Recherche fondamentale

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par inhalation de CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules d'ostéosarcome sont injectées dans le tibia sous anesthésie, y compris chez de très jeunes animaux, pour reproduire cette tumeur osseuse de l'enfant et suivre sa progression. Le porteur indique que l'apparition de métastases peut provoquer une gêne respiratoire entraînant une mise à mort immédiate, et un boitement traité au paracétamol. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du microenvironnement tumoral et retient une lignée conservant un système immunitaire.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente chez les enfants et les adolescents (âge médian au diagnostic 15 ans). Pour mieux comprendre l’ostéosarcome et donc mieux le traiter, il est nécessaire de développer des modèles animaux récapitulant les interactions entre les cellules tumorales et l’environnement osseux prenant en compte l’âge de survenue. La majorité des modèles d’ostéosarcome sont établis à partir de lignées cellulaires humaines hors de l’os et ne permettent pas alors de reproduire l’interaction de la tumeur avec l’environnement osseux. De plus ces modèles ne possèdent pas le système immunitaire afin d’éviter le rejet de greffes des cellules humaines. Pour mieux comprendre la biologie de cette tumeur, un modèle récapitulant les caractéristiques environnementales et pédiatriques (immaturité du système immunitaire et influence hormonale notamment) serait nécessaire. Nous avons un modèle d’ostéosarcome de souris établi dans le tibia chez des animaux avec le système immunitaire (immunocompétents) et âgés de 5 semaines. Nous souhaitons à présent établir une greffe dans le tibia chez des animaux plus jeunes afin de reproduire l’ostéosarcome de l’enfant (survenue et traitement de l’ostéosarcome avant 13-15 ans). Nous souhaitons le caractériser en termes de progression, histologie, signature moléculaire et immunitaire.

Bénéfices attendus

Nous avons un modèle d’ostéosarcome implanté dans le tibia chez des souris immunocompétentes âgés de 5 semaines. Cet environnement d’origine influe sur le comportement de la tumeur (progression, résistance). Or, les hormones, notamment sexuelles, ont été démontrées comme agissant également sur le développement des os. Un modèle d’ostéosarcome au niveau de l’os établi chez des animaux plus jeunes récapitulerait les étapes essentielles de l’ostéosarcomagenèse d ans le contexte du système immunitaire immature avec une influence hormonale. Un tel modèle permettrait d’avancer les connaissances biologiques de l’ostéosarcome et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en tenant compte de ses particularités notamment celles liées à l’âge de survenue de cette tumeur pédiatrique avec un pic à la puberté.

Procédures

Les animaux vont subir une injection orthotopique des tumeurs en intratibiale dans toutes les procédures sous anesthésie et de durée 5 min au maximum.

Impact sur les animaux

En cas d’apparition des métastases, une gêne respiratoire peut subvenir (fréquence respiratoire irrégulière ou accélérée). Cette gêne est rapidement repérée grâce aux observations cliniques régulières et l’animal sera mis à mort immédiatement pour éviter sa souffrance. Dans le cas de la douleur de l’animal, le plus souvent observer par le boitement de l’animal qui ne pose pas sa patte au sol, on administrera un antalgique (paracétamol, 300 mg/kg) dans la boisson des animaux. En cas de non amélioration de l’état de l’animal jusqu’à 3h après l’administration du paracétamol, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par l’inhalation de CO2 à la fin des procédures et les tissus seront récupérés pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le microenvironnement de la tumeur étant très complexe, il n’existe pas un autre moyen i.e. in vitro, pour reproduire sa complexité avec tous ses composants, notamment immunitaires et d’autres modèle in vivo sont insuffisants.

Réduction

Ces expériences de la mise en place du modèle par l’injection intratibiale des cellules tumorales de souris seront réalisées de façon séquentielle par les procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A la fin des procédures les animaux seront mis à mort et les tissus collectés afin de construire une banque tissulaire pour d’autres analyses histologiques et moléculaires. Il n'y aura pas de statistiques pour les procédures 1 et 3 avec une détermination de la quantité des cellules à injecter par la voie intratibiale. Pour les procédures 2 et 4 des tests paramétriques ou non-paramétriques, selon les règles de leur application, pour la caractérisation de l’environnement tumoral pourront être appliqués.

Raffinement

Toute intervention d’injection intratibiale sera faite sous anesthésie générale. Les animaux seront manipulés sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale. Une définition précise des points limites conduisant à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux. Une surveillance adaptée des animaux, une pesée bihebdomadaire et une observation au minimum 3 fois par semaine permettront d’éviter toute douleur ou souffrance de l’animal. Dans le cas de la douleur de l'animal, le plus souvent observer par le boitement de l'animal qui ne pose pas sa patte au sol, on adminsitrera un antalgique (paracétamol) sans influence sur le système immunitaire dans la boisson des animaux. Les animaux plus jeunes à l’implantation tumorale seront surveillés avec attention accrue sur la journée après le réveil afin de vérifier que la mère ne les rejette pas. En plus, pour éviter le rejet par la mère nous minimiserons le temps de séparation des petits avec la mère. Nous remettrons les petits dans le nid après qu’ils aient été frottés avec de la litière de la cage d’origine.

Choix des espèces

Nous disposons d’un modèle d’ostéosarcome établi par l’injection dans le tibia dans les souris âgées de 5 semaines. Ce modèle est à notre connaissance le plus proche de l’ostéosarcome humain (agressivité, pouvoir métastatique, environnement immunitaire) hormis les cancers spontanés. Les cellules utilisées sont une lignée cellulaire d’ostéosarcome d’origine des souris de la même souche ; ce modèle peut donc être établi sur un animal immunocompétent, condition nécessaire pour étudier l’environnement immunitaire de cette tumeur. L’âge plus jeune ne devrait pas influer le taux de prise tumorale, voire le taux de prise peut être améliorer avec le système immunitaire immature avec moins de rejet de greffe.

40 cailles japonaises adultes vont être utilisées dans des procédures classées en gravité modérée, puis gardées pour de futurs projets ou confiées à une association pour placement. Chaque oiseau est logé en cage individuelle et déplacé deux à quatre fois par semaine pendant trois semaines pour des tests de réaction à la nouveauté, isolé au plus dix minutes, son comportement étant filmé. Le porteur situe la gravité surtout dans le logement individuel, qu'il reconnaît comme une nuisance pour les femelles, et affirme n'infliger aucune atteinte physique. Il décrit un projet collaboratif d'observation du comportement et retient la caille pour sa petite taille et son développement rapide.

Objectifs

Le projet global est un projet collaboratif multisite de science ouverte qui vise à collecter le plus de données possibles sur la cognition des oiseaux afin de comparer différentes espèces, d'évaluer la variabilité individuelle et de relier facteurs socio-écologiques (alimentation, socialité...) et évolution de capacités cognitives caractéristiques de chaque espèce. Le premier volet du projet porte sur la néophobie, c'est-à-dire la réaction à la nouveauté de différentes espèces d'oiseaux et de différents individus. La néophobie détermine la façon dont les individus vont interagir avec leur environnement et l'explorer et va donc avoir des conséquences sur l'adaptation et la survie des individus, notamment dans un environnement changeant. Toutes les espèces sont les bienvenues dans le projet collaboratif. Celle que nous étudierons est la caille japonaise. Deux autres laboratoires vont utiliser cette espèce, ce qui permettra d'obtenir plus de données et d'évaluer la reproductibilité et la généralisation du protocole et des résultats obtenus. Le projet s'articule autour de 3 questions : la première est de comparer la néophobie chez différentes espèces et de voir si l'espèce peut prédire le niveau de néophobie ; la deuxième est d'examiner les effets de facteurs socio-écologiques tels que la taille, le régime alimentaire, la socialité... sur la néophobie ; et la troisième est de tester la répétabilité dans le temps et dans le contexte des réactions individuelles.

Bénéfices attendus

Nous espérons apporter une contribution significative à un projet collaboratif multisite qui devrait aider à mieux comprendre le comportement et la biologie des oiseaux en général, et plus précisément leurs capacités cognitives. D'un point de vue plus restreint, les données collectées nous permettront aussi de mieux connaître le comportement et la variabilité individuelle des cailles. La néophobie est un comportement déterminant lors de toute situation nécessitant de placer l'animal dans un environnement nouveau ou de le confronter à des objets inconnus. Il est donc crucial de pouvoir la mesurer chez différents individus et de voir comment elle se caractérise, en général mais aussi chez chaque individu.

Procédures

Les animaux seront élevés en cages individuelles. Cela peut constituer une nuisance pour les femelles, mais pas pour les mâles, qui ne se tolèrent pas. Les cages seront néanmoins placées dans une pièce où les oiseaux pourront se voir et s’entendre. Les individus seront déplacés et testés dans un dispositif auquel ils auront été habitués. Ils seront testés au plus une fois par jour, 2 à 4 fois par semaine, pendant 3 semaines. Ils seront isolés le temps des tests expérimentaux (pas plus de 10 minutes). Leur comportement sera filmé afin que la présence d'un expérimentateur ne les perturbe pas.

Impact sur les animaux

Les éléments qui sont susceptibles de perturber les animaux et de les stresser sont le déplacement et l'isolement lors des tests (pas plus de 10 minutes par jour), et la présence d'un objet nouveau. La présence d’un objet nouveau est par exemple susceptible de réduire la mobilité des animaux qui auront peur de l’approcher. Nous nous attendons néanmoins à ce que les effets de ces perturbations soient minimes et à ce que les animaux retrouvent très rapidement un comportement habituel une fois leur cage de vie et les congénères retrouvés (les animaux seront hébergés dans des cages individuelles mais dans une pièce où ils peuvent voir et entendre des congénères).

Devenir

Le projet n’implique aucune atteinte à l’intégrité physique et comportementale des animaux. Ceux-ci pourront donc être, soit gardés au laboratoire pour de futurs projets, soit confiés à une association de réhabilitation des animaux de laboratoire pour placement en refuge ou en famille d’accueil.

Remplacement

Le projet consiste à observer le comportement d’animaux vivants libres de leurs mouvements et de leurs réactions, ce qui, par essence, exclut tout remplacement par des modèles autres que ces animaux.

Réduction

Le projet s'inscrit dans le cadre d'un projet plus vaste qui cherche à collecter le plus de données possibles venant de structures et institutions du monde entier. Il se base sur le modèle d'autres études multisites qui ont réussi à constituer de vastes banques de données qu'aucune structure ou institution aurait pu collecter à elle seule. Cette approche collaborative multisite nous permet de réduire au minimum le nombre d'individus testés, tout en gardant un échantillon suffisant pour observer des effets modérés à forts et des variations entre individus.

Raffinement

Tout sera fait pour limiter les manipulations des animaux. Les tests nécessiteront néanmoins de déplacer les animaux et de les isoler de façon ponctuelle et limitée dans le temps (pas plus de 10 minutes par jour). Les oiseaux seront hébergés dans des cages individuelles enrichies (avec nourriture et eau à volonté, abri, substrat permettant d’exprimer des comportements naturels), en présence de congénères (contact auditif et visuel). Ils seront soignés et observés tous les jours. La détection de tout changement de comportement conduira à isoler l'individu et à le soigner si nécessaire, l’objectif étant de pouvoir le remettre dans ses conditions de vie habituelles dès que possible.

Choix des espèces

Les cailles japonaises sont domestiquées depuis des siècles. En raison de leur taille relativement petite et de leur développement rapide, elles sont rapidement devenues populaires tant dans l'industrie agricole que dans la recherche scientifique. Ce sont des gallinacées dont les capacités cognitives ne sont pas toujours suffisamment explorées. Pourtant, elles sont capables d'apprentissage et sont douées d'une mémoire pouvant aller jusqu'à au moins 1 mois. En tant que telles elles ont donc toute leur place dans une étude comparative sur la cognition chez les oiseaux. Leur comportement social (notamment maternel), leur régime alimentaire et leurs cycles biologiques sont bien connus, ce qui permettra de fournir les données socio-écologiques nécessaires, à la comparaison des autres espèces du projet collaboratif qui englobe notre étude, et à la compréhension de l'évolution des capacités cognitives propres à chaque espèce. Les cailles utilisées seront âgées de 7 à 8 mois. A cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle et on peut considérer que leurs traits de personnalité sont stables, ce qui nous permettra de caractériser chaque individu de façon robuste et de comparer les différents individus entre eux pour estimer la variabilité inter-individuelle.

110 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur humaine greffée, elles reçoivent cinq injections dans la veine de la queue puis sont imagées pour suivre la colonisation de la tumeur par des bactéries, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et dislocation cervicale. Le porteur précise que le projet est une prestation de service pour un client privé cherchant à utiliser ces bactéries comme vecteur thérapeutique. Il affirme que la physiologie globale de l'animal ne peut être remplacée pour étudier cette colonisation.

Objectifs

Ce projet est réalisé dans le cadre de la contractualisation de prestations de services pour un partenaire privé. Cette étude vise à imager la colonisation par des bactéries d'un modèle de cancer implanté en sous-cutané grâce au 18F-fluorodeoxysorbitol (18F-FDS).

Bénéfices attendus

La visualisation des bactéries grâce au 18F-FDS permettra de valider la colonisation des tumeurs par les bactéries. Ainsi, elle permettra à notre client de définir si les bactéries utilisées dans cette étude pourraient être interessantes pour vectoriser des molécules d'intéret vers les tumeurs dans une optique d'utiliser ces bactéries comme un nouvel outils de ciblage thérapeutique.

Procédures

Les animaux recevront au total 5 injections en intraveineuse dans la veine caudale en vigile dans un système de contention dédié: J0: 1 injection intraveineuse des bactéries ou du véhicule (volume environ 50µL; durée moins de 1min) et 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J1: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J4: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J6: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). NB: la demi-vie du 18F étant de 110min, il est nécessaire de réinjecter les souris pour chaque point de suivi soit à J1, J4 et J6.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétaire de l'injection de 18F-FDS ou des bactéries n'est attendu sur la durée du suivi en imagerie. Les effets indésirables pourraient être liés à la pousse tumorale et à une nécrose précoce de la tumeur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par surdosage d'anesthésie gazeuse suivie d'une dislocation cervicale en vue des analyses de comptage des organes ex vivo.

Remplacement

La physiologie globale de l'animal entre en jeu dans le processus étudié (colonisation de bactéries depuis le tractus digestif vers des tumeurs). Ainsi, l'animal ne peut être remplacé dans cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience de notre client sur ces modèles murins de tumeurs et le nombre d'animaux nécessaires pour apporter une valeur statistique à l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire est réduit au maximum en sélectionnant uniquement les expérimentations essentielles.

Raffinement

Un enrichissement des cages d’hébergement sera assuré par l'ajout de briquettes de bois. Les animaux seront suivis de façon quotidienne. Ainsi tout signe d’inconfort pourra être détecté rapidement ce qui permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est classiquement utilisée pour les études en cancerologie. Son statut immunitaire permettant de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines. Les animaux seront inoculés avec une xénogreffe chez notre client à 5 semaines. Ils seront transférés par un transporteur agréé vers notre établissement à 6 semaine et seront hébergés pour une durée estimée à 4 semaines (le temps de la croissance tumorale).

54 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par gavage une molécule dérivée d'une plante, sont maintenues en cage individuelle pour mesurer leur prise alimentaire, puis mises à mort par perfusion intracardiaque d'un fixateur afin d'examiner les réseaux nerveux de l'appétit. Le porteur reconnaît que le gavage entraîne un inconfort et que l'isolement est imposé pour la mesure. Il présente cette molécule comme un futur coupe-faim et complément alimentaire contre l'obésité, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier la prise alimentaire.

Objectifs

L’obésité, qui se définie par un excès de poids en raison d'une augmentation excessif de la masse adipeuse, est connue pour augmenter la prévalence des maladies cardiovasculaires, du diabète de type 2 et de certains types de cancer. L’obésité est reconnue comme une maladie par l’organisation mondiale de la santé depuis 1997. A l’échelle mondiale, on estime à plus de 600 millions le nombre de personnes obèses et à 2,8 millions le nombre de personnes décédant chaque année de surpoids ou d’obésité. Ces chiffres ne font qu’augmenter depuis des décennies, que ce soit dans les pays développés ou dans les pays émergeants. Souvent associé à l’obésité, le diabète de type 2 ou diabète sucré est l'une des maladies dont la croissance est la plus rapide au monde. Cette pathologie métabolique se caractérise par une hyperglycémie résultant d'une anomalie de la sécrétion d'insuline, d'une résistance à l'insuline ou des deux à la fois. Depuis l'Antiquité, diverses plantes ont été utilisées à des fins médicinales dans le monde entier. Cleistocalyx operculatus est une plante largement répandue dans l’Asie du sud dont l’extrait est couramment utilisé en médecine traditionnelle. Il a été récemment montré que l’extrait de Cleistocalyx operculatus exerçait une activité anti-hyperglycémique. La 2 ', 4'-dihydroxy-6'-méthoxy-3',5'-diméthylchalcone (DMC), un composé majeur de cet extrait de plante, exerce des effets anti-tumoraux, antioxydants et anti-inflammatoires. Récemment, il a été montré que le DMC empêche le développement excessif du tissu adipeux et limite les effets toxiques de l’hyperglycémie. Synthétisé à partir de la molécule DMC naturelle, une molécule X résistante à la dégradation par le foie et donc susceptible d’avoir des effets plus marqués. Dans une première étude, nous avons déjà montré l’effet coupe faim de la molécule X (65 mg/kg de poids corporel) chez des animaux obèses. Dans ce contexte, le présent projet vise à poursuivre le travail en cours i/en étudiant l’action coupe-faim d’une molécule X d’origine végétale chez la souris obèse (ob/ob) et chez la souris non obèse (C57Bl/6), ii/ en déterminant si la molécule induit des nausées et iii/ en identifiant les réseaux neuronaux activés suite à l’administration de cette molécule. Ce travail s’inscrit dans un contexte général d’études précliniques de compléments alimentaires ciblant le traitement des troubles de la balance pondérale (diabète, obésité).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les effets de la molécule X sur le comportement alimentaire. Les résultats obtenus permettront de préciser la nature des réseaux neuronaux activés par cette molécule et ainsi déterminer si elle est capable d’affecter la prise alimentaire en agissant sur l’hypothalamus et le tronc cérébral, principales structures nerveuses impliquées dans la régulation de l’appétit. La mise en évidence d’un effet anorexigène « coupe faim » de la molécule X en ferait un bon candidat comme complément alimentaire pour le traitement des troubles de la balance pondérale.

Procédures

Les animaux recevront la molécule X ou son véhicule par gavage. Le gavage est réalisé à l’aide d’une canule d’intubation de taille adaptée, délicatement introduite dans l’œsophage jusqu’à l’estomac. L'administration par gavage étant donné le volume administré ici durera une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

Le gavage entraine un inconfort chez l’animal. L'isolement des souris pendant les périodes néccésitant une mesure individuelle de la prise alimentaire est indispensable.

Devenir

Les analyses histologiques post-mortem permettront de vérifier l'histologie des tissus prélevés afin d'écarter un effet potentiellement indésirable de la molécule. Une partie de tissus prélevés constituront un banque de tissu pour de future exploration histologique et immunohistochimique.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact de la consommation de la molécule X sur l’homéostasie énergétique et la prise alimentaire.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 54 souris mâles. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Pour la procédure 1. Pour minimiser, le nombre d’animaux, chaque animal recevra le véhicule puis les différentes doses de la molécule X, avec une période de 72h entre chaque administration. Pour la procédure 2 : Pour minimiser les tests, seule une dose de la molécule X, validée lors de la procédure 1, sera utilisée ici. Pour la procédure 3 : Pour minimiser les tests, seule une dose de la molécule X, validée lors de la procédure 1, sera utilisée ici Pour l’effectif par lot dans les procédures 1 et 2, le nombre minimum de souris nécessaires pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives dans l’évaluation de la prise alimentaire entre les lots a été établi à 6 animaux par lot compte-tenu de la variabilité des mesures. Pour la procédure 3, le nombre d’animaux par lot est de 6 et a été déterminé à partir de nos résultats obtenus au cours d’études précédentes. Ce nombre tient compte des variabilités que nous avons pu observer dans l’expression de la protéine c-Fos d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et anesthésie. La mise à mort par perfusion intracardiaque de PFA sera réalisée sous analgésie pré-opératoire et anesthésie générale. Les animaux seront habitués à la contention et au gavage. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la prise alimentaire due à la manipulation des animaux et à la contention. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour une analyse fine de la prise alimentaire de chaque souris. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque, d’une part, c’est le modèle le plus documenté dans la littérature scientifique, et d’autre part notre projet implique l’utilisation de souris génétiquement obèses permettant d’étudier l'impact de la molécule X sur la prise alimentaire. Des souris adultes de 8 semaines entreront dans chacune des procédures. Ainsi, les souris seront accueillies en hébergement à 7 semaines. Les expérimentations devront être terminées à la fin de la 15ème semaine car le profil hyperglycémique des souris obèses ob/ob tend à diminuer au-delà de cet âge.

4 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la tête provoque l'occlusion d'une artère cérébrale par injection de thrombine, suivie d'une IRM sous anesthésie et de tests comportementaux pendant deux semaines, puis d'une ouverture du thorax et d'une ponction cardiaque terminale, pour tester huit stratégies contre l'accident vasculaire cérébral à trois doses. Le porteur nomme les tests employés, neuroscore, force d'agrippement et retrait d'adhésif, et indique des déficits sensorimoteurs et des pertes d'équilibre possibles. Il affirme que la souris est le modèle de référence de l'AVC et qu'aucune méthode sans animaux n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester huit stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos huit stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC ischémique chez la souris par administration intrapéritonéale (i.p), par administration intra veineuse ou bien par voie orale (per-os), pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 3 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit moteur ainsi que du volume lésionnel.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la murine alpha-thrombine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire pour l’infusion des traitements. Une moyenne de 5 minutes est à prévoir pour cette pose. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Nous comptons un total de 10 minutes pour la prise du neuroscore, 25 à 30 minutes pour la réalisation du test de force d’agrippement puis 10 minutes pour la mise en place et la mesure de la sensibilité digitale par le test de retrait d’adhésif. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme : l’animal peut continuer à s’alimenter, s’abreuver ou encore se fabriquer un nid. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Aucune nuisances n'est attendues concernant l'administration des traitements, les test comportementaux ainsi que pour l'examen IRM.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 15. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en sous-cutanée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Une anesthésie locale de lidocaïne est appliquée (spray ou crème) dans les conduits auditifs. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection à la Chlorexidine et enfin l’application d’une dose de lidocaïne en crème. Le choix de la technique de sutures se porte sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, la concentration d’isoflurane et le débit de N2O sont ramenés à zéro, et le débit d’O2 est élevé à 1 L/min pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 5. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS et de 25g pour les C57BL6J. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit une chirurgie d'environ deux heures pour implanter une matrice d'électrodes sous le crâne, puis des enregistrements cérébraux hebdomadaires, des trains de stimulation électrique une semaine sur deux et des mesures de potentiels évoqués mensuelles, pour tester un implant biorésorbable destiné à se dégrader dans l'organisme. Le porteur indique une douleur postopératoire de 24 à 48 heures traitée par antalgiques et un stress à la nouveauté réduit par une habituation. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne convient car l'évaluation exige un "organisme complet", et retient le rat pour sa taille et sa proximité avec l'humain.

Objectifs

Actuellement, les dispositifs implantables utilisés pour l’enregistrement cérébral (électroencéphalographie corticale de surface : ECoG) pour, par exemple localiser un foyer chez les patients atteints d’épilepsie, doivent être retirés lors d’une seconde chirurgie pour limiter les réactions du système immunitaire ou le risque infectieux. Cependant, toute nouvelle chirurgie augmente les risques pour les patients et peut engendrer des complications. Afin de réduire ses aspects, en 2010, un premier dispositif électronique organique ayant la capacité de se dégrader au cours du temps après une période d’utilisation de l’ordre de 30 jours a été développé. L’objectif global du projet consiste à concevoir un dispositif basé sur de nouveaux matériaux (polymères) biocompatibles et biorésorbables, pour l’enregistrement et la stimulation des signaux cérébraux. Ce nouveau polymère conducteur est développé pour optimiser l’interface électrique entre le dispositif et les tissus biologiques et pour améliorer sa biorésorbabilité. Ces innovations offrent une très grande flexibilité et une très fine épaisseur à notre d’implant, permettant une meilleure adaptabilité de ce dernier dans l’organisme, en évitant de léser les tissus et en limitant une encapsulation qui induit une dégradation neuronale. Notre projet a pour but de développer un nouveau dispositif implantable, basé sur une matrice d’électrodes non lésionnelle pour enregistrer les signaux ECoG, afin de réaliser un suivi d’activités électrophysiologiques pendant une période de temps défini, puis permettre une élimination de ce dernier par l’organisme. Ces dispositifs peuvent être utilisés pour différentes applications comme la localisation pré chirurgicale des foyers épileptogéniques ou un suivi post opératoire de l’activité cérébrale. Des travaux de développement d’un nouveau polymère conducteur biorésorbable favorisant l’interface entre les tissus et l’électronique ont été réalisés. L’intégration de ce dernier au sein d’une matrice d’électrodes biorésorbables a été réalisée ainsi que des tests in vitro de biocompatibilité afin de permettre une implantation in vivo. Notre étude in vivo, vise à évaluer i) l’avantage de l’intégration de ce polymère au niveau de l’interface pour réaliser un suivi électrophysiologique sur plusieurs semaines ii) la bonne dégradation et l’assimilation par l’organisme de la matrice.

Bénéfices attendus

Le bénéfice majeur de notre projet sera de valider un dispositif d’enregistrement ECoG implantable et biodégradable. Ce nouveau type de dispositif permettrait : 1) de ne pas léser les tissus de par son épaisseur et sa flexibilité 2) de ne pas être encapsulé par l’organisme et donc de ne pas induire de dommage neuronal 3) de ne pas devoir retirer le dispositif, lors d’une seconde chirurgie qui est risques de complications et d’infection

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie qui sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie sur une durée maximale estimée de 2 heures. Une fois par semaine, des mesures d’impédance de chacune des électrodes et l’enregistrement de signaux ECoG seront réalisés sur une durée de 30 min environ. En complément de ces mesures, une fois toutes les 2 semaines pendant 10 à 15 min, des trains de stimulation bipolaire seront appliquées au niveau de certaines électrodes pour évaluer la stabilité des électrodes et leurs influences sur la qualité du contact entre les tissus et l’électrode. Au préalable, les animaux auront eu une période d’habituation à la procédure d’enregistrement sur 1 semaine afin d’éviter l’anesthésie des animaux et assurer leurs bien-être. En revanche, si lors de cette période nous notons des comportements permanents stressants chez les animaux, une légère anesthésie gazeuse sera mise en place lors de la connexion de l’animal à l’appareil d’enregistrement et de stimulation afin de sécuriser les dispositifs implantés et d’assurer le bien-être des animaux. Une fois par mois une mesure de potentiel évoqué sera effectuée. Pour cela un potentiel évoqué visuel (PEV) ou un potentiel évoqué somesthésique (PES) sera induit et un enregistrement des signaux ECoG de chacune des électrodes sera réalisé en parallèle. La durée totale de chaque test est de respectivement 2 à 3 minutes et 150 secondes. Tout est mis en œuvre par les expérimentateurs pour limiter la douleur de l’animal.

Impact sur les animaux

Bien que tout soit fait par les expérimentateurs pour limiter les effets indésirables et l’inconfort des animaux, certains sont prévus et des méthodes pour les atténuer seront mises en place : Stress de l’animal face à la nouveauté, qui est réduit puis éteint grâce à l’habituation. Douleur transitoire post opératoire de 24 à 48h, traitée par l’injection d’antalgiques.

Devenir

Tous les animaux de cette procédure sont concernés, soit 12 rats au maximum. Les animaux seront euthanasiés selon un protocole autorisé et approprié, afin de prélever les pièces anatomiques pour analyses histologiques et/ou protéomiques pour compléter scientifiquement l’étude.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. Nous devons réaliser des enregistrements ECoG, valider le fonctionnement des électrodes et évaluer en parallèle la biodégradabilité du dispositif. Ce qui nécessite un organisme complet et complexe sur le plan biologique

Réduction

Les résultats attendus ne pouvant être quantifiables numériquement, un test statistique ne peut être utilisé pour déterminer le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux a été réduit de 50% en réalisant l’implantation sur un seul hémisphère, permettant que chaque animal soit son propre contrôle et ainsi ne pas utiliser d’animaux pour constituer un groupe contrôle. Le nombre d’animaux pourra être aussi encore être réduit jusqu’à 50% dans la procédure si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations).

Raffinement

Les rats seront hébergés à l’animalerie en groupes sociaux, dans un environnement enrichi adapté à leur espèce. De plus, tous les enregistrements réalisés sur les animaux sont indolores et seront effectuées par des personnes expérimentées et formées. Les animaux seront entrainés et habitués à la manipulation et aux conditions d’expérimentation, afin d’assurer leur bien-être. Lors de la chirurgie sous anesthésie générale et analgésie, les rats seront placés sur un tapis chauffant pour maintenir leur température et un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur inconfort. Des soins post opératoires adéquates seront adaptés pour chaque animal. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et tout sera mis en œuvre pour que les animaux aient un niveau d’inconfort aussi limité que possible. En cas d’effets inattendus, de perte importante de poids ou d’observation d’un phénomène douloureux, le vétérinaire en charge du bien-être des animaux sera immédiatement alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés ou de décider de l’interruption de l’expérimentation.

Choix des espèces

Compte tenu des objectifs de l’étude, les expériences peuvent être réalisées chez le rongeur. Du fait de sa taille et de sa proximité phylogénétique avec l’Homme, nous utiliserons le rat. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux.

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises quatorze semaines à un régime riche en graisses, reçoivent des composés libérant du monoxyde de carbone puis, pour une partie, une transplantation de microbiote fécal par gavage suivie de quatorze semaines supplémentaires de ce régime, avec des prélèvements de sang à la queue sans anesthésie. Le porteur indique que tous les animaux sont mis à mort pour prélever leurs organes. Il décrit avoir d'abord testé vingt composés sur des cellules en culture pour n'en retenir que trois, et attend de l'étude des informations sur l'intérêt thérapeutique de la transplantation fécale.

Objectifs

Les altérations de la composition et de la fonction du microbiote intestinal (dysbiose) contribuent fortement à l'obésité et aux morbidités associées. Des découvertes récentes nous indique que l’administration du monoxyde de carbone (CO) réduit la prise de poids et les dérèglements métaboliques chez les souris nourries avec un régime riche en graisses. C'est pourquoi, nous souhaitons tester l’hypothèse que le CO offre ces bénéfices sur le microbiote intestinale pendant l'obésité. Pour ce faire, les souris seront d'abord nourries avec un régime riche en graisses (HFD) pendant 14 semaines et traitées avec des composés capables de libérer du CO. Par la suite, des échantillons fécaux seront prélevés de ce groupe et transplantés par gavage oral dans un deuxième groupe de souris qui seront soumises à HFD pendant 14 semaines supplémentaires. Ce projet mènera à différents objectifs. Premièrement, celuir d'évaluer l'action thérapeutique directe du CO en reprogrammant le microbiote vers un phénotype sain. Dans un second temps, cela nous permettra de déterminer si la transplantation de microbiote fécal (TMF) reprogrammé par le traitement au CO empêche le dysfonctionnement métabolique lié à l'obésité.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques des composés libérant du CO sur le microbiote intestinal. Cette étude nous fournira des informations nouvelles et importantes concernant l'applicabilité thérapeutique de la transplantation fécal du microbiote précédemment exposé au CO sur le dysfonctionnement métabolique pendant l'obésité.

Procédures

Les souris recevant du TMF (nombre total d'animaux = 80) seront soumises à un prélèvement de sang sans anesthésie au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive.

Impact sur les animaux

Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé. Cette méthode est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. De même, la transplantation fécale du microbiote est réalisée par gavage oral, une procédure bien tolérée par les animaux. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.

Devenir

Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles expérimentaux pour la préparation du microbiote intestinal traité avec des composés libérant du CO par gavage oral, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés afin de déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture, remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Ces 20 composés avaient tous la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse. Cependant, seulement 3 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique face aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont alors permis de sélectionner les 3 meilleurs, tout en prenant en compte leur structure chimique diversifiée.

Réduction

Pour chacun des groupes étudiés nous utiliserons 10 souris en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. De plus, l'analyse de la composition du microbiote par séquençage de l'ADN nécessite un certain nombre d'échantillons pour mieux homogénéiser les données. Dans nos protocoles, nous pourrons réduire le nombre de souris car les mêmes fèces obtenues à partir de souris HFD ou HFD+composés libérant du CO seront utilisées pour la transplantation fécale de plusieur animaux. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Suite à l’obtention des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Deux types de tests seront utilisés en fonction des groupes comparés : le test Student si nous comparons deux groupes et le test Anova si nous comparons plus de deux groupes. Ce dernier sera suivi d’un post test de type Bonferroni. Les résultats seront considérés significatifs si la P-valeur est inférieure à 0.05.

Raffinement

En optimisant les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons essayé autant que possible d'utiliser des approches qui ne sont pas trop invasives et ainsi de minimiser la douleur, mais aussi la souffrance et la détresse que peuvent ressentir les animaux. Nous avons également sélectionné un nombre limité de composés sur la base de données in vitro tout en n'utilisant qu'une seule dose de traitement pour chaque composé. Nous nous assurerons que le logement et l'élevage seront effectués en prenant en compte le bien-être des animaux. Nous utiliserons des anesthésiques appropriés, et, en cas de nécessité, des analgésiques efficaces afin de minimiser la douleur des animaux. Les souris seront logées à 3 par cage, en nettoyant la cage une fois par semaine et en s'assurant qu'elles ont accès à de la nourriture et de l'eau ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle souris C57BL/6 est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). La transplantation fécale par gavage oral est également couramment utilisée dans ce modèle pour évaluer l'effet du microbiote sur l'obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Des souris de 8 semaines seront utilisées pour démarrer nos protocoles car nous devons évaluer l'effet des composés libérant du CO sur le microbiote et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

25 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une plaie est faite dans le pharynx puis suturée et recouverte d'un biomatériau, pour tester un dispositif censé prévenir les fistules salivaires après ablation du larynx chez l'Homme. Le porteur liste comme risques un hématome, une infection, une fistule, des douleurs à l'alimentation et une dégradation de l'état général. Il indique que la mise à mort est nécessaire pour l'analyse histologique et qu'aucun modèle in vitro ou in silico de fistule salivaire n'existe.

Objectifs

Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après une chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale). Cette chirurgie consiste en l'ablation du larynx, généralement pratiquée pour traiter un cancer. La fistule salivaire est une complication fréquente de cette chirurgie, et elle est associée à de fréquentes complications, un allongement de la durée d'hospitalisation, des chirurgies répétées, des dépenses de soins accrues, une qualité de vie moindre, voire un décès. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux et 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design d'un biomatériau. Le projet présenté ici consiste à évaluer le biomatériau sur chirurgie du cou / de la gorge chez le petit animal (n = 25 rats). L'objectif de ce projet est l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration).

Bénéfices attendus

Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale) chez l'homme. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution du taux de fistule salivaire et des complications suscitées qui en découlent, et donc de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale consistant à effectuer une plaie dans le pharynx (situé dans le cou / dans la gorge), la suturer et couvrir la suture par le biomatériau. Chirurgie durant 30 minutes environ. Réalisation au cours de la même anesthésie d'un prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), fistule salivaire (pharyngostome), douleurs à l'alimentation, impact sur le comportement et déterioration de l'état général.

Devenir

Mise à mort nécessaire car l'objectif primaire de l'étude concerne l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration), requérant une analyse histologique (autopsie).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier la bioadhésion et la biocompatibilité de ce biomatériau nouveau dans une étude préalable sur modèle animal. Le dispositif médical n'a jamais été testé in vivo. Les analyses in vitro ont été réalisées, un modèle in silico n'est pas envisageable pour ce projet. De plus, aucun modèle de fistule salivaire in silico ou in vitro n'existe ou n'est envisageable à l'heure actuelle, du fait d'une grande complexité anatomique, histologique et microbiologique.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Des tests in vitro ont été réalisés au préalables afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. 25 animaux sont nécessaires pour atteindre l'objectif de l'étude selon le design suivant : (risque alpha = 10%, 1-beta=90%) et (p0=70%; p1=90%).

Raffinement

Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur. Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès ad libitum à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée à la règlementation à savoir un compartiment minimal de 800cm² par animal. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car une analyse de l'intégration du biomatériau au microscope est nécessaire (autopsie).

Choix des espèces

Rats Whistar mâles sexuellement matures pour plus de robustesse et pour faciliter la chirurgie (pharynx plus grand). Modèle animal de pharyngotomie simple, fiable et robuste, déjà décrit dans la littérature.

424 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées en vie pour de futures expériences. Chaque souris reçoit une puce RFID implantée sous la peau par une courte chirurgie sous anesthésie, avant un suivi comportemental automatisé en groupes de quatre pendant un à trois jours, par caméra de profondeur et apprentissage automatique. Le porteur indique que les animaux seront réutilisés ensuite pour de l'électrophysiologie, de la biochimie et de l'anatomie, procédures qui supposent leur mise à mort. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'analyser le comportement d'un organisme dans son environnement social.

Objectifs

Les études de neuroscience utilisent des modèles animaux pour étudier l'impact de facteurs environnementaux ou de mutations génétiques sur des traits complexes tels que la prise de décision et les interactions sociales. Nous voulons implanter une méthode d'analyse en temps réel du comportement de souris hébergées par groupes de quatre au maximum sur plusieurs jours et dans des environnements enrichis. Cette méthode combine la vision par ordinateur grâce à une caméra infrarouge à détection de profondeur, l'apprentissage automatique pour l'identification des animaux et des postures, et l'identification par radiofréquence pour contrôler la qualité du suivi des souris. Elle suit plusieurs souris avec précision, extrait une liste de traits comportementaux des individus et des groupes de souris, et fournit un profil phénotypique pour chaque animal.

Bénéfices attendus

Les souris présentent une organisation et un développement des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Les souris ont un riche répertoire comportemental ; notamment en ce qui concerne l’interaction social. Il n’existe pas de méthodes alternatives à l’analyse du comportement animal, permettant d’appréhender l’ensemble d’un organisme au sein de son environnement social. À ce jour, il reste donc encore indispensable d’utiliser des modèles animaux (en l’occurrence les souris des deux sexes) pour générer des connaissances valides en recherche fondamentale, dans le domaine du comportement social. Ainsi les bénéfices attendus du rpjet

Procédures

Afin d'analysee en temps réel du comportement de souris hébergées par groupes de quatre au maximum sur plusieurs jours et dans des environnements enrichis, tout les animaux sont implanaté en sous-cutannée par une puces RFID permettant l'identification par radiofréquence pour contrôler la qualité du suivi des souris. Donc toutes les souris seront soumises à une courte chirurgie sous anesthésie. Pour effectuer le suivi comportemental automatisée et sans manipulation de plusieurs souris avec précision et créer un profil phénotypique pour chaque animal, toutes les souris seront hébergées dans le système LMT par groupe de 4, sans manipulation pendant 1 à 3 jours. Au terme de la cession expérimentale les souris seront replacées dans leur cage habituelles, dans changer les groupe social. Les nuisances attendues ont pour origine la courte chirurgie (sous anesthésie) nécessaire à l'implantation, sous-cutanée des puces RFID. Compte-tenu de la brieveté de l'intervention et des soins post-op (analgésie cutanée et surveillance des souris), peu d'effets indésirables sont à craindre.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ont pour origine la courte chirurgie (sous anesthésie) nécessaire à l'implantation, sous-cutanée des puces RFID. Compte-tenu de la brieveté de l'intervention et des soins post-op (analgésie cutanée et surveillance des souris), peu d'effets indésirables sont à craindre.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux (424) sont gardés en vie, dans leurs cages habituelles. Ils pourront être réutilisés ultérieurement pour des expériences d'électrophysiologie, de biochimie et d'anatomie afin de réduire le nombre d'animaux expérimentaux utilisés par l'équipe

Remplacement

Les souris présentent une organisation des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles souris génétiquement modifiés qui modélisent de manière adéquate les pathologies neuropsychiatriques que nous étudions.

Réduction

Réduire, Raffiner : Mâles et femelles pour rendre compte au mieux des différences entre les deux sexes et limiter le nombre d’animaux utilisés. Outre l’intérêt scientifique et translationnelle de l’étude des animaux des deux sexes, la communauté européenne recommande et le NIH impose l’étude des deux sexes. C’est également un moyen de raffiner nos expériences et de réduire le nombre d’animaux. Si aucune différence statistique n’est observée entre mâles et femelles les deux sexes seront regroupés et le nombre d’animaux utilisé réduit. De plus la méthode LMT est validée chez les souris, les articles publiés avec ce modèle ont utilisé les souris : l’existence de données publiées permettra de limiter les animaux nécessaires et nos résultats seront partagés sur la data base souris LMT.

Raffinement

Réduire, Raffiner : Mâles et femelles pour rendre compte au mieux des différences entre les deux sexes et limiter le nombre d’animaux utilisés. Outre l’intérêt scientifique et translationnelle de l’étude des animaux des deux sexes, la communauté européenne recommande et le NIH impose l’étude des deux sexes. C’est également un moyen de raffiner nos expériences et de réduire le nombre d’animaux. Si aucune différence statistique n’est observée entre mâles et femelles les deux sexes seront regroupés et le nombre d’animaux utilisé réduit. De plus la méthode LMT est validée chez les souris, les articles publiés avec ce modèle ont utilisé les souris : l’existence de données publiées permettra de limiter les animaux nécessaires et nos résultats seront partagés sur la data base souris LMT.

Choix des espèces

Les souris présentent une organisation des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles souris génétiquement modifiés qui modélisent de manière adéquate les pathologies neuropsychiatriques que nous étudions. Les implantataions de puces RFID auront lieu au moins une semaine avant la première période d'enregistrement. Ainsi les implantations eront réalisées entre P25 et P28. La première session d'enregistrement de 5 jours sera effectuée entre P35 et P40, la seconde session d'enregistrement de 5 jours sera effectuée à P100, au stade adulte.