Recherche fondamentale

1 942 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de 30 à 60 minutes pour une injection de virus dans le cerveau, certaines dès l'âge de trois semaines, puis la pose d'une fenêtre crânienne d'une à deux heures, pour l'imagerie de l'activité du cortex insulaire postérieur, une région impliquée notamment dans le traitement du goût. Le porteur annonce aussi des "tests comportementaux spécifiques" sans les nommer, et les bénéfices se limitent à des "notions fondamentales" que l'équipe espère acquérir. Les souris qui ne sont pas tuées sur place pour des études d'électrophysiologie partent dans un autre établissement utilisateur, où elles sont utilisées puis tuées elles aussi.

Objectifs

L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des études électrophysiologiques ou alors ils seront utlisés dans un autre établissement utilisateur où ils seront euthanasiés également.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence.Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.au laboratoire. L'expérimentateur a une forte expérience de pour toutes les procédures proposées.

1600 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par les établissements partenaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après tonte et dépilation sous anesthésie, un produit est appliqué sur leur dos jusqu'à vingt-quatre fois pour induire un psoriasis, avec des injections sous-cutanées et des pesées répétées. Le porteur attend une perte de poids pouvant atteindre 20 %, un érythème, une desquamation et un épaississement de la peau, et précise que l'élevage préalable conduit aussi à tuer les animaux non sélectionnés. Il affirme ne pas pouvoir se passer de l'expérimentation animale pour cette maladie multifactorielle.

Objectifs

Le psoriasis est une maladie pro-inflammatoire chronique et multifactorielle de la peau (démangeaisons, plaques inflammatoires, …), touchant 2 à 4% de la population française, principalement bénigne et actuellement sans traitement curatif définitif. Dans 20% des cas, des formes sévères sont relevées montrant l’augmentation des risques cardiovasculaires et métaboliques chez ces patients. Le récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloide 1) est un acteur majeur dans la perception et l’intégration des sensations douloureuses (nociception), et est impliqué dans l’inflammation des couches superficielles de la peau (épiderme externe et derme plus profond), dans de nombreuses maladies, mais son rôle précis au niveau vasculaire local et/ou dans les échanges entre les différents types cellulaires, n’est pas clairement démontré à ce jour. Aujourd’hui, parallèlement à des études pharmacologiques en biologie cellulaire (in vitro sur cultures cellulaires) ou par des analyses biochimiques et de biologie moléculaire sur organes isolés (ex vivo, explants de peau ou prélèvements tissulaires de patient), notre objectif est de caractériser in vivo l’implication du récepteur TRPV1 dans un modèle induit de psoriasis chez des souris génétiquement modifiées. Ce projet inclus 2 procédures expérimentales. La procédure 1, de sévérité legère, est une procédure d'élevage permettant de générer 3 nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées « Knock-Out tissu-spécifique », où l’expression du gène TRPV1, soit le complexe protéique constitutif du récepteur TRPV1 exprimé à la membrane cellulaire, est spécifiquement invalidée dans l’un des 3 compartiments cellulaires suivants : vasculaire (microcirculation vasculaire locale), épidermique (relations entre les cellules constitutives de l’épiderme) ou nerveux (relations entre cellules sensitives), et de sélectionner au maximum de 1600 animaux d’intérêt. Ces animaux seront tous inclus dans la procédure 2, de sévérité modérée, permettant d’induire un modèle psoriasique selon 3 modalités : très court terme / précoce – 3 jours, court terme / aigüe – 6 jours et long terme / chronique – 9 semaines. Au terme de l’induction du modèle pathologique, des analyses fonctionnelles et biochimiques permettront de caractériser finement l’implication du récepteur TRPV1 au niveau des 3 compartiments précédents, de proposer une nouvelle approche de développement de traitements du psoriasis et/ou des pathologies dermatologiques similaires.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif définitif, seuls des traitements symptomatiques aux résultats transitoires sont proposés aux patients étant atteint d’un psoriasis. L'idée novatrice de ce projet est d'étudier l'implication fine du récepteur TRPV1 et de le placer au centre de la dérégulation de l'équilibre homéostatique (constantes fonctionnelles régulées et maintenues à des valeurs bénéfiques pour l’organisme), incluant l'ensemble des acteurs, et d'identifier si possible le site d'inflammation privilégié (épithélial, neuronale, vasculaire) permettant d'envisager une possible nouvelle voie de développement d’un traitement diminuant le nombre et l’intensité des poussées.

Procédures

Les souris issues des 3 nouvelles lignées KO tissu-spécifique TRPV1, soit au maximum 1600 animaux, obtenues par la procédure 1 – élevage et obtention des 3 lignées de souris LoxP-Cre Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, seront incluses dans la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris et seront donc soumises à 3 types d’interventions : I – en amont du protocole d’induction (procédure 2), chaque souris sera tondue et dépilée (crème VEET « peaux sensibles »), sous anesthésie gazeuse ; intervention réalisée 1 fois et d’une durée maximale de 5 minutes, II – durant le protocole d’induction (procédure 2), chaque souris vigile recevra une application externe / topique de Vaseline® (condition contrôle) ou d’Aldara™ 5% (condition induite), sur la zone dépilée ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce – 3 jours », 5 fois pour la modalité « aigüe – 6 jours » et 24 fois pour la modalité « chronique – 9 semaines » et d’une durée de moins de 5 minutes, III – Durant la procédure 2, chaque souris vigile recevra une injection sous-cutanée préventive de NaCl 0,9% (300µL), après contention manuelle, pour limiter déshydratation générale liée à la procédure d’induction ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce », 3 fois pour la modalité « aigüe » et 6 fois pour la modalité « chronique », d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont : I – du stress lors des pesées régulières (entre 2 et 7 fois par semaine, durée inférieure à 30 secondes) diminuant avec l’habituation, II – du stress lors des anesthésies gazeuses générales de préparation (tonte, dépilation) des animaux en amont de l’induction du modèle, de faible intensité (maximum 5 minutes), III – du stress et de l’inconfort lors des manipulations des animaux vigiles pour induire le modèle (application dorsale de crème, injection sous-cutanée préventive, observations comportementales, …), de faible intensité, et se réduisant avec l’habituation à la répétition journalière des opérations (5 minutes par animal et par jour), IV – une perte de poids corporel transitoire, attendue durant les premières 48 heures après début du traitement d’induction et pouvant atteindre 20% maximum, due à une déshydratation générale, soit d’une intensité modérée (maximum durant une semaine), V – L’apparition des « symptômes » induits, caractéristiques du psoriasis (rougeur / érythème, desquamation, épaississement cutané), d’intensité faible à modérée (durée totale de l’expérimentation) et VI - du stress lors de la réalisation des transferts des animaux vers nos partenaires (préparation, conditionnement, nouvel environnement transitoire, vibrations lors du transport, …), de faible intensité, sur 24-48h.

Devenir

Ce projet comporte 2 procédures expérimentales. Lors de la procédure 1 – Elevage et obtention des 3 nouvelles lignées de souris Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, l’apparition éventuelle d’un phénotype dommageable mettrait fin au projet et l’ensemble des animaux seraient mis à mort. Les animaux présentant les génotypes d’intérêt, ainsi que les géniteurs d’intérêt pour la cryoconservation de leurs gamètes, seront gardés en vie. Les animaux non-sélectionnés seront mis à mort. Les animaux sélectionnés en procédure 1, intègreront la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris, où ils seront transférés immédiatement vers nos partenaires (modalité « précoce – 3 jours » et « aigüe – 6 jours ») ou intègreront la modalité « chronique – 9 semaines », où ils débuteront le protocole d’induction du psoriasis, avant d’être transférés, à leur tour, vers nos partenaires, qui se chargeront de finaliser l’induction et de réaliser les expérimentations finales, puis mettrons à mort l’ensemble des animaux. Ils seront donc tous conservés en vie dans notre établissement.

Remplacement

Le psoriasis est une maladie multifactorielle, dont la physio-pathologie implique différents intervenants et composantes au sein de la peau (vasculaires, nerveux, barrière cellulaire, …), ne pouvant être reproduits et étudiés uniquement par le développement de modèles cellulaires et/ou l’utilisation de méthodes alternatives. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale et de la mise en place de protocoles in vivo pour prendre en compte l’ensemble de ces aspects.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu afin de réduire au maximum le nombre d’animaux sans compromettre l’interprétation statistique des résultats. De par la variabilité interindividuelle dans les tests fonctionnels finaux, nous devons inclure 20 animaux par double analyse fonctionnelle pour obtenir des résultats robustes. Si les variations des résultats expérimentaux sont « significatives », nous envisagerons de réduire le nombre d’animaux par groupe et ainsi diminuer le nombre global d’animaux nécessaire. De plus, nous limiterons le nombre de groupes « contrôle » dans les 3 modalités d’induction du modèle (précoce - 3 jours, aigüe - 6 jours, chronique - 9 semaines), en utilisant les animaux contrôles de la modalité d’induction « aigüe - 6 jours » pour la réalisation des analyses de la modalité « précoce - 3 jours ».

Raffinement

Les responsables du projet s’assureront du bien-être de l’ensemble des animaux au quotidien, par la réalisation d’observations comportementales et d’évaluations du poids corporel, au minimum 2 par semaine. Si nécessaire et en suivant une échelle de cotation adaptée, les responsables prendront en charge la gestion de la douleur ou du mal-être par une analgésie adaptée, et si un point limite est atteint, pratiqueront la mise à mort immédiate de l’animal concerné.

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle d’étude in vivo est courant en immuno-dermatologie. Son système immunitaire, humoral et cellulaire est largement décrit depuis de nombreuses années et font référence, ce qui nous permettra d’expérimenter sans avoir recourt à des espèces de mammifères plus proches de l’homme. Dans notre contexte, il nous semble d’autant plus pertinent d’induire un psoriasis sur cette espèce, car, commercialement, nous pouvons obtenir des animaux génétiquement modifiés d’intérêt (mutant KO total TRPV1, souris LoxP-TRPV1, souris Cre-tissu spécifique), et créer des souris Cre-LoxP KO spécifique TRPV1 par les méthodologies d’inactivation Cre-LoxP développées dans les années 2000. Le modèle inductible d’inflammation cutanée / psoriasis est documenté depuis plus de 10 ans, utilisé par de nombreuses équipes mondialement et nos partenaires sont rompus à son utilisation. Les 3 nouvelles lignées produites permettront de caractériser l’implication du récepteur TRPV1 au sein de 3 compartiments cellulaires impliqués dans le psoriasis induit chez la souris. Le psoriasis touche l’ensemble de la population, du jeune à l’adulte, avec un pic d’apparition de la maladie chez l’homme se situant entre 20 et 30 ans. Notre étude souhaite évaluer les phases précoces d’apparition du psoriasis, puis l’installation de la pathologie à court terme (phase aigüe) et l’évolution à long terme (phase chronique) dans un modèle induit de dermatite psoriasiforme chez la souris. Nous utiliserons donc des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et dont le poids variera entre 20 et 30g au moment de débuter le protocole d’induction du modèle.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent une injection de chlorure de baryum dans les muscles de la patte pour provoquer une lésion, après un gavage de dioxine, afin d'étudier l'effet de ce polluant sur la régénération musculaire. Le porteur reconnaît qu'une paralysie ou une nécrose de la patte reste possible, et prévoit la mise à mort au plus tard vingt-huit jours après la lésion. Il indique que l'étude d'interactions cellulaires dans l'organisme entier ne peut être qu'en partie remplacée par la culture in vitro.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables parce qu’il possède de grandes capacités régénératrices, ce qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. La dioxine, un polluant organique et hautement toxique, a un impact sur les cellules souches du muscle squelettique et il a été démontré qu’il existe une différence de réponse face à la pollution au sein des sous-populations de cellules souches du muscle. Une partie d’entre elles semblent résistantes à la pollution et présentent un mécanisme de résistance unique, tandis que la majorité des cellules satellites y sont sensibles. Ceci interroge désormais sur le rôle respectif de ces deux sous-populations quant à la réparation du muscle squelettique dans un contexte de pollution. Comme la pollution est un facteur de risque important pour la santé humaine nous proposons avec ce projet et sur la base de nos résultats, de décrypter les réponses cellulaires et moléculaires spécifiques de chacune de ces deux souspopulations au cours de la régénération musculaire après une exposition à la pollution. Alerter sur les effets de la pollution dans un système biologique tel que le système musculaire permettra de comprendre quel stress cellulaire peut engendrer la pollution. Dans notre étude, nous utiliserons des modèles murins qui subiront une exposition à la dioxine ou à une molécule contrôle. Une partie des souris sera, dans un deuxième temps, soumise à une blessure musculaire. Nous pourrons ainsi étudier l’impact de la pollution par dioxine sur les cellules souches musculaires notamment au cours du processus de la régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Comme notre projet s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires nous ne pouvons pas mettre en place une méthode alternative au vivant. Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessif d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre étude fera appel à un total de 480 souris sur une procédure expérimentale.

Procédures

Pour le déroulement de ce projet les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles TA et BCPS. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux).

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte du traitement de TCDD par gavage. Les animaux gavés avec TCDD ou contrôle nonane sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. L’induction de la régénération musculaire peut entrainer des contraintes au niveau du mouvement de la patte pendant quelques heures. Dans notre expérience nous n’avons jamais observé de complications majeures liés à la régénération musculaire mais nous ne pouvons pas négliger la possibilité qu’une éventuelle paralysie ou nécrose de la patte puisse se manifester.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyse au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et/ou l’interaction entre de nombreux types cellulaires/tissus. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De plus, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des testes préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.

Raffinement

Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé et les cellules satellites sont en quiescence. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de l’impact de l’exposition à la TCDD et pour l’étude de la régénération musculaire.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la patte leur inflige une douleur neuropathique maintenue pendant sept semaines, avec des tests de douleur répétés et, pour certaines, une injection de naloxone déclenchant un syndrome de sevrage. Le porteur précise que l'allodynie mécanique ne peut être soulagée "car c'est l'objet de l'étude", et attend une perte de poids transitoire, pour évaluer une association méthadone-gabapentine. Il affirme le remplacement "impossible", la douleur ne pouvant être observée que chez l'animal vivant et vigile.

Objectifs

La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel, généralement chronique elle affecterait 5 à 7% de la population française. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients et leurs effets secondaires conduisent de nombreux patients à arrêter le traitement. Antidépresseurs, anticonvulsivants (Gabapentine) et tramadol/tapentadol sont parmi ces traitements. En clinique, les opiacés classiques (morphine, fentanyl) sont de moins en moins prescrits pour soulager ce type de douleur du fait de leurs nombreux effets indésirables et de la crise des opiacés qui existe aux États-Unis en particulier. Les médecins se tournent alors de plus en plus vers la méthadone qui est actuellement utilisée dans de nombreux pays, mais pas encore en France, comme traitement antalgique des douleurs complexes liées au cancer. Ces douleurs complexes et chroniques mêlent des douleurs par excès de nociception ainsi que des douleurs neuropathiques, ce qui rend difficile leur évaluation et leur traitement. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de la méthadone seule mais également en association avec un traitement plus courant la Gabapentine dans le soulagement des douleurs neuropathiques périphériques dans un modèle murin. L’association de ces 2 molécules permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Plusieurs doses seront testées afin de trouver une association de doses idéale, c’est-à-dire provoquant un soulagement idéal de la douleur neuropathique avec les plus petites doses possibles (ce qui provoquera donc le moins d’effet indésirable possible). Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Le projet s'inscrit dans une démarche de raffinement des traitements existants chez l’Homme pour soulager les douleurs neuropathiques. L’association de méthadone et de gabapentine (anticonvulsivants déjà utilisé à plus fortes doses en clinique dans le traitement des douleurs neuropathiques) permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant la meilleure efficacité avec le moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique pendant 7 semaines. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Ces animaux subiront également 6 fois le test de douleur durant une vingtaine de minutes environ avant la chirurgie neuropathique puis trois fois par semaine (délai de 5 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) pendant 5 semaines. Les animaux auront un traitement par un analgésique potentiel (méthadone, gabapentine, morphine ou 2 de ces molécules associées) dans leur eau de boisson 15 jours après l’induction de la douleur neuropathique Certains animaux seront soumis à un syndrome de sevrage modéré par une injection de naloxone.

Impact sur les animaux

Il y a présence de douleur, plus particulièrement une allodynie mécanique qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie, une perte de poids transitoire peut se produire. Le traitement par la méthadone peut produire un syndrome de tolérance, d’hyperalgésie ou de sevrage, normalement peu présents voir pas présents aux doses utilisées dans ce projet. Un effet positif, antidouleur, induit par les traitements est également attendu.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre de souris nécessaire a été calculé mathématiquement et les effets de la combinaison des deux traitements sera évalué par les tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton et de la frisure seront placés dans la cage pour favoriser la nidation pour limiter les comportements d’agressivité, et des barreaux de bois à ronger pour favoriser le comportement naturel du rongeur de ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant la chirurgie d’induction de douleur neuropathique des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites pour limiter la souffrance de l’animal sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, ces nouvelles pratiques pourraient être intégrées au projet.

Choix des espèces

Les modèles d’animaux neuropathiques utilisés dans cette étude ont été caractérisés et validés pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe) et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).

200 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection de manganèse à travers le tympan puis une IRM d'une heure et demie, pour mettre au point une imagerie des acouphènes servant à tester des candidats médicaments. Le porteur signale un inconfort de l'oreille après l'injection et indique que les animaux sont tués juste après l'IRM parce que le manganèse, toxique à forte dose, est incompatible avec leur maintien en vie. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de mesurer les acouphènes chez l'animal.

Objectifs

Développer des techniques IRM comme marqueur des acouphènes chez le rongeur en vue de développer et tester des médicaments traitant ce trouble.

Bénéfices attendus

Consolidation scientifique de cette technique d’imagerie pour évaluer l’efficacité de candidat médicament sur les acouphènes.

Procédures

Tous les animaux vont subir une imagerie IRM pendant 1h30 maximum.

Impact sur les animaux

Inconfort au niveau de l'oreille après l'injection trans-tympanique du manganese.

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés en fin de procédure afin d'éviter les effets du marqueur nécessaire pour détecter les acouphènes (MnCl2). Une forte dose de MN2+ peut produire de signes cliniques qui représentent des points limites, donc l'incompatibilité avec le maintien des animaux au-delà de l'acquisition IRM.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer la présence d'acouphènes chez l'animal et l'activité cérébrale in-vitro. Il reste nécessaire de vérifier l’efficacité des principes actifs avant de poursuivre le développement chez l'Homme.

Réduction

Le développement d’une technique IRM du sodium permettra à l’avenir de garder les animaux dans le temps. Cette technique sera complètement non invasive et permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés en les gardant pour qu’ils puissent être leurs propres contrôles dans le temps.

Raffinement

Nous avons choisi d'utiliser l'IRM comme methode quantitative de mesure des acouphènes afin d'éviter une approche par électrophysiologie neurochirurgicale avec l'implantation d'électrodes dans le cortex auditif. Cette méthode, moins invasive, ne nécessite pas un point limite associé à la technique de'IRM en elle même. Les animaux sont euthanasiés directement après la mesure IRM sans réveil après l'IRM. L'approche de l'anesthésie sous isoflurane, nous permet de conserver une anesthésie constante et régulière pour éviter le stress d'un réveil de l'animal. Nous conservons les animaux sur un plateau chauffant à température nécessaire pour éviter l'hypothermie de l'animal.

Choix des espèces

Le modéle des acouphénes chez le rat et la souris est validé dans la litérature. Selon les données préliminaires de pharmacologie obtenues sur le traitement des acouphénes, le choix de l'espace s'orientera vers la souris ou le rat. Les animaux utilisés sont des adultes avec une oreille interne complètement formée et fonctionnelle. Cela implique l’utilisation d’animaux âgés au minimum de 4 semaines.

346 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, un suivi de la tumeur trois fois par semaine sous anesthésie et, pour une partie, des injections d'anticorps, afin de tester le blocage d'une réponse immunitaire régulatrice sur la croissance de la tumeur. Le porteur présente cette approche comme une possible alternative ou un complément au traitement anti-PD1. Il conclut que la complexité des réactions immunitaires rend "nécessaire" l'expérimentation in vivo.

Objectifs

Notre système immunitaire est divisé en deux: une réponse inflammatoire qui protège l'organisme contre les infections et les cancers, et une réponse immunitaire régulatrice (anti-inflammatoire) qui contre-balance la réponse inflammatoire pour éviter des réponses trop fortes ou non nécessaires, et donc l'apparition de maladies autoimmunes ou d'allergies. Cependant, il est suggéré que la réponse immunitaire régulatrice peut également avoir un rôle néfaste, comme dans le cancer où elle pourrait empêcher l'élimination de la tumeur par notre corps. D’un point de vue thérapeutique, il serait donc intéressant de bloquer la réponse immunitaire régulatrice dans le but de stopper la croissance tumorale. Pour imaginer bloquer la réponse régulatrice, il est nécessaire d'en comprendre les mécanismes sous-jacents, en particulier la façon dont elle est régulée. Dans ce projet, nous souhaitons donc déterminer les molécules impliquées dans la mise en place de la réponse régulatrice dans un contexte tumoral. Nous testerons dans une seconde partie le potentiel thérapeutique des molécules identifiées en les bloquant à l'aide d'anticorps pour voir si cela arrête la croissance tumorale. Ceci nous permettra de déterminer si bloquer ces molécules pourraient être utilisé comme traitement en complément des thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes contrôlant la réponse anti-inflammatoire, ainsi que le rôle des cellules régulatrices impliquées dans le cancer. L'étude des mécanismes induisant la réponse T régulatrice dans la tumeur, ainsi que le blocage de cette réponse pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant servir dans le traitement du cancer. De plus, ce projet nous permettra de déterminer si le blocage de ces cibles pourrait se réveler comme une meilleure alternative au traitement actuel anti-PD1 ou alors en améliorer son efficacité.

Procédures

Lors de la première partie du projet, 94 animaux seront anesthésiés au jour 0 puis injectés en sous-cutané avec des cellules tumorales (durée : 5 minutes). Par la suite, ces 94 animaux seront anesthésiés trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum pour le suivi de la croissance tumorale (prise de photos + mesure de la tumeur) (durée : 5 minutes x 9 traitements =45 minutes). Au total, la durée de cette procédure expérimentale par souris est de 50 minutes. Lors de la deuxième partie du projet, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 puis injectés en sous-cutané avec des cellules tumorales (durée : 5 minutes). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum pour le suivi de la croissance tumorale (prise de photos + mesure de la tumeur) (durée : 5 minutes x 9 traitements =45 minutes). Ces animaux seront également injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée : 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30 secondes). Au total, la durée de cette procédure expérimentale par souris est de 51 minutes 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une tumeur localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur. Tous les animaux seront surveillés se traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour analyser la croissance tumorale et la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la tumeur.

Remplacement

Les cibles (molécules et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. Les phénomènes mis en œuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu plusieurs organes (tumeur et ganglions lymphatiques) et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécéssaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la réponse immunitaire et et son implication dans la croissance tumorale.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 346 souris, permettant de caractériser la réponse T régulatrice dans la croissance tumorale, et son potentiel en tant que cible thérapeutique. Les groupes comporteront 8 souris, ce qui est l'effectif minimal pour avoir des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquence de Tregs et taille de la tumeur) à l'aide d'un t-test. Deux expériences pilotes seront effectuées avec un nombre limité de souris par groupe, ce qui permettra de déterminer 1) la lignée cellulaire la plus appropriée, 2) les doses d'anticorps à injecter. De plus, nous allons tout d'abord étudier une lignée de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite la lignée de souris dans laquelle le gène est absent dans un type cellulaire donné. De la même manière, nous essayerons de bloquer la signalisation de OX40L avec des anticorps, seulement si nous obtenons des résultats prometteurs au cours de la partie 1 concernant le rôle de cette molécule.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales, avec un enrichissement. L'injection de cellules tumorales, les prises de photos et les mesures de la taille de la tumeur seront faites sous anesthésie gazeuse légère. Après ces traitements, les animaux seront placés sous une lampe chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Les sites d'injections d'anticorps seront alternés. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle et selon la grille d'évaluation de la douleur établie. Si un animal dépasse le point limite établi, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires mettent en jeu différents organes, ce qui rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour étudier ces mécanismes. Le modèle choisi est la souris car elle présente un système immunitaire similaire à celui de l’Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d’étudier le système immunitaire à l’âge adulte.