Recherche fondamentale
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Réalisation d’une preuve de concept d’un pansement hémostatique en poudre pour la prise en charge de plaies chirurgicales et mesure de la résorption du produit chez le modèle lagomorphe (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
Onze lapins vont être utilisés, dont huit réutilisés d'une étape à l'autre avant d'être tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois prises de sang et une chirurgie pouvant atteindre une heure et demie donnant accès au foie, décrite par le porteur comme une "chirurgie lourde pour le lapin", ainsi qu'un abord musculaire, pour tester un pansement hémostatique en poudre. Le porteur indique une douleur per et post-opératoire prise en charge par analgésie, et prévoit des prélèvements du foie à deux, treize et vingt-six semaines. Il affirme que le pansement doit être testé dans un environnement d'organes et de fluides corporels que le modèle in vitro ne peut reproduire.
Objectifs
Le pansement idéal n’existe pas. Mais il doit présenter certaines caractéristiques : maintenir la plaie en milieu humide et chaud, être modifié selon les stades de cicatrisation, être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, ne pas être toxique et être hypoallergénique, protéger des chocs, être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanée et très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables sont utilisés comme traitement.
Bénéfices attendus
Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de poudre) sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie et sur un tissu non lésé (muscle) mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.
Procédures
-Prise de sang sur animal vigiles : 3 fois , le prélèvement est effectué après application d'un anesthésique local et dure moins d'une minute. -Chirurgie: une seule intervention comprenant un abord du foie dont la durée ne devrait pas excéder 1h30 (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès au foie, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture des plans musculaire et cutané), puis un abord musculaire sur le flanc dont la durée ne devrait pas excéder 30 minutes (incision, dissection, implantation du produit, suture).
Impact sur les animaux
L’accès au foie est une chirurgie lourde pour le lapin. Afin de limiter l’impact et de ne pas risquer un incident de chirurgie, nous avons opté pour un abord sous costal (incision sous les côtes) à la laparotomie médiane (ouverture de l’abdomen). Le risque hemorrhagique suite à la lésion hépatique reste extrèmement limité par la taille de la lésion réalisée et les moyens d'hémostase à dispositon. La douleur attendue en per et post opératoire est prise en charge par une analgésie adaptée. La chirurgie est réalisée stérilement ce qui limite le risque de complications infectieuses. Les plaies sont protégées.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort, soit parce qu’ils auront atteint un point limite soit parce qu’ils auront atteint le temps du prélèvement final : J+2 semaines EU 1/2, J+13 semaines et J+26 semaines EU 2/2. L'étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée et nécessite le prélèvement du foie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption sur un tissu lésé et un autre non lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique sous forme de poudre permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire et cutanés en cours de chirurgie et d’observer son intégration sur le tissu à différents temps post-opératoire. Il nous est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.
Réduction
Nous utiliserons 11 lapins au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes, il y a 2 animaux supplémentaires prévus afin de compléter l’un des groupes si nécessaires. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé la voie d’abord sur des animaux décédés. Dans un principe de réduction, nous ferons simultanément un test de résorption sur tissus sain et un test d'hémostase/resorption sur le foie. Il s’agit d’une preuve de concept, le nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.
Raffinement
L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation. Après une semaine et demie d’acclimatation, une puce d'identification électronique permettant de mesurer sa température corporelle sera implanté sous la peau, puis l’animal sera habitué au passage du lecteur et au pyjama pour faciliter le suivi post-opératoire. Le vétérinaire, sur place, intervient quotidiennement dans le suivi post-opératoire et prend en charge tout symptôme clinique: complication de plaie, hypo activité etc... Il prend également la décision de recourir à une mise à mort si l'état de l'animal le nécessite ou à son exclusion si le traitement nécessaire à sa prise en charge n'est pas compatible avec la poursuite du projet.
Choix des espèces
Le lapin est un animal de taille intermédiaire, dont le foie a une taille suffisante pour supporter les scarifications prévues et l’implantation de la poudre hémostatique (le produit) en quantité thérapeutique pour obtenir l'effet pharmacologique souhaité (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés à 2.5-3 kg pour atteindre 3.5-4 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.
Etude du rôle d’un peptide antimicrobien dans le système nerveux central chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie crânienne pour injecter un adénovirus dans le cerveau, une induction d'encéphalomyélite auto-immune provoquant une paralysie progressive des membres, puis une mise à mort par perfusion intracardiaque, pour étudier le rôle d'un peptide antimicrobien dans la sclérose en plaques. Le porteur mentionne des "tests comportementaux" sans préciser lesquels, et indique que la paralysie culmine quinze jours après l'induction avant de devenir chronique. Il affirme que les tests de comportement et l'étude de la neuroinflammation nécessitent des modèles in vivo.
Objectifs
Les peptides antimicrobiens sont des acteurs majeurs de l’immunité dans tous les organismes vivants. Largement produits au niveau des surfaces épithéliales, la première fonction décrite de ces peptides est de protéger contre l'exposition continue aux micro-organismes environnementaux de part leur fonction microbicide. De plus, ces peptides sont des molécules immuno-régulatrices dont l’implication dans de nombreuses maladies auto-immunes a été démontrée (diabète de type 1, arthrite rhumatoïde, lupus...). Enfin les peptides antimicrobiens modulent aussi directement la fonction de cellules non immunitaires telles que les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale ou cutanée. Un peptide antimicrobien est exprimé dans le système nerveux central à la fois en condition basale et inflammatoire. Ce projet a pour but de comprendre le rôle de ce peptide antimicrobien à la fois dans le fonctionnement normal du système nerveux et dans le dévelopment de la slérose en plaque, une maladie autoimmune affectant le système nerveux central. Pour cela, nous inhiberons l’expression de ce peptide dans des souris sauvages au moyen de l’injection d’adénovirus. Nous étudierons le comportement de ces animaux à l’aide de différents tests comportementaux et le dévelopment de la sclérose en plaque dans un modèle induit de la maladie (encéphalomyélie autoimmune expérimentale).
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de comprendre le rôle d'un peptide antimicrobien exprimé dans le système nerveux central aussi bien en condition basale (comportement) qu’en condition inflammatoire (encéphalomyélie autoimmune expérimentale). Ce projet pourrait ainsi mettre à jour une nouvelle cible thérapeutique pour des troubles du comportement, de la mémoire ou de la concentration et pour la sclérose en plaque.
Procédures
-Procédure chirurgicale de 30min pour l'injection intracebrale des AAV. -Injection intrapéritonéale , tests comportementaux, mise à mort par perfusion intracardique. -induction d'encéphalomyélie autoimmune expérimentale
Impact sur les animaux
-Procédure chirurgicale de 30min sous anésthésie générale. -Injection intrapéritonéale d'anesthésiques induit (douleur de quelques secondes), tests comportementaux peuvent induire un stress, mise à mort par perfusion intracardique sous anésthésie générale. -induction d'encéphalomyélie autoimmune expérimentale est caractérisée par une paralysie progressive des membres inférieurs qui culmine 15 jours après induction de la maladie et diminue partiellement pour ensuite devenir chronique.
Devenir
-Mise à mort à la fin de la procédure pour collecte des tissus post-mortem.
Remplacement
Pour réaliser les tests de comportement et évaluer le développement de la neuroinflammation, nous devons utiliser des modèles in vivo. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques.
Réduction
L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Pour la robustesse de l’analyse statistique des expériences, chaque groupe comparé deux à deux doit comporter un minimum de 20 animaux par expérience pour effectuer un test statistique.
Raffinement
-nombre d’individus par cage : entre 3 et 5 pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : gestion de l’analgésie; Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Concernant spécifiquement les souris atteintes d'encéphalomyélie autoimmune expérimentale: nourriture humide (gel nutritif) en fond de cage. La perfusion intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Les souris C57BL/6 seront utilisées à l’âge de 8 semaines quand le développement du système nerveux central est terminé.
Radiothérapie par rayons X des tumeurs cérébrales de haut grade 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 300
600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur implante des cellules de tumeur cérébrale sous anesthésie, puis on les soumet à une radiothérapie par microfaisceaux de rayons X et à des examens d'IRM répétés, pour mettre au point un protocole d'irradiation transférable en clinique. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques en phase terminale, une perte d'appétit et de poids, et une dermatite radio-induite, les animaux étant tués quand les points limites de poids et de comportement sont atteints. Il affirme que "la seule alternative aux études animales est l'étude in vitro", jugée insuffisante pour rendre compte du tissu tumoral vivant.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 14 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. Notre projet s’inscrit dans ce contexte en utilisant une source de rayons X très particulière et encore expérimentale, de basse énergie mais de haut flux, permettant (i) de sélectionner au mieux les énergies intéressantes (ii) de faire un microfractionnement spatial de la dose. Ces deux spécificités ne sont pas techniquement possibles sur les sources classiques hospitalières à l’heure actuelle. Le potentiel de cette technique est étudié depuis une vingtaine d’années déjà, selon différentes approches expérimentale comme l'irradiation de cellules en culture ou des calculs dosimétriques. Ces approches bien qu’indispensables restent très limitées car elles ne prennent pas en compte la complexité du tissu tumoral, se développant de façon autonome, possédant sa propre vascularisation. L’objectif de notre projet vise à tester les modalités d’imagerie (diagnostique) et les modalités d’irradiation (géométrie, balistique, dose) sur des tumeurs proches des tumeurs humaines grâce à l’utilisation de modèles précliniques de rongeurs porteurs de tumeurs (souris et rats). Ce projet portant sur la physiologie tumorale, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'acquérir un ensemble de données précliniques de haute qualité sur des animaux porteurs de tumeurs cérébrales pour des protocoles de radiothérapie par rayonnements X de haute énergie. Les études réalisées pendant les 5 ans du projet permettront d’élargir nos connaissances sur les réponses biologiques du tissu tumoral et du tissu sain exposés aux microfaisceaux, d’évaluer le rôle du microenvironnement tumoral par rapport à l’efficacité du traitement, d’analyser les effets des rayonnements sur la vascularisation tumorale et saine, sur le comportement des animaux. L'objectif est également de pouvoir proposer un schéma d'irradiation optimal (nombre d'incidences, dose, géométrie) avec une préservation efficace des tissus sains pour un transfert réaliste vers un essai clinique. En effet, la radiothérapie par microfaisceaux est une méthode innovante et prometteuse, permettant de détruire efficacement le tissu tumoral tout en préservant le tissu sain environnant. Elle répresente donc une bonne alternative de la radiothérapie conventionnelle et ses effets secondaires. Ce projet est un facteur clé pour promouvoir notre méthode en clinique humaine et pour pouvoir proposer aux patients de tumeur cérébrale un meilleur rapport entre l'efficacité thérapeutique et effets secondaires, une meilleure qualité de vie et une survie prolongée.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : implantation de cellules tumorales sous anesthésie générale et locale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; radiothérapie par microfaisceaux ou par irradiation conventionnelle sous anesthésie générale, sur 500 animaux (250 rats, 250 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; imagerie par resonnance magnetique sous anesthésie générale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), 3 à 4 fois par animal, pendant environ 1 heure
Impact sur les animaux
Le changement d'environnement et le transport des animaux de l'animalerie jusqu'au lieu d'irradiation représente du stress et de l'angoisse. La procédure de radiothérapie n'induit pas de douleur mais du stress et de l'angoisse. L'inoculation tumorale répresente une douleur locale et du stress. Il peut y avoir l’apparition de troubles neurologiques dus à l'effet de masse induit par la tumeur en phase terminale, c'est-à-dire à partir de 2 semaines après l'implantation (troubles du mouvement, perte d'appétit). Dans des rares cas la radiothérapie elle-même peut induire une perte d'appétit. Une alopécie et, plus rarement, une dermatite radio-induite transitoire peuvent apparaitre dans le champ d'irradiation environ 2 semaines après l'exposition. La procédure d’imagerie implique du stress pour les animaux et l’injection de l’agent de contraste induit une douleur locale.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort pour obtenir un prélèvement cérébral. D’après les connaissances actuelles (littérature) et notre expertise, un délai de 2 semaines entre la radiothérapie et le prélèvement cérébral pour analyse histologique permet une bonne évaluation des réponses tissulaires différentielles entre l’irradiation par microfaisceaux ou champ plein auxquelles nous nous attendons. Cette analyse histologique est complémentée par la courbe de suivi long terme qui est indispensable pour évaluer l’efficacité de notre traitement et pour pouvoir proposer un protocole d’irradiation optimisé et transférable à un futur essai clinique.
Remplacement
La thérapie anticancéreuse a pour but d’éradiquer la tumeur ou de ralentir sa croissance tout en préservant au maximum les tissus sains avoisinants. La seule alternative aux études animales est l’étude in vitro (cellules). Cependant, il est impossible d'étudier la réponse tumorale et les effets secondaires sur la fonction cérébrale, l'irradiation de la peau et des os du crâne avec des expériences in vitro. En effet, l’appréciation de l’efficacité d’une technique de thérapie anticancéreuse nécessite le passage par un organisme vivant, reflétant la complexité des interactions entre le tissu sain et le tissu tumoral, la présence d’une vascularisation tumorale et d’un système immunitaire, le microenvironnement tumoral et l’index thérapeutique. Les modèles de tumeurs les plus reproductibles et à croissance rapide ont été développés chez les rongeurs. L’un des outils permettant de mesurer l’efficacité thérapeutique est l’établissement de courbes de suivi long terme permettant de calculer des moyennes et médiane de survie. Parallèlement, certains animaux sont mis à mort à temps fixes pour la réalisation d’études visant à obtenir une ‘image’ de la tumeur ou de l’organe à un moment donné afin d’appréhender les interactions rayonnement-matière spécifiques de la technique. Par ailleurs, des études ex vivo ont déjà été menées dans le passé mais elles ne correspondent pas suffisamment aux buts recherchés lors d'irradiations d'un organisme vivant comme mentionné ci-dessus. Ces études incluent des simulations informatiques pour simuler les interactions entre photons et matière et des irradiations de cellules en culture.
Réduction
Pour le calcul du nombre d'animaux, il faut prendre en considération la variabilité intra- et inter-tumorale pour une population de rongeurs implantés suivant un même protocole. Tous les groupes seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés et reconnus pour chaque étude. Nos précédentes expériences montrent qu’un nombre d’animaux de 7-8 animaux suffit à obtenir des résultats robustes. Nous prévoyons donc des groupes d’animaux n=10 du aux problèmes éventuels rencontrés durant les différentes étapes de l’expérience. Ce calcul mène à utiliser 60 animaux par expérience, 2 expériences par an, sur 5 ans, 600 animaux au total.
Raffinement
Les animaux arrivent à l’animalerie une semaine avant l’implantation tumorale pour acclimatation et seront hébergés en groupes. Ils sont hébergés dans des grandes cages. Nous utiliserons la procédure d’enrichissement définie par le SBEA et l’animalerie. Nous allons réduire le stress du transport par un transport d'animaux groupés en cage filtrée et nous allons mettre à disposition de l'hydrogel. Afin de réduire le stress et la douleur des procédures chirurgicales, de l’imagerie et de la radiothérapie, ces procédures sont réalisées sous anesthésie soit (i) par inhalation (ii) soit par induction gazeuse suivie d’une injection intrapéritonéale d’un mélange d'anesthésiques/antalgiques et d’une injection sous-cutanée d'un anesthésique local au-dessus du site d’implantation des cellules tumorales. Une injection postopératoire d'antalgique sera administrée lors de l’implantation tumorale. Les animaux sont observés quotidiennement par le responsable du projet après chaque procédure et seront hébergés en cage isolée dès que les premiers signes cliniques apparaissent (perte d'appétit, perte de poids, prostration, convulsions). Les animaux disposent alors de nourriture humide à l’assiette et/ou d’un aliment riche en nutriment (« boost »). L'administration d'antalgiques sera considérée pour soulager la douleur (décision prise par le responsable du projet). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés (examen clinique (EC) 2 fois par jour après chaque procédure et en cas de symptômes cliniques, EC quotidien pendant les 3 premières semaines post irradiation en cas de bonne santé générale, ensuite EC un jour sur 2 ou 3 en cas de bonne santé générale jusqu'à la mis à mort). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux sont mis à mort quand les points limites, definis dans la grille de symptômes et basés à la fois sur le comportement et le poids, sont atteints.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur de plus petits nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez la souris et le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante des irradiations comparables à nos expériences. L'utilisation de rongeurs d'un même patrimoine génétique permet une grande réproductibilité de résultats. Les souris sont favorisées car elles sont adaptées à notre installation et peuvent être manipulées et hébergées facilement. Les rats sont importants dans notre cas, car du fait de leur taille plus importante, les irradiations et la dosimétrie sont plus faciles à mettre en oeuvre de façon fiable et reproductible. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons sont bien adaptées pour étudier les effets de la radiothérapie sur le microenvironnement tumoral. Nous validerons nos protocoles d'irradiations (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) chez 2 espèces d'animaux et plusieurs modèles tumoraux différents, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Les animaux sont utilisés entre 4 à 12 semaines après la naissance (4 à 8 semaines pour les souris, 8 à 12 semaines pour les rats), ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés. Les modèles tumoraux ont été développés dans les animaux à cet âge quand le cerveau est encore en cours de développement, ce qui nous mène à choisir le même stade de développement pour rester reproductible dans nos résultats. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficile à gérer en animalerie. Enfin, les courbes de suivi long terme durent environ 6 mois (pour certains animaux seulement), justifiant aussi l’utilisation de cette tranche d’âge.
Caractérisation du rôle de la famille des prokinéticines dans l’inflammation du placenta due à une infection bactérienne chez la souris gestante.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
1 485 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Cent soixante-cinq femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale pour poser une mini-pompe sur l'utérus, des injections intrapéritonéales et une ponction intracardiaque terminale, et leurs souriceaux sont comptés dans le total, pour étudier le rôle de protéines placentaires dans l'infection déclenchant la prématurité. Le porteur indique que les injections et la chirurgie peuvent provoquer un léchage, une automutilation de la zone douloureuse et une position recourbée, ainsi qu'une perte de poids pendant l'allaitement. Il affirme que les mécanismes de la pathologie ne peuvent être étudiés que dans un "organisme entier", en gestation.
Objectifs
La chorioamniotite (CA) est une infection des membranes placentaires pendant la grossesse, souvent consécutive à une infection bactérienne de la mère, notamment par le streptocoque du groupe B (SGB) et Escherichia coli. La CA est une cause majeure de prématurité. Elle concerne approximativement 5-11% des naissances dans le monde, reste sans traitement efficace et coute très cher au système de santé publique. L'inflammation importante du placenta causé par la CA libère des facteurs de l’inflammation dans la circulation maternelle et fœtale, responsables de dérégulations dans le développement et fonctionnement de plusieurs organes, en particulier le cerveau chez le fœtus et/ou chez l’enfant après la naissance. Dans le projet proposé, nous étudierons le rôle potentiel des prokinéticines (PROKS), dans la CA. Les membres de cette famille jouent un rôle important dans le développement placentaire et dans le contrôle des pathologies de la grossesse, y compris celles associées aux processus inflammatoires. Le mécanisme d'action des PROKS fait intervenir des récepteurs qui contrôlent plusieurs fonctions biologiques en particulier celles de la reproduction. Par ailleurs, hors contexte de grossesse, les PROKS régulent les processus inflammatoires et induisent des réponses immunitaires innées. L’ensemble de ces observations suggère que les PROKS pourraient jouer un rôle régulateur dans les mécanismes qui conduisent au déclenchement de l’accouchement. Jusqu’à présent, le rôle de la famille des PROKS dans un contexte infectieux de la grossesse a été peu étudié, alors que l'on sait que ce contexte provoque des effets indésirables importants sur l'issue de la grossesse et au-delà sur la fonction cérébrale des enfants issus de ces grossesses. Ce projet a pour objectif de caractériser le rôle des PROKS dans la prématurité induite et de vérifier leur valeur informationnelle pour le diagnostic et/ou le pronostic de la prématurité.
Bénéfices attendus
Les troubles fonctionnels dus à une atteinte inflammatoire du placenta et ceux qui en découlent au niveau du cerveau du fœtus restent encore mal connus. Il n’existe à ce jour pas de marqueur biologique de la prématurité ni de traitement spécifique protecteur pour le neuro-développement fœtal dans ces situations d’infection / inflammation anténatale. Nous proposons ce projet pour tenter de démontrer que des PROKs pourraient constituer un marqueur biologique de la prématurité et pour caractériser leur rôle dans l’inflammation liée à une CA. A terme le projet pourrait permettre d’identifier une nouvelle méthode pour diagnostiquer et/ou traiter la chorioamniotite au cours de la grossesse infectieuse.
Procédures
Une seule chirurgie avec incision au niveau de l’abdomen est prévue par souris. Cette chirurgie est effectuée au niveau de l’abdomen pour poser la mini-pompe au niveau de l’utérus. La chirurgie durera dix minutes et s’effectuera sur animal anesthésié/analgésié. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur chaque animal, au minimum une fois et au maximum 3 fois pendant toute l’expérimentation. Celle-ci durera 5 min et s’effectuera sur animal anesthésié. Une ponction intracardiaque entrainant la mort de l’animal sera réalisée dans toutes les procédures, pour permettre le prélèvement de tissus et organes. Cette intervention sera effectuée sur l’ensemble des souris adultes. Celle-ci durera 5 min et s’effectuera sur animal anesthésié/analgésié.
Impact sur les animaux
Une injection intrapéritonéale est susceptible de provoquer un stress, un léchage de la région d’injection et/ou l’adoption d’une position recourbée de l'animal. Les souris donnant naissance et allaitant jusqu’au sevrage pourront également perdre du poids. Pour les animaux recevant deux injections intrapéritonéales, une automutilation au niveau de la région douloureuse peut également être observée. La chirurgie suivie d’une injection peut provoquer léchage et automutilation au niveau de la région opérée, ainsi qu'une mobilité réduite et une position recourbée de l'animal. Les souris donnant naissance et allaitant jusqu’au sevrage pourront également perdre du poids. Par ailleurs, une surveillance plus rapprochée sera mise en place dans les groupes injectés avec du LPS. Cela nous permettra de tenir la bonne conduite en cas de mise bas prématurée.
Devenir
Afin de valider les PROK comme marqueurs biologiques de la prématurité et caractériser leur rôle dans l’inflammation liée à une CA, le sang ainsi qu’un ou plusieurs organes seront prélevés sur les animaux pour être analysés, ce qui implique que les animaux devront être euthanasiés avant de réaliser ces prélèvements.
Remplacement
Ce projet s’intéresse à la compréhension du rôle de certaines PROK dans le développement de la CA. Les PROK sont des molécules majoritairement libérées par le placenta dans la circulation sanguine, en particulier en cas de stress placentaire. Leur libération et leur circulation ne peuvent pas être modélisées dans des systèmes in vitro qui ne représenteraient que partiellement un organisme. Les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie ne peuvent apparaitre et être étudiés de façon intégrée que dans un contexte d’organisme entier, dans des modèles in vivo de gestation.
Réduction
Il est prévu d’utiliser 165 souris femelles qui donneront naissance à environ 8 souriceaux chacune, soit 1485 souris au total sur une durée de 5 ans. Le nombre de souris femelles a été calculé et réduit au minimum de façon à ce que les résultats puissent être exploités et interprétés de façon fiable d'un point de vue statistique. Avant de passer sur le modèle animal, nous avons réalisé des études in vitro qui confortent nos hypothèses et nous incitent à considérer un modèle in vivo pour ensuite passer à la clinique.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement, 7 jours sur 7, pour s’assurer de leur bon état général. Différents paramètres permettant le suivi de l'aspect général comme le comportement, la locomotion, ainsi que la perte de poids seront estimés de façon régulière. Les interventions seront effectuées sous anesthésie. Des critères d'arrêt sont prévus dans le projet en cas de survenue d’effets inattendus.
Choix des espèces
Le modèle choisi pour cette étude est le modèle animal souris gestantes OF1, âgées de 8 à 14 semaines, qui permettra de suivre toutes les étapes de la gestation. Le modèle souris est choisi pour sa gestation courte et proche de la gestation humaine. Comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale, c’est-à-dire que les échanges entre la mère et le fœtus se font à travers la barrière placentaire à travers la barrière trophoblastique et endothéliale fœtale, sans que le sang de la Maman et de son fœtus ne soient mélangés. Plusieurs études ont démontré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse sont exprimés dans des types cellulaires similaires et régulés de la même façon. Le modèle souris OF1 est choisi en particulier car nous l’avons utilisé dans le passé comme modèle pour l’étude du rôle la protéine PROK1 dans la placentation normale. Nous souhaitons nous appuyer sur ces résultats pour poursuivre avec la présente étude.
Etude chez la souris des effets neurophysiologiques d’une maladie causée par une mutation d’un canal calcique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter des électrodes, puis des enregistrements de vingt minutes par jour pendant un mois dans un champ ouvert, pour étudier une atrophie du cervelet due à une mutation d'un canal calcique. Le porteur indique que les souris porteuses de la mutation peuvent développer une ataxie et une mort des cellules de Purkinje, et que la chirurgie peut provoquer une douleur modérée pendant la récupération. Il affirme que le modèle murin est "incontournable" et que les réseaux de neurones ne peuvent être obtenus en culture ni par modélisation.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation génétique conduisant à une réduction de la taille du cervelet (une atrophie) dès l'enfance (elle a été nommée atrophie céréelleuse infantile, ChCA). Cette maladie est due à un dysfonctionnement dans une protéine de transport du calcium qui se trouve à la surface de certaines cellules, notamment les cellules de Purkinje du cervelet. La mutation conduit à un plus grand influx de calcium dans les cellules de Purkinje dès l'enfance, ce qui pourrait induire la mort des cellules et donc une atrophie du cervelet. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation pourra être induite sélectivement dans les cellules de Purkinje et ainsi étudier les conséquences de cette mutation dans le cervelet. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.
Bénéfices attendus
Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle de la protéine mutée dans le développement du cervelet et le fonctionnement des cellules de Purkinje. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.
Procédures
Pour ce projet, 90 animaux subiront une chirurgie d'une durée de une heure pour l'implantation crânienne d'électrodes pour des enregistrements cellulaires. Sur ces animaux, les enregistrements (branchement d'un cable souple sur les électrodes implantées) dureront 20 minutes par jour pendant 1 mois pendant qu'ils se déplacent dans un champ ouvert.
Impact sur les animaux
Pour les animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des modifications précoces du fonctionnement des cellules de Purkinje du cervelet, puis à leur mort, ce qui peut conduire à une ataxie cérébelleuse et une réduction de la taille du cervelet (atrophie). Les chirurgies sous anesthésie destinées à implanter les électrodes peuvent induire une douleur modérée pendant la récupération.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant à la procédure seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des expériences sur tranches aigues ou des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse pathophysiologique de la ChCA (ataxie cérébelleuse infantile). Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences ne pouvant être réalisées via une modélisation sur ordianteur ou des lignées de cellules humaines. Ainsi, les conséquences fonctionnelles de la mutation seront d'abord modélisées sur lignées cellulaires humaines et des approches in silico. Cependant, ces stratégies permettront de faire des prédictions sur l'impact de la mutation à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau. En effet, les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. De même, les conséquences motrices des dysfonctionnements du cervelet nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 90) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques de façon fiable et reproductible. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille d'observation pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésiques, une adaptation des conditions de vie et lorsqu'une douleur ou un inconfort non reversibles apparaissent, l'euthanasie.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par une recombinase est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.
Validation in vivo de composés destinés à promouvoir la remyélinisation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Pour tester dix composés censés favoriser la remyélinisation dans la sclérose en plaques, 720 d'entre elles subissent une injection dans la moelle épinière sous anesthésie créant une lésion de la myéline, et 200 une encéphalomyélite induite par immunisation. Le porteur indique que la chirurgie médullaire entraîne un risque d'hypothermie, des saignements et une douleur post-opératoire, et que le modèle EAE provoque une paralysie progressive gênant les déplacements et l'accès à l'eau. Il affirme que "seul le modèle animal est pertinent" pour reproduire les lésions de la pathologie humaine.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (cerveaux, moelle épinière et nerfs optiques) du jeune adulte au cours de laquelle la gaine de myéline protégeant les axones est détruite (démyélinisation). Cette perte de myéline conduit, à long terme, à une dégénérescence des axones conduisant ainsi à des troubles sensitifs et moteurs (fourmillements, troubles de l’équilibre, troubles visuels, paralysies…). La SEP a une plus forte prévalence chez la femme (3/4 de femme) et touche plus de 100 000 personnes en France. Deux mille cinq cents nouveaux cas de SEP sont diagnostiqués chaque année. Cette maladie représente la première cause de handicap sévère non traumatique du jeune adulte. La SEP est caractérisée par des épisodes inflammatoires et de démyélinisation pouvant affecter toutes les structures du système nerveux central. A ce jour, les traitements de la SEP ciblent uniquement la composante inflammatoire de la maladie mais ces traitements ont peu d’effets sur la remyélinisation. Le développement de stratégies pharmacologiques visant à promouvoir la remyélinisation est donc un enjeu thérapeutique majeur pour le traitement de la SEP. Récemment plusieurs composés pharmacologiques déjà utilisés pour le traitement d’autres pathologies ont montrés avoir un effet positif sur cette remyélinisation. Il en est de même pour certains composés issus de la recherche fondamentale. Il apparait donc important d’étudier le rôle de ces molécules au potentiel remyélinisant prometteur dans des modèles de sclérose en plaques. L’étude sera menée en utilisant deux modèles de la SEP : un premier permettant d’analyser les différentes étapes de la remyélinisation d’une lésion focale (modèle de lésions obtenues par injection de LPC dans la moelle épinière de la souris). Un deuxième mimant les composantes inflammatoires et démyélinisantes des lésions de la SEP (encéphalomyélite allergique expérimentale : EAE). Pour cette étude, nous étudierons l’effet de 10 composés pharmacologiques dans deux modèles précliniques de la SEP. Pour chaque composé étudié, il sera utilisé 92 animaux soit un total de 920 animaux. Ce projet est développé dans le respect de la règle des 3 R
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d’identifier une ou plusieurs molécules candidates permettant d’augmenter significativement la remyélinisation. Ils permettront d’envisager le développement de nouveaux médicaments à visé thérapeutique ; venant ainsi compléter les traitements immuno-modulateurs de la SEP.
Procédures
Nous utiliserons deux modèles expérimentaux de la sclérose en plaques chez la souris, afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de diverses molécules candidates. Les molécules, seront administrées selon leurs natures et leurs caractéristiques pharmacologiques (administration orale ou par injection). Des études réalisées en amont permettront de déterminer la fréquence d’administration. Le premier modèle consiste pour chaque animal en une injection dans la moelle épinière, effectuée sous anesthésie générale, d’un agent induisant une lésion focale de la myéline. Cette intervention dure environ 30 minutes par animal. Les animaux seront ensuite traités de 4 à 20 jours avec les molécules d’intérêt. L’analyse de la lésion permettra d’évaluer l’impact des molécules sur les différentes étapes du processus de réparation des lésions. Pour ce modèle, nous utiliserons 720 animaux pour tester 10 composés. Le deuxième modèle est l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), un modèle complémentaire où la perte de myéline est induite par immunisation. La durée de cette procédure est d’environ 20 minutes par animal. Les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Pour cette partie de l’étude, nous utiliserons 200 animaux pour 10 molécules et les animaux seront traités durant 20 jours. Ce modèle permettra d’étudier l’impact des composés sur l’évolution et les caractéristiques de la maladie. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions, quand cela s’avèrera nécessaire. Pour la poursuite de l’étude, et pour tous les animaux, il est nécessaire d’obtenir des échantillons biologiques dans un état le plus proche possible de l’état physiologique. A la fin de ces procédures un liquide fixateur est donc injecté à la totalité des animaux. On peut alors procéder à la récupération des tissus d’intérêt en vue de leurs analyses.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors des procédures sont liées à la chirurgie et à l’immunisation par l’injection sous-cutanée. Lors de La chirurgie nécessaire à la réalisation de lésions de la moelle épinière : risque hypothermique, lésion musculaire, saignement et douleur post-opératoire légère durant 48 heures. Pour l’EAE : plaie au site d’injection, paralysie progressive et temporaire des animaux suite à l’installation du modèle entrainant des difficultés à se déplacer et à s’abreuver. Les injections IP et le traitement par voie orale peuvent entrainer respectivement un hématome au site d’injection et une irritation des voies supérieurs si le traitement est répété.
Devenir
Une analyse post mortem est nécessaire afin d’évaluer le potentiel des molécules testées dans les deux modèles ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Après des essais préalables sur différents modèles cellulaires, seuls les meilleurs candidats seront retenus. Seul le modèle animal est pertinent pour cette étude car nous pouvons ainsi analyser l’effet de ces molécules dans un contexte in vivo reproduisant le mieux les caractéristiques des lésions observées dans la pathologie humaine.
Réduction
Des études pharmacocinétiques (détermination des doses efficaces à administrer par exemple) seront menées en amont afin de raffiner et réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Les modèles qui seront utilisés ont déjà démontré leurs pertinences pour l’analyse des mécanismes de réparation des lésions de la myéline et de la composante inflammatoire observée dans la maladie. Le nombre d’animaux (920 au total) est limité au stricte nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables.
Raffinement
Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par le vétérinaire agréé. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hydrométrie recommandées par les normes européennes. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe avec un nid et une maison dans chaque cage). Les point limites de ces procédures ont été définis et ils seront suivis.
Choix des espèces
Le seul moyen à notre disposition pour décortiquer le processus de réparation de lésions de la myéline est d’utiliser des modèles murins bien établis du processus de démyélinisation/ remyélinisation. Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas les animaux, et plus précisément la souris. Les animaux utilisés sont âgés d’au moins 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du SNC (jeunes adultes). De plus à ce stade du développement, la chirurgie de la moelle est facilitée par la relative faible masse musculaire et de tissus graisseux des animaux, permettant ainsi une meilleure accessibilité à la moelle épinière lors de la chirurgie. Les animaux des différents groupes seront séparés à raison de 6 animaux par cage ; chaque groupe correspondant à une condition expérimentale. Les différents lots expérimentaux seront stabulés, par traitement, dans des cages différentes (groupe de 5 à 6 animaux âgés de 8 à 12 semaines).
Identification de nouveaux vecteurs de thérapie génique ciblant plus efficacement les muscles squelettiques
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection unique de vecteurs viraux AAV par voie intraveineuse ou intramusculaire, des prises de sang et une mesure de bioluminescence sous anesthésie, pour identifier des vecteurs de thérapie génique ciblant mieux le muscle dans les dystrophies musculaires. Le porteur indique que la stratégie d'évolution dirigée permet de tester de nombreux variants en même temps, et que les organes sont prélevés après la mort. Il affirme qu'un vecteur doit être évalué dans un "organisme entier" que les cultures cellulaires ne permettent pas d'aborder.
Objectifs
L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches thérapeutiques pour des maladies génétiques rares du muscle, les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Les dystrophies musculaires sont des maladies dégénératives du muscle qui conduisent à une perte progressive des fonctions motrices telle que la marche. Une option thérapeutique possible est la thérapie génique, stratégie qui consiste à introduire du matériel génétique dans des cellules pour soigner une maladie. Le transport du gène thérapeutique dans les tissus cibles peut se faire grâce à l’utilisation de virus modifiés, appelés vecteurs, en raison de leur propriété naturelle de transférer leur propre matériel génétique dans les cellules humaines. Pour produire des vecteurs viraux, on utilise des virus modifiés génétiquement, dits sécurisés. Dans le cas des maladies musculaires, le fait qu’il soit nécessaire de pouvoir cibler l’ensemble de la masse musculaire impose d’injecter des niveaux très élevés de vecteurs, ce qui peut conduire à des effets adverses allant jusqu’à des effets graves, voire le décès. Il est donc souhaitable d’améliorer les vecteurs. La question scientifique posée dans ce projet est de donc de rechercher des vecteurs ayant des propriétés améliorées pour le transfert de gène en utilisant l’espèce souris comme support de l’identification de ces vecteurs.
Bénéfices attendus
Malgré des succès encourageants, le domaine de la thérapie génique pour les maladies neuromusculaires est toujours confronté à un certain nombre de défis en termes de sécurité et d'efficacité tels que la nécessité de doses élevées pour apporter le gène médicament dans toutes les cellules musculaires ou la présence de réaction immunitaire contre le vecteur ou le transgène. Dans ce projet, nous proposons de développer de nouveaux vecteurs afin d'augmenter l'efficacité du transfert de gène dans les tissus d’intérêt tels que le muscle pour de futures applications chez l'homme. Les bénéfices attendus du projet sont de permettre de proposer une stratégie thérapeutique plus efficace et donc une meilleure correction de la pathologie chez les patients. De plus, une meilleure efficacité devrait permettre une réduction des doses à administrer, permettant de minimiser les risques d’effet adverse chez le patient. Les données obtenues devraient également permettre de mieux comprendre les éléments biologiques gouvernant l’entrée des vecteurs dans les différents organes.
Procédures
Les vecteurs sont injectés une seule fois soit par administration intraveineuse sur animaux vigiles, soit par voie intramusculaire sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de sang se feront en début et en fin de protocole. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. En fin de protocole, les animaux sont examinés sous un capteur qui permet de recueillir de la lumière dont l’intensité va dépendre du niveau de transfert de gène. Cette analyse se fait sur animaux anesthésiés. Il s’agit d’une anesthésie gazeuse. Cette mesure dure 10 minutes et est faite une seule fois, avant l’euthanasie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : - Piqûre IP pour administration d’anesthésique avant injection en intramusculaire (une seule fois au cours du protocole) ; - Piqûres intraveineuse caudale pour injection AAV (une fois au cours du protocole) ; - Intraveineuse sinus pour injection AAV (une fois au cours du protocole) sous anesthésie gazeuse ; - Prélèvements de sang au sinus soit sous anesthésie gazeuse, soit sous anesthésie fixe en début et fin de protocole ; - Injections intrapéritonéales de luciférine pour la mesure de la bioluminescence ; - Possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies (utilisation de gel pour réduire cette nuisance le cas échéant).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Afin d’évaluer ou de sélectionner de nouveaux vecteurs, il est nécessaire de les administrer dans un organisme entier où il va se distribuer et rentrer dans certains organes en fonction de possibilités d’interaction. Des vecteurs identifiés sur des cellules en culture n’auront pas forcément les caractéristiques voulues pour un transfert efficace dans un organisme. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico (avec un programme informatique) ou in vitro (sur des cellules). Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre la structure et l’activité biologique d’une molécule ou des modélisations d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Cependant, ces cultures ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doivent prendre en compte des paramètres tels que les interactions des vecteurs avec le système sanguin, le système immunitaire et l’ensemble des éléments qui guide comment se distribue un virus dans un organisme.
Réduction
La stratégie de l’évolution dirigée (méthode utilisée en biologie et qui imite le processus de séléction naturelle) pour la sélection de nouveaux vecteurs utilisé dans ce projet permet de réaliser l’évaluation de très nombreux variants en même temps, ce qui permet une réduction extrêmement importante du nombre d’animaux nécessaires. Nous utiliserons un seul modèle de maladies musculaires, choisi pour sa représentativité. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes chaque fois que possible. Quand cela est possible, les groupes contrôles seront communs entre les différents vecteurs évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs selon un critère défini par le type d’analyse réalisée.
Raffinement
Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux auront reçu au préalable un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles que l’utilisation de la chaleur pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil, ou l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Dans cette étude, les animaux seront utilisés à partir de leur sevrage au stade jeune adulte. Ces animaux présentent une taille et une maturation des organes adéquates pour l’évaluation moyenne du transfert des vecteurs.
Evaluation de la réponse T CD8 contre le virus de la dengue induite par un vaccin peptidique chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
180 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intramusculaires d'un candidat vaccin peptidique contre la dengue sous anesthésie, ainsi qu'une à deux prises de sang par voie rétro-orbitale, avant d'être tuées pour prélèvement des organes. Le porteur indique qu'aucun signe clinique n'est attendu, le vaccin étant "faiblement immunogène", et que les mâles sont écartés pour éviter le stress lié à un dominant. Il conclut que la réponse immunitaire antivirale ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
La dengue ou « grippe tropicale » est une maladie virale transmise par piqûre de moustique. Chaque année, on rapporte 400 millions de cas de dengue dont 500 000 cas sont associés à des fièvres hémorragiques. A l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin efficace sur le marché. L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité d’un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire protectrice de type cellulaire contre le virus de la dengue. Pour cela, des souris recevront deux injections intramusculaires du candidat vaccin (Une immunisation et un rappel 21 jours après). Trois adjuvants différents seront comparés afin de choisir celui permettant d’induire la meilleure réponse cellulaire. Les animaux seront mis à mort à 7 jours ou 28 jours post-rappel afin de permettre la mesure de la réponse cellulaire. Ce projet nécessite l’utilisation de 180 animaux.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin permettant l’induction d’une protection efficace contre le virus de la dengue. Ce projet permettrat de démontrer l’efficacité d'un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire cellulaire contre le virus de la dengue.
Procédures
2 injection intramusculaires ( 50 uL) à jours 0 et 21 sur animaux anesthésiés à l'isofluorane. 1 à 2 prélèvements sanguins (150 uL) par voie retro-orbitale sur animaux anesthésiés à l'isofluorane.
Impact sur les animaux
Le candidat vaccin est un vaccin de type peptidique, donc faiblement immunogènes. Ainsi, aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à la vaccination. Les adjuvants sélectionnés sont des adjuvants de type liposomes, couramment utilisés pour l’évaluation de l’immunogénicité de candidats vaccin chez la souris. Les composants de ces adjuvants permettent l’induction d’une inflammation locale modérée au niveau du muscle et du ganglion drainant le muscle, nécessaire à l’initiation de la réponse immunitaire. Cependant, ces adjuvants sont très bien tolérés et aucune réaction locale ou systémique n’est observée après une ou deux injections.
Devenir
Mis à mort pour prélèvement des organes (mesure des paramètres immunologiques)
Remplacement
La réponse immunitaire antivirale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différentes localisations (muscle, ganglions drainants, rate …). La procédure ne peut donc être reproduite in vitro.
Réduction
Nous utiliserons 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Un test de Mann-Whitney sera réalisé́ car la comparaison porte sur 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée. En considérant des différences de moyenne d'au moins 20% avec une déviation standard inférieure à 5% et un seuil minimal du risque alpha à 5%, un groupe de 5 animaux permet d’obtenir une puissance de test d'environ 0.8. Les expériences seront répétées une fois pour vérifier la reproductibilité́ et la validité des résultats (Giles, J. The trouble with replication. Nature 442, 344–347 (2006)). La procédure sera réalisée avec des femelles. En effet, les souris mâles sont à écarter dans les expériences longues (> 3 semaines) afin d’éviter le stress éventuel généré par la présence d'un mâle dominant dans la cage. Si aucune réponse CD8 n’est observée 7 jours après rappel, le projet s’arrêtera et la réponse à jour 28 ne sera pas évaluée.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sont administrés sous PSM II afin de prévenir tout risque d’infection opportuniste. Précautions particulières : - Immunisation par le candidat vaccin : Les injections intramusculaires sont réalisées sous brève anesthésie à l’isofluorane. Aucun signe clinique, local (douleur à la patte) ou systémique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à l’immunisation. Les animaux feront néanmoins l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. Une attention particulière sera portée au boitillement évocateur d’un douleur à la patte ayant reçue l’injection. Si une souris présente des signes de souffrance tel que le pelage hérissé, la prostration ou l'absence de réponse aux stimuli extérieurs, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort par dislocation cervicale. - Prélèvements de sang : un collyre anesthésique est appliqué à l’œil avant la procédure pour réduire toute douleur. Les prélèvements de sang sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique (Framycétine).
Choix des espèces
Les éléments immunogènes du candidat vaccin sont capable d'être reconnu par le système immunitaire de la souris. Les souris seront âgées de 8-12 semaines au démarrage de l’expérience, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Etude des altérations du développement du cortex cérébral dans un modèle de prématurité chez la souris (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
192 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero sous anesthésie, puis la moitié des mères et de leurs portées passent huit jours dans un air appauvri en oxygène, pour modéliser l'hypoxie de la grande prématurité. Le porteur indique une mortalité fœtale pouvant atteindre 10 % et des lésions cérébrales diffuses chez les souriceaux, qui sont ensuite tués pour prélèvement du cerveau. Il affirme que l'approche in vivo est "incontournable" car les modèles in vitro ne reconstituent pas la complexité des connexions nerveuses.
Objectifs
La grande prématurité résulte fréquemment en des périodes de manque d'oxygène (appelées périodes d'hypoxie) du fait notamment de l’immaturité des poumons, et aboutit donc à des perturbations profondes de la capacité du cerveau à utiliser et produire de l'énergie (on parle de capacité métabolique), et à des lésions diffuses du cerveau. Bien que le cerveau du nouveau-né présente une capacité à se réparer supérieure à celle du cerveau adulte, des études récentes suggèrent que cette réparation pourrait être imparfaite ou même inadaptée. Ainsi, la probabilité d’apparition de troubles cognitifs est très fortement augmentée à l'adolescence, chez les enfants grands prématurés par rapport à ceux nés à terme, possiblement du fait de la mise en place de réseaux neuronaux anormaux. Objectif du projet : Cette étude a pour but de tester comment les perturbations survenant autour de la naissance et notamment l’hypoxie périnatale entraîne une perturbation durable de l’activité métabolique cérébrale, et notamment de l’activité des mitochondries, qui sont les organelles responsables de l’essentiel de la production d’énergie cellulaire. Ces perturbations métaboliques entraîneraient à long terme des anomalies du développement des réseaux neuronaux qui peuvent expliquer la survenue plus tard dans la vie de troubles neurologiques variés. Ce projet utilisera un modèle murin de naissance très prématurée (hypoxie néonatale chronique), combiné à une méthode chirurgicale permettant d’exprimer des protéines fluorescentes dans des populations ciblées de neurones du cortex cérébral chez la souris. Il permettra de répondre en même temps à deux questions : - Quelles sont les conséquences de l’hypoxie périnatale sur le développement à long terme du cerveau - Est-ce que ces défauts sont associés à un défaut métabolique persistant dans ces neurones.
Bénéfices attendus
Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) : -Sur un plan translationnel, ce projet permettra de mieux prédire les conséquences à long terme de lésions cérébrales survenant tôt dans la vie (pendant la période périnatale). Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale n’est pas totalement efficace, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. -Sur un plan fondamental, ce projet pourra fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie. La mise à mort sera réalisée par une éthode dérogatoire seule à même de préserver les tissus cérébraux.
Impact sur les animaux
Pour les femelles : La procédure permettant l'expression de marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries, implique une approche chirurgicale invasive avec réveil. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté de mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. Pour les souriceaux : Une mortalité foetale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons sur lesquels la procédure est effectuée est constatée, bien qu’il soit difficile de déterminer si la résorption fétale résulte de l’élimination spontanée de fétus surnuméraires pendant la gestation, ou d’une mortalité liée à la procédure chirurgicale. La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau. Une réduction périnatale de l'oxygène ambiant (hypoxie) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses. Après la période de réduction de l'oxygène ambiant, les souriceaux rattrapent leur retard de croissance et les lésions cérébrales apparaissent réparées au niveau macroscopique. Des altérations à long terme de la connectivité cérébrale résultant de l’hypoxie périnatale peuvent en théorie entraîner des déficits cognitifs (défauts d’apprentissage, d’activité spontanée et de comportements sociaux) qui peuvent être détectés lors de tests de comportement mais sont généralement impossibles à détecter dans l’observation de comportements spontanés de souris élevées en cage.
Devenir
Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.
Remplacement
Les hypothèses de travail ont été au préalable validées dans des modèles in vitro et justifient à présent de confirmer par une approche in vivo, incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les séquelles neurologiques observées suite à une oxygénation insufisante, dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer totalement la complexité des connections nerveuses entre régions du cerveau, qui est l’objet de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Certains animaux devront être exclus de l’analyse à postériori pour des raisons techniques (mauvaise qualité du marquage des neurones et des mitochondries qu'ils contiennent ou de préparation histologique). Les animaux seront traités deux à deux (deux femelles, soit deux portées, en parallèle : groupe expérimental et groupe témoin) et les portées seront analysés au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus l’étude est prévue sur 4 âges correspondant à 4 stades de développement distincts, mais nous commencerons par les âges J11 et J45 qui correspondent aux effets les plus forts attendus dans notre étude. Dans le cas où les résultats à ces âges invalideraient notre hypothèse (étude négative), nous arrêterions l’étude sans procéder à l’étude des autres âges. L’analyse des projections nerveuses sera réalisée sur des cohortes d’animaux des deux sexes, par un test statistique approprié. Cette analyse permettra de déterminer la part de la condition expérimentale (normoxie/hypoxie), du sexe, de l’environnement, et leur interaction, sur le phénotype observé. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages immunohistochimiques variés, permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées a été mis en place pour optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Une méthode d’imagerie et d’analyse innovante sera utilisée pour tirer encore plus d’information par animal, en permettant d’observer les projections axonales dans l’ensemble des régions du cortex.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, les méthodes ont été établies dans cette espèce ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés aux âges suivants afin d'étudier les effets d'une réduction de l'oxygène ambiant à des étapes clés de la mise en place des réseaux de neurones du cerveau: -J(our après la naissance) 11, correspondant à la fin de la période de réduction de l'oxygène ambiant. -J21, correspondant à l’âge ou les connections nerveuses sont établies, mais où elles sont encore immatures -J45, correspondant à un âge où les connections nerveuses maturent. Cet âge est également pertinent car il correspond à la maturité sexuelle chez les souris (adolescence/jeune adulte), qui est un âge auquel plusieurs maladies neuropsychiatriques sont détectées (par exemple schizophrénie) -J90-J120, correspondant à un stade adulte et qui est également le stade où nous observons des déficits comportementaux.
Nouvelle approche d’immunothérapie dans le contrôle du développement d’un carcinome ovarien chez la souris femelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
285 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un poinçon à l'oreille, six prises de sang dans la veine faciale espacées de quatorze jours et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, pour tester une immunothérapie fondée sur le parasite Neospora caninum contre le carcinome ovarien. Le porteur indique qu'une ascite peut se développer au-delà de 45 jours et provoquer des douleurs, les souris dépassant 20 % de gain de poids étant alors mises à mort. Sur le remplacement, il conclut que les approches in vitro et les organoïdes ne reproduisent pas le "modèle de régulation complexe" recherché.
Objectifs
Le projet, basé sur l’efficacité d’un microorganismee en immunothérapie antitumorale, a déjà montré sa pertinence et son efficacité dans un modèle d’étude de tumeur solide et dans des modèles précliniques murins de cancers de mauvais pronostics. Plusieurs stratégies ont été développées au sein de notre laboratoire afin de contrôler le développement de tumeurs solides, ici appliquées au carcinome ovarien chez la souris. Des premières données ont été obtenues démontrant la capacité du microorganisme à réduire le développement tumoral par différents mécanismes ayant des actions complémentaires. L’objectif du présent projet est d’optimiser cette nouvelle approche d’immunothérapie notamment dans le but de se rapprocher de ce qui est observer en clinique en termes de délai de prise en charge des patients mais également d’améliorer son efficacité. Nous avons d’ores et déjà obtenus au sein de l’équipe des microorganismes capables de sécréter des molécules d’intérêt en immunothérapie qui doivent maintenant démontrer leur supériorité en termes de protection en modèles précliniques murins dont le carcinome ovarien.
Bénéfices attendus
Nous espérons obtenir une inhibition totale du développement tumoral en faisant sécréter par Neospora caninum une ou plusieurs molécules immunothérapeutiques d’intérêt contre le carcinome ovarien. Le but ultime étant de démontrer également son efficacité lors d’une prise en charge tardive ce qui laisserait envisager une nouvelle issue thérapeutique pour les femmes atteintes de cancer ovarien.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à une identification individuelle par poinçon à l'oreille (moins d'une minute / animal), six prises de sang espacées de 14 jours dans la veine faciale (environ 1 minute / animal), de une à cinq injections par voie intrapéritonéale espacées de 14 jours (moins d'une minute / animal).
Impact sur les animaux
La souris, tout comme l’homme, n’est pas un hôte naturel de ce protozoaire (WTNEO) et y est résistant avec une prise en charge rapide par son système immunitaire. Jusqu’à présent, les recombinants testés ont sans exception montré une virulence comparable, c’est-à-dire le plus souvent sans aucun signe clinique. Il peut parfois être observé une légère asthénie pendant 2 à 3 jours. Cependant, si des signes cliniques devaient survenir à la suite de l’infection (5 à 10 jours après), ceux-ci seraient les suivants : asthénie prolongée, prostration, hyporéactivité, piloérection, perte de poids supérieure à 15%. Concernant le développement tumoral, d’après les données bibliographiques, aucun signe de douleur particulier n’est détecté au cours des 45 premiers jours du protocole expérimental. Au-delà de ce temps, une ascite peut se développer reflétant le développement d’une tumeur solide sur les ovaires, ce qui peut entrainer des douleurs ou de la souffrance inutile pour les animaux.
Devenir
A l'issu des procédures les animaux seront mis à mort afin d'étudier la protection conférée en termes de croissance tumorale (nécessité de prélever la tumeur située sur les ovaires et l'omemtum) et également d'étudier la réponse immunitaire associée à cette protection ( prélèvement des rates, ganglions mésentériques, ganglions inguinaux, tumeur).
Remplacement
Une approche in vitro a été développée en amont afin de valider notre hypothèse de travail et l’utilisation de tachyzoïtes sur des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle de la tumeur mais cela ne reproduit pas un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie. Des modèles d’organoïdes sont également en cours de développement dans le laboratoire afin d’étudier certains mécanismes.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et nos données préliminaires. L’étude statistique des résultats entre les lots de souris implantées traitées ou non (les lots contrôles ne sont pas intégrer dans les études statistiques, ce sont des animaux utilisés comme référence interne à titre indicatif mais cependant nécessaire dans les dosages effectués) sera réalisée avec le test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire cellulaire (dosage de cytokines) ainsi que pour l’étude de protection liée du développement tumoral qui est notre critère d’étude principal.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Le modèle de développement tumoral a été choisi est pour être le moins lourd en termes de procédures pour l’animal (injection intrapéritonéale et non chirurgie orthotopique des cellules tumorales). Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Ainsi que d’un enrichissement ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique des points limites. L’apparition d’une ascite liée au développement tumoral est possible à partir de 45 à 60 jours, dès lors un suivi journalier et une pesée 3 fois par semaine seront effectués pour détecter aux plus tôt l’apparition de signes cliniques modérés à sévères (absence de toilettage, apparition de poils hérissés, hyporéactivité, dos voûtés et un gain de poids rapide, supérieur à 20%, associé à une dilatation visible de l’abdomen) qui conduira à la mise à mort sans délai des animaux (si un signe sévère ou plusieurs signes modérés cumulés). Concernant le traitement par Neospora caninum, celui-ci n’est pas reconnu ni dans la littérature ni par notre expérience pour induire de symptômes chez la souris. Jusqu’à présent, les recombinants testés ont sans exception montré une virulence comparable, c’est-à-dire le plus souvent sans aucun signe clinique. Il peut parfois être observé une légère asthénie pendant 2 à 3 jours. Cependant, si des signes cliniques devaient survenir à la suite de l’infection (5 à 10 jours après), ceux-ci seraient les suivants : asthénie prolongée, prostration, hyporéactivité, piloérection, perte de poids supérieure à 15% et conduiront à la mise à mort sans délai des animaux. Tout type de médication pouvant interférer avec l’étude de la réponse immunitaire et/ou la multiplication parasitaire est proscrit.
Choix des espèces
Le modèle d’implantation de tumeur est déjà établi et maîtrisé chez la souris qui est un modèle adapté à la greffe de cellules tumorales syngéniques. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Ce modèle de cancer ovarien reproduit avec fidélité le développement du cancer humain. Adulte. Il n’y a pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants
Evaluation de la séquestration de la chlordécone par l’utilisation de biochars de Sargasses afin de sécuriser la production des denrées animales
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Poules : 24
54 animaux non-humains, poules pondeuses et porcelets, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont nourris avec du sol antillais contaminé au chlordécone, avec ou sans biochar de Sargasse, et confinés dans des compartiments individuels pour contrôler leur exposition, avant d'être tués pour doser le pesticide dans leurs muscles et leur foie. Le porteur indique que le confinement peut perturber les comportements sociaux et provoquer du piquage entre poules, atténué par des objets placés dans les cages. Il affirme que cette expérimentation sur ces deux espèces autoconsommées aux Antilles est "nécessaire" et ne peut être remplacée.
Objectifs
Les Antilles (Guadeloupe et Martinique) sont soumises à une forte pollution des sols, des végétaux, animaux et de la population aux pesticides organochlorés tels que le chlordécone (CLD). La pollution initialement présente dans les sols a atteint la population antillaise par le transfert des pesticides dans la chaine alimentaire (sol --> végétaux --> animaux --> Hommes). L’objectif général du projet est d’évaluer l’efficacité d’une matrice carbonée (le biocharbon) issu de Sargasse (une algue invasive aux Antilles) à séquestrer ces pesticides (plus particulièrement le CLD) et à étudier l’impact sur leur transfert du sol à différents biotes (végétaux et animaux). Les matériaux utilisés sont des biochars, matrices poreuses obtenues par pyrolyse en condition anoxique (sans oxygène) et ont été préalablement employés avec succès dans un précédent projet ANR démontrant une réduction de transfert in vitro et in vivo. Les biotes cibles ont été sélectionnés sur la base de leur contribution à l'exposition de la population antillaise par l'alimentation (spécifiquement par l'autoconsommation). En première étape, nous nous assurerons en conditions de laboratoire de l'efficience de ces matrices avant de procéder à des expérimentations sur animaux. La seconde étape a pour objectif d’évaluer la biodisponibilité relative du chlordécone après exposition orale (alimentation) d’animaux à du sol antillais (Nitisol et Andosol) avec du biochar de Sargasse ou non afin de sélectionner la matrice la plus efficace. Ce projet portera sur deux espèces particulièrement utilisées aux Antilles françaises, autoconsommées et autoproduites : la poule pondeuse et le porc.
Bénéfices attendus
Cette expérimentation permettra de valider ou non une matrice carbonée (biocharbon de Sargasse) à des fins de séquestration de la CLD (pesticide particulièrement présent aux Antilles Française et imprégnant plus de 90% de la population). Ce projet permettra de contribuer à la production de denrées animales saines dans ce contexte de pollution.
Procédures
Les poules pondeuses et les porcelets seront pendant des périodes de temps limitées contenus dans des compartiments afin de contrôler finement leur exposition au sols antillais avec ou sans biochars.
Impact sur les animaux
La période de mise en cage individuelle pourra avoir une incidence sur les comportements sociaux des animaux. Des jouets seront insérés dans les cages afin de limiter cet impact. Pour les porcelets cette claustration sera limitée à quelques minutes à 2h. Pour les poules du fait de piquage entre congénères, cette stratégie ne pourra être réalisée sur un temps aussi court et se déroulera la journée.
Devenir
Du fait des prélèvements envisagés (prélèvement d'organes comme des muscles, le foie) et de leur importance pour l'animal la mise à mort est rendue nécessaire.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, cette expérimentation sur ces espèces est nécessaire et ne peut être remplacée. Cependant, des essais in vitro ont été réalisés au préalable afin de vérifier l’effet du biochar sélectionné sur la séquestration du CLD.
Réduction
Afin de réduire les expérimentations des tests en amont ont permis de sélectionner le biochar de Sargasse et donc de limiter le nombre de matrice à tester (et par conséquent le nombre d’animaux à utiliser). De plus, ces tests préalables ont montré que le biochar de Sargasse est plus efficace dans les Nitisols (sols antillais) que dans les Andosols (sols antillais) ce qui nous a permis de réduire le nombre de porcelet nécessaire pour les modalités avec Nitisols à n=4 (au lieu de n=6).
Raffinement
Des objets adaptés aux espèces seront déposés dans les compartiments des poules (os de seiche, CD, miroirs, paille et perchoirs) et porcelets (cordes, ...). La période de claustration a été envisagée pour être la plus réduite pour les espèces considérées (pour les porcs < 2h, pour les poules du fait du piquage la période de claustration sera la journée). Dans tous les cas, les interactions sociales inter-individus seront préservés par des contacts visuels,olfactifs, auditifs pendant ces périodes de mise en compartiment individuel. Au-delà de ces conditions, un contrôle quotidien sera réalisé en vérifiant quotidiennement la prise alimentaire, l’état de la peau et du plumage, l’absence de plaie ou de parasites (poux) et le suivi du poids de l’animal..
Choix des espèces
Du fait de l'objectif final de ce projet (contrôler la sécurité chimique des denrées animales auto-produites aux Antilles), les espèces choisies correspondent à celles auto-consommées par la population antillaise. Les porcelets qui prendront part aux expérimentations auront de 30 à 55 jours afin qu'ils soient sevrés (plus représentatifs des porcs adultes), castrés (représentatifs des conditions d'élevage classique). Les poules pondeuses seront adultes (au moins 18 semaines à l'arrivée dans nos installations) pour obtenir une ponte régulière (après une période d'hébergement au sol en collectif dans nos installations).
Comportement social d’un modéle souris de schizophrénie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées, trente-cinq tuées à l'issue et quinze réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Trente-cinq reçoivent une pompe implantée diffusant un composé censé induire une schizophrénie, puis passent cinq tests comportementaux d'interaction sociale, d'anxiété et d'anhédonie, avant d'être tuées pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les animaux traités montrent un retrait social et sont isolés, les quinze souris visiteuses étant gardées pour d'autres projets. Il affirme que l'étude de la cognition sociale ne peut se faire ni par ordinateur ni hors des mammifères.
Objectifs
La schizophrénie (SCZ) est un trouble de santé mentale fréquent, chronique, grave et invalidant, caractérisé par des symptômes positifs et négatifs (trouble cognitifs et retrait social). De plus, près des 2/3 des patients schizophrènes sont résistants au traitement par des antipsychotiques. Les substrats cérébraux des dysfonctionnements négatifs et cognitifs restent peu clairs. En effet, on retrouve des dysfonctionnements du cervelet, testé en imagerie par résonnance magéntique fonctionnelle (IRMf) de repos, chez les patients schizophrènes en lien avec les symptômes négatifs . De plus, des stimulations du cervelet par TMS (méthode non-invasive magnétique), effectuée par nos collaborateurs permettent de réduire ces symptômes négatifs. Une meilleure compréhension de la neurobiologie sous tendant les effets de la stimulation du cervelet sur les symptômes négatifs permettra de mieux cibler les stimulations chez l’homme. Pour répondre à cette question, nous devons passer sur un modèle animal afin de trouver les bases neurobiologiques du fonctionnement de la stimulation et tester et comparer différents protocoles de stimulation. Nous avons précédemment démontré des troubles de la cognition sociale et de la communication en utilisant un modèle préclinique de schizophrénie via l’injection aigue d’un antagoniste des récepteurs NMDA MK-801 chez la souris . Notre objectif est ici de confirmer ces déficits cognitifs dans le modèle chronique d'infusion de MK-801 avant de pouvoir envisager de voir les dysfonctionnements du cervelet.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de determiner la pertinence du modéle chronique MK-801 comme permettant de modéliser les altérations sociale de la schizophrénie. Ceci nous permettra alors de poursuivre ces travaux en collaboration avec nos collègues.
Procédures
une procédure chirurgicale d'implantation de puces RFID et de minipompe est réalisée .Nous ouvrons la peau au niveau du dos et insérons une puce RFID et une mini-pompe osmotique , l'incision est ensuite recousue. Nombre 1, durée 5 min. 5 tests de comportements seront réalisés. Le test d’interaction sociale, durée 40 min, le test des 3-chambres (3-CH), durée 2 fois 20 min, un test de comportement social d’une durée de 3 jour, un test d’anxiété d’une durée de 5min puis un test d’anhédonie d’une durée de 3 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales seront un isolement, à l'age adulte des animaux, et une modification probable du comportement social des animaux MK-801 avec un retrait social.
Devenir
les animaux expérimentaux (35) seront euthanasiés et leur cerveau prélevés. Les 15 animaux visiteurs seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets. en fonction de l’avis du responsable de projet et l’avis du vétérinaire référent.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d'étudier l'altération de la cognition sociale et de l’organisation d’interaction sociale dans un groupe chez des animaux modéle de schizophrénie, il ne peut donc pas être remplacé par des modélisations informatiques, ni être conduit chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
Nous utilisons uniquement un groupe restreint d'animaux traités (20 animaux expérimentaux) car nous voulons juste savoir si le modéle est pertinent, sans pour autant utiliser trop d'animaux. De plus, nos experiences précédentes montrent que 20 animaux permettront une analyse avec des tests statistiques et de prendre en compte la variabilité de réponse au traitement des animaux.
Raffinement
Nous allons faire des protocoles complexes et utiliser des materiels innovant permettant de dissequer précisement le comportement social en vue de bien caracteriser les déficit sur un groupe restreint d'animaux. Tout les animaux sont élévés dans des cages avec de l'enrichissemnent (papier/coton) et une cachette. Au niveau de la procédure chirurgicale, il sera utilisé un anesthésiant gazeux et anesthésique local pour les incisons de la peau, un antalgique en cas de douleur détectée selon une grille d’évaluation de la douleur.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités cognitives et sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Notre projet entend modéliser des alterations cognitive équivalent à ceux de patients adultes, donc les animaux seront utilisés à l'age adulte