Recherche fondamentale

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer de l'estomac, elles reçoivent neuf injections de chimiothérapie en trois semaines, pour tester le rôle du gène SCRIB dans la maladie. Le porteur indique que la tumeur et les injections peuvent provoquer inflammation, déshydratation, douleur et perte de poids. Il affirme que le modèle animal est "indispensable" et que la souris est le "seul modèle" où la mutation étudiée est possible.

Objectifs

Le but de ce projet est de créer et étudier une nouvelle lignée de souris mutante pour le gène SCRIB qui semble impliqué dans les cancers gastriques (estomac). En effet, lorsque que ce gène ne fonctionne pas correctement (en étant modifié), le cancer a plus de chance de se déclarer. Une version mutée de ce gène SCRIB est trouvée chez des patients atteints de cancers gastriques. Ces souris mutantes qui déclareraient des cancers gastriques nous permettrait de tester l’efficacité des traitements chimio-thérapeutiques sur ces cancers.

Bénéfices attendus

Les cancers gastriques sont la 5ème cause de mortalité par cancer dans le monde, avec plus de 1 millions de nouveaux cas par an. Ces cancers se caractérisent par une forte agressivité avec une survie à 5 ans de moins de 25%. Les raisons de cette mortalité élevée sont multiples et peuvent s’expliquer notamment par un diagnostic tardif. Une meilleure connaissance des mécanismes liés au cancer nous permettrait d’améliorer les diagnostics et les traitements. A terme, le gène étudié ici pourrait être utilisé à l’avenir comme cible thérapeutiques si les traitements s’avèrent efficaces dans ce projet.

Procédures

Les souris engagées dans ce projet sont porteuses de mutations qui induisent un cancer gastrique. Elles auront donc des tumeurs qui se développeront au niveau de l'estomac. Afin d'évaluer l'efficacité de 4 chimiothérapies, les souris recevront ces traitements par injection, 9 au total sur une durée de 3 semaines. Chaque injection prend quelques dizaines de secondes pour être réalisée et peut entraîner du stress et de l'inconfort chez l'animal. L'impact des anticancéreux sur ce modèle réalisé n'est pas connu actuellement.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans ce projet développeront des tumeurs au cours du temps. De plus, les souris subiront toutes 9 injections en IP en 3 semaines. Les souris pourront présenter de l’inflammation de la déshydratation et une douleur transitoire suite aux injections ainsi qu’une perte de poids et d’appétit dues au développement de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. En effet, le but, en plus d'observer les animaux et d'évaluer l'efficacité des traitements, est de mener ensuite des analyses sur plusieurs de leurs tissus (tumeurs et organes).

Remplacement

Au laboratoire, des travaux in vitro encourageants démontrent que la dérégulation de SCRIB, notamment sa perte de fonction, favorise la prolifération cellulaire des cellules de cancer gastriques et diminue l’adhésion cellulaire. L’utilisation d’un modèle animal est maintenant indispensable pour identifier le rôle de SCRIB au niveau d’un organisme et ainsi définir le potentiel statut de SCRIB en tant que gène suppresseur de tumeur. La souris est à ce jour le seul modèle où la mutation sur notre gène d’intérêt est possible.

Réduction

Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées et disposeront d’un enrichissement adapté (tunnels, maisonnettes, carrés de coton pour la fabrication de nid). Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les injections seront réalisées par des personnels compétents. Un suivi régulier comprenant l’observation des critères définis (point d’injection, poids et état de maigreur, état général) sera effectué. Les effets secondaires de la chimiothérapie chez la souris peuvent se traduire par de la diarrhée. Aux doses décrites dans ce projet, le risque est extrêmement faible. Si toutefois des diarrhées apparaissaient, nous mettrons en place un suivi déshydratation (pli de peau) associé à un suivi de poids tous les jours et du gel nutritif sera mis au fond de la cage. Des points limites ont été établis permettant de détecter le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de douleur et ainsi de soustraire l’animal de la procédure rapidement si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est utilisée comme organisme modèle. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. Les animaux utilisés dans ce projet sont génétiquement modifiés et ces lignées sont disponible chez la souris. C’est un modèle de référence dans le domaine de la cancérologie et nous possédons les lignées d’intérêt. Enfin, fort de notre expérience sur ce modèle dans des projets antérieurs, nous choisissons de rester sur le modèle murin. La première partie du projet consiste à évaluer les cancers sur les souris mutantes pendant 12 mois. Les souris seront suivies de la naissance jusqu’à maximum l’âge d’un an. Pour la deuxième partie du projet, l’efficacité des traitements sera tester par chimiothérapie à l’âge adulte. Ainsi, les traitements commenceront entre 6 et 12 semaines.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une maladie rénale chronique leur est induite par un régime à l'adénine pendant quatre semaines, suivie de prélèvements sanguins répétés sur animal vigile et de tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour comparer des régimes carencés en acides aminés. Le porteur indique que le dosage final des toxines urémiques exige un millilitre de sang, soit la quasi-totalité du volume sanguin, ce qui justifie la mise à mort de toutes les souris. Il affirme qu'une étude in vivo est "nécessaire", un éventuel essai chez les patients restant conditionnel.

Objectifs

La maladie rénale chronique correspond à une perte irréversible du fonctionnement des reins. Elle touche 3 millions de personnes en France et est associée à une augmentation de la mortalité en partie liée à l’accumulation de déchets. Actuellement un régime pauvre en protéines est proposé aux patients afin de ralentir la progression de la maladie rénale chronique. Les mécanismes à l'origine de cette protection rénale par les régimes pauvres en protéines restent méconnus. Des études récentes ont démontré qu’une diminution sélective en certains acides aminés (les composants des protéines) pouvait préserver le fonctionnement des reins de façon similaire aux régimes en protéines. Par exemple la réduction sélective des acides aminés aromatiques (phénylalanine, tyrosine et tryptophane) chez la souris ayant une maladie rénale chronique était associée à une amélioration de la fonction rénale similaire à celle observée à la diminution de l'ensemble des protéines. Cependant, ce régime n’a pas été comparé à la réduction sélective d’autres familles d’acides aminés. Ainsi notre projet aura pour but de déterminer de façon formelle quelle(s) réduction(s) de quel(s) groupes d’acides aminés en particulier est responsable de la protection rénale. Nous cherchons à étudier, chez la souris ayant une maladie rénale chronique, l’effet de régimes alimentaires sélectivement carencés en certaines familles d’acides aminés sur la fonction rénale, l’accumulation des déchets, le microbiote intestinale et différents paramètres métaboliques : taux de sucre et de lipides dans le sang, état nutritionnel.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes et notamment quels réduction d'acides aminées en particuliers sous tendent l’effet « protecteur» des régimes pauvres en protéines proposés aux patients atteints de maladie rénale chronique afin de préserver leurs reins. Si les résultats sont positifs, ce projet pourra faire l’objet d’un essai thérapeutique (intervention nutritionnelle) chez les patients atteints de maladie rénale chronique.

Procédures

La maladie rénale chronique sera induite chez les souris de façon pharmaceutique en nourrissant les souris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire contenant 0,25% d’adénine. Au cours de la procédure les animaux auront plusieurs prélèvements réalisés en condition vigile grâce à une micro-incision longitudinale sur la veine de la queue. L'incision sera désinfectée par une solution iodée et le saignement sera arrêté par un coton hémostatique. Un premier prélèvement (15 μL) réalisé avant la mise en place de régimes spécifiques et réitéré 3 semaines après afin permettra d'effectuer un dosage de l'urée plasmatique. A 11 semaines, nous réaliserons un test de tolérance au glucose après 6 heures de jeûne. Le glucose sera injecté en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min (total 6 prélèvements). A 12 semaine, nous réaliserons un test de tolérance à l’insuline après 6 heures de jeûne. L’insuline sera injectée en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. Au cours de ces tests, une seule incision permettra de recueillir tous les prélèvements en grattant la croûte formée. A 13 semaine, les souris seront placées 2 par 2, pendant 24 h en cage à diurèse pour collecter l’urine. 48 h après les souris seront mises à mort: une ponction intra-cardiaque sera effectuée après anesthésie profonde, pour évaluer l’accumulation des déchets de la maladie rénale.

Impact sur les animaux

Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n’induit qu’un ralentissement de la croissance pondérales liée à une diminution de la prise alimentaire (sans doute lié au goût de l'aliment enrichi en adénine). S’il s’avère que les animaux perdent trop de poids pendant l’induction de la MRC, le régime Adénine pourra être discontinué pendant 2 jours afin de restaurer une croissance pondérale (5 jours de régime adénine – 2 jours de régime standard). Quoiqu’il en soit, les animaux reprennent rapidement du poids à l'issu du régime. L’utilisation de régimes pauvre en protéines ou de modification des apports en AAs ne sont pas responsables d'une perte d'appétit. Ils peuvent cependant induire une agressivité chez les animaux. Au cours des tests de GTT et ITT, les souris auront des prélèvements sanguins réalisés grâce à une incision à l'extrémité de la queue qui peut générer un stress. Préalablement à ces tests métaboliques les souris seront mises à jeun pendant 6 heures. La mise à mort à la fin de l'étude ou en cas d'atteinte d'un point limite sera effectuée sous anesthésie générale.

Devenir

Le dosage des toxines urémiques (les déchets de la maladie rénale) nécessite 200 microlitres de sérum soit 1 ml de sang. Chez une souris, ce volume correspond à une spoliation de la quasi totalité du volume sanguin et justifie donc la mise à mort de toutes les souris à la fin de l'étude soit 140 animaux.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans la production de déchets urémiques et le développement du syndrome urémique sont multifactoriels. La maladie rénale chronique et les déchets urémiques ont un effet délétère sur l’ensemble des tissus de l’organisme comme le rein, la régulation de la glycémie et les paramètres nutritionnels. Ces éléments ne sont pas modélisables sur un modèle cellulaire. Il est donc nécessaire de recourir à une étude in vivo pour étudier l’impact des différent régimes alimentaires sur l’ensemble de ces paramètres étant donné l’impact globale de la maladie rénale chronique. De plus nous voulons étudier en autre les modifications de la structure l’intestin et du rein qui nécessite des examens trop invasifs pour être réalisé chez l’homme. A ce stade de développement, il est impossible de supprimer un ou plusieurs acides aminés dans l’alimentation humaine. Ainsi toute expérimentation dans des modèles cellulaire ou chez l’homme est impossible à ce stade.

Réduction

Nous avons pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure expérimentale. En effet, à notre connaissance, la question scientifique que nous posons ici n’a encore jamais été adressée. Il s’agit donc d’un projet totalement original et nous avons veillé, lors de l’élaboration de notre procédure, à éviter toute redondance dans les expérimentations. L'analyse statistique sera effectuée par ANOVA ou test non paramétrique de Kruskall-Wallis lorsque justifié. Ces tests seront complétés d'analyses post-hoc. Ainsi, le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Selon nos données précédente, le nombre de sujets par groupe est de 8. Il a donc été décidé de porter le nombre d’animaux à 10 par groupe afin de parer aux aléas expérimentaux : atteinte de points limites, décès liés à la maladie rénale, échec de l'induction de la maladie rénale par le régime. La procédure sera dans un premier temps réalisé que chez 70 souris mâles et nous renouvellerons l'experience dans les mêmes conditions chez des souris femelles pour évaluer l'impact du sexe sur ces régimes au cours de la maladie rénale chronique. Un total de 140 animaux est donc nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés 5 par cage (stabulation sociale) dans un environnement enrichi. Une surveillance appropriée permettra de repérer la survenue de points limites généraux: apathie, prostration, perte de poids, hypoglycémie profonde. La maladie rénale chronique sera induite chez nos souris par méthode pharmaceutique grâce à un régime en Adénine qui est bien toléré par les animaux. Il peut cependant être responsable d'un ralentissement de la prise pondérale à cause d'une diminution de la prise alimentaire (sans doute lié au goût de l'aliment enrichi en adénine). En cas de perte de poids trop importante, le régime sera suspendu pendant 48h ce qui permet habituellement un rapide rattrapage du poids normal. Au cours de l'étude, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront réalisés. Le volume d'injection de glucose et d'insuline a été adapté afin de limiter tout inconfort et la glycémie sera suivie toutes les 15 minutes. La survenue d'une hypoglycémie sévère sera suivie d'une injection de glucose et, en cas de peristance, constituera un point limite spécifique de ces tests. Les prélèvements sanguins réalisés au cours de l'étude seront effectués en condition vigile, grâce à une incision de moins de 1mm à l'extrémité de la queue. A la fin de l'étude, tous les individus seront mis à mort. La mise à mort des souris, indiquée par la fin de l'étude ou la survenue d'un point limite, sera réalisée sous anesthésie générale puis dyslocation cervicale.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des souris, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme (accumulation de toxines urémiques, hyperglycémie, modification du microbiote intestinale). Des souris âgées de 6 semaines ont été choisies correspondant à des jeunes adultes chez lesquels l'induction de la maladie rénale est bien tolérée (pas de signe de souffrance des animaux). Etant donnée que la fonction rénale s'altérè de façon physiologique avec l'âge des souris, nous choissisons des souris juvéniles afin de s'affranchir de ce biais.

13 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, puis des administrations répétées de substances, pour tester l'efficacité d'anticancéreux pour le compte de clients industriels ou de laboratoires. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer perte de poids, hypothermie, épanchement abdominal et difficultés respiratoires. Il décrit une activité de prestation commerciale et affirme que ce modèle ne peut "pas être remplacé" par des méthodes in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeure et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles animaux de cancer humain et murin demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Le modèle d’injection de cellules en sous-cutané, dit hétérotopique, permet d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments peuvent facilement être évaluées grâce à un suivi cinétique de la croissance tumorale par des mesures au pied à coulisse. Bien que la greffe de cellules ou de tissu cancéreux n’est pas réalisée dans l’organe d’origine dont est issue la tumeur, ce type de modèle a pu montrer un caractère prédictif satisfaisant afin d’identifier des molécules à activité thérapeutique pour la clinique humaine, qui en fait un modèle standard de la recherche en oncologie. La procédure décrite dans ce projet correspond à la création de différents modèles de tumeurs chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est d’administrer des cellules tumorales issues de différents types de tumeurs et de mesurer différents critères (taille de la tumeur, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles. La création de ce type de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de tumeur chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration. Dans ces buts, la procédure consistera à injecter des lignées cellulaires humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), des cellules primaires obtenues à partir biopsies de patients ou d’explants tissulaires en sous cutané chez des animaux immunocompétents (souris ou rats), immunodéprimés (souris ou rats), transgéniques ou humanisés dépendant du modèle. Un suivi de la croissance du volume tumoral sera réalisé avec un pied à coulisse ou d’autres modalités d’imagerie par bioluminescence ou fluorescence (utilisant des cellules reportrices adaptées à ce type de modalité) mais aussi par rayons X ou échographie. De plus, le poids et l'état général des animaux seront suivis au cours du temps. Cependant les modèles de mélanome, aussi injectés en sous cutanés, ne seront pas considérés dans ce projet car induisent la formation de métastases agressives. Les animaux présentant une immunodéficience nécessitant un cloisonnement ou certains animaux transgéniques seront hébergés en condition Biosafety level 2 (BSL2) afin de maintenir leur statut Specific and Opportunistic Pathogen Free (SOPF) et éviter toutes contaminations chez ces animaux plus sensibles.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 10 min pendant laquelle ils seront tatoués dans la pulpe de leurs doigts en utilisant une aiguille imbibée d’encre de tatouage pour animaux. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude. - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance. - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et ne permettent pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Des analyses in-vitro pourront être réaliser en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclue une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Des études de ces aberrations et la compréhension de leur contribution à la physiopathologie du cancer sont nécessaires pour améliorer le diagnostic et la thérapie. Aujourd’hui encore, les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. Tous les animaux utilisés seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris.

Une souris dont le score de souffrance atteint 21 est mise à mort, tout comme celle qui reste entre 14 et 20 sans évolution 24 heures après la prise en charge de sa douleur. 200 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post mortem. Un vecteur viral injecté dans un muscle de la patte y supprime une protéine, et la contraction de ce muscle diminue puis disparaît, ce qui affecte la mobilité de la souris. Selon les groupes, les souris reçoivent ensuite un peptide dans la veine sous anesthésie, ou dans le ventre sous contention, puis une petite chirurgie sous anesthésie expose le muscle EDL pour mesurer sa contraction, et elles sont tuées sans réveil. Le porteur présente ce travail comme la "première preuve de concept" de ce peptide, une démonstration qui, selon lui, "ouvrirait la possibilité" de l'utiliser dans différentes maladies.

Objectifs

La contraction des muscles squelettiques nécessite une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium qui est contrôlée par l’interaction de deux protéines, A et B. L’interaction de ces deux protéines permet le déclenchement de la contraction musculaire et le dérèglement de cette interaction entraine des troubles graves de la contraction musculaire. L’objectif de ce projet est de tester la capacité d’un peptide d’intérêt à restaurer la contraction lorsque l’interaction entre ces deux protéines est perturbée par l’absence de l’une d’entre elles. L’absence dans tous les muscles de l’une ou l’autre de ces deux protéines entrainant la mort de l’animal, nous supprimerons l’expression de la protéine A dans un seul muscle de la patte. Une fois constatée une diminution significative de la contraction de ce muscle nous injecterons le peptide d’intérêt dans le muscle et observerons le retour de la contraction. Cette étude permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes qui commande le couplage excitation-contraction du muscle squelettique. Différentes myopathies humaines ont pour origine un dérèglement des mécanismes de contrôle du déclenchement de la contraction. La caractérisation de molécules permettant de contrôler les différentes étapes de ce processus revêt donc une importance majeure non seulement au niveau fondamental mais également dans la mise au point de traitement de ces pathologies. Cette étude représente la première preuve de concept de l’utilisation « in vivo » de peptides capables de moduler au niveau intracellulaire les acteurs du déclenchement de la contraction.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet. Ce projet devrait permettre : 1) De démontrer in vivo la capacité du peptide d’intérêt à rétablir le couplage entre l’excitation et la contraction des cellules musculaire squelettiques lorsque la protéine située à la surface de la cellule fait défaut. 2) D’établir la preuve de concept que le peptide d’intérêt est capable in vivo d’interagir avec sa cible et d’en contrôler l’activité. Cette démonstration ouvrirait la possibilité d’utiliser ce peptide dans différentes situations pathologiques causées par une déstabilisation de l’interaction entre les protéines A et B (RYR1 et CACNA1S).

Procédures

Les souris recevront une injection unique dans le muscle tibial crânial avec 30 µl de PBS ou d’un vecteur viral de type AAV (Adeno Associated Virus). La durée totale d’intervention est d’environ 10 mn. Selon les groupes, les souris recevront une injection unique du peptide soit en Intra Veineuse, qui sera réalisée au niveau de la veine caudale sous anesthésie gazeuse (environ 5 mn) soit en IP qui sera réalisée sous contention en moins d’une minute. Pour les mesures de contraction du muscle, les animaux seront anesthésiés. Après une petite chirurgie pour atteindre le muscle squelettique EDL, celui-ci sera soumis à un protocole de contraction musculaire afin d'évaluer les propriétés contractiles de ce muscle d'intérêt. À la fin de ces mesures et afin de réaliser des analyses post mortem, les animaux seront immédiatement mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les injections en intramusculaire (IM) et en intraveineuse (IV), les souris seront sous anesthésie gazeuse. Une légère douleur au point de ponction pourrait être ressenti après le réveil. L’injection en intra péritonéale (IP) sera réalisée sur animaux vigiles. Elle engendre une légère douleur au moment de la piqure. Une fois le muscle tibial crânial injecté avec le vecteur, les animaux subiront de façon progressive une diminution puis la disparition de la contraction de ce muscle. La mobilité en sera donc affectée, et cela, dans un temps qui sera défini lors de la Phase 1 du projet. C’est sur la base de cette nuisance que le choix d’injecté qu’un seul membre a été décidé. Pour les mesures contractiles du muscle, les animaux seront anesthésiés puis mis à mort (acte expérimental sans réveil).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post mortem.

Remplacement

La capacité du peptide d’intérêt à rétablir la contraction du muscle a été testé sur des cellules musculaires en culture. Cependant les modèles cellulaires ne permettent pas d’obtenir des cellules musculaires totalement matures et donc d’approcher la complexité des interactions entre protéines en place dans la cellule musculaire adulte. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres physiologiques de la contraction musculaire et l’effet du peptide d’intérêt sur ces différents paramètres.

Réduction

Dans le contexte de cette étude, et en se basant sur notre expérience des données d’expression après injection d’un vecteur AAV dans le muscle chez la souris, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum. Ainsi, un maximum de 200 souris réparties sur 3 phases sera utilisé afin d’avoir suffisamment de données pour déterminer dans un premier temps, la fenêtre d’injection possible du peptide, dans un second temps la voie d’administration et le temps de pénétration dans le muscle de ce peptide et dans un dernier temps, son efficacité ou non, in vivo. Selon les paramètres analysés, des tests statistiques de type non paramétriques (Mann & Whitney) pourront être utilisés pour comparer les souris traitées et non traitées.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.) En cas d’observation d’un mal être de la part de l’animal, un examen clinique sera réalisé à l’aide d’une grille de score afin d’évaluer le degré de souffrance de l’animal. Ainsi, sera observé l’aspect physique global (poil, morphologie général, pertes de poids), l’aspect physique du facies (Paupières, Aspect des larmes, colorations des muqueuses/oreilles), l’aspect comportemental (agressivité, comportement, activité) et la respiration. Pour ce projet, l’observation se portera également sur les capacités motrices de l’animal ainsi que sa capacité à pouvoir se nourrir. Cette grille d’évaluation décisionnaire est générique et mis à disposition par notre SBEA. Selon le score enregistré, certaines actions seront mises en place selon le schéma suivant : score de 0, aucune action ; de 1 à 6, signes cliniques légers, réflexion sur l’environnement (milieu, social). Si un animal présente 3 signes associés, utilisation d'AINS ou analgésique faible ou anesthésique local ou opioïdes dose faible; de 7 à 13, signes cliniques modérés, utilisation d’opioïdes dose faible à moyenne, réflexion sur l’environnement (milieu, social…) et observation régulière (min 1f/j) ; de 14-20 signes cliniques sévère, observation (min 2f/j) et utilisation d’opioïde de dose moyenne à forte, s’il n’y a pas d’évolution dans les 24h malgré la prise en charge de la douleur, alors l’animal sera euthanasié ; ≥ 21, euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire. En effets, les modèles « in vitro » ne peuvent reproduire la complexité du mécanisme qui commande le couplage excitation-contraction du muscle squelettique. Les vecteurs AAV sont fréquemment utilisés avec succès chez la souris. Ainsi nous allons utiliser ce modèle afin de pouvoir mimer grâce au vecteur AAV le dérèglement du couplage excitation-contraction et faire preuve de concept de la capacité d’un peptide à rétablir le déclenchement de la contraction « in vivo ». Afin de pouvoir réaliser notre étude sur des muscles tibiaux et EDL homogènes et de tailles adultes, des souris adultes d’environ 14 semaines seront utilisées.

Capturés dans un cours d'eau salmonicole, 800 truites communes et 400 chabots, soit 1 200 poissons sauvages, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque poisson est mesuré, pesé, puis incisé sur le ventre pour l'implantation d'un transpondeur, et reste entre 30 secondes et une minute hors de l'eau. Tous sont remis à l'eau vivants, pour vérifier si les ouvrages aménagés sur la rivière, dont une passe à poissons, leur permettent de circuler. Le porteur compte jusqu'à 5 à 10 % de truites qui perdent leur transpondeur dans les semaines suivantes et jusqu'à 20 % de femelles qui l'expulsent lors de la fraie, et affirme que "Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale".

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité des ouvrages et des aménagements réalisés pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau salmonicole. Dans cette rivière, de nombreuses actions de restauration de la continuité écologique ont été réalisées sur un secteur long de 6.7 km, sur lequel 8 seuils ont être arrasés ou modifiés pour faciliter la mobilité piscicole mais aussi sédimentaire. En 2022, le dernier des seuils de ce secteur a été aménagé pour permettre aux poissons de franchir un obstacle considéré jusqu’ici comme infranchissable (création d’une rivière de contournement). Dans la suite des efforts réalisés par le syndicat gestionnaire pour améliorer la continuité écologique sur ce secteur dit « renaturé », une étude écologique pluriannuelle, par la technologie RIFD devra confirmer que la mobilité piscicole et sédimentaire y est à nouveau assurée. Cette étude devrait aussi permettre d’identifier les zones de déplacements des poissons en tenant compte des contraintes physiques et morphologiques du milieu (thermie, disponibilité en habitat).

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » des ouvrages à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'200 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l'ouvrage. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. Pour les chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent une injection intracérébrale de vecteurs viraux ou la pose chirurgicale d'un implant dans le cerveau, suivies de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, pour étudier le rôle de la dopamine dans la peur et l'anxiété. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent provoquer une perte de poids, un détachement de l'implant ou des troubles du comportement. Il affirme que la souris est le "seul organisme modèle" permettant ce type d'étude, d'éventuelles approches thérapeutiques restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Le cerveau possède des systèmes dits de récompense qui évaluent les effets bénéfiques de certaines actions et facilitent leur apprentissage. Ils attribuent ainsi une valeur plus ou moins grande à des signaux annonçant une « récompense » et règlent leur valeur motivationnelle. Symétriquement des valeurs motivationnelles sont attribuées à des signaux prédictifs de situations « menaçantes ». Les neurones produisant la dopamine jouent un rôle important dans ces phénomènes et la libération de dopamine module la force de la valeur motivationnelle. Le dérèglement de ces systèmes intervient dans l’addiction aux drogues (valeur motivationnelle excessive) ou dans les troubles anxieux généralisés (valeur « menaçante » excessive). De multiples facteurs participent au contrôle de la libération de dopamine. Parmi eux, les récepteurs de la dopamine appelés autorécepteurs D2 exercent un rétrocontrôle négatif empêchant ainsi une libération excessive de dopamine. Une faible expression de ces récepteurs est un facteur de risque d’addiction chez les humains. Dans ce projet, nous émettons l’hypothèse que le même type d’anomalie favorise l’apparition de troubles anxieux en exacerbant la valeur motivationnelle attribuée à certains signaux prédisant une situation « menaçante ». Nous testerons cette hypothèse en manipulant sélectivement les autoD2R au sein de populations de neurones dopaminergiques spécifiques. Nous utiliserons une combinaison d’approches allant de la génétique moléculaire à la mesure de l’activité des neurones, le tout couplé à des études comportementales.

Bénéfices attendus

Cette étude s’inscrit dans le cadre d’une meilleure compréhension des circuits neuronaux contrôlant les réponses émotionnelles associées à des stimuli aversifs (réponse de peur). Les résultats de ce projet permettront de préciser certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l’apparition de troubles anxieux observés dans différentes affections psychiatriques et à terme de proposer des approches thérapeutiques innovantes

Procédures

600 animaux subiront une injection dans la cavité abdominale pour induire des mutations de nos gènes d’intérêts (durée : >1min). 2100 animaux auront une chirurgie pour injecter dans des régions précises du cerveau des vecteurs (virus recombinant non pathogène) pour induire des mutations spécifiques de certains neurones (Durée >45min). 1200 animaux subiront une chirurgie pour poser un implant (fibre photométrique) pour révéler l’activité de certains neurones dans le cerveau (Durée >45min). Tous les animaux auront des tests de comportement.

Impact sur les animaux

La procédure prévoit des injections stéréotaxique. Ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques (voir annexe). D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

La réalisation de notre projet repose sur l'utilisation de nombreuses lignées transgéniques exprimant la protéine fluorescente GFP et l'enzyme Cre recombinase nous permettant ainsi d'identifier les neurones et d'invalider par recombinason homologue (système Cre/Lox) notre protéine d'intérêt. La souris est le seul organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc la seule option à ce jour pour évaluer avec précision et pertinence les liens de causalité entre l'identité moléculaire et cellulaire des neurones dopaminergiques et le controle des réponses émotionnelles dans notre projet de recherche.

Réduction

Ce nombre a été déterminé de manière à reduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Sample size determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité : p=0.05). Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Dans le but d'une exploitation maximale des données obtenues, plusieurs régions cérébrales seront systématiquement analysées.

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies sont faites avec des anesthésiques et analgésiques adaptés. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles pour l'évaluation du rôle des recepteurs D2R , au cœur de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisésentre 3 et 8 mois ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines.

300 truites sauvages vont être capturées et relâchées après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après anesthésie, chaque poisson reçoit un transpondeur implanté par incision ventrale, avec un maintien hors de l'eau de trente secondes à une minute, pour évaluer le franchissement d'une passe à poissons récemment aménagée. Le porteur indique que la capture et le marquage induisent un stress et décrit une cicatrisation qu'il juge généralement bonne. Il affirme que cette étude comportementale ne peut se faire que sur des individus vivants relâchés dans leur milieu naturel.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité par les poissons d’un ouvrage de franchissement (passe à poissons) récemment réalisé pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau jurassien. Un seuil constituait un obstacle à la montaison des truites au niveau de la tête du bassin versant, connu pour proposer historiquement des habitats piscicoles de qualité. Le gestionnaire local a décidé d’équiper ce seuil d’une passe à ralentisseurs plans afin de rétablir la montaison des truites et autres espèces accompagnatrices. En 2022, cette passe a été réalisée et doit maintenant faire l’objet d’une étude de franchissabilité piscicole par RFID.

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » de l’ouvrage à la migration des truites, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à cette espèce de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 300 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la truite de rivière. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 120 mm à l’aide de tags de 23 mm). Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués, à l’aide de PIT tags 23 mm. Cette taille minimale assure un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.