Recherche fondamentale

183 poissons cichlidés vont être utilisés, gardés vivants et replacés dans les aquariums d'élevage à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. De jeunes alevins sont exposés pendant trois à six mois à des sons de bateaux à moteur, puis soumis à un test de conditionnement aversif où chaque individu reçoit un choc électrique associé à une couleur, pour mesurer l'effet du bruit sur leurs capacités cognitives et leur mémoire. Le porteur indique que ces manipulations pourraient engendrer un stress et prévoit d'arrêter l'expérience en cas de comportement anormal. Sur le remplacement, il affirme en une phrase que l'apprentissage suivi de l'observation comportementale fait que l'animal ne peut pas être remplacé.

Objectifs

Élucider comment les contraintes environnementales et sociales façonnent l'évolution de la communication chez les vertébrés ainsi que leur capacité à produire et à percevoir des signaux sensoriels est un défi majeur de la science moderne. Pour aborder cette question, nous développons au sein du laboratoire ,une approche expérimentale et pluridisciplinaire sur une espèce de poisson Cichlidé (Maylandia zebra) endémique du lac Malawi, mêlant neurophysiologie et éthologie. Cette espèce, étudiée depuis plusieurs années au sein de notre laboratoire, utilise plusieurs canaux sensoriels pour communiquer, dont le canal acoustique, et possède des comportements très stéréotypés dans différents contextes comme par exemple la défense du territoire. De plus, l’incubation des œufs, jusqu’au stade alevin, est réalisée dans la bouche de la mère pendant 21 jours (mouthbreeding), ce qui permet, en laboratoire, un contrôle des naissances. La réalisation de ce projet est soutenue via le financement d’une thèse de 4 ans intitulée « Contrôle multisensoriel du comportement chez les poissons au cours du développement » en lien avec cette thématique. Les sons anthropogéniques, c’est-à-dire liés à l’activité humaine, sont aujourd’hui omniprésents et aucun écosystème n’est épargné. Si depuis ces 5 dernières années, plusieurs études ont été réalisées sur les réponses physiologiques et comportementales des poissons au bruit, les effets sur le développement du comportement, des capacités cognitives et des fonctions sensorielles (système auditif par exemple) sont encore mal connus. Ainsi, l’objectif du projet présenté ici est de tester les capacités cognitives et de mémorisation de jeunes alevins de poissons cichlidés soumis ou non à des sons de bateaux à moteur à l’aide de tests de conditionnement aversif Pavlovien (Pavlovian Fear Conditionning Tests).

Bénéfices attendus

Ces dernières années les études sur la polution sonore se sont largement développées et nous savons qu'il existe des effets sur les comportements, la communication, la physiologie des populations aquatiques (poisson, invertébrés..). Toutefois, les études plus fines au niveau de l'individu et notamment au niveau des capacités cognitives ou de mémorisation des poissons sont rares et commencent à émerger. Cette étude nous permettra d'aller plus loin dans la recherche des impacts de l'activité humaine sur la faune aquatique.

Procédures

Aucun prélèvement et aucune procédure chirurgicale ne sont prévus. La procédure 1 aura une durée comprise entre 3 et 6 mois. La procédure 2 se déroule de la façon suivante : L’expérimentation consiste en 3 phases principales: 1) le poisson nage librement dans le bac avec un fond de couleur donnée (Gris ou vert) pendant 5 minutes, 2) l’individu reçoit un faible choc électrique (9v DC de 80ms), le poisson associe alors la sensation désagréable du choc électrique à la couleur, 3) les 2 couleurs sont placées sur le fond et le poisson se déplace librement pendant 1 minutes. Donc en totalité cette expérimentation dure 7minutes mais la procédure 2 proprement dite dure 80 millisecondes.

Impact sur les animaux

Ces manipulations pourraient engendrer un stress : le comportement des animaux sera suivi (et enregistré) pendant toute la durée de l'expériementation. Si un comportement anormal est observé l'expérience sera immédiatement stoppée.

Devenir

A la fin de la procédure 1 (soumission à un environement bruité pendant 3 mois par groupe de 10), les capacités cognitives de chaque individu seront testées individuellement dans la procédure 2 (Tests de conditionnement aversif Pavlovien). Tous les poissons seront gardés en vie. A la fin des tests cognitifs (Procédure 2), les animaux seront replacés dans des aquariums dédiés, en respectantleur groupe d'origine, dans la salle d'élevage du laboratoire.

Remplacement

Ces expériences reposent sur des techniques d'apprentissage suivi de l'observation de séquences comportementales : l'animal ne peut pas être remplacé

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre de réplicats (3) afin d'avoir des résultats statistiquement exploitables et recevables. Chaque réplicat correspond à une ponte d'environ 20 individus qui seront placés dans 2 conditions environnementales différentes (bruitée et non bruité). Ainsi, au total, 60 poissons seront testés par conditions d'incubation.

Raffinement

Les aquariums seront enrichis avec du sable et des abris permettant ainsi les comportements . Les densités utilisées dans les aquariums respecteront les règles sanitaires. Enfin, les conditions physico-chimiques et lumineuses se rapprocheront au mieux de l'environnement dans le milieu naturel.

Choix des espèces

Maylandia zebra est un poisson cichlidé social, grégaire présentant une forte hiérachie. En contexte de défense du territoire et de parade nuptiale, ce poisson communique via les canaux visuels, acoustique et olfactif, ce qui en fait un modèle de choix pour l'étude des interactions sociales et de la communication multimodale. De plus, l'incubation des oeufs se fait dans la bouche de la femelle, ce qui facilite l'étude de l'effet de paramètres environnementaux au cours du développement embryonnaire.

8 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles reçoivent des cellules T humaines et des cellules tumorales, avec une à deux injections ou prélèvements par semaine, pour optimiser l'efficacité de ces cellules contre le lymphome. Le porteur indique une perte de poids possible et l'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Il affirme que cette analyse de cellules humaines ne peut se faire qu'in vivo, sur un modèle murin très immunodéprimé.

Objectifs

Le traitement des cancers des cellules du sang représente un enjeu majeur et dans ce contexte, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer ont récemment été développées en utilisant notre système de défense pour cibler et éliminer les tumeurs. Notamment, des immunothérapies basées sur l’injection de cellules immunitaires spécifiques de protéines tumorales, comme par exemple les approches utilisant des cellules T modifiées pour reconnaitre spécifiquement une tumeur, ont démontré leur potentiel thérapeutique, et sont maintenant approuvées en clinique pour certaines applications. Cependant des cas de résistances/rechutes pour ces patients restent trop nombreux et de nombreuses questions demeurent pour en comprendre les raisons et en conséquence, pouvoir optimiser la persistance et la réactivité des cellules T greffées chez ces patients. Dans ce projet, nous proposons de déterminer dans un modèle murin adapté : 1) l'efficacité anti-tumorales de cellules T humaines générées à partir d’échantillons de patients atteints de lymphome 2) de quelle manière le processus de préparation des cellules T et la nature de la tumeur, affectent le devenir et l’efficacité des cellules T greffées. Les résultats obtenus pourraient permettre une amélioration de l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de notre projet sont tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une réponse anti-tumorale efficace d’une population de cellules de notre système immunitaire, les cellules T. D’autre part, nous espérons que nos résultats auront pour conséquence l’amélioration dans un premier temps du traitement des lymphomes mais également, à plus long terme, d’autres types de cancers. Cette problématique reste en effet une problématique majeure puisque le traitement des cancers des cellules sanguines en général, et du lymphome en particulier, représente toujours un enjeu de santé majeur (plus de 5000 nouveaux cas/an dont 1/3 de cas réfractaires aux traitements de premières lignes). Dans ce contexte, comme indiqué ci-dessus, le développement de nouvelles stratégies anti-tumorales, basées sur les propriétés du système immunitaire pour cibler et éliminer les tumeurs, a permis d’améliorer les traitements contre le cancer et notamment les hémopathies. Ainsi, les traitements basés sur l’injection de cellules T anti-tumorales sont maintenant approuvés en clinique pour le traitement de différents cancers hématologiques tels que les leucémies ou les lymphomes. Toutefois, malgré des résultats spectaculaires, des formes réfractaires à cette approche persistent. Différentes explications peuvent être invoquées comme une faible/absence d’expansion des cellules T anti-tumorales après infusion, un défaut de persistance ou encore une altération de leur fonctionnalité. Ainsi, il est crucial de déterminer les causes de ces échecs afin d’optimiser l’efficacité de ces nouvelles thérapies pour cet enjeu majeur de santé publique. Ce projet permettra ainsi comme indiqué précédemment d’accroître nos connaissances sur les paramètres pouvant impacter l’efficacité des cellules T anti-tumorales et ainsi, identifier de nouvelles pistes pour optimiser cette approche thérapeutique prometteuse.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'injections ou prélèvements pour lesquelles la douleur est faible à modérée et ne requièrent pas plus que quelques minutes par animal. Par souci du bien être animal et en fonction du type d'injection, l'intervention sera réalisée sous anesthésie ou contention appropriée de l'animal. En moyenne, un animal subira 1 à 2 injections ou prélèvements par semaine au cours d’une expérience.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental mis en place afin de répondre à nos objectifs peut induire une perte de poids transitoire chez l’animal. Les animaux seront observés et suivis régulièrement afin de détecter l’apparition de tout signe de douleur détaillée dans une fiche de suivi clinique (perte de poids, altération du comportement, de la qualité du poil, de la mobilité, …). En cas de souffrance de l'animal, l'expérimentation sera arrêtée.

Devenir

La totalité des animaux impliqués dans cette demande sera mise à mort en fin d'expérimentation afin de prélever les organes lymphoïdes et réaliser des analyses par cytométrie en flux et microscopie.

Remplacement

La caractérisation des effets anti-tumoraux des cellules T de patients modifiées ex vivo en parallèle du suivi du développement tumoral ne peut être abordé à ce stade qu’in vivo. Il n’existe pas d’approches in vitro ou in silico qui permettent de s’en affranchir. Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence de tumeurs. Toutefois, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront, dans une première phase, testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser, le nombre de conditions testées in vivo.

Réduction

Cette étude est basée sur les données de la littérature et l’expertise de nos collaborateurs dans la réalisation d’expériences comparables. Par ailleurs, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront dans une première phase testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser le nombre de conditions qui seront ensuite testées in vivo. Les modèles tumoraux utilisés dans cette étude permettent un suivi facilité du développement tumoral par bioluminescence et une limitation du nombre d’animaux utilisés. De plus, nous avons évalué en fonction des données connues, du degré d’hétérogénéité de la pathologie et de la prise des greffes, que le nombre d’animaux par groupe expérimental (n=8) permettait d’atteindre une puissance statistique suffisante. Les expériences proposées sont décrites en deux phases ce qui permettra de sélectionner et limiter les conditions à tester dans la deuxième phase et ajuster, si nécessaire, le nombre d’animaux requis. Par ailleurs, mâles et femelles pourront être utilisés dans ce projet afin d’optimiser au maximum l’utilisation des animaux. Enfin, les données obtenues seront systématiquement évaluées au moyen de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Durant les expériences, les animaux seront suivis quotidiennement par les zootechniciens et/ou chercheurs. Pour leur bien être et réduire le plus possible souffrance et angoisse, les animaux seront maintenus systématiquement à plusieurs par cage avec un enrichissement suffisant pour leur permettre de construire des nids et ainsi améliorer leur bien être. Afin d'évaluer la souffrance des animaux en expérimentation, la qualité du poil, la mobilité, la posture et le poids des souris seront monitorés (en utilisant une grille d'évaluation clinique). Une attention toute particulière sera portée à la perte de poids : ainsi, le poids des animaux sera mesuré régulièrement et un peu de nourriture humidifiée (et/ou substitut gélifié) sera déposé si besoin directement dans la cage afin d’éviter aux souris d’aller chercher en hauteur la nourriture et l’eau. L’expérimentation sera arrêtée immédiatement si un état de souffrance est détecté chez les animaux.

Choix des espèces

Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence ou en absence de tumeurs. Ces questions ne peuvent pas être abordées à l’heure actuelle au moyen de méthodes alternatives in vitro ou in silico, et demandent ainsi de faire appel à des modèles animaux, murins dans le cas présent, en raison des grandes similitudes du système immunitaire murin et humain. Par ailleurs, pour cette étude faisant appel au transfert adoptif de cellules T humaines, seul un modèle murin fortement immunodéprimé peut être utilisé. Dans cette optique, des animaux adultes males et femelles (agés de 8-15 semaines) seront utilisés pour les expérimentations proposées.

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou un carcinogène associé à un produit inflammatoire dans l'eau de boisson pour déclencher un cancer du côlon, puis du tamoxifène, avant leur mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les tumeurs. Le porteur indique que l'induction du cancer colorectal peut provoquer prolapsus et perte de poids, et affirme que seul l'animal permet une approche intégrée.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.

303 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de lésion du cerveau par injection d'une toxine et la pose d'un cadre métallique sur le crâne, puis des séances d'imagerie et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, pour étudier la connectivité cérébrale dans deux modèles de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que la chirurgie de lésion réduit la motivation à se nourrir pendant une semaine environ. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit la complexité du cerveau, ce qui rend selon lui le modèle animal "indispensable".

Objectifs

La maladie de Parkinson touche jusqu'à 4% des personnes âgées 65 ans ou plus et est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue. Elle est causée par une perte de neurones dopaminergiques entraînant des symptômes moteurs et non-moteurs. La reconstitution des niveaux normaux de dopamine via l’administration d'un médicament est le traitement le plus courant de la maladie de Parkinson. Le médicament atténue de nombreux symptômes, mais pas tous, induit des mouvements musculaires incontrôlables, avec un taux d'incidence rapporté de jusqu' à 80%, après 5 à 10 ans de traitement chronique. La physiopathologie de la maladie de Parkinson et de ces mouvements incontrôlables induits par le médicament n'est pas entièrement comprise, mais des dérèglements structurels et fonctionnels des réseaux neuronaux cortico-sous-corticaux et des modifications du réseau et de la connectivité du cerveau ont été observés. Les techniques de neuro-imagerie fournissent des informations importantes sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson, les mécanismes compensatoires potentiels et les effets liés au traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer, chez la souris, si la connectivité fonctionnelle des réseaux neuronaux est modifiée en fonction de l’état de dépletion de dopamine et de sa reconstitution. Nous utiliserons une technique d'imagerie de l'échographie rapide dans un modèle murin de lésion et un modèle murin génétique de maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier une modification de connectivité fonctionelle des réseaux neuronaux et des connectivité fonctionelles dans deux modèles différents de souris de la maladie de Parkinson. Cette technique sera hautement transposable puisqu'elle mésure le même paramètre physiologique, c'est-à-dire les changements de la perfusion cérébrale, que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle clinique et puisqu'elle produira des profils de réseau en corrélation avec la progression de la maladie et la réponse au traitement. Bien que le projet proposé soit une première étape pour déchiffrer les changements du connectome dans le cerveau de souris malades par rapport au cerveau de souris saines, nous envisageons que l'imagerie pourrait être utilisée dans le développement de médicaments, comme prédicteur de l'efficacité des médicaments et pour cribler de nouveaux candidats médicaments dans des modèles précliniques.

Procédures

Certaines souris subiront une chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue et de preparation pour imagerie. Une partie des animaux sera soumise à des études d'imagerie fonctionnelle après une injection aiguë ou chronique de médicaments dopaminergiques. D'autres animaux subiront une évaluation comportementale par plusieurs tests comportmentaux. En tout, 240 souris subiront une chirurgie d'une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

Certaines souris subiront une chirurgie : le montage d' un cadre metallique sur le crane, et d'autres subiront une opération supplémentaire : la chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue. La chirurgie des lésions rendra les animaux moins motivés de se nourrir pendant environ une semaine.

Devenir

Tous les animaux seront mise à mort pour des analyses de tissus post mortem. Pour la fixation du cerveau, une perfusion intracardiaque avec une solution de paraformaldehyde sera utilisée et la procédure sera realisée sous une anesthésie générale profonde. Les tissus sont prélevés sur animaux morts.

Remplacement

Remplacement : A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet. L’analyse de la connectivité sur animal éveillé n’a été mise au point à ce jour que chez la souris.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Nous estimons que N=12 animaux sont suffisants par groupe. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Raffinement : Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesia générale. Les séances d'imagerie seront réalisées sur animal anesthesie et vigile dont la tête sera immobilisée mais dont le mouvement des pattes ne sera pas entravé ; des séances d'habituation seront effectuées au préalable. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur,souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

Cette étude vise à étudier la connectivité cérébrale. Le cerveau est un organe dont le fonctionnement est extrêmement complexe, qu’on ne sait pas encore modéliser dans une boite de pétri ou sur ordinateur. Donc, nous devons faire appel à des modèles animaux. Notre choix s’est porté sur la souris car l’étude d’imagerie par ultrasons chez l’animal éveillé a été mise au point seulement dans cette espèce. Les animaux ayant atteint un poids corporel de 30 gr (âgés d'environ 4-6 mois) seront soumis à une chirurgie d'injection intracrânienne de 6-OHDA, les tests comportementaux auront lieu 3 semaines après, pour toutes les groupes expérimentaux.

2 030 poissons de rivière vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés vivants dans leur habitat. Ils sont capturés par pêche à l'électricité puis marqués par une puce implantée sous anesthésie, pour mesurer si une rampe à macrorugosités leur permet de franchir un obstacle. Le porteur indique que la pêche électrique peut rarement provoquer des blessures et que le marquage laisse une petite plaie à cicatriser. Une partie des poissons peut être déplacée de l'amont vers l'aval pour les forcer à remonter le cours d'eau.

Objectifs

Suite à la Loi sur l’Eau et les Milieux Aquatiques de 2006, de nouveaux classements des cours d’eau, prenant en compte la restauration de la continuité écologique, sont parus en 2012-2013. Sur les cours d’eau classés en liste 2, les aménagements qui font obstacle à la continuité écologique doivent être équipés ou gérés de manière à rétablir le franchissement des poissons (par exemple par effacement de l’ouvrage ou construction d’une passe à poissons). Parmi les différents types de passes à poissons, les rampes à macrorugosités (rampe avec des plots verticaux, organisés en quinconce qui offrent une importante diversité écoulement) constituent une solution technique intéressante en termes de franchissabilité par toutes les espèces de poissons. Ces types de dispositifs sont régulièrement mises en œuvre en France depuis 2010. Des études hydrauliques en laboratoire ont permis d’établir les critères de conception de ces rampes mais les retours d’expérience in situ sur l’efficacité biologique de ces dispositifs sont encore peu nombreux. Une première étude a été conduite récemment sur une rampe avec une pente douce (4%). L’objectif de ce projet est de mener une deuxième étude pour quantifier l’efficacité d’une rampe à macrorugosités plus inclinée (5.5%), avec un focus sur les espèces encore peu étudiées jusqu’à présent, dont les capacités de nage sont plus réduites (goujon, spirlin, chevaine, etc.). L’étude permet également d’acquérir des connaissances sur les fractions d’individus migrant selon les espèces et sur leurs conditions de migration (période, débit, température, …). Le suivi des déplacements des poissons, en approche et sur la rampe à macrorugosité, se fera par le marquage des individus à l'aide des marques de type PIT (Passive Integrative Transponder) et leur détection aux antennes RFID (Radio Frequency Identification) installées sur le site. Les poissons seront capturés dans le cours d’eau par pêche à l'électricité. Deux stratégies de pêche/marquage sont prévues : 1/ les poissons seront prélevés tout d’abord dans le tronçon entre 300 et 900 m à l’aval de la rampe, marqués et relâchés au même endroit. 2/ en cas de besoin (si la stratégie 1 n’apporte pas de résultats recherchés suite à la première année d’étude), les poissons seront prélevés dans le tronçon à l’amont de la rampe à macrorugosités, marqués puis relâchés à l’aval de la rampe. Cette translocation force les poissons à remonter rapidement le cours d’eau pour retrouver leur habitat d’origine.

Bénéfices attendus

La construction de la passe à macrorugosités peut être préconisée par les autorités administratives de l’Etat aux maîtres d’ouvrages propriétaires des obstacles pour restaurer la continuité écologique. Ce projet, de portée nationale, s’inscrit dans une démarche de validation de l’efficacité de ces prescriptions techniques (type d’équipement et son dimensionnement).

Procédures

Le projet nécessite de capturer les poissons par pêche à l’électricité (jugée de sévérité légère, temps d'exposition est inférieur à 5 secondes) et de les marquer par PIT tags (Passive Integrative Transponder, procédure chirurgicale de sévérité modérée d'une durée inférieure à 15-20 secondes) sous anesthésie (d'une durée d'environ 10 minutes, de l'induction jusqu'au réveil complet), par des équipes formées et expérimentées.

Impact sur les animaux

1/ La pêche à l’électricité est la technique de capture la plus efficace pour obtenir rapidement le nombre de poissons nécessaire tout en réduisant au maximum les dommages sur les individus. L’immobilisation des individus est de très courte durée (quelques secondes). Les effets indésirables plus graves (blessures internes ou externe) peuvent subvenir mais sont rares, et tout est mis en œuvre pour les minimiser (réglage de l’engin de pêche, retrait rapide des individus hors champs d’action). 2/ Plusieurs études ont démontré que le marquage avec des marques PIT n’a pas d’effet sur la survie des poissons, pas ou peu d’effet sur leur croissance et pas d’effet sur leur capacité de nage. Les effets indésirables à court terme, suite au marquage, sont : le stress de la manipulation, la douleur de l’acte d’incision chirurgicale produisant une petite plaie (longue entre 2-5 mm) à cicatriser. Pour réduire ces nuisances du marquage, il sera effectué sous anesthésie générale de l’individu. La taille de la marque utilisée (12, 13, 23 ou 32mm) sera adaptée à la taille des poissons. Les poissons seront rapidement libérés en milieu naturel pour réduire le stress engendré par la captivité et les manipulations.

Devenir

L’étude est conduite en milieu naturel. Tous les animaux seront relâchés vivants dans leurs habitats d’origine, ceci étant un prérequis à l’étude.

Remplacement

Des études hydrauliques antérieures ont permis d’établir certains critères de conception des rampes à macrorugosités mais le comportement réel des poissons dans ces dispositifs ainsi que leur franchissement n’a encore pas été suffisamment étudié. Il est aujourd’hui nécessaire de mener plus de tests directement sur les poissons présents naturellement dans les cours d’eau concernés, afin de valider la performance de ces dispositifs pour rétablir la continuité piscicole.

Réduction

L’objectif, pour mener dans les bons termes l’évaluation de la rampe à macrorugosités, est de pouvoir détecter une centaine de tentatives de franchissement par espèce cible et individus de différentes tailles. 4 espèces seront étudiées en priorité (barbeau, chevaine, goujon et ablette). Pour calculer le nombre d’individus nécessaire à marquer en aval de l’ouvrage, nous avons utilisé leurs taux de migration observés au cours de l’étude précédente : -barbeaux (taux de migration env. 50%) : 200 individus seront marqués -chevaines (taux de migration env. 30%) : 330 ind. -goujons (taux de migration env. 20%) : 500 ind. -ablettes (taux de migration inconnu mais supposé à 25%) : 400 ind. seront marqués Compte tenu des atteintes aux animaux jugées faibles et sachant que l’information sur le franchissement des autres espèces (non prioritaires mais présentes sur le site d’étude) apporterait de nouvelles connaissances utiles, leur suivi n’est pas écarté d’office. Par expertise et extrapolation de l’information provenant des sites proches, on s’attend à contacter par pêche électrique les espèces telles que : gardon, vandoise, toxostome, perche fluviatile, truite fario, anguille, brêmes, loche, vairon, bouvière, rotengle, hotu, etc. Leur nombre maximal à marquer a été défini par expertise à 200 au total, sachant que dans l’étude précédente, leur nombre a été inférieur à cet objectif. En aval de l’ouvrage, il est donc prévu de marquer au maximum 1630 individus sur la durée du projet, appartenant à toutes les espèces présentes sur le secteur. Pour la translocation des individus, le même objectif de 100 individus par espèce cible transloquée de l’amont vers l’aval, a été retenu (4 espèces prioritaires * 50 ind. * deux occasions de translocation = 400 ind. au total). Il est à noter que la translocation est optionnelle, et sera utilisée au cours du projet uniquement si jugée nécessaire pour l’évaluation de la rampe.

Raffinement

Méthodes de raffinement utilisées : - Les poissons pêchés seront rapidement retirés du champ électrique et placés dans des seaux d’eau (équipés d’aérateur) pour leur récupération immédiate. Ils seront ensuite transportés et stockés dans plusieurs viviers (60x40x40 cm) perforés et immergés dans la rivière en attendant le marquage et la fin de la pêche. - L’implantation des transpondeurs et la biométrie se feront sous anesthésie générale, il n’y aura pas de manipulation à sec. - Surveillance régulière (visuelle et à l’aide d’une sonde multiparamétrique) et maintien de bonnes conditions d’anesthésie et de réveil (température proche du cours d’eau pêché, oxygénation de l’eau en continu avec aérateur, renouvellement d’eau fréquent) - Installation de caches (grands galets) dans les viviers de stabulation (eux-mêmes immergés dans la rivière) - Réduction du temps de captivité avec retour le plus rapide possible en milieu

Choix des espèces

Les rampes à macrorugosités sont des équipements multispécifiques, avec l’ambition de rétablir la continuité pour la grande majorité d’espèces des communautés piscicoles. Pour l’évaluation de leur efficacité, nous avons donc choisi d’utiliser les espèces de poissons de rivière, naturellement présentes à proximité de l’ouvrage étudié. Des poissons dès la taille 80-100mm (selon espèce) ont été détectés en migration lors de l’étude antérieure. De plus, des analyses statistiques ont mis en évidence l’influence de la taille sur le succès de franchissement de la rampe. Par conséquent, tous les stades marquables (tailles > 70 mm) sont visés par ce projet.

380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, ils reçoivent de fortes doses de fentanyl ou d'autres opioïdes puis l'antidote, pour comparer les effets respiratoires et leur réversion. Le porteur indique attendre une sédation pouvant aller jusqu'au coma, une rigidité musculaire et, du fait des doses choisies, possiblement la mort. Il affirme que ces effets sur le système respiratoire ne peuvent s'étudier que sur un "animal entier".

Objectifs

Le fentanyl est un opioïde synthétique peropératoire dont l’efficacité analgésique en comparaison à l’intensité des effets secondaires est à l'origine de l'essor de son utilisation en particulier en anesthésie mais aussi dans la prise en charge de la douleur. L’utilisation du fentanyl exposerait néanmoins au risque de toxicité opioïde typique avec survenue d’un trouble de conscience et d’une dépression respiratoire ainsi qu’un risque de dépendance et d’abus. De plus, on observe une rigidité thoracique et diaphragmatique survenant très rapidement après injection, durant près de 15 min et pouvant conduire au décès rapide en l’absence de prise en charge immédiate et optimale. Il a par ailleurs été rapporté la nécessité de plus grandes doses de naloxone, l’antidote utilisé pour reverser les effets des opioïdes. Depuis récemment, le Center for Disease Control (CDC) américain considère que les opioïdes représentent désormais la première cause de mort toxique aux États-Unis, avec une contribution supérieure à 85% du fentanyl et de ses dérivés aux décès. Les effets neurorespiratoires délétères observés en clinique en cas de surdosage par les dérivvés du fentanyl ainsi que la particularité des décès qui leur sont attribués (survenue dans les minutes suivant l'injection d'une forte dose, rigidité musculaire entrainant la paralysie des muscles respiratoires), nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs d’abord, de caractériser de façon comparative, la réponse ventilatoire et diaphragmatique après administration d’une dose élevée de différentes molécules opioïdes. Ensuite, on étudiera l’efficacité de la réversion de leurs effets neurorespiratoires respectifs par l'antidote de référence.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes et les spécificités de la toxicité neuro-respiratoire à la suite d'overdose aux dérivés opioïdes et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques pour la prise en charge des patients intoxiqués.

Procédures

Pour les animaux de la procédure 1 : Procédure chirurgicale (30 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes). Pour les animaux de la procédure 2 : Procédure chirurgicale (30 mins), injection de la substance étudée (1 injection; 5 secondes) et prélevements sur animaux vigiles (8 prélèvements; environ 1 min). Pour les animaux de la procédure 3 : Procédure chirurgicale (45 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes).

Impact sur les animaux

En raison du contexte d’exposition des animaux et des effets recherchés dans ce projet, on s’attend à plusieurs effets secondaires à l’utilisation des dérivés opioides y compris : Sédation allant d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma, myoclonies, rigidité musculaire, ou encore l'élévation non contrôlée de la queue. De part le choix de la dose, on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction de l’opioïde utilisé. De plus, les procédures 2 et 3 nécessiteront l'hébergement en cage individuelle des rats à la suite de leur chirurgie et jusqu'à la fin de la procédure.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire intégrée sur animal entier.

Réduction

Par nos expériences passées sur les mêmes modèles animaux, il est estimé qu’un groupe de 6 animaux exploitables est suffisant pour appliquer une analyse statistique et mettre en évidence des différences le cas échéant. Ce nombre est prédéterminé à l’aide du logiciel InVivoStat® (Essex, Royaume-Uni). Pour tous les tests, une valeur de p

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques dans la limite du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associé à une analgésie péri-opératoire. Enfin, une ouate en silicone sera utilisée en post-opératoire pour permettre une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement.

Choix des espèces

La quasi-totalité des études expérimentales in vivo effectuées sur les dérivés opioïdes ainsi que sur la physiologie neurorespiratoire a été faite chez le rongeur, et principalement chez le rat. De plus, le rat est un bon modèle pour les études de pharmacocinétique ayant un métabolisme semblable à celui de l’Homme. De par sa taille, les prélèvements sanguins, ainsi que la pose des sondes de télémétrie sont plus aisés et donc plus reproductibles. Enfin, les prélèvements sanguins peuvent se faire de manière repetée sur un même animal permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ces études. Nous utiliserons des rats Sprague-Dawley adultes, âgés de 8 à 9 semaines (jeunes adultes, poids : 250-350 g) au moment de l’expérimentation. Ce stade de développement a été choisi par analogie avec la littérature.