Recherche fondamentale

1 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des immunomodulateurs par voies intrapéritonéale et orale, pour tester une molécule associée à la radiothérapie contre le cancer du côlon et le mélanome. Le porteur décrit les atteintes très brièvement, la tumeur et le traitement pouvant "affaiblir la souris", sans détailler les points limites. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le micro-environnement tumoral et conclut que le projet doit être mené sur un organisme disposant d'un système immunitaire.

Objectifs

L’efficacité des immunothérapies ciblant l’axe PD-1/PD-L1, est très prometteuse, mais il semblerait que, dans certaines situations, ce traitement ne soit pas suffisant pour complètement activer la réponse immunitaire antitumorale. Dans ces cas, l’association de ce traitement avec notre molécule d’intérêt pourrait présenter une activité synergique bénéfique in vivo. De plus, l’efficacité accrue des traitements combinés radiothérapie/immunothérapie en comparaison avec les monothérapies est un des axes les plus prometteurs en ce qui concerne la lutte contre le cancer du colon et du mélanome.

Bénéfices attendus

L'ajout de la molécule (ACB1801) dont l’activité semble augmenter l’activité de protéines impliquées dans la présentation d’antigène in vitro, semble améliorer la réponse aux monothérapies ciblant PD-1 dans des modèles in vivo. Nous souhaitons donc combiner ces traitements avec la radiothérapie, afin d’améliorer l’efficacité de ces thérapies dans le cadre du cancer du colon et du mélanome. Déterminer si il y a une toxicité de la triple combinaison sur l'animal afin d'éviter les effets seconduires chez le patient.

Procédures

Les seules interventions prévues sont l'injection de cellules tumorales en sous cutané ainsi que l'injection en intrapéritonéal et par administration orale des immunomodulateurs pour les deux procédures.

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont pousse la tumeur peuvent, dans certains cas, affaiblir la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés du fait des greffes qu'ils ont eues et pour effectuer des prélèvements d'organes en vue d'analyses sur certains d'entre eux.

Remplacement

Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: effet «bystander» de l’irradiation i.e. effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèle in vitro permettant une telle étude. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire.

Réduction

Nous avons choisi d'utiliser les modèles du cancer du colon et des mélanomes pour lesquels il y a beaucoup de données dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire concernant la réponse à la radiothérapie et l'immunothérapie. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales (dose d'irradiation et d'immunomodulateurs) et donc le nombre d'animaux nécessaires pour tester nos hypothèses. De plus nous nous sommes basés sur des analyses statistiques pour déterminer le nombre nécessaire d'animaux.

Raffinement

Le développement de la tumeur sera suivi par la mesure du volume tumoral et les souris seront pesées très régulièrement. Un suivi quotidien de signes éventuels de souffrance sera effectué. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les procédures seront effectuées sous anesthésie locale ou générale. En cas de besoin, une analgésie sera utilisée. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi (sizzlenests, maisons en cartons).

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. Les souris C57BL/6 et Balb/C ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, un âge où la souris est suffisamment développée (jeune adulte).

670 animaux non-humains, 520 souris et 150 hamsters dorés, vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les hamsters reçoivent de la testostérone pour élargir leur organe de flanc, les souris subissent des mesures de peau, et tous reçoivent quotidiennement des molécules contre l'acné avec imagerie sous anesthésie et prélèvements sanguins. Le porteur précise qu'aucune analgésie ne sera employée, car elle risquerait d'interférer avec l'analyse. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle capable de remplacer la peau comme tissu vivant et revendique un projet "nécessaire".

Objectifs

Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques ayant une activité sur l'acné. Ces tests sont requis pour permettre le choix des meilleures molécules ou traitements thérapeutiques avant essai chez l’homme (tests cliniques).

Bénéfices attendus

L'acné est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus à des moments clés de la vie (l'adolescence, la femme jeune) et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints d'acné de guérir de l'acné et de son inflammation, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.

Procédures

Les Hamsters seront tondus pour identification au niveau des organes de flanc (durée d'intervention < 5 minutes), ils recevront le traitement sur les organes de flanc (durée d'intervention

Impact sur les animaux

L'injection de testosterone chez les Hamsters peut avoir une répercussion sur le comportement (augmentation de l'agressivité, excitation, dominance...). Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique.

Devenir

A l'issu des procédures tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale (isoflurane afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo pour l'évaluation de l'efficacité des traitements testés.

Remplacement

Nous n'utiliserons le modèle animal d'inflammation provoquée par l'acné qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles alternatifs qui permettent d’effectuer un premier test d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles alternatifs ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau - L’efficacité ne pouvant être complètement testée dans les modèles alternatifs, des premières preuves d’efficacité chez l'animal doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).

Réduction

Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence commercialisé type bétaméthasone). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés immédiatement. L'utilisation de l'imagerie permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du même animal. Les animaux seront anesthésies lors des prélèvements sanguins et les étapes d'imagerie OCT. Aucune analgésie ne sera employée car cette dernière risquerait d'interférer lors de la phase analytique.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris Rhino et hamster) sont d’excellents modèles d'acné. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de l'acné dans ces espèces. De plus, ces animaux présentent des lésions d'acné très semblables à celles observés chez l’humain. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Tous les animaux auront le même âge. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.

384 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une alimentation contaminée par la mycotoxine déoxynivalénol et du fer héminique, avec pour certains une injection cancérigène d'azoxyméthane et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme, avant d'être tués pour prélèvement d'organes. Le projet étudie l'effet combiné de ces contaminants alimentaires sur le cancer colorectal. Le porteur affirme qu'une étude in vitro ne rend pas compte de la complexité de l'organisme entier.

Objectifs

Les mycotoxines sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine déoxynivalénol (DON) se retrouve dans près de 50 % des céréales et les concentrations augmentent avec le changement climatique. Aujourd’hui, environ 80 % des individus sont exposés au DON, à des niveaux proches ou supérieurs à la Dose Journalière Tolérable. Nous faisons l’hypothèse que dans des conditions réalistes de multi-exposition, le DON exacerbe le potentiel toxique du fer héminique présent en grande concentration dans la viande rouge et la charcuterie et qui est associé au développement de plusieurs maladies chroniques, dont le cancer colorectal. Les objectifs de ce projet sont d'étudier et caractériser in vivo les effets “cocktails” du DON avec du fer héminique sur la génotoxicité au niveau des cellules épithéliales intestinales et sur l'initiation et la promotion de la carcinogenèse colorectale. L’hypothèse d’un effet exacerbateur de ce mélange auquel nous sommes exposés nécessite une évaluation toxicologique chez l’animal avec pour objectif de répondre à une question de santé publique.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, nous étudierons in vivo chez le rat l’effet d’une exposition à moyen (28 jours) et long terme (100 jours) au mélange DON/fer héminique. Ce projet permettra de mieux appréhender les questions de multi expositions liées à l’exposome chimique alimentaire auquel la population humaine est quotidiennement exposée. Les données expérimentales découlant des différentes procédures apporteront des réponses en terme de toxicité et génotoxicité de ce mélange dans un contexte d'exposition réaliste au DON et au fer héminique via l'alimentation. Cela permettra de répondre à une question de santé publique quant aux effets des co-expositions sur la santé digestive et le développement du cancer colorectal. Nous étudierons si l’exposition combinée aux différents cocktails impacte les marqueurs de génotoxicité dans les cellules épithéliales intestinales et coliques. D’autres marqueurs d’atteintes tissulaires (perméabilité intestinale, scores microscopiques, apoptose, prolifération cellulaire, …) d’inflammation (dosage de cytokines, activité myéloperoxydase…), et des marqueurs en lien avec la consommation de fer héminique et de DON dans les urines et les eaux fécales seront également mesurés. Les résultats attendus du projet sont importants sur le plan de la santé publique car les consommateurs sont exposés de façon chronique à ces contaminants en mélange. Si l'hypothèse d'une exacerbation de leurs effets individuels lorsqu'ils sont en mélange est confirmée, les données produites dans ce projet pourront être prises en compte dans les évaluations du risque d'exposition chez l'homme.

Procédures

L’objectif de ce projet porte sur des études nutritionnelles à moyen (28 jours) et long terme (100 jours). Les animaux sont hébergés par groupe de 3. Les féces seront prélevés à 2 reprises pour les procédures 1 et 2, en début et fin d'expérimentation. Pour les procédures 3 et 4, les féces seront prélevés à 3 reprises, en début, milieu et fin de procédure. Lors de l’injection d’azoxyméthane en intra-péritonéal, la solution est tamponnée pour éviter une douleur au point d’injection et dure moins d'une minute. Cette injection sera unique au cours de la procédure n°4. Dans les procédures 1 et 2, les animaux subissent un passage en cage à métabolisme pendant 24 h. Dans les procédures 3 et 4, les animaux subissent 3 passages en cage à métabolisme pendant 24 h. Préalablement une période d’adaptation de 3 h sera réalisée la veille du premier passage afin de diminuer le stress de l’animal. La mycotoxine déoxynivalénol ayant un pouvoir anorexigène, une perte de poids peut être observée à la dose de 10 mg/kg chez le rat. Les animaux seront pesés de manière bi-hebdomadaire et si une perte de poids supérieure à 15% est observée, l'animal sera alors sorti du protocole expérimental et euthanasié.

Impact sur les animaux

L’objectif de ce projet porte sur des études nutritionnelles à moyen (28 jours) et long terme (100 jours). Un suivi du bien-être animal sera effectué chaque jour et si l’un d’entre eux présente des signes de souffrance il sera examiné par le vétérinaire référent. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit a priori pas de douleur. Cependant, un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur en charge de la procédure sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress. Pour les différentes procédures, les animaux sont gardés en cage à métabolisme individuelle pendant 24h. 3 heures seront nécessaires à l'habituation et adaptation des animaux avant une période de 24 heures nécessaire pour pouvoir récupérer les urines et fèces bien séparées. Pour limiter le stress d'isolement lors des passages en cages à métabolisme, chaque rat en cage à métabolisme pourra avoir un lien visuel avec au moins deux de ces congénères. Pour l'injection en intrapéritonéal de l'AOM, une douleur au point d'injection peut être engendrée, elle sera limitée par le fait que la solution est tamponnée avant l'injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation et des organes prélevés post-mortem pour analyses.

Remplacement

Une étude in vitro sur des cellules épithéliales intestinales montre des résultats quant aux effets du mélange DON-fer héminique sur plusieurs mécanismes cellulaires. Cependant les effets du mélange sur un seul type cellulaire ne permet pas d'appréhender la complexité d'un organisme dans sa totalité. Ainsi, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de la co-exposition mycotoxines/ fer héminique seul ou en mélange, de manière sub-chronique ou chronique sur la physiologie et santé du rat fisher 344 telles que, par exemple, l'observation d'une perte plus ou moins importante de poids ou une augmentation des atteintes dans l'intestin (inflammation et atteintes tissulaires). Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique ainsi que les interactions entre les différents composés sur la physiologie intestinale et leurs rôles dans l'inflammation et l'appration de dommages à l'ADN dans l'épithélium.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Pour ces études nutritionnelles, nos travaux montrent qu'un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour suivre les modulations de la prise de poids et de la perméabilité intestinales. Afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement relevants, nous prévoyons un nombre similaire d'animaux par groupe dans ce projet.

Raffinement

Les rats étant des animaux sociables, ils seront hébergés par 3 dans des cages transparentes afin de permettre le contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant, pour diminuer le stress provoqué par la préhension des animaux avant le prélèvement, une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'étude. Un enrichissement sous forme d’un abri en inox sera mis à disposition des animaux Y compris lors de l'hébergement en cages à métabolisme. L'utilisation de cages à métabolisme est justifiée par la nécessité de récupérer des fèces et urines séparées. Les rats y séjourneront 3 jours au total après avoir y été habitués pendant 2 demi-journées. Le suivi de leur bien-être sera renforcé pendant cette période avec plusieurs visites fois par jour. L’utilisation d’une grille de suivi individuel permettra de repérer les signes de stress ou de souffrance (poil hérissé, perte de poids supérieure à 15%, prostration, comportement alimentaire perturbé…). Si l'expérimentateur juge que l'état de l'animal se détériore au-delà d'un point limite, la procédure s'arrêtera.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l'étude de la relation entre l'alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi sur l’utilisation de modèles animaux. La lignée de rats F344 est un modèle largement utilisé pour étudier la modulation des biomarqueurs urinaires, fécaux et coliques associés à l'exposition au fer héminique. Dans cette étude, le choix d’utiliser des rats mâles a été fait pour éviter de possibles interactions avec le cycle hormonal chez la femelle notamment sur la réponse immunitaire inflammatoire. Les rats âgés de 4 à 8 semaines sont adultes et leur système digestif est pleinement fonctionnel. Les études précédentes portant sur l’exposition au fer héminique ou au DON ont été faites dans des conditions similaires.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris triples mutantes, elles reçoivent du tamoxifène par injection puis par trois gavages, avant une séance d'IRM sous anesthésie légère, pour tester si l'on peut suivre l'activation de certains neurones sensoriels. Le porteur présente une étude pilote censée conditionner un projet plus large sur la douleur, les animaux étant tués faute de pouvoir être relâchés. Il affirme que la détection des variations cérébrales ne peut se faire que sur animal vivant.

Objectifs

Il s'agit ici d'une étude pilote dont les objectifs sont les suivants : Le but de ce projet est d'étudier la biologie d'une classe particulière de neurones somato-sensoriels non myélinisés capables de transduire des stimulation mécaniques à bas seuil, détectées au niveau de la peau poilue. Typiquement, chez l'homme, ces neurones interviennent dans la détection et transduction du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes, y compris certaines réalisées au sein de notre équipe, suggèrent que ces neurones sont aussi capables de moduler la douleur postlésionnelle ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Cependant, ces conclusions ont toutes été formulées de manière indirecte et à l'heure actuelle, aucune étude n'apporte la démonstration directe de leur fonction in vivo, à l'état basal et dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. C'est précisément le but de notre projet. Il repose sur l'utilisation d'une série de lignées de souris génétiquement modifiées de manière à générer des souris triple mutantes permettant d'activer, inhiber ou bien éliminer séléctivement ces neurones in vivo, et ce, de manière inductible. Le but de cette étude pilote est de vérifier qu’il est possible de suivre par IRM la réponse cérébrale induite par l'activation de ces neurones. Les résultats de cette étude préliminaire conditionneront la mise en œuvre d’un projet s’appuyant sur des méthodes d’IRM fonctionnelle pour l’étude des réseaux cérébraux de la nociception impliquant ces neurones.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette étude pilote sont les suivants : La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones somatosensoriels, qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques, qui pourraient avoir une application chez les patients humains. A noter que les neurones étudiés ont été également décrits chez l'homme.

Procédures

L'ensemble des animaux recevra une série administrations de tamoxifen : une injection intra-péritonéale à P42 suivie de 3 gavages espacés de 3 jours, 3jours après l’injection I.P. Une session d'imagerie (d'une durée inférieure à 1h30) sera ensuite réalisée de façon non invasive sur chaque souris (sous anesthésie et sédation légères) à l’état basal (avant injection) et après injection.

Impact sur les animaux

Les animaux seront examinés une seule fois par IRM avant et après administration du véhicule ou d’une solution d'un composé appelé Clozapine-N-Oxyde (CNO. Nos données préliminaires nous permettent d’affirmer que les doses de tamoxifen et CNO utilisées ici n’ont aucun effet délétère sur nos souris triples mutantes. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque l’isoflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.

Devenir

Les animaux seront tous euthansiés à l'issue de la procédure d'imagerie. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées et sur des souris dégénérées, leur mise en liberté est inconcevable.

Remplacement

Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. Le recours à l’animal est incontournable car la détection de variations hémodynamiques cérébrales résultant d’une stimulation pharmacologique ne peut être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation d’une technique d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. En l’absence de données préliminaires permettant de connaître la taille d’effet attendu (l’objectif de ce projet exploratoire étant justement d’apporter des informations sur la réponse cérébrale au CNO) nous avons estimé la taille des groupes nécessaires à l'obtention de données fiables sur la base de notre expérience en IRM préclinique. Les animaux seront leur propre contrôle. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique non paramétrique pour mesures répétées adaptée aux petits échantillons.

Raffinement

Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress et l’angoisse. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.

Choix des espèces

Chez la souris, la population des C-LTMRs est similaire à celle décrite chez l'homme sous le nom de C-Tactile. Cette étude pilote sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.

750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une mutation reproduisant la dystrophie musculaire de Duchenne, ils subissent des tests répétés de force et de locomotion sur animal vigile, puis un prélèvement sanguin à la jugulaire sous anesthésie, avant d'être tués pour l'analyse musculaire. Le projet teste des composés pharmacologiques et vise à remplacer le modèle chien, jugé plus lourd et coûteux. Le porteur affirme qu'aucun modèle non animal ne permet cette évaluation préclinique.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la plus fréquente des maladies musculaires (environ 1/3500 naissances males). Elle est causée par un défaut dans le gène de la dystrophine (sur chromosome X) à l’origine d’une dégénérescence progressive du tissu musculaire. La maladie touche tous les muscles de l’organisme, y compris le muscle cardiaque et le diaphragme. Chez les patients DMD, la marche est définitivement perdue avant l’âge de 15 ans et le décès survient généralement avant 30 ans. Il n’existe pas de traitement curatif à ce jour sur le marché. En attendant la validation et mise en place de thérapies curatives visant à ré-exprimer la dystrophine, la thérapie pharmacologique est une des approches envisageables pour pallier les processus physiopathologiques liés à l’absence de dystrophine. Avant le passage chez l’homme, l’efficacité thérapeutique des approches de thérapie est validée en préclinique sur des modèles animaux de la pathologie. Deux modèles animaux DMD, la souris mdx et le chien GRMD, sont couramment utilisés pour l’évaluation d’approches thérapeutiques mais présentent des limites : - La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD et présente un phénotype peu marqué. - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle de gros animal qui est coûteux et lourd à manipuler. Le modèle de rat DMDmdx, générée par un consortium de laboratoires en 2014, est un modèle intermédiaire : c’est un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations d’utilisation que le modèle canin., cette lignée de rat DMDmdx peut donc être utilisée pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de l’efficacité de nouveaux produits thérapeutiques. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer l’efficacité de produits pharmacologiques pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, sur ce modèle de rat DMDmdx, nous envisageons de tester 10 produits en 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence au niveau pré-clinique les effets musculaires de composés d’intérêt sur le modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne. Aussi, ce projet conduit chez le rat DMDmdx permettra également de valider l'évaluation préclinique d'approches thérapeutiques de la DMD dans un modèle animal adapté. Ainsi, l'objectif est de réduire voire remplacer le chien GRMD, autre modèle de la pathologie humaine également utilisé, plus lourd et plus couteux à manipuler, pour cette évaluation préclinique.

Procédures

Au cours de la période de traitement les animaux seront soumis à des tests d'exploration fonctionnelle (force, locomotion, anxiété) non invasifs via la réalisation de différents exercices. Chacun de ces exercices durent entre 5 et 10 minutes maximum. Ces tests seront effectués 3 fois au cours de ce projet : avant la mise en place du traitement, (soit 4 semaines d'âge), au milieux (soit 3.5 mois d'âge) et à la fin de la période de traitement (soit 6 mois d'âge). En fin de période de traitement un prélèvement sanguin à la jugulaire sera effectué sur des animaux anesthésiés (durée: environ 30 min, de l'induction à la sédation à la remise de l'animal dans sa cage d'hébergement).

Impact sur les animaux

L'évolution de la maladie en elle-même peut entrainer un déclin de l'état de santé (difficultés locomotrices, d'alimentation voire respiratoires). Aussi, l’ensemble des tests d’évaluation de la fonction neuromotrice sera effectué sur animal vigile. Bien que validés, non invasifs, et précédés d'une période d'habituation, ces tests peuvent induire un stress chez les animaux.

Devenir

Ce projet vise à évaluer les effets de composés pharmacologiques sur la fonction musculaire de rats DMDmdx, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne, via la réalisation de tests moteurs sur des animaux vigiles associés à des tests in vitro visant spécifiquement l'étude du tissu musculaire. A la fin de la procédure d'analyse des composés sur la fonction neuromotrice, réalisée à différents stades de développement des animaux et du traitement, l'ensemble des rats sera donc euthanasié afin de conduire cette analyse de la masse et fonction musculaire, afin de corréler les effets physiologiques et cellulaires (identification du lien entre effet et cible d’action)

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne pour évaluer au niveau pré-clinique les effets de traitement pharmacologiques sur la progression de la pathologie.

Réduction

Le nombre d’animaux estimés dans ce protocole est suffisant pour justifier d’une pertinence scientifique, et est réduit au maximum tout en tenant compte de la validité statistique, des contraintes du modèles et des approches expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. L'évolution de la maladie en elle-même pouvant entrainer un déclin de l'état de santé (difficultés locomotrices, d'alimentation voire respiratoires), l'état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne par le personnel animalier et responsable du projet pour estimer une éventuelle gêne ou douleur liées à l'expression clinique de la maladie. Si un seul signe clinique spécifique ou 3 signes notables sont détectés, alors le responsable du la structure chargée du bien être des animaux et le responsable de l’étude seront prévenus et l'animal sera sacrifié sans délais. Un prélèvement sanguin sera réalisé en fin de traitement. L’ensemble des tests d’évaluation, validés et non invasifs, sera effectué sur animal vigile. Afin de limiter au maximum le stress engendré par la manipulation, les mesures seront précédées par une période d’habituation à la salle d’expérimentation, aux dispositifs expérimentaux ainsi qu’à l’expérimentateur et un renforcement positif (récompense des animaux suite réalisation des essais) sera mise en place.

Choix des espèces

La lignée de rats DMDmdx possède, comme chez les patients atteints de dystophie musculaire de Duchenne (DMD) une mutation à l'origine d'une déficience en une protéine, la Dystrophine. Le phénotype sévère implique une atteinte des muscles squelettiques et cardiaque. Deux modèles animaux de la Dystrophie musculaire de Duchenne , la souris mdx et le chien GRMD, sont couramment utilisés pour l’évaluation d’approches thérapeutiques mais présentent des limites : - La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD et présente un phénotype peu marqué. - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle de gros animal qui est coûteux et lourd à manipuler. Le modèle de rat DMDmdx est un modèle intermédiaire : c’est un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations d’utilisation que le modèle canin. Rats d’âge compris entre 1 et 6 mois afin : - d’évaluer l’efficacité du traitement à différents stades de l’évolution de la maladie dont les premiers symptômes sont visibles chez le rat dès l’âge de 4 semaines. L'exploration des fonctions motrices sera effectuée à 3 stades : avant le traitement (environ 4 semaine d'âge), au milieux (environ 3.5 mois d'âge) et à la fin de la période de traitement (environ 6 mois d'âge). La procédure d'analayse des composés sur la masse et fonction musculaire in vitro des rats DMDmdx sera réaliser en fin de traitement soit à 6 mois d'age.

850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de lignées de cancer colorectal humain, subissent une ou deux chirurgies sous anesthésie, des résections de tumeur et pour certaines cinq séances d'irradiation, avant d'être tuées pour prélèvement. Le projet évalue un dispositif d'imagerie par fluorescence censé guider le chirurgien, le porteur reconnaissant inflammation, perte de poids et douleur postopératoire. Il affirme que la validation du dispositif rend l'étape animale "indispensable" avant tout essai clinique.

Objectifs

Le cancer colorectal est l’un des cancers les plus fréquents et mortels chez les hommes et les femmes avec un taux de survie de 63 % à 5 ans malgré la mise en place d’un programme de dépistage. Des cancers colorectaux (CCR), 30 % sont localisées dans le rectum (CR). Le CR nécessite un diagnostic et un traitement spécifiques. La résection chirurgicale est le traitement de référence, mais elle induit une morbidité importante et une qualité de vie réduite. Les chirurgiens doivent se reposer sur leurs sens de la vision et du toucher afin de distinguer les tissus malades devant être retirés des tissus sains à préserver. Cette absence de guidage est critique ; une identification inadéquate des zones de résection peut être responsable du développement de métastases, d’une récidive locale et de la diminution de la survie. Pour répondre à cette problématique, l’imagerie est devenue un domaine de recherche majeur, notamment autour de l’imagerie de fluorescence. Cette technique non-irradiante est adaptée aux contraintes d’un bloc chirurgical. Elle nécessite l’usage d’un fluorophore sensible et spécifique au tissu malade ciblé. La stratégie « Watch and Wait » (observer et attendre) est une approche permettant de préserver les organes. Un suivi précis de ces patients est crucial pour identifier toute (re)croissance tumorale locale ou dans des organes avoisinants. C'est pourquoi de nouvelles technologies de surveillance ont été développées afin de permettre un suivi plus précis et plus objectif et de minimiser le risque de récidive et d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif l’évaluation d’un nouveau système d’imagerie avec un fluorophore cible comparé à différents systèmes d’imagerie et à d’autres fluorophores. Pour ce faire, un modèle murin de xénogreffe de cancers colorectaux permettant de reproduire les conditions du cancer colorectal humain sera utilisé. Ce nouveau dispositif d’imagerie, s’il est validé, pourrait être utilisé au cours d’une chirurgie CRC ou d’une coloscopie afin d’aider les chirurgiens dans leur prise de décision. Ce projet sera donc réalisé sur un effectif total de 850 animaux dans le respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait contribuer à optimiser les thérapies chirurgicales des cancers colorectaux en réduisant le nombre d'opérations inutiles après une réponse clinique complète et d'assurer un meilleur suivi des patients. En effet, le traitement à visée curative du cancer colorectal consiste en une chimioradiothérapie néoadjuvante suivie d'une résection chirurgicale. Cette technique a permis de diminuer la récidive avec de meilleurs résultats à long terme. Toutefois, il est difficile pour les chirurgiens de distinguer les tissus cancéreux des tissus sains. Ainsi, de nouveaux outils d'imagerie diagnostique pourraient améliorer le contraste entre les tissus cancéreux et les tissus sains adjacents pendant la chirurgie. L'imagerie moléculaire ciblée sur la tumeur est une technologie émergente qui pourrait répondre au besoin d'évaluation nécessaire aux chirurgiens. Cette technique innovante peut permettre une visualisation peropératoire en temps réel de la tumeur en mettant en évidence de manière sélective les cellules cancéreuses. Ainsi, cette étude pourrait permettre la mise en place d’essais cliniques chez l’homme et fournir de meilleurs outils d'orientation aux chirurgiens traitant des patients atteints de cancers colorectaux.

Procédures

Les animaux des différentes procédures expérimentales seront soumis à : - Implantation d’une lignée cellulaire au niveau des deux flancs sous anesthésie générale gazeuse sur 72 animaux (PE1, partie 1) - Implantation de 3 lignées cellulaires sous anesthésie générale gazeuse sur 778 animaux (PE1, partie 2 et PE2-PE9) - 1 chirurgie sous anesthésie générale gazeuse pour exposer la tumeur sur 666 animaux pendant environ 1 heure (PE1, 2, 3, 4, 5, 7 et 8) - 2 chirurgies sous anesthésie générale gazeuse sur 184 animaux pendant 1 heure (PE6 et 9) - 1 résection de tumeur complète sous anesthésie générale gazeuse sur 697 animaux pendant 1 heure (PE2, 3, 4, 5, 6 résection totale, 7, 8 et 9) - 1 résection de tumeur incomplète sous anesthésie générale gazeuse sur 69 animaux pendant 1 heure (PE6 résection partielle) - imagerie (non invasive) sous anesthésie générale gazeuse sur 850 animaux pendant 5 minutes - 5 séances d’irradiation sous anesthésie générale gazeuse sur 46 animaux pendant 10 minutes une séance par jour pendant 5 jours - Euthanasie prélèvements d’organes terminaux sous anesthésie générale sur tous les animaux (850).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sur notre modèle de souris de cancers colorectaux sont : - Inflammation ou nécrose de la tumeur, - Perte de poids, - Douleur suite à la chirurgie. Une grille d’évaluation de la souffrance/points limites des souris établies tous les 2-3 jours permettra de détecter et suivre la totalité des effets secondaires et de les gérer en cas de besoin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever les tissus pour des études et validations post-mortem.

Remplacement

Après un début de développement du dispositif d’imagerie grâce à des approches « in silico » (numériques) et « in vitro » (substrats de synthèse, tissus, organes isolés), le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de cette nouvelle technologie. Il s’agit de démontrer l’efficacité du dispositif d’imagerie en temps réel au cours d’une chirurgie, en validant des paramètres spécifiques dans différentes procédures expérimentales réalisées sur un modèle de cancers colorectaux. L’objectif principal est de démontrer que le nouveau dispositif d’imagerie permet de distinguer les tissus sains des tissus cancéreux pour guider le chirurgien lors de son opération. Cette étape sur l’animal est indispensable afin de pouvoir envisager, par la suite, la mise en place d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de mesures réalisées par animal a été optimisé (plusieurs systèmes d’imagerie seront utilisés sur un même animal) afin de réduire le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les études seront réalisées par étapes, avec des phases préalables de validation et d’optimisation des modèles sur de faibles effectifs avant de passer aux étapes suivantes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec du matériel pour la nidification. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement quelques jours avant de démarrer les procédures expérimentales ; la mesure de leurs tumeurs et leur poids sera réalisée 3 fois par semaine. L’implantation des tumeurs, les chirurgies et les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. L’usage d’analgésie avant les opérations permettra une meilleure gestion de la douleur. Une partie des animaux sera sacrifiée sans réveil après la chirurgie. Les animaux qui seront réveillés après chirurgie seront suivi quotidiennement afin de pouvoir détecter et gérer la douleur en cas de besoin. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chirurgiens. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. Il est ainsi possible d’obtenir un modèle standardisé optimal de tumeurs colorectales, modèles plus difficiles à réaliser chez d’autres espèces. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Nous utiliserons des souris nude. Ce modèle de souris permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs. Ces souris sont connues pour être de bons modèles pour le développement de tumeurs sous-cutanées. Les animaux seront livrés à partir de l'âge de 5 semaines. A cet âge, nous pourrons réaliser les analyses prévues sur les tumeurs. L’utilisation de souris nude, sans poils, fera en sorte que la couleur de la peau et les poils n'interfèrent pas avec les différentes technologies d'imagerie utilisées.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées jusqu'à quinze jours dans une centrifugeuse reproduisant une hypergravité de 2G, ce qui les plaque au sol et augmente leur stress, puis passent le test de la croix surélevée et le test du labyrinthe en Y avant d'être tuées pour l'étude de leur hippocampe. Le projet vise à comprendre l'effet de la gravité sur la mémoire, en vue d'aider les astronautes lors des vols spatiaux. Le porteur affirme que l'effet de l'hypergravité sur un "organisme entier" ne peut pas être modélisé in vitro.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer les effets de l’hypergravité (à court ou à long terme) sur la potentialisation à long terme (LTP) dans l’hippocampe des animaux, l’un des mécanismes essentiels de la mémoire. Nous allons aussi déterminer si l’exposition à l’hypergravité (2G) va mener à des difficultés dans des tests comportementaux évaluant la mémoire, la cognition et le stress des animaux. Après une période d’habituation, en groupe sociaux, dans des cages de l’animalerie, la totalité des animaux, soit 80 animaux, seront soumis soit à l’hypergravité (2G) pendant 24h (n=20), 48h (n=20) ou 15 jours (n=20) dans une centrifugeuse in vivo, prévue à cet effet soit à 1G (condition normogravitaire, n=20). Pour reproduire un champ gravitaire de 2G, et donc placer les animaux en hypergravité, nous utilisons une centrifugeuse in vivo (programme spatial du CNES). A la fin de ces différentes périodes, la première moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort pour une étude electrophysiologique approfondie sur tranches d’hippocampe. L’autre moitié des animaux effectura des tests comportementaux pour étudier si des modifications sont concommittantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe). Après 15 jours d’adaptation, durant lesquels ces tests seront effectués à nouveau 4 fois (2 fois par semaine), les souris seront mises à mort pour effectuer des enregistrements electrophysiologiques et voir si les propriétés électrophysiologiques sont modifées.

Bénéfices attendus

Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe. En effet on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est directement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulment à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération de leurs fonctions cognitives lors de changement de gravité telles qu’ils subissent lors des vols spatiaux.

Procédures

Après une période d’habituation, en groupe sociaux, dans des cages de l’animalerie, la totalité des animaux, soit 80 animaux, seront soumis soit à l’hypergravité pendant 24h (n=20), 48h (n=20) ou 15 jours (n=20) dans une centrifugeuse in vivo, prévue à cet effet soit à 1G (condition normogravitaire, n=20). A la fin de ces différentes périodes, la première moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort pour une étude electrophysiologique approfondie sur tranches d’hippocampe. L’autre moitié des animaux sera soumise à des tests comportementaux non invasifs. Ces tests seront réalisés sur animaux vigiles et sans anesthésie. Concernant les 20 animaux témoins, ils seront placés, en groupe sociaux, dans une nacelle de centrifugeuse qui sera déposée dans la meme pièce que la centrifugeuse mais qui ne sera pas en rotation. Alors que 10 de ces animaux effecturont le protocole « électrophysiologie », les 10 autres effecturont le protocole « comportement + electrophysiologie ». Les nuisances prévues sont au nombre de 3. Tout d’abord l‘exposition à l’hypergravité (pour 60 souris), puis les tests comportementaux (pour 40 souris) puis l’électrophysiologie post-mortem (pour 80 souris). L’exposition à l’hypergravité va consister en une augmentation progressive de l’accélération générée par la mise en rotation de l’appareil. Nous prévoyons une augmentation lente permettant d’atteindre un vecteur d’intensité gravitaire perpendiculaire au sol des cages de 2G en 5 minutes. Lors de cette augmentation les animaux vont ressentir une augmentation de leur poids qui va les plaquer au sol et réduire leurs mouvements puis les animaux vont s’adapter et on observe qu’après quelques heures ils commencent à retrouver un certain niveau d’activité. On observe pendant cette phase d’adaptation une augmentation du niveau de stress, puis une habituation à ce nouvel environnement et une réapparition des comportements normaux. Les tests comportementaux que nous effectuerons dès la sortie de la centrifugeuse puis à deux autres délais pour les souris exposées durant 2 semaines sont le test de la croix surélevée et le test du labyrinthe en Y (alternance spontanée). Ce ne sont pas des tests qui génèrent une nuisance particulière, les animaux sont libres de leurs mouvements et on recueille seulement des paramètres liés à leur exploration.

Impact sur les animaux

La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui peut potentiellement induire une augmentation du niveau du stress, en perturbant leur perception de la gravité et de leurs déplacements dans l’espace. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont s’immobiliser pendant une periode de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitationnel et reprendre une activité normale.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure. En effet la première moitié des animaux est utilisée pour des études electrophysiologiques ex-vivo de tranches d’hippocampe, par conscéquent ils seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse. L’autre moitié des animaux sera soumise à des tests comportementaux non-invasifs à la sortie de la centrifugeuse, ils seront ensuite réutilisés quelques jours plus tard, pour des mesures électrophysiologiques, pour évaluer des phénomènes de réadaptation plusieurs jours apres la centrifugation. Par conséquent, à la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Des études in vitro ou in sillico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculo-squelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements életrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveau qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in sillico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut etre maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisament proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.

Réduction

Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=10 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. De plus, le fait d’utiliser les mêmes animaux pour les études comportementales et pour le suivi de la récupération des animaux après l’exposition à l’hypergravité permet de réduire considérablement leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables dans des cages standard, répondant aux normes d’éthique. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, c’est-à-dire dans un environnement stabilisé en température à 21°, hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h). L’eau et la nourriture seront ad libitum, de la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition. Leur milieu est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement l’état des animaux et particulièrement des éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe des animaux (poils hérissés, blessures…), des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et mis à mort.

Choix des espèces

Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille et supporte très bien une modification de la gravité jusqu’à 2g. De plus, son génome est connu et suffisament proche de celui de l’homme pour obtenir des premiers résultats concluants. Nous utilisons des souris adultes de 8 semaines car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soit atteint.

1404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée par ajout de dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, avec pour une partie des animaux une induction de cancer intestinal par injection, puis une injection de cellules B régulatrices et des prélèvements sanguins. Le projet teste une thérapie cellulaire contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les souris étant tuées pour caractériser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme que les migrations et interactions cellulaires en jeu ne peuvent pas être modélisées in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser l’effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices (Bresg) dans des modèles de maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Les MII incluent la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC) qui sont des troubles chroniques et récidivants, dont le cancer est une complication à long terme potentiellement mortelle. Plus de 2 millions d'Européens et 1,5 million de Nord-Américains sont atteints de MII. Bien que les traitements actuels permettent de ralentir la progression de ces maladies chez certains patients, une rémission durable et la prévention du cancer associé ne sont pas toujours possibles, et il n'existe actuellement aucun traitement curatif pour les MII. Les MII impliquent des cellules du système immunitaire responsables de la pathologie intestinale. L’activation de ces cellules pathogènes est normalement empêchée par un autre type de cellules du système immunitaire appelées Bregs. Les Bregs sont déficitaires chez les patients atteints de MII si bien qu’elles ne bloquent plus l’activation des cellules qui causent la maladie. Il y a un grand espoir qu’il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices chez ces patients. Des Bregs peuvent être produites en grand nombre en utilisant un protocole récemment établi. Les MII peuvent être modélisées chez la souris. En utilisant ces modèles les objectifs de ce projet sont de caractériser l’effet des Bregs produites in vitro sur la progression de la maladie, leur localisation dans les souris traitées, les mécanismes moléculaires impliqués dans leur effet bénéfique, et leur capacité à compenser pour des défauts dans d’autres mécanismes régulateurs importants dans l’inflammation intestinale. Le projet évaluera également la capacité de ces Bregs à empêcher le développement de cancer intestinal provoqué par l’inflammation.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'optimisation d'une nouvelle approche de thérapie cellulaire basée sur les Bregs pour traiter les MII et empêcher le développement de cancers associés, ainsi que la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cet effet thérapeutique au niveau de l'organe affecté, l'intestin. Les MII, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, sont des troubles chroniques et récidivants du tractus gastro-intestinal. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif des MII. Les dysfonctionnements du système immunitaire contribuent à l'inflammation intestinale aberrante chez ces patients. L'activation de la réponse immunitaire est normalement contrebalancée par des lymphocytes régulateurs, tels que les lymphocytes B régulateurs (Bregs). Les Bregs sont déficients dans les MII et donc incapables de bloquer la réponse inflammatoire conduisant à la maladie. Il existe un grand espoir qu'il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices à ces patients. Les Bregs peuvent être produits en grand nombre par différenciation des cellules B naïves à l'aide d'un protocole récemment établi.

Procédures

La colite sera induite dans 1404 souris par ajout de dextran sodium sulfate (DSS) à l'eau de boisson. Ces souris suivront 8 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chacun de ces traitements. 1) injection de Bregs, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 90 souris. 2) injection de PBS, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 15 souris. 3) injection de Bregs, analyse J10 : 345 souris. 4) injection de PBS, analyse J10 : 210 souris. 5) Injection de Bregs, analyse J28 : 384 souris. 6) Injection de PBS, analyse J28 : 96 souris. 7) pré-traitement AOM, injection de Bregs, analyse semaine 12 : 216 souris. 8) pré-traitement AOM, injection de PBS, analyse semaine 12 : 48 souris.

Impact sur les animaux

La colite aiguë est induite par ajout de DSS dans l'eau de boisson pendant une semaine à une concentration de 4,0 % (modèle aigu). Pour le modèle chronique, les souris ont une eau de boisson avec du DSS à 2,5 % pendant une semaine, puis une semaine pendant laquelle l’eau de boisson ne contient pas de DSS, suivie par une semaine avec de l’eau de boisson à 2,5% en DSS (modèle chronique). Dans le modèle aigu, les souris développent la colite quelques jours après l'administration de DSS. Pour le modèle chronique, la concentration de DSS a été optimisée afin que les souris développent une maladie plus légère. Dans le modèle chronique, les souris développent progressivement la colite après le premier cycle d'administration de DSS et sont en rémission pendant la semaine suivante, puis la maladie rechute avec le deuxième cycle d'administration de DSS et se rétablit progressivement après le retrait du DSS. L'induction d'un cancer associé à une colite se fait par injection intrapéritonéale d'AOM suivie de trois cycles d'administration de DSS via l’eau de boisson (modèle AOM/DSS). Dans ce modèle de cancer, les symptômes sont provoqués par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par DSS. Les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur sont généralement peu nombreux et le nombre d’animaux devant être mis à mort pour atteinte de point limite est généralement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que la réponse au traitement, et leur système immunitaire seront alors caractérisés.

Remplacement

Les protocoles expérimentaux nécessaires à ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue d'un remplacement afin de réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole de production des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures contenant uniquement des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le besoin d'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l'effet Bregs dans des modèles de MII et de cancer du côlon associé. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires et impliquent des processus d'interaction entre différents types de cellules et des migrations cellulaires qui ne peuvent actuellement pas être modélisés in vitro. Les maladies inflammatoires intestinales impliquent également la migration des cellules du système immunitaire vers l'intestin, puis l'interaction de ces cellules avec les cellules intestinales locales. Ces processus ne peuvent pas être étudiés in vitro. Il n'y a donc pas d'alternative à la réalisation des études décrites chez la souris.

Réduction

Le protocole d'induction des MII a été optimisé de manière à ce que les maladies se développent de façon homogène chez des souris génétiquement identiques, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement valides. Des mesures de remplacement et d'affinement ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires à ce projet. Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et sur les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power. Nous comparerons le jour d'apparition des signes cliniques, le score clinique maximum et l'incidence de la maladie avec le test de Mann-Whitney, et le niveau global de la maladie avec des ANOVA à mesures répétées. En outre, nous utiliserons une stratégie d'imagerie par luciférase pour suivre le devenir des Bregs au fil du temps sur le même animal, ce qui réduit le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Le protocole d'induction des MII a été affiné de manière à ce que l'évolution de la maladie ne dure que 10 jours dans le modèle aigu, si bien que les souris ne sont malades que pour quelques jours, et soit plus douce dans le modèle chronique afin de réduire la souffrance des animaux. Dans le modèle de cancer associé à la colite, les symptômes sont causés par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par le DSS. Le protocole a été raffiné au niveau des doses utilisées afin que les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur soient généralement rares. Nous avons établi des points finaux pour chaque procédure afin d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont logés en groupes de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés à leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux, et par les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement pour les expériences avec le modèle de colite aiguë et deux fois par semaine pour les modèles de colite chronique et de cancer de l'intestin.

Choix des espèces

Les modèles de MII et de cancer colorectal proposés ici sont bien standardisés. Les connaissances disponibles sur ces modèles permettent de mieux définir les plans expérimentaux et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ces modèles, ce qui permet d'aborder les problèmes posés de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d'informations. Ces modèles expérimentaux ont été utilisés pour le développement de thérapies actuellement utilisées chez les patients atteints de MII. Même si ces modèles ne sont pas une copie parfaite des MII ou des cancers associés, ils constituent des modèles utiles pour le développement de pistes thérapeutiques pour la pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est approprié pour ces études car cela correspond à l’âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est appropriée pour étudier cette maladie.