront lors du retour des animaux en hébergement classique. Le plutonium possède une toxicité radiologique, mais pas de toxicité chimique. Il induira une irradiation pulmonaire chronique durant 3 mois au maximum. Ce délai est trop court pour donner lieu à l’apparition de pathologies cancéreuses ou des fibroses pulmonaires déclarées. Des signes biologiques précurseurs devraient néanmoins être observés (lésions préfibrotiques, sécrétion de certaines cytokines, accumulation de collagène, etc.).

Devenir

Tous les animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés 6 semaines ou 3 mois après la contamination afin de prélever différents organes et tissus. Ces prélèvements seront nécessaires pour étudier la biodistribution du plutonium dans l’organisme et l’apparition de phénomènes inflammatoires ou fibrotiques en présence des différents traitements.

Remplacement

La contamination interne par des radioéléments résulte principalement d’une exposition accidentelle par inhalation ou via une blessure. Cette contamination interne implique un passage à travers plusieurs barrières physiologiques indicatives d’un système complexe et intégré. Les approches de décorporation doivent agir à la fois localement (au niveau du site d’entrée) et de façon globale dans l’organisme afin de diminuer la rétention des radioéléments dans les organes cibles (foie et os notamment), et de faciliter leur élimination par les voies naturelles. En raison de la biocinétique complexe des radioéléments dans l’organisme, l’évaluation de l’efficacité des traitements ne peut se limiter à étudier leurs effets sur un type cellulaire particulier ou sur un modèle in vitro non intégré. De même, les anti-inflammatoires sont des molécules agissant sur plusieurs cibles et les mucolytiques fluidifient les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux, phénomène qui ne peut être obtenu sur des modèles in vitro. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier (in vivo). Des expériences préliminaires à ce projet ont par ailleurs été menées in vitro afin de confirmer la pertinence des traitements envisagés en amont du recours à l’expérimentation animale.

Réduction

La stratégie adoptée s’appuie sur les données du laboratoire. L’expérience suggère que des groupes de 5 à 7 animaux sont suffisants pour démontrer une efficacité thérapeutique du DTPA ou d’autres traitements par voie veineuse, par voie pulmonaire ou par voie orale chez le rat après analyse statistique. Un effectif de 6 animaux par groupe a donc été retenu pour la conduite de notre projet. Pour des raisons réglementaires inhérentes au travail en installation nucléaire il n’est pas possible de réaliser une campagne de contamination sur plus de 30 animaux simultanément. Ces contraintes justifient la conduite de plusieurs campagnes de contamination. Par ailleurs, en raison de la variabilité inhérente à la préparation des solutions de plutonium et à la contamination, chaque campagne devra inclure un groupe contrôle contaminé non traité ainsi que les traitements simples avec une seule molécule (6 animaux par groupe). L’analyse statistique comparera chaque groupe traité au groupe non traité et au groupe traité avec une seule molécule (dans le cas des associations de traitements) au sein d’une même campagne.

Raffinement

Après contamination les animaux sont hébergés individuellement dans des cages à métabolisme (5 jours maximum) en plastique transparent à travers desquelles les rats peuvent se voir les uns les autres, s’entendre et se sentir. Un enrichissement de type jouet à ronger est ajouté dans les cages à métabolisme. Par la suite, les animaux sont hébergés en groupe (3 animaux par cage) avec des enrichissements matériels et nutritionnels (tunnel ou boule en plastique, bâtonnets en bois, papier, grosse croquette etc..). La contamination et le gavage des animaux seront réalisés après induction d’une anesthésie générale afin de limiter le stress et l’inconfort lié à ces actes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine minimum (ou plus si besoin pour expérimentation ou surveillance accrue). Mise en place de points limites identifiés pour ce projet et l’utilisation d’analgésique pour soulager l’animal en cas de souffrance. Une vigilance particulière sera également portée à l’apparition de potentiels symptômes respiratoires (dyspnées, essoufflements, éternuements et toux), une réponse inflammatoire pulmonaire pouvant faire suite à la contamination.

Choix des espèces

Le rat est l'espèce animale retenue pour nos études du fait de la richesse des données issues de la littérature sur la contamination par les radioéléments de la même famille que le plutonium, d'un point de vue de la biocinétique et des tests de traitements de décorporation des radioéléments. En effet, le rat est un modèle pertinent pour la contamination interne pulmonaire : sa taille, supérieure à celle de la souris, permet de réaliser des prélèvements biologiques suffisamment conséquents pour obtenir des niveaux de radioactivité mesurables et des informations exploitables sur un certain nombre de paramètres biologiques. De plus, de nombreuses données historiques obtenues sur cette espèce sont disponibles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront âgés de 4 à 6 semaines au moment de la réception car les risques de contamination interne avec des radioéléments concernent principalement les travailleurs jeunes adultes et adultes). Les rats présenteront initialement des poids allant de 150 à 200 g, de façon à faciliter leur hébergement en groupe et leur assurer un meilleur confort lors du séjour en cage à métabolisme.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques reçoivent pendant 6 à 12 mois une alimentation enrichie d'un mélange de six pesticides, avec suivi de la glycémie, séjours en cage métabolique, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par injection puis prélèvements sanguins répétés, pour explorer un lien entre pesticides, maladie de Parkinson et diabète. Seuls des mâles sont exposés, et les animaux sont tués pour prélever cerveau, pancréas et autres organes. Le porteur affirme que ces liens n'ont "jamais été explorés" et écarte les modèles cellulaires ou invertébrés comme inadaptés à sa question.

Objectifs

Notre projet vise à apporter des connaissances sur les liens potentiels qui n’ont jamais été explorés à notre connaissance entre exposition alimentaire à des pesticides et des maladies humaines chroniques fréquentes, les maladies de Parkinson (MP) et le diabète, à l’aide d’un modèle « humanisé » développant une maladie neurodégénérative caractérisée par l'accumulation anormale d'agrégats de la protéine alpha-synucléine dans le cerveau. Ce projet s’inscrit dans un contexte ou certaines données épidémiologiques suggèrent que le diabète serait associé à un risque accru de maladie de Parkinson. Par ailleurs, plusieurs méta-analyses confirment le lien entre exposition professionnelle aux pesticides et MP. Dans ces conditions, notre projet envisage l’évaluation de la toxicité d’un mélange de 6 pesticides à des doses individuelles supposées ne pas exercer d’effets sur la santé chez l’homme mais rapportées pour induire en mélange un surpoids et/ou un diabète chez des souris non transgéniques. En utilisant ce mélange, nous étudierons alors le lien entre les perturbations métaboliques observées et les mécanismes qui sous-tendent le développement de la MP dans un modèle de souris transgéniques.

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des éléments de connaissance concernant le rôle de l’exposition quotidienne à de faibles doses de pesticides en mélange via l’alimentation dans l’incidence des maladies neurodégénératives associées à la protéine alpha-synucléine (comme la maladie de Parkinson) et du diabète. Par ailleurs, ce projet doit permettre d'investiguer le lien entre le diabète et la maladie de Parkinson.

Procédures

Premièrement, 40 souris (10 par lot) feront l'objet d’un suivi périodique de la glycémie sur 6 mois (semaine 9, 17, et 24). Après une période de jeûne de 4-6h des prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre (3 minutes par animal). Deuxièmement, 40 souris (10 par lot) feront l’objet de prélèvements urinaires et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les animaux seront mis individuellement dans des cages métaboliques pour récupérer les urines sur une période de 24h (semaine -1, 6, 27 et 52). Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin, Pour les tests de tolérance au glucose (semaine 16, 36, et 48) après une période de jeûne de 4-6h, une injection intrapéritonéale d’une solution saline de D-Glucose stérile sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués, pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min. Par ailleurs, deux prélèvements sanguins supplémentaires seront réalisés pour un dosage ultérieur de l’insuline plasmatique qui sera mesurée 30 min avant et 15 minutes après l’injection du DGlucose. Troisièmement 20 souris (5 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels et d’un suivi des paramètres métaboliques selon les mêmes modalités que le point 2 (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les tests fonctionnels (semaine 0/1, 12/13, 25/26, 38/39 et 51/52) seront réalisés afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles de l’exposition aux pesticides, en comparaison avec le vieillissement normal. Lors de chaque test, les animaux seront évalués pendant 7 minutes. Quatrièmement 40 souris (10 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels (selon les mêmes modalités que le point 3) et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance à l’insuline) sur 12 mois. Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin pour les tests de tolérance à l'insuline intrapéritonéal (semaine 15, 35 et 47) les souris seront mises à jeun pendant 4-6h puis une injection intrapéritonéale d’une solution d'insuline (0,75U insuline/kg de poids corporel) sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min.

Impact sur les animaux

L'administration d'aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides a déjà été réalisée chez la souris sans complication observée pour elles-mêmes. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul. Les suivis envisagés sont couramment utilisés et n'induisent pas d'effet indésirable particulier en dehors de la douleur ou du stress induit par l'acte lui-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 20%), les souris seront mises à mort. Concernant les animaux qui seront soumis à un ensemble de tests fonctionnels, la planification des tests est prévue afin de limiter le stress des animaux et garantir un niveau d’activité. En particulier, lors de chaque session, les tests seront étalés sur 2 semaines et aucun suivi des paramètres métaboliques ne sera réalisé durant la période de suivi des capacités motrices des souris.

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement des organes nécessaires à l'exploitation des résultats : cerveau, pancréas, foie, moelle épinière, tissu adipeux, intestin, fèces, yeux et sang.

Remplacement

L'étude des liens entre la maladie de Parkinson et le diabète de type 2 en condition d'exposition chronique à un mélange de faibles doses de pesticides à l'aide de cellules, organoïdes, modèles numériques ou modèles animaux moins sensibles (invertébrés) constituerait des approches différentes qui ne pourraient pas répondre aux questions que nous souhaitons aborder. Par ailleurs, l'étude des mécanismes moléculaires au niveau pancréatique dans un modèle murin de synucléinopathie n’a jamais été réalisée, et encore moins dans des conditions d’exposition alimentaire à un mélange de pesticides à faibles doses, pertinente au regard de l’évaluation des risques de l’alimentation humaine.

Réduction

Les animaux exposés seront tous étudiés dans les différentes expériences (tests fonctionnels, suivi métabolique) et ils seront analysés avec les différentes techniques choisies. Les souris seront mises à mort après 6 mois ou 12 mois afin de mimer une exposition d'un consommateur humain durant 15 et 30 ans. Ces choix de durée d’exposition sont également motivés par les caractéristiques spécifiques de l’évolution de la neuropathologie dans la lignée M83 d’une part et par les données déjà publiées sur l’évolution des troubles métaboliques chez la souris conventionnelle d’autre part. La quantité d'animaux par groupe de 35 animaux/groupe est le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Une fois les données relevées (comparaison de la masse des souris (en g), mesure de la glycémie, réponse au test de tolérance au glucose, réponse au test de tolérance à l’insuline, capacité motrice, étude des perturbations métaboliques et des mécanismes liés au développement de la MP) des tests statistiques sont prévus pour la comparaison des 2 groupes entre eux (exposé, non-exposé). En accord avec les récentes observations publiées, seules les souris mâles seront exposées de façon continue, à l’aliment enrichi (ou non) par le mélange de 6 pesticides pendant 12 ou 6 mois.

Raffinement

Les animaux seront suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière pour le suivi métabolique des animaux (la mesure du poids, la quantité de nourriture ingérée, tests de tolérance au glucose intrapéritonéal, prise d'urine, mesure de la glycémie) et la mise en œuvre des tests fonctionnels. Les souris seront hébergées avec un environnement enrichi. Elles auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne, aucune sur-mortalité n'avait été enregistrée. En cas de mal être: blessure, poids trop faible (si la perte de poids est de plus de 20%), déshydratation, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La lignée de souris transgéniques (M83) exprimant l’alpha-synucléine humaine sera utilisée et exposée (ou non) au mélange de pesticides via l’alimentation, parallèlement aux souris Bl6/C3H, fond génétique de la lignée M83. Les travaux sont proposés à partir de la lignée de souris transgéniques M83 exprimant l’alpha-synucléine humaine mutée A53T. Ce modèle murin, dont l’agrégation protéique est facilitée par la mutation, permettra d’évaluer l’impact du mélange sur la neuropathologie. Nos résultats préliminaires montrent la présence très précoce d’alpha-synucléine phosphorylée en sérine 129 dans les ilots pancréatiques des souris transgéniques. Les souris seront exposées à l’aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides à partir de l’âge de 4 mois (stade adulte) pour nous conformer à la publication de référence.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un antipsychotique en injection, une quinzaine d'examens d'imagerie sous anesthésie, puis une craniotomie avec pose d'une chambre d'enregistrement laissée en place pour six mois d'enregistrements et une trentaine d'injections intracérébrales sur animal vigile. Le porteur décrit un risque d'infection au niveau de la chambre et des lésions cérébrales possibles, mais conserve les animaux vivants pour un usage ultérieur en raison de leur "grande valeur scientifique". Il qualifie le modèle primate d'"irremplaçable", notamment pour certains traceurs d'imagerie.

Objectifs

L’aripiprazole est un antipsychotique de troisième génération indiqué dans le traitement de différentes maladies neuropsychiatriques présentant un déséquilibre dopamine-sérotonine, telles que le syndrome de Gilles-de-la-Tourette, la schizophrénie et les troubles bipolaires. Bien que son utilisation s’accroisse, les mécanismes d’action de l’aripiprazole restent peu compris. Les objectifs du présent projet sont d’identifier où et comment ce traitement agit dans les différentes régions cérébrales pour moduler de multiples fonctions cognitives et motrices.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la balance dopamine-sérotonine dans le contrôle comportemental. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant le mode d’action de l’aripiprazole, désormais traitement de première intention pour de nombreux patients atteints de troubles psychiatriques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’aripiprazole et des effets cognitifs induits par ce traitement ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différentes modalités d’imagerie cérébrale, nous allons avoir l’opportunité de caractériser comment la balance dopamine-sérotonine module l’activité neuronale de repos à l’échelle du cerveau entier. Cette balance étant défectueuse dans de nombreuses pathologies (ex : dépression, anxiété, schizophrénie, Tourette, addictions), nos résultats seront donc d’intérêt pour de nombreuses applications. En complément, l’apport de l’electrophysiologie va nous permettre d’étudier des aspects plus fonctionnels de l’action de l’aripiprazole et de la balance dopamine-sérotonine au niveau des neurones du striatum. Nos résultats devraient ainsi démontrer l’importance de cette structure sous-corticale dans le contrôle de certains biais décisionnels, et définir quels types de troubles émergent lorsque la balance dopamine-sérotonine devient dysfonctionnel dans cette région du cerveau.

Procédures

(i) Traitement pharmacologique systémique par aripiprazole en semi-chronique (plusieurs périodes de 2 semaines, injections en IM). Ces tests s’étendront sur 4 mois, afin de tester comportementalement plusieurs doses de traitement. (ii) Examens d’imagerie cérébrale sous anesthésie générale. L’action de l’aripiprazole sur les systèmes dopaminergiques et sérotoninergiques sera étudiée via 5 traceurs ciblant différents récepteurs (5 traceurs x 3 doses d’aripiprazole = 15 scans par animal). Ces imageries s’étendront sur une période de plus d’un an. (iii) Implantation chirurgicale d’un plot de tête et d'une chambre avec craniotomie sous anesthésie générale (1 fois,

Impact sur les animaux

La partie pharmaceutique du projet impliquant un traitement chronique par aripiprazole ne constitue pas une source potentiel de nuisances importantes. L’aripiprazole est une molécule fréquemment utilisée en clinique humaine avec très peu d’effets secondaires nuisibles, il est rapporté un effet sédatif et orexigène (augmente l’appétit) bien moindre que pour les autres neuroleptiques. Les imageries cérébrales vont nécessiter l’injection d’un produit de contraste pouvant induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques. Pour limiter ces risques, les imageries seront espacées d’au moins deux semaines et des analyses sanguines seront réalisées pour contrôler les enzymes hépatiques. Ainsi, aucun effet nuisible significatif n’est spécifiquement prévu suite à l’accumulation des imageries sur animal anesthésié. La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. La chambre d’enregistrement donnera sur une craniotomie (10 x 10mm) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode au moment des sessions d’expérimentation. La présence de cette chambre d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les phases d’imagerie, de pharmacologie et d’électrophysiologie de l’étude soit délétère pour la santé de l’animal. La partie de l’étude intégrant les examens d’imagerie et le traitement par aripiprazole étant classée en procédure légère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives sur écran tactile. Les animaux ayant une chambre implantée seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches invasives telles que l’électrophysiologie ou des perturbations intracérébrales. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude pré-clinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec de l’électrophysiologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, certains radiotraceurs TEP utilisés dans cette étude ne sont disponibles et utilisables que chez le primate non-humain, faisant de ce modèle un élément irremplaçable pour la conduite de cette étude.

Réduction

Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 6 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques pharmacologiques chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Nos approches seront réversibles et complémentaires, ce qui permettra de répéter les tests et de comparer différentes doses d’agents pharmacologiques sur les mêmes animaux pour ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les données électrophysiologiques recueillies sur quatre animaux permettront également d’atteindre un échantillon de neurones striataux importants le plus représentatif possible en fonction des différents territoires cérébraux étudiés.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant de contrôler différents facteurs tels que le poids, la prise de nourriture, le comportement social et la mobilité. Dépendamment du score des animaux sur notre grille d’évaluation comportementale, un traitement adapté sera fourni et l’étude pourra être suspendue, voir définitivement arrêtée si les points limites sont atteints. L’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité neuronale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. En combinant simultanément différentes modalités d’imagerie grâce à une caméra hybride, nous allons réduire (/2) le nombre de scans pour pouvoir collecter un jeu de données suffisants. Les animaux ne seront implantés qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Des traitements analgésiques seront utilisés en périodes pré-, per- et postopératoires. Notre grille d’évaluation de la douleur permettra d’adapter le traitement et le protocole si nécessaire en fonction de divers points limites. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiqueront comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Phylogénétiquement, ce modèle animal préclinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. -Différents troubles comportementaux ont déjà pu être induits chez le macaque suite a une perturbation d’activité localisée au niveau du striatum antérieur. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. -Toute information physiologique ou physiopathologique obtenue chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les animaux reçus sont généralement des adolescents (3 ans). Ils arrivent souvent déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. Une recommandation sera formulée en ce sens auprès de nos fournisseurs pour favoriser des groupes sociaux compatibles.