Recherche fondamentale
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Développement d’un dispositif de déformation de la paroi artérielle d’anévrismes cérébraux dans un modèle préclinique lapin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
18 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur crée un anévrisme cérébral par cathéter à ballon introduit dans la carotide, laissé mûrir jusqu'à trois mois, avant l'insertion d'un dispositif de mesure puis la résection du tissu. Le porteur reconnaît des complications déjà observées sur un modèle voisin, hémorragies mortelles, gangrène d'une patte, réouverture de plaies et perte d'appétit. Il présente le lapin comme un modèle validé et justifie le recours à l'animal après des essais sur artères imprimées en 3D.
Objectifs
Un anévrisme intracrânien correspond à une anomalie anatomique résultant d’une déformation structurale et résiduelle de la paroi d’une artère cérébrale. On estime qu’entre 2 et 5% de la population possède un anévrisme cérébral. Le risque annuel de rupture de ce dernier varie entre 1 et 4% dans la population porteuse de la pathologie (130000 AVC chaque année en France). Les anévrismes intracrâniens sont généralement découverts lors de leur rupture, ce qui entraîne, dans un cas sur quatre environ, le décès du patient avant même son arrivée à l’hôpital. La formation d’un anévrisme peut être interprétée comme une dégradation locale des propriétés mécaniques du tissu artériel et dans le cadre de ce projet, nous proposons de développer un dispositif de caractérisation in vivo des anévrismes cérébraux, de le valider sur des artères artificielles, puis de le tester sur l’animal. Les objectifs du projet sont les suivants : • Expérimentation in vivo sur modèle lapin avec anévrisme induit permettant l’établissement d’une gamme de pressions n’engendrant pas la rupture de l’anévrisme et étant suffisamment importante pour être détectée à l’imagerie • Imagerie de l’anévrisme induit durant l’essai grâce à un scanner spectral qui permettra l’obtention d’images durant le temps de sollicitation de la paroi anévrismale.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément la pathologie visée. Sur du court terme, comme indiqué au préalable, l’identification d’une gamme de pressions est visée. Ce projet aura aussi pour bénéfice de permettre la validation de notre prototype de sollicitation de la paroi anévrismale in situ et in vivo. Cette étape semble indispensable avant de passer à l’expérimentation de notre dispositif sur modèle anatomique humain. Effectivement, sur du long terme, l’objectif principal de ce projet est de donner un outil de diagnostic aux praticiens quant à la distance à la rupture ou non d’un anévrsime à partir des propriétés biomécaniques de la paroi.
Procédures
Les lapins seront soumis à une procédure d’induction d’anévrisme classée sévère. Cette procédure implique une anesthésie générale des animaux afin d’introduire via l’artère fémorale un système de cathéter avec ballon, monté jusque dans l’artère carotide commune afin de créer l’anévrisme. Selon les groupes, la procédure pourra s'étendre jusqu'à 3 mois (1 mois, 2 mois, 3 mois) à compter de la création de l’anévrisme afin de tester et de comprendre l’effet du temps de maturation sur la fragilité des parois anévrismales (durée opération création anévrisme entre 45 et 60 minutes). Les lapins seront de nouveau anesthésiés afin d’introduire le dispositif de caractérisation jusque dans l’anévrisme réalisé et imagés (durée 45 minutes + imagerie 30 minutes).
Impact sur les animaux
Les lapins seront soumis à une procédure d’induction d’anévrisme classée sévère. Hormis les décès liés à une complication pendant la réalisation de la procédure d'anévrisme (hémorragie ) ; sur un précédent modèle, avec un même abord chirurgical, portant sur l’aorte du lapin, certaines nuisances ont été observées : - réouverture de la plaie par les points de sutures qui sautent, une anesthésie est réalisée pour refaire les points, entrainant une cicatrisation en seconde intention. – de rare cas de gangrènes sur la patte postérieure peuvent être observés en raison d'une injection trop proche du nerf sciatique, entrainant une paralysie du membre - une perte d'appétit : les lapins ne s'alimentent pas après l'opération et deviennent léthargiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure, une résection du tissu anévrismal est effectuée afin de réaliser des tests de caractérisations biomécaniques sur ces tissus.
Remplacement
L’expérimentation animale (in vivo) arrive après une phase expérimentale sur artère cérébrale artificielle (impression 3D) ainsi qu’une phase couplée de simulations numériques qui nous ont permis de créer une première itération de notre prototype de dispositif médical qu’il reste à valider en in vivo. De plus les analyses in vitro ne suffisent pas en ce qui concerne les propriétés biomécaniques de la paroi, car des paramètres biofidèles sont très durs à obtenir et à reproduire (élasticité, dégradation de la paroi, multicouche...). La première étape a consisté à développer et à dimensionner un outil de sollicitation de la paroi anévrismale. Un travail de deux ans a été réalisé sur des artères fantômes (imprimées en 3D) en testant différents paramètres afin d’établir une première gamme de pressions utile.
Réduction
Afin de réduire le nombre de lapins nécessaires à l’étude, un test de puissance statistique a été utilisé dans un premier temps. Il s’agit d’un test ANOVA à l’aide du logiciel GPower. Trois groupes de 5 lapins seront créés soit 15 avec 3 lapins supplémentaires afin d’anticiper une mortalité accidentelle, soit un nombre total de 18. La puissance du test statistique utilisé dans ce cas est de 0,95 pour une taille d’effet de 0,81.
Raffinement
La règle de raffinement est appliquée notamment pour l’hébergement. Un hébergement au sol est prévu quand des lapins de sexe femelles seront utilisées : litière, cartons de différentes hauteur, jouet, foin et abreuvement automatique Un hébergement individuel par l’utilisation de cages enrichies quand des lapins de sexe mâles seront utilisés : bâton et bloc de cellulose à ronger, foin, paroi de cages transparentes permettant aux animaux de se voir. Enfin, toutes les procédures expérimentales seront réalisées avec l’utilisation d’anesthésie gazeuse et sous analgésiques pour éviter en tout point que les animaux ne souffrent. Une grille de score et fiche de suivi individuelle permettront de mettre en avant des critères d’interruptions de la procédure et exclusion des animaux.
Choix des espèces
Le lapin reste un des modèles de choix pour la création d’anévrismes cérébraux et est validé par plusieurs publications et est considéré comme un bon modèle préclinique dans cette pathologie. La taille de l’animal permet d’utiliser le prototype de déformation ainsi que l’imagerie souhaitée et il est possible de mimer la pathologie (en termes de dégradation des couches artérielles) humaine avec ce modèle. Les lapins au stade de développement adulte seront utilisés afin d'avoir un accès fémoral et une navigation pendant la procédure aisée.
Optimisation de la dose injectée de nanoparticules pour de l’imagerie bimodale (EU porteur ; EU1/3)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis des injections de nanoparticules et des séances d'imagerie IRM et scanner sous anesthésie, pour optimiser la dose à injecter. Le porteur qualifie la douleur chirurgicale de modérée, avançant que le cerveau n'est pas innervé et que seule l'incision du cuir chevelu fait mal. Il justifie le recours à l'animal par la complexité du développement tumoral, impossible selon lui à reproduire in vitro.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.
Bénéfices attendus
Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.
Procédures
Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois
Impact sur les animaux
Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.
Devenir
Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'une canule dans le cerveau, sont logés seuls puis reçoivent deux injections quotidiennes d'une formulation dans le liquide céphalorachidien, animal éveillé, avant des tests comportementaux. Le porteur indique que les formulations toxiques peuvent provoquer convulsions, détresse respiratoire et vocalisations, déclenchant la mise à mort. Il présente ce modèle comme un moyen de limiter le recours ultérieur aux primates non humains.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de mettre en place un modèle chez le rongeur permettant d’évaluer l'absence de toxicité de différentes formulations de tampon d’un médicament innovant pour les pathologies neurologiques en caractérisant leurs effets sur le comportement général et neurologique. Ce modèle devra permettre la détection d’effets secondaires cliniquement observables liés aux formulations de tampon administrées deux fois par jour dans le cerveau. Le but de ce modèle étant d’éliminer toute toxicité et de valider la sécurité des formulations chez le rat avant de passer à l’étape suivante des tests précliniques sur primates non humains et d'ainsi en limiter leur nombre. Il devra donc être représentatif de ce qui se passe chez le primate non humain. Pour cela, nous réaliserons l’administration de ces formulations deux fois par jour sur une seule journée chez le rat éveillé afin de suivre durant et après le processus d’injection tout signe d’effets secondaires cliniquement observables. Des analyses comportementales permettront d’apprécier le comportement général et neurologique des animaux. Enfin le prélèvement du cerveau des animaux permettra de contrôler le site d’injection et la bonne administration des formulations testées.
Bénéfices attendus
L’évaluation de l’innocuité des différentes formulations de tampon administrées dans le cerveau chez le rongeur devrait permettre de détecter précocement tout signe de toxicité afin d’optimiser et de limiter pour les tests précliniques suivants le recours aux primates non humains. Seuls les tampons ne présentant aucun effet secondaire cliniquement observable chez le rongeur seront testés dans les phases précliniques suivantes. Ces formulations sont utilisées pour un médicament innovant qui à terme, pourrait faire l’objet de tests en phase clinique pour le traitement de maladies neurologiques chez l’Homme.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour la réalisation de l’implantation de la canule de micro-injection. Sous anesthésie générale, la canule de micro-injection sera implantée au niveau cérébral. La chirurgie sera réalisée en 30 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Un maintien des rats en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les canules. Le jour de l’administration des formulations, la micro-injection a lieu sur les rats éveillés maintenus dans la main de l’expérimentateur et dure environ 5 minutes avant que le rat ne retourne dans sa cage d'élevage. A la suite de l’injection, les rats effectueront un test d’exploration libre en Open-Field (dispositif carré en polyethylène noir, enceinte de 60x60x60cm) durant 15 minutes afin d’évaluer l’activité locomotrice spontanée générale puis les rats réaliseront une batterie de tests fonctionnels durant 15 minutes Cette série de tests consistent principalement à de l’observation de l’animal dans sa cage d’élevage, une prise en main de l’animal par l’expérimentateur et une mesure automatisée de force de préhension des membres antérieurs (grip-test). Pour cela, le rat sera tenu par la queue et présenté à une barre en forme de T (mesure de force globale avec 2 membres antérieurs) puis délicatement tiré jusqu’au lâcher prise.
Impact sur les animaux
L’utilisation d’une couverture analgésique lors de la procédure de chirurgie va permettre de limiter au maximum la souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des rats implantés, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux la canule, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et par l’utilisation d’enrichissement pour améliorer leur bien-être. En cas d’administration d’une formulation toxique, des effets secondaires sont attendus : tout comportement de type convulsion, détresse respiratoire, vocalisations, prostration entrainera la fin de la procédure et la mise à mort de l’animal dans des conditions éthiques.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale 1, les 280 rats seront mis à mort dans des conditions éthiques pour le prélèvement d'organes (cerveau).
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’observer des signes cliniques comportementaux et neurologiques de toxicité. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation du projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études exploratoires précédentes du même type. La seconde phase du projet n’aura lieu que si et seulement si la première phase du projet est validée et les effectifs pourront être revus à la baisse à la suite de la première phase du projet. Ce projet a également pour objectif principal de réduire le recours aux primates non humains.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la chirurgie (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après la réalisation de celle-ci. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection au niveau de la plaie (jonction avec le ciment dentaire) ou des modifications du comportement des animaux (avant l’injection) sont observés (arrêt de prise alimentaire ou de boisson, cachexie, vocalises, piloérection, convulsions, etc), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Au moment de l’injection ou après injection, tout comportement de type convulsion, détresse respiratoire, vocalisations, prostration, automutilation entrainera la fin de la procédure et la mise à mort de l’animal dans des conditions éthiques. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enchissement pour assurer le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa facilité de manipulation pour l’implantation de canule, de l’injection en condition vigile et de la FOB largement décrite dans la littérature scientifique pour évaluer le comportement générale et neurologique des rats. Les animaux seront des rats âgés de 3 mois à leur arrivée au laboratoire, les expérimentations déburteront 1 semaine après leur arrivée. Cela correspond à de jeunes rats adultes pour être dans des conditions identiques à celles des tests sur les primates non humains.
Exploration fonctionnelle des mécanismes de l’action antidouleur de TAFA4 chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 384 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris subit un modèle de douleur, injection de carraghénane pour une inflammation, ou chirurgie pour une lésion neuropathique ou post-opératoire, avec administration de composés par gavage ou injection. Le porteur mentionne des pertes de poids liées aux modèles lésionnels et décrit des tests comportementaux répétés. Il conclut que l'étude de la douleur est indispensable in vivo, la douleur ne pouvant selon lui être dissociée de l'organisme entier.
Objectifs
Nous avons récemment découvert une molécule particulièrement adaptée au traitement de la douleur, notamment dans le cas des douleurs post-opératoires aigues et chroniques. Nous avons également découvert que l’action de cette molécule nécessite un récepteur exprimé à la surface de toutes nos cellules appelé LRP1. Le but de cette étude est de déterminer les mécanismes physiologiques d’action de la molécule anti-douleur que nous avons identifié. Pour cela nous allons utiliser des souris dans lequel nous éliminerons séquentiellement LRP1 dans un type cellulaire donné tout en le maintenant dans les autres types cellulaires. Ainsi nous déterminerons qu’elles sont les cellules impliquées directement dans le fonctionnement de notre molécule antidouleur.
Bénéfices attendus
Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique.
Procédures
Pour le modèle de douleur inflammatoire, une unique injection de Carraghénane sera réalisée sur chaque souris. La durée d’une injection ne dure que quelques secondes et nécessite une contention rapide de l’animale vigile. En ce qui concerne les modèles de douleur neuropathique ou post-opératoire (nécessitant une chirurgie), les souris seront sous anesthésie générale. La chirurgie ne nécessite qu’une seule anesthésie par souris, car il s’agit de chirurgies de courtes durées (pas plus de 15 minutes par souris). Chaque souris ne subira qu’un seul modèle de douleur, soit une chirurgie, soit une injection.
Impact sur les animaux
Les animaux seront amenés à subir l’administration de composés par gavage ou bien par injection intra-péritonéale et sous-cutanée. De plus, ils subiront des modèles lésionnels mimant une lésion inflammatoire, post-opératoire ou neuropathique qui pourraient entrainer une perte de poids.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par inhalation d’une concentration croissante de CO2 (ou perfusion intra-cardiaque pour la procédure 1). En effet, ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.
Remplacement
Une de nos thématiques de recherche est de comprendre comment et pourquoi une personne a mal. Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Il est donc nécessaire de réaliser une étude comportementale afin d’étudier l’intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie (peau) jusqu’au cerveau. Par ailleurs, les animaux génétiquement modifiés que nous utilisons représentent des alternatives prometteuses pour des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension des pathologies humaines. En particulier, les souris génétiquement modifiées fournissent des modèles nouveaux permettant de mettre en évidence de nouvelles molécules analgésiques ayant un spectre d’action plus spécifique afin, à terme, d’améliorer la qualité de vie des patients. Ainsi, l’expérimentation sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Des stratégies seront mises en place afin de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, nous utiliserons des outils statistiques nous permettant d’évaluer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées et maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Ce projet nécessitera au maximum 984 souris.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique sera effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.
Evaluation et développement de médicaments pour le traitement des pathologies hypertensives spécifiques de la gestation.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
120 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'un médicament entre le 12e et le 18e jour de gestation, avec des prises de sang sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser placentas et fœtus. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grave et signale qu'un tiers des animaux livrés peuvent ne pas être gestants. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de modèle in vitro reproduisant l'interaction entre la mère, le placenta et le fœtus.
Objectifs
Décrire l'effet d'une classe médicamenteuse sur les marqueurs sanguins de la maladie (molécules circulantes dans le sang maternel) en cours de gestation animale. Décrire d'éventuels effets toxiques de cette classe méicamenteuse sur l’évolution des fœtus en cours de gestation animale.
Bénéfices attendus
Le développement de thérapeutiques est une priorité de la recherche en médecine périnatale. Le bénéfice attendu de nos recherches est d'apporter la preuve de concept sur un model d'animal gestant qu’une classe médicamenteuse permet potentiellement de ralentir l’évolution de la maladie sans effets secondaires indésirables sur le developpement foetal. Cette preuve de concept permettra de decliner des propositions d'études médicamenteuses avec des molécules déja commercialisées utilisables chez l'espèce humaine.
Procédures
L’injection quotidienne des médicaments est un acte peu douloureux et peu stressant quand il est réalisé par un opérateur entrainé. Cette procédure est réalisée quotidiennement par un très grand nombre d’équipes de recherche. L’injection de médicament sera effectuée entre le 12e et le 18e jour de la gestation. Les prises de sang (réalisées 3 fois dans notre protocole de recherche, 12e, 15e et 18e jour de la gestation) seront systématiquement réalisées sous anesthésie générale pour limiter au maximum à la fois le stress et la douleur des animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet secondaire, ni indésirable grave n’est attendu des gestes réalisés en cours de gestation (injection de médicament, prise de sang) au cours de notre protocole. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée sur les animaux jusqu’au jour de l'euthanasie.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié en fin de procédure au 7ème jour du protocole expérimental c’est-à-dire au 18e jour de gestation. L'euthanasie se justifie par la nécessité d’une prise de sang maternel de plus gros volume et l’analyse systématique des placentas et des fœtus. Nos procédures d’analyses ne sont pas possibles après la parturition et la mise bas des portées.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de remplacer l’interaction entre la mère, le placenta et le fœtus au cours de la gestation. C’est pourquoi en recherche en reproduction le modèle d’animal gestant reste indispensable à ce jour. De plus cette étape experimentale est incontournable pour repérer les éventuels effets malformatifs ou délétères pour la gestation de classes médicamenteuses.
Réduction
Compte tenu de la variabilité du nombre de fœtus par portée et de la variabilité des dosages in vivo, le nombre nécessaire pour montrer une différence significative entre deux groupes est de 8 animaux par groupe. De plus, l’établissement éleveur qui nous procure les animaux gestants, ne peut nous assurer la gestation des animaux à la livraison. Les animaux non gestants peuvent représenter jusqu’à 1/3 de l’effectif total d’animaux prévus initialement. Nous profitons de cette procédure experimentale pour tester un appareil de monitorage du pH tissulaire in vivo le jour de l'euthanasie. Le fait d'effectuer ce test au cours de notre protocole sur souris gestante, ne biaise pas nos données experimentales, n'allonge pas la procédure de manière à perturber nos analyses et surtout permet de diminuer le nombre total d'animaux utilisés pour nos recherches.
Raffinement
Les critères objectifs de souffrance et/ou la détresse d’un animal seront quotidiennement évalués. L’expérimentation sera systématiquement interrompue pour chaque animal en cas d’atteinte des points limites préalablement définis par une grille de suivi. Nous prévoyons de tester systématiquement la dose la plus faible de médicament et d’arreêer en cas d’effet mesuré significatif.
Choix des espèces
Le modèle murin est choisi pour plusieurs raisons : - Son type de placenta est proche de celui de l’expèce humaine - Les molécules responsables de la maladie humaine sont également retrouvées dans le sang maternel au cours de la gestation chez la souris. Les dosages de ces molécules chez la souris sont commercialisés. - Le modèle de gestation chez la souris est systématiquement utilisé de par le monde pour étudier de potentiels effets deletères de classes médicamenteuses en cours de gestation.
Etude chez la souris des effets neurophysiologiques d’une maladie causée par une mutation d’un canal calcique (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
438 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 81 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modélisant une maladie cérébelleuse infantile, elles subissent des chirurgies stéréotaxiques et des implantations d'électrodes crâniennes pour enregistrer l'activité cérébrale, et présentent ataxie et crises d'épilepsie. Le porteur indique que la chirurgie d'électrodes peut induire une douleur modérée et évoque l'attente des patients et cliniciens. Il justifie le recours à la souris par l'impossibilité de reproduire in vitro ou in silico les réseaux de neurones du cervelet.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation gain de fonction d’un canal calcique décrite dans une maladie cérébelleuse infantile. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation causale pourra être induite. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.
Bénéfices attendus
Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle du canal calcique dans le développement du cerveau, du cervelet en particulier. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.
Procédures
Pour ce projet, 294 animaux seront évalués pour leurs capacités motrices et cognitives dans des tests standards. 70 animaux subiront une injection i.v. d'adénovirus codant pour la cre recombinase par chirurgie « stéréotaxique » pour induire l'expression du canal calcique mutant dans le cerveau et le cervelet. Les autres animaux évalués dans cette 'procédure comportementale' sont issus de croisements permettant une expression conditionnelle de la mutation du canal. Ces différents tests, potentiellement générateurs de stress, se dérouleront sur une période d'environ 1 mois. 81 animaux subiront une chirurgie pour l'implantation crânienne d'électrodes pour l'enregistrement d’électroencéphalogramme (EEG). Sur ces animaux, l'EEG sera enregistré sur une période d'environ 1 mois, à raison d'une séance de 6 heures par semaine. 63 animaux participeront à une étude longitudinale des paramètres anatomofonctionnels par échographie photoacoustique du cerveau et du cervelet. Les mesures seront réalisées lors de courtes séances (15 min) d'acquisition sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des défauts neurologiques précoces qui vont résulter en une atrophie cérébelleuse et des troubles fonctionnels cérébelleux de type ataxie, ainsi que des crises épileptiques de type généralisée (absence). Nos procédures expérimentales pourront conduire à des effets indésirables. (i) les études comportementales du suivi locomoteur de l'ataxie pourront résulter en un stress des animaux lié à la préhension manuelle et la découverte de l'environnement expérimental que nous atténuerons par une habituation de ces animaux aux dites procédures. (ii) le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution des éventuelles dysmorphies cérébrales et cérébelleuses est une approche non invasive et non douloureuse. Comme en (i), le stress subi par les animaux se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15 min/animal). (iii) Le suivi du phénotype épileptique par enregistrement électroencéphalographique (EEG) peut induire une douleur modérée puisqu'il implique une chirurgie pour la pose d'électrodes intracraniennes.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse physio/pathophysiologique de l'ataxie cérébelleuse. Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) ne pouvant être réalisées sur les modèles in vitro et in silico de la pathologie. Les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur l'activité du canal calcique seront étudiées dans des expériences d'électrophysiologie sur lignées cellulaires et des approches in silico seront développées pour modéliser les conséquences de cette mutation sur l'excitabilité neuronale. Ces stratégies in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact du canal muté à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau, puisque les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. Quant aux études phénotypiques, par exemple les conséquences motrices d'anomalies du cervelet, elles nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 438) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement relevant. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par la recombinase Cre (lignées de souris driver, injection de virus codant pour la recombinase Cre) est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation de jeunes adultes et d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.
Vaccination anti-système andrénomédulline comme modalité de traitement anti-angiogénique et anti-tumoral.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules de mélanome ou de glioblastome, sous la peau ou dans le cerveau, pour tester un vaccin visant à détruire la vascularisation des tumeurs. Le porteur décrit des tumeurs pouvant se nécroser, des métastases et une perte de poids déclenchant la mise à mort à 20 %. Il présente l'expérimentation comme "indispensable" faute de modèle immunocompétent équivalent et prévoit de dupliquer chaque expérience.
Objectifs
Les vaccins thérapeutiques contre le cancer ont connu une résurgence au cours de la dernière décennie. L'objectif de ces vaccins est d'induire la régression de la tumeur, d'éradiquer la maladie résiduelle minimale, d'établir une mémoire anti-tumorale durable et d'éviter les réactions non spécifiques ou indésirables. Notre objectif est de développer un vaccin thérapeutique innovant qui vise à détruire la vascularisation des tumeurs en mettant à profit le système immunitaire humain pour cibler une hormone et ses récepteurs ayant un rôle dans cette vascularisation. Cela devrait permettre une meilleure efficacité du vaccin et prolonger son action dans le temps dans le but d’une meilleure prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Notre objectif est de démontrer que cette vaccination peut bloquer la croissance tumorale et la formation des métastases grâce à une déstabilisation de la vascularisation tumorale par apoptose des cellules vasculaires, et une mort de la cellule tumorale maligne. La réussite de ce projet va nous permettre de proposer une vaccination plus efficace dans différents schémas thérapeutiques selon la pathologie cancéreuse et l’organe en question.
Procédures
4 procédures d'expérimentation : 1/ Test d’angiogenèse sur souris C57BL/6 avec différents groupes d’expérimentation : 1 groupe contrôle placebo recevant une solution saline ; 1 groupe contrôle recevant une solution d’Adjuvant de Freund ; 1 groupe positif traité avec un anticorps polyclonal ayant montré dans une étude in vivo antérieure une efficacité ; 5 groupes correspondant aux 5 peptides candidats pour la vaccination. Chaque groupe de souris va recevoir en sous-cutanée au niveau de l’aine une injection de Matrigel contenant l’Adrenomedulline. Pour chaque groupe, 8 souris seront nécessaires soit 64 souris pour 8 groupes. Cette expérience sera réalisée en duplicate pour valider les résultats obtenus et montrer leur reproductibilité, nous aurons besoin de 128 souris. Un système de ON/OFF sera mis en place entre chaque étude affinant le nombre de peptides à tester. 2/ Effet de la vaccination sur des xénogreffes hétérotopiques de cellules tumorales murines de mélanomes et de glioblastomes. Nous aurons besoin au maximum de 5 groupes de souris pour les 5 peptides candidats, les 2 groupes contrôles et 1 groupe traité avec un anticorps polyclonal. Nous aurons donc 8 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe, soit 80 souris par modèle tumorale, soit pour 2 modèles = 160 souris. Cette expérience sera dupliquée, ce qui fera un total de 320 souris. 3/ Effet de la vaccination sur des xénogreffes orthotopiques de cellules murines de glioblastomes. Nous aurons 8 groupes d’expérimentation : 2 groupes contrôles, 1 groupe traité avec un anticorps polyclonal et 5 groupes immunisés avec les différents peptides candidats. Nous aurons 8 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 80 souris. Cette expérience sera dupliquée, ce qui fera un total de 160 souris. 4/ Effet de la vaccination sur la formation des métastases issues de cellules murines de mélanome rendues fluorescentes. Nous aurons au maximum 8 groupes d’expérimentation : 2 groupes contrôles, 1 groupe traité avec un anticorps polyclonal et 5 groupes vaccinés avec les différents peptides candidats. Nous aurons 8 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 80 souris. Cette expérience sera dupliquée, ce qui fera un total de 160 souris. Sans perte de poids ou modification des critères définis comme points limites, le temps maximum pour les procédures 1, 2 et 3 sera de 21 jours et pour la procédure 4, elle sera de 21 à 30 jours.
Impact sur les animaux
L'effet indésirable attendu dans le modèle des xénogreffes hétérotopiques est une gêne liée à la masse tumorale développée et peut se traduire par une diminution de la mobilité de l'animal pouvant aller jusqu'à la prostration. Cependant notre expérience acquise au cours d'autres expériences menées avec ces modèles tumoraux montre que cette gêne est légère si le volume tumoral est contrôlé et n'excède pas les 10% du poids de l'animal. Des pertes de poids dans les deux modèles de xénogreffes peuvent aussi être observées mais si la perte de poids est supérieure ou égale à 20%, une mise à mort sera réalisée. Des phénomènes de nécrose peuvent également être observés sur les xénogreffes hétérotopiques. Ils sont associés au développement tumoral des glioblastomes sans traitement au préalable ceci étant due probablement à la vitesse de croissance tumorale très importante. Les autres modèles tumoraux peuvent également présenter des phénomènes de nécrose de la tumeur suite à un traitement anti-angiogénique. Enfin des métastases peuvent apparaître. Seules les métastases superficielles (ganglion) seront détectées. Les métastases internes entraineront une détérioration de l’état de l’animal détectée par le suivi des paramètres cliniques comme des signes respiratoires (modification de la fréquence respiratoire, dyspnée) qui pourrait faire penser à l’existence de métastases pulmonaires. Si métastase, les animaux seront alors immédiatement mis à mort. Pour détecter toute souffrance, nous observons quotidiennement le comportement des souris : mobilité, alimentation, agressivité, prostration, déshydratation, abcès, hémorragies. Pour déterminer les points limites adaptés à la souris, nous nous basons sur la grille d’évaluation de la souffrance ou de détresse de Morton et Griffiths.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Prélèvement de tissus après mise à mort : sous hotte stérile prélèvements du Matrigel, des tumeurs et des organes afin de réaliser des études permettant l'analyse de la croissance tumorale en fonction des traitements appliqués.
Remplacement
Cette étude in vivo sur modèles tumoraux ne peut être remplacée. En effet il est indispensable d’avoir un modèle animal immunocompétent pour développer tout simplement des anticorps in vivo puisque le sujet de cette demande concerne la vaccination en utilisant des peptides immunogènes dérivant la séquence d’AM et ses récepteurs. De ce fait l’animal immunocompétent est le modèle le plus approprié pour développer ce genre de projet. Le modèle animal est très important pour développer des modèles tumoraux du fait qu’il apporte le microenvironnement tumoral constitué des cellules vasculaires (cellules endothéliales et péricytes, cellules pro-angiogéniques, cellules CD45+ et toutes les cellules dérivant de la différenciation des cellules CD45), les cellules fibroblastes qui sécrètent différents facteurs angiogéniques, et enfin les cellules immunitaires telles que les macrophages,… Les données de la littérature démontrent que le microenvironnement tumoral est devenu une composante aussi active que la cellule tumorale lors de la croissance tumorale. Il est également nécessaire de déterminer s’il existe des effets physiologiques de cette vaccination anti-système adrenomedulline. Les retours d’expériences in vivo sont donc indispensables au développement de potentiel médicament et sont des pré-requis à l’étude clinique.
Réduction
Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de 768 souris, cependant ces études seront menées avec un système de ON/OFF et en affinant le nombre de peptides à tester. Une première étude d’angiogenèse sera réalisée avec les 5 peptides. Si l’expérience est infructueuse, elle sera arrêtée. Si des résultats positifs sont obtenus, l’étude sur xénogreffes hétérotopiques pour les glioblastomes (étape 2) et orthotopique pour les mélanomes (étape 2) sera lancée. Pour l’étape 3 s’agissant de l’étude sur xénogreffes orthotopiques de glioblastomes, seuls les peptides ayant des résultats positifs à l’étape 2 seront lancés. Cependant si les résultats sont négatifs à l’étape 2, l’étude sera arrêtée. Ce nombre de 768 souris correspond à 128 souris pour l’étude d’angiogenèse (n=8 par groupe) et 640 souris avec n=10 souris par groupe d’expérimentation pour les deux modèles tumoraux. Ce nombre de 8 ou 10 souris par groupe d’expérimentation vont nous permettre d’avoir un échantillonage statistiquement interprétable au niveau de la réponse à la vaccination et de faire face aux problèmes de prises tumorale. Pour valider les résultats, les expériences doivent être dupliquées pour prouver leur reproductibilité et leur non-dépendance de la production des lots de souris. Le test statistique utilisé est le test de variance ou de Fisher PLSD, StatView 512. Pour valider les résultats, les expériences devront être dupliquées pour prouver leur reproductibilité et leur non-dépendance par exemple au lot de production des souris.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées au plus tôt 15 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les souris seront hébergées par cinq dans des cages adéquates (taille des cages : 35cm x 19cm x 14cm). Un enrichissement du milieu par igloo en polycarbonate sera utilisé afin de réduire le stress induit par les facteurs environnementaux et les interactions sociales. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement d'air) sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Les souris seront surveillées quotidiennement par un personnel expérimenté. Pour diminuer la souffrance au moment de l'acte chirurgical, une analgésie pré et post-opératoire sera appliquée : buprenorphine à 0,1mg/kg en sous-cutanée à injecter en pré-opératoire avant l’intervention et en post-opératoire 2 fois par jour pendant 3 jours. Le volume de buprénorphine injecté très lentement est d’environ 100μl par animal en fonction du poids (l’ampoule de buprécare de 0,3mg est diluée dans 10ml de NaCL 0,9%). Le temps d’analgésie post-opératoire sera adapté en fonction des souris et peut être prolongé si des signes de souffrances persistent. Au moment de l'injection des cellules tumorales en hétérotopique une anesthésie gazeuse sera réalisée (Isoflurane ou Sévoflurane 4%). Dans le cas du modèle orthotopique et du modèle d’angiogenèse (injection du Matrigel) une anesthésie fixe à base de kétamine (100mg/kg) et xylasine (10mg/kg) par voie intra-péritonéal sera utilisée (200μl par souris). Si des nécroses de la tumeur apparaissent, nous soulagerons la douleur des souris par injection très lente du buprenorphine 0,1mg/kg en sous-cutanée. Le volume d'analgésique utilisé est le même que précédemment. Pour détecter toute souffrance, leur comportement est observé régulièrement : mobilité, alimentation, agressivité, prostration, déshydratation, abcès et hémorragies. La perte de poids de la souris ne devra pas être supérieure ou égale à 20% de son poids et la charge tumorale ne devra pas représenter plus de 10% du poids de l'animal sans excéder 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux (3 fois/semaine) et dans le modèle hétérotopique par la mesure du développement des tumeurs avec un pied à coulisse (3 fois/semaine). Le volume tumoral sera calculé grâce à la formule suivante : longueur x largeur x épaisseur x 0,5236. Si un des critères préétablis survient chez l'animal, il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Notre projet concerne l’étude de l’effet de la vaccination dirigée contre le système AM sur l’angiogenèse AM-dépendant et la croissance tumorale des cellules d’origine murine, B16F10 (mélanome) et GL261 (glioblastome). Ceci nécessite l’utilisation des animaux immunocompétents capables de développer des anticorps contre les peptides immunogènes dérivant de l’AM et ses récepteurs. Ceci justifie notre choix des souris C57BL/6, modèle général polyvalent. D’autre part, l’immunocompétence de ces souris est importante car l’objectif est d’étudier l’ensemble des cellules recrutées par l’AM au sein du Matrigel lors du test de l’angiogenèse in vivo, les cellules provasculaires, les cellules pro-angiogéniques et les cellules du système immunitaire. Ce modèle a été validé dans nos études sur l’angiogenèse in vivo mais également dans différents travaux de laboratoires internationaux. Pour les études sur la croissance tumorale, ce modèle a déjà été utilisé dans différents laboratoires pour le développement des xénogreffes a partir des cellules tumorales murines telles que les cellules B16F10 et GL261. Les souris seront âgées de 8-10 semaines afin d'avoir un poids adulte stable.
Impact de consortia bactériens, isolés du microbiote du lait maternel humain, sur l’homéostasie intestinale ; Etude dans un modèle mini-porc.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
36 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Séparés de leur mère à deux jours et logés en cage individuelle, ils reçoivent une préparation pour nourrisson pendant dix-neuf jours puis sont abattus à vingt et un jours pour prélèvement des tissus digestifs et cérébraux. Le porteur reconnaît que la séparation maternelle et l'isolement peuvent être une source de stress, qu'il dit limitée aux premières heures. Il justifie le choix du porcelet par sa proximité physiologique avec le nourrisson humain.
Objectifs
L’enjeu de ce projet est l’amélioration des propriétés fonctionnelles des préparations pour nourrisson, pour mimer au mieux les effets bénéfiques du lait maternel. L’allaitement maternel est recommandé par l’Organisation Mondiale de la Santé pour les nourrissons en alimentation exclusive jusqu’à 6 mois. Cependant, moins de la moitié d’entre eux sont actuellement allaités par leur mère. Ainsi, les préparations pour nourrisson sont aujourd’hui l’alternative lorsque l’allaitement n’est pas possible ou souhaité. Il est donc essentiel que leur qualité soit optimale afin d’assurer une croissance et un développement adéquat du nouveau-né. Il reste à ce jour des différences entre le lait maternel et les préparations pour nourrisson, notamment au niveau des composés bioactifs retrouvés dans le lait maternel et peu ou pas présents dans les préparations pour nourrisson. Le présent projet s’intéressera à l’un de ces composés qu’est le microbiote du lait maternel. Ce dernier participe à la mise en place de l’homéostasie intestinale du nourrisson et il pourrait contribuer aux bénéfices santé associés au lait maternel. Cependant, la plupart des préparations pour nourrisson ne contiennent pas de composantes microbiennes et, quand elles en contiennent, celle-ci se limite généralement à l’ajout d’une ou deux souches probiotiques dans des concentrations non physiologiques (forte dose). Ce projet a donc pour objectif d'évaluer l'impact santé du microbiote du lait maternel pour le nourrisson. Une collection de bactéries issues du microbiote naturel du lait de femmes ne présentant pas de problèmes de santé, a été constituée. Sur la base de leurs propriétés immunomodulatrices, des consortia bactériens d’intérêt ont été retenus. L’impact de ces PPN avec une composante bactérienne variable sera étudié sur le développement physiologique de l’intestin et de son microbiote, en utilisant le porcelet mini-porc Yucatan comme modèle du nourrisson humain.
Bénéfices attendus
L’enjeu de ce projet est d’améliorer la fonctionnalité des préparations pour nourrisson en s’intéressant à la composante bactérienne du lait de femme pour mimer au mieux les effets bénéfiques de ce dernier sur la santé du nourrisson. Son objectif est d’évaluer l’impact de deux consortiums bactériens incorporées à une dose proche de leur concentration dans le lait de femme. Les propriétés immunomodulatrices de ces deux consortiums bactériens ont été testées au préalable par différentes approches in vitro sur des modèles cellulaires. Le présent projet d’expérimentation sur porcelets fait donc suite à une sélection drastique des souches d’intérêts qui a abouti à la constitution de deux consortiums d’intérêt. L’expérimentation sur porcelets pemettra d’évaluer le réel impact de ces consortiums bactériens d’intérêt chez un individu nouveau-né présentant des caractéristiques physiologiques proches du nouvean-né humain, dans un système plus complexe que les modèles cellulaires in vitro. Ce projet participera à la conception de probiotiques de nouvelle génération, plutôt utilisés en cocktails avec des espèces et des genres variés pour avoir un spectre d'activité plus étendu, et à dose physiologique proche de celle apportée par le lait humain.
Procédures
Aucun prélèvement biologique, ni intervention chirugicale ne seront réalisés sur les animaux vivants durant la période d’expérimentation. Les paramètres mesurés concerneront la consommation alimetaire et la croissance des porcelets. Tous les animaux concernés par la procédure (n = 36) seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour réaliser des prélèvements post-mortem de tissus et contenus digestifs et de zones cérébrales ciblées.
Impact sur les animaux
Les bactéries ont été isolées du lait de femmes ne présentant aucune pathologie (conditions d’inclusion des femmes définies dans le protocole de collecte de laits). Les bactéries sélectionnées ont été testées in vitro pour leurs propriétés immunomodulatrices bénéfiques ; à priori elles sont sans danger pour la santé du porcelet. Un effet indésirable sur l’appétit des animaux qui entrainerait une perte de poids, ne peut pas être totalement exclu. A noter que la préparation pour nourrissons (PPN) qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est très proche d’une formule porcinisée utilisée dans un précédent projet et qui n’a engendrée aucun problème d’alimentation, ni de troubles digestifs chez le porcelet Yucatan. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. Ils seront placés dans des cages individuelles équipées de distributeurs automatiques de lait réparties dans deux salles. Ils seront alimentés avec une des 3 PPN porcinisées pendant 19 jours avant leur abattage à 21 jours d’âge et le prélèvement post-mortem d’échantillons. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils sont hébergés dans une salle contenant 7 cages permettant des contacts olfactif, visuel et sonore avec leurs congénères, leur environnement est enrichi avec des jouets source d’interaction avec le milieu environnant et leur alimentation répond à leur besoin nutritionnel. L’ensemble de ces éléments, associé à des interactions régulières avec les animaliers se traduit par un comportement des porcelets qui ne traduit aucun état de stress au-delà des 12 premières heures post-séparation maternelle durant lesquelles les animaliers sont en permanence présents dans les salles.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par la procédure décrite (n = 36); ils seront tous euthanasiés à la fin de l’expérience.
Remplacement
Le projet s’intéressant à l’impact de l’alimentation sur les fonctions physiologiques du nourrisson, l’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale de l’effet des consortiums bactériens. Le porcelet a été choisi pour sa proximité physiologique avec le nourrisson.
Réduction
L’étape in vitro a permis de réduire le nombre de bactéries d’inétrèt et de définir deux consortiums, représentatifs du microbiote du lait de femme en termes de composition et ne présentant pas d’effets négatifs dans les tests utilisés (pas de cytotoxicité, pas de perte d’intégrité de l’épithélium, pas d’activité pro-inflammatoire aigüe). Ils seront additionnés à une PPN reconstituée et distribuée sous forme d’alimentation liquide aux porcelets. L’impact des deux consortiums bactériens sera comparé à celui d’une soultion probiotique disponible commercialement. L’effectif (nombre total = 36) a été fixé à minima afin de permettre une évaluation statistiquement significative des effets attendus (réponses physiologiques).
Raffinement
L’alimentation sera adaptée aux besoins nutritionnels des porcelets (formule « porcinisée »). Les compétences et l’expérience des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Des points limites ont été établis, entraînant la sortie de protocole ou l’euthanasie anticipée de l’animal en cas de nécessité.
Choix des espèces
Le mini-porc Yucatan est un modèle animal beaucoup plus proche de l’Homme que les rongeurs, de par sa taille, l’anatomie de son tube digestif, sa physiologie digestive, son système immunitaire et son microbiote.. S’intéressant à l’alimentation infantile, il est à noter que la dynamique de croissance et de développement des organes digestifs chez le porc nouveau-né est très proche de celle décrite chez le nouveau-né humain. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très utilisé pour des recherches en nutrition humaine. Enfin, sa taille et sa maturité à la naissance sont compatibles avec un allaitement avec des PPN dès les premiers jours de vie. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. Ils seront placés dans des cages individuelles équipées de distributeurs automatiques de lait et répartis dans deux salles (7 cages/salle). Ils seront alimentés avec une des 3 PPN porcinisées jusqu’à leur abattage à 21 jours d’âge et le prélèvement post-mortem d’échantillons tissulaires et de contenus digestifs. Trois traitements alimentaires, à avoir une PPN différant uniquement par la composante bactérienne additionnée, seront testés dans le cadre de ce projet : une PPN avec un consortium bactérien A, une PPN avec un consortium bactérien B, et une PPN avec une solution probiotique (ce traitement sera considérée comme le traitement témoin).
Rôle de l’innervation cutanée dans le développement des neurofibromes dans la neurofibromatose de type 1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris génétiquement modifiées développant des neurofibromes cutanés, elles reçoivent des injections intradermiques répétées de vecteurs viraux et des dénervations chimiques de la peau, sous anesthésies générales répétées. Le porteur affirme n'attendre aucun effet nuisible et décrit des tumeurs superficielles de taille limitée. Il indique qu'à sa connaissance aucun autre modèle animal ni système in vitro ne reproduit le développement de ces neurofibromes.
Objectifs
La NF1 est une maladie génétique qui affecte 1 sur 3000 naissances. Le gène responsable de cette maladie est nommé Nf1. C’est un gène suppresseur de tumeur qui ne fonctionne plus en raison d’une mutation. Il commande la fabrication d’une protéine : la neurofibromine. En l’absence de cette protéine (lorsque le gène Nf1 est muté), des tumeurs le plus souvent bégnines se développent. Tous les patients NF1, hommes et femmes, développent des neurofibromes cutanés (NFc), des tumeurs bégnines qui se développent au niveau des terminaisons nerveuses dans la peau. Les NFc, apparaissent généralement à partir de la puberté et leur nombre et taille ne cesse d’augmenter avec l’âge, de sorte que les patients peuvent en développer des milliers. Les mécanismes qui gouvernent le développement des NFc restent mal connus. Le rôle de l'innervation dans leur développement n’a jamais été exploré et constitue une nouvelle piste mécanistique et thérapeutique. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes d'interaction entre les nerfs et leur microenvironnement immunitaire dans la peau permettra de mieux comprendre la pathophysiologie d'autres atteintes cutanées comme le psoriasis et la dermatite atopique. Le but de ce projet est d’explorer l’hypothèse selon laquelle l’innervation cutanée contrôle le développement des NFc. Pour cela nous utiliseront le modèle murin de NF1 (NF1-KO) qui développe des NFc avec pour objectif de proposer des nouveaux traitements ciblant l’innervation des NFc.
Bénéfices attendus
Les mécanismes qui gouvernent le développement de NFc restent mal connus. Le rôle de l'innervation dans leur développement n'a jamais été exploré et constitue une nouvelle piste mécanistique et thérapeutique. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes d'intéraction entre les nerfs et leur microenvironement immunitaire dans la peau permettra de mieux comprendre la pathophysiologie d'autres atteintes cutanés comme le psoriasis et la dermatite atopique.
Procédures
Procédures 2, 3, 4 et 5 (3, 4 et 5, selon le mode d’injection choisi lors de la procédure 2) : Dépôt local des vecteurs viraux pour tracer l'innervation et pour éliminer les neurones qui innervent les neurofibromes, durée de l’intervention : 30 min pour le dépôt + 45 min d’absorption de l’adénovirus par souris (total de 1h15 par souris), 6 dépôts par souris, sous anesthésie générale. Procédures 2, 3, 4 et 5 (3, 4 et 5, selon le mode d’injection choisi lors de la procédure 2) : Injection intradermique locale des vecteurs viraux pour tracer l'innervation et pour éliminer les neurones qui innervent les neurofibromes, durée de l’intervention : 30 min d’injection par souris, 6 injections par souris, 6 x 2 (12) injections par souris (6 au jour 1 et 6 au jour 2), sous anesthésie générale. Procédure 4 : Dénervation cutanée locale des neurones sensoriels d'origine pharmacologique, utilisée pour étudier l'innervation sensorielle de peau sans pour autant induire de phénomènes douloureux, durée de l’intervention : 30 min d’injection par souris, 6 x 2 (12) injections intradermiques par souris (6 au jour 1 et 6 au jour 2), sous anesthésie générale. Procédure 5 : Dénervation cutanée globale des neurones sympathiques d'origine pharmacologique, utilisée pour étudier l'innervation sympathique de peau sans pour autant d'induire des phénomènes douloureux, durée de l’intervention : 20 min d’injection par souris, 1 x 3 (3) injections intrapéritonéales par souris (1 au jour 1, 1 au jour 2 et 1 au jour 3), sous anesthésie générale. Procédures 2, 3, 4 et 5 : Suivi du développement des NFc sous la lampe à épifluorescence : 20 min pour raser, épiler et prendre une photo du dos de la souris, 2 fois par semaine pendant la durée du suivi, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Aucun effet nusible ou indésirable n'est attendu en prenant en compte des travaux similaires récemment publiés. De plus, les NFc développés par les souris de notre modèle d'étude sont des tumeurs qui restent superficielles et se développent en région dorsale à partir de 2 mois et jusqu’à 6 mois. Elles sont plates et peuvent atteindre un diamètre de quelques millimètres mais leur épaisseur demeure très fine (de l’ordre de 1 mm maximum), ce qui les rends non détectables à l’œil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence. Leur volume est donc négligeable par rapport à celui de la souris. Leur nombre peut être d’une quinzaine par souris.
Devenir
A la fin de chaque expérience tous les animaux seront mis à mort par injection létale de Dolethal, puis la peau disséquée et analysée.
Remplacement
Pour le Remplacement ; à notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc et permettant d’étudier leur innervation.
Réduction
Pour la Réduction ; cette étude, de par sa nouveauté, nécessite des mises au point. Nous estimons que 20 souris adultes seront nécessaire pour la procédure expérimentale 2 ce qui permettra, par la suite, de réduire le nombre total d’animaux inclus dans ce projet. Ce nombre de 20 souris a été defini afin de mettre au point le mode d’injection (injection intradermique : ID ou transcutanée : T), le temps de diffusion (2 ou 3 semaines) et le type de virus utilisé (virus sans tropisme : ST ou avec tropisme axonal : TA). Nous possédons déjà une grande expertise d’analyse cellulaire et moléculaire des NFc et de manipulation des nerfs périphériques (microdissections, injections des vecteurs d’expression et des colorants). Pour la procédure expérimentale 4, 12 souris seront nécessaires pour effectuer les mises au point, ce nombre plus faible que pour la partie précédente est lié au fait que la technique utilisée d'ablation des nerfs sensoriels à l'aide de la résinifératoxine est un modèle efficace et bien documenté dans la littérature. De la même facon et pour les mêmes raisons, 12 souris seront nécessaires pour effectuer les mises au point de la procédure expérimentale 5. Nous estimons la reproductibilité des résultats avec les techniques des procédures expérimentales 4 et 5 à 80% donc nous attendons un groupe de 9-10 animaux pour etre analysé.
Raffinement
Pour le Raffinement ; nous considérons qu’une fois les mises au point validés, les variations liées à l’expérimentateur et la méthodologie seront faibles (+/- 5%) ce qui conduira a une reproductibilité des resultats d'environ 95% . Nous surveillerons régulièrement l’état de santé des animaux afin de déceler tout signe de souffrance avérée et si tel est le cas nous effectuerons une mise à mort compassionnelle. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés dans des cages contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Contrairement aux patients NF1, les souris de notre modèle d'étude NF1-KO développent des NFc dont la taille est limitée (les tumeurs ne sont pas visibles à l’œil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence) n’entrainant donc pas de phénotype dommageable. Au cours de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’un onguent ophtalmique dès la perte de conscience afin de prévenir un dessèchement de la cornée. A la suite de chaque procédure impliquant une anesthésie générale, les souris endormies seront gardées seules dans une cage propre séparée jusqu’à leur réveil.
Choix des espèces
Nous avons récemment concu le modèle de souris génétiquement modifiées qui récapitule fidèlement le développement des NFc (NF1-KO) et qui sera utilisé dans ce projet. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier les NFc et leur innervation Animaux adultes agés entre 2-6 mois. Le developpement des NFc a lieu pendant cette période.
Etude des altérations du développement du cortex cérébral dans un modèle de prématurité chez la souris (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie d'électroporation in utero de 30 minutes, puis la moitié des portées est placée huit jours dans un air appauvri en oxygène pour modéliser la grande prématurité. Le porteur signale une mortalité fœtale pouvant atteindre 10 % et des déficits cognitifs possibles chez les souriceaux. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reconstituer in vitro les connexions nerveuses entre régions du cerveau.
Objectifs
Contexte de l’étude : La grande prématurité résulte fréquemment en des périodes de manque d'oxygène (appelées périodes d'hypoxie) du fait notamment de l’immaturité des poumons, et aboutit donc à des perturbations profondes de la capacité du cerveau à utiliser et produire de l'énergie (on parle de capacité métabolique), et à des lésions diffuses du cerveau. Bien que le cerveau du nouveau-né présente une capacité à se réparer supérieure à celle du cerveau adulte, des études récentes suggèrent que cette réparation pourrait être imparfaite ou même inadaptée. Ainsi, la probabilité d’apparition de troubles cognitifs est très fortement augmentée à l'adolescence, chez les enfants grands prématurés par rapport à ceux nés à terme, possiblement du fait de la mise en place de réseaux neuronaux anormaux. Objectif du projet : Cette étude a pour but de tester comment les perturbations survenant autour de la naissance et notamment de périodes de manque d'oxygène à la naissance, entraînent une perturbation durable de l’activité métabolique cérébrale, et notamment de l’activité des mitochondries, qui sont les organelles responsables de l’essentiel de la production d’énergie cellulaire. Ces perturbations métaboliques entraîneraient à long terme des anomalies du développement des réseaux neuronaux qui peuvent expliquer la survenue plus tard dans la vie de troubles neurologiques variés. Ce projet utilisera un modèle murin de naissance très prématurée (manque d'oxygène chronique à la naissance), combiné à une méthode chirurgicale permettant d’exprimer des protéines fluorescentes dans des populations ciblées de neurones du cortex cérébral chez la souris. Il permettra de répondre en même temps à deux questions : - Quelles sont les conséquences d'un manque d'oxygène chronique à la naissance sur le développement à long terme du cerveau - Est-ce que ces défauts sont associés à un défaut métabolique persistant dans ces neurones.
Bénéfices attendus
Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) : - Sur un plan translationnel, ce projet permettra de mieux prédire les conséquences à long terme de lésions cérébrales survenant tôt dans la vie (pendant la période périnatale). Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale n’est pas totalement efficace, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. - Sur un plan fondamental, ce projet pourra fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie. La mise à mort sera réalisée par une éthode dérogatoire seule à même de préserver les tissus cérébraux.
Impact sur les animaux
Pour les femelles : La procédure permettant l'expression de marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries, implique une approche chirurgicale invasive avec réveil. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté de mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. Pour les souriceaux : Une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons sur lesquels la procédure est effectuée est constatée, bien qu’il soit difficile de déterminer si la résorption fétale résulte de l’élimination spontanée de fétus surnuméraires pendant la gestation, ou d’une mortalité liée à la procédure chirurgicale. La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau. Une réduction périnatale de l'oxygène ambiant (hypoxie) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses. Après la période de réduction de l'oxygène ambiant, les souriceaux rattrapent leur retard de croissance et les lésions cérébrales apparaissent réparées au niveau macroscopique. Des altérations à long terme de la connectivité cérébrale résultant de l’hypoxie périnatale peuvent en théorie entraîner des déficits cognitifs (défauts d’apprentissage, d’activité spontanée et de comportements sociaux) qui peuvent être détectés lors de tests de comportement mais sont généralement impossibles à détecter dans l’observation de comportements spontanés de souris élevées en cage.
Devenir
Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.
Remplacement
Les hypothèses de travail ont été au préalable validées dans des modèles in vitro et justifient à présent de confirmer par une approche in vivo, incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les séquelles neurologiques observées suite à une oxygénation insufisante, dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer totalement la complexité des connections nerveuses entre régions du cerveau, qui est l’objet de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Certains animaux devront être exclus de l’analyse à postériori pour des raisons techniques (mauvaise qualité du marquage des neurones et des mitochondries qu'ils contiennent ou de préparation histologique). Les animaux seront traités deux à deux (deux femelles, soit deux portées, en parallèle : groupe expérimental et groupe témoin) et les portées seront analysés au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus l’étude est prévue sur 4 âges correspondant à 4 stades de développement distincts, mais nous commencerons par les âges J11 et J45 qui correspondent aux effets les plus forts attendus dans notre étude. Dans le cas où les résultats à ces âges invalideraient notre hypothèse (étude négative), nous arrêterions l’étude sans procéder à l’étude des autres âges. L’analyse des projections nerveuses sera réalisée sur des cohortes d’animaux des deux sexes, par un test statistique de type ANOVA à plusieurs facteurs. Cette analyse permettra de déterminer la part de la condition expérimentale (normoxie/hypoxie), du sexe, de l’environnement, et leur interaction, sur le phénotype observé. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages immunohistochimiques variés, permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées a été mis en place pour optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Une méthode d’imagerie et d’analyse innovante sera utilisée pour tirer encore plus d’information par animal, en permettant d’observer les projections axonales dans l’ensemble des régions du cortex.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, les méthodes ont été établies dans cette espèce ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés aux âges suivants afin d'étudier les effets d'une réduction de l'oxygène ambiant à des étapes clés de la mise en place des réseaux de neurones du cerveau: - J(our après la naissance) 11, correspondant à la fin de la période de réduction de l'oxygène ambiant. - J21, correspondant à l’âge ou les connections nerveuses sont établies, mais où elles sont encore immatures - J45, correspondant à un âge où les connections nerveuses maturent. Cet âge est également pertinent car il correspond à la maturité sexuelle chez les souris (adolescence/jeune adulte), qui est un âge auquel plusieurs maladies neuropsychiatriques sont détectées (par exemple schizophrénie) - J90-J120, correspondant à un stade adulte et qui est également le stade où nous observons des déficits comportementaux.
Étude de la senescence dans la rétine par l’utilisation de souris transgéniques ciblant les cellules exprimant p16
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
1 372 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 372 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intravitréales répétées dans l'œil et, pour une partie, une induction de diabète par la streptozotocine, avec une mortalité annoncée de 10 %. Le porteur décrit ces injections comme proches de celles pratiquées chez les patients et signale un possible prurit lié à une fibrose hépatique chez les souris âgées. Il justifie le recours à l'animal par la complexité de la sénescence, présentée comme un processus d'"organisme entier" impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
En vieillissant, l’organisme accumule des cellules potentiellement toxiques appelées « cellules sénescentes » ou CS. L’impact des CS sur le corps reste incompris mais réduirait l’espérance de vie en favorisant l’apparition de différentes pathologies liées à l’âge comme l'athérosclérose, la prise de poids ou le diabète. Il est donc généralement considéré que leur délétion augmenterait l’espérance de vie et diminuerait les comorbidités associées au vieillissement. Néanmoins, leurs rôles et fonctions restent largement incompris. Elles apparaissent après une exposition à un stress et peuvent donc s’accumuler de 2 façons différentes : soit lentement et graduellement tout au long de la vie, reflétant ainsi la multitude d’agressions auxquelles tous tissu est normalement exposé, soit au contraire à la suite d’un stress intense éventuellement induit par une pathologie. L’œil, et notamment la rétine, est un exemple de tissu développant des pathologies liées à la senescence, tel que le glaucome et la dégénérescence de la macula. Ces maladies sont clairement associées à l’âge mais peuvent également constituer des conséquences d’autre pathologie, en particulier le diabète. L’objectif de ce projet de recherche fondamentale est de caractériser la senescence au niveau de la rétine ainsi que de mettre en évidence son lien avec d’autres pathologies, notamment le diabète. Cette étude pourrait ainsi aider à la compréhension et à la prise en charge de maladies provoquant des pertes ou des altérations de la vision.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules sénescentes dans la rétine, laquelle est une partie de l’œil indispensable pour son fonctionnement. Il aidera à comprendre comment la senescence participe à la genèse de l’organe, puis son impact sur le vieillissement et sa contribution à la rétinopathie induite par le diabète. Enfin, ce projet permettra également de déterminer si les CS constituent une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour soigner les rétinopathies et les déficiences visuelles induites par l’âge.
Procédures
Procédure 1 : Activation de la CreER par exposition au tamoxifène. Traitement 3 fois par jour pendant 5 jours consécutifs par dépôt de gouttes sur les yeux. -- Procédure 2 : Traitement aux senolytiques. 1 ul de solution sera injecté dans l'œil par de façons intravitreal 3 jours avant leurs mises à mort. Les souris auront été préalablement anesthésiées. --Procédure 3 : Traitement au liposome-clodronate. Cette procédure consistera donc à traiter les yeux des souris du modèle 1 (p16-Cre/GFP) par injection intravitreal d’1 ul. Les souris auront été préalablement anesthésiées. Ce traitement sera fait sur des souris de 20 jours avant leurs mises à mort à 40 jours, mais également, une fois par mois, sur des souris de 1 an jusqu'à leurs mises à mort à 18 mois (donc 4 injections). --Procédure 4 : Traitement à l'anti-VEGF. Administré aux souris de modèle 1 (p16-Cre/GFP) et 2 (p16-Cre/DTA) par injection intravitreal a raison de 1ul par œil. Nous réaliserons cette procédure sur des souris jeunes (20 jours) et plus vieilles (1 an). Les souris jeunes seront mises à mort à 40 jours après une seule injection à 20 jours. Les souris âgées seront mises à mort à 18 mois après une injection tous les mois à partir d'un an (donc 4 injections). Les souris auront été préalablement anesthésiées. --Procédure 5: Induction du diabète par injection IP de STZ. 1 injection par jour durant 5 jours consécutifs sur des souris de 8 semaines. Les souris seront mises à jeun les 4 heures précèdent les injections.
Impact sur les animaux
1--Dans les procédures 1, 2 et 4, les souris p16-Cre/DTA (modèle 2) de 12 mois et plus pourraient développer une fibrose hépatique se traduisant par un prurit. En effet, nos analyses précédentes montrent les souris avant 1 an n’auront pas le temps d’activer le gène p16 dans un nombre significatif de cellules, tandis qu’a 12 et 18 mois la déplétion de CS pourrais être assez importante pour affecter la santé de la souris. Par conséquent, nos souris en reproduction générant les animaux expérimentaux seront mises à mort avant 1 an, tandis que les souris assignées aux différentes procédures seront suivies de façon hebdomadaire à l’aide d’une feuille de score adaptée. 2—Dans les procédures 2, 3 et 4, les souris devront subir des injections intravitreal. Ce type d’administration est similaire à ce qui se fait pour traiter les patients contre la dégénérescence maculaire ou les rétinopathies d’origine diabétique. Les souris seront anesthésiées pendant la procédure et ne devraient subir qu’un inconfort passager et limité apres leur réveil. 3—Dans la procédure 1, le traitement se fera par application d’une solution non toxique et non irritante sur les yeux. Nous n’attendons pas de toxicité liée à ces molécules dans le cadre d’une application topique. 4—La procédure 5 consiste à réaliser des injections de streptozotocin (STZ) pour induire le diabète. Le STZ est une toxine connue pour induire le diabète en ciblant spécifiquement les cellules sécrétrices d’insuline du pancréas. Ce produit est relativement spécifique avec peu d’effet secondaire et une toxicité réduite. Cette toxicité survient très rapidement, avant dix jours, et est due à une hypoglycémie induite par un relâchement important d’insuline dans le sang lors de la mort de cellules sécrétrices du pancréas : l’ajout de sucrose dans l’eau pendant 48 heures permet de limiter celle-ci à moins de 5%. Une mortalité évaluée à 10% survient ensuite durant une période allant de 10 jours à 9 semaines après l’injection de STZ, mais est due aux complications de l’hyperglycémie induite par le traitement. Les paramètres importants à observer pour limiter la souffrance chez l’animal sont faciles à détecter : perte de poids, torpeur, prostration. On notera que la souris sera mise à jeun 4 heures avant chaque injection, générant potentiellement un stress et un inconfort limité en intensité et en durée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
L'étude de la sénescence est un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire. Il est ainsi impossible de mimer in vitro ou in silico le vieillissement de la rétine et l’effet du système immunitaire sur ce processus. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable et trop complexe pour être mimé in vitro.
Réduction
Les effectifs ont été choisis en prenant en compte 2 paramètres : -Le nombre minimum de souris permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous obtenons 16 souris/groupe en utilisant le logiciel Gpower avec un test de student unilatéral et paramétrique (comparaison de 2 groupes indépendants sous loi normale) de puissance statistique modérée (0.7) associé à un effet taille important (0.8) pour p≤0.05. -Le taux de mortalité/echec associe au travail sur les animaux et à la part d’incertitude des différentes procédures. Nous n’attendons pas de mortalité particulière pour la plupart des procédures exceptées dans la procédure 5. En effet, les injections de STZ induiront une certaine mortalité (15%) et nous estimons que 20% ne développeront pas au traitement. Par conséquent, seulement 65% des souris deviendront diabétiques. Par conséquent, la plupart des groupes comprendront 20 souris exceptés pour la procédure 5 où nous choisirons 31 souris/groupe STZ de façon à compenser cette mortalité/resistance au traitement.
Raffinement
Pour limiter la douleur que nos procédures expérimentales pourraient induire, les souris seront suivies par les expérimentateurs et le personnel technique avec une fiche de score fournie (annexe 1). Notre fiche de score est basée sur plusieurs observations d’ordre général (feuille de score standard) ou plus spécifique, car associée à un génotype ou traitement particulier (injection de produit dans différentes parties de la souris ou traitement par goutte). Ces fiches comprennent des points limites qui correspondent à un score maximum prenant en compte les différents paramètres cités plus haut et seront remplies tout au long de l'expérimentation. Ces points limites seront adaptés au modèle et suffisamment précoces afin d’anticiper toute souffrance à l’animal, notamment dans le cadre de la procédure 5 avec ‘induction du diabète. Etant donné que les yeux de nos souris seront fréquemment traités, un suivi particulier orienté sur cet organe sera fait. Les injections intravitreals seront réalisées sous anesthésie. De façon plus général : -Par souci de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage et conservés intact -Un enrichissement permettant l’expression des besoins comportementaux et physiologiques de l’espèce (morceau de bois, abris dans la cage...). -les animaux seront manipulés dans le calme, hébergés 4 par cages, avec un rythme nycthéméral de 12h, eau et nourriture à volonté.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude exploratoire et innovante avec l’utilisation de modèles murins récents (P16-Cre et P16CreER) qui n'existent pas chez d'autres espèces. La sénescence est un phénomène complexe impliquant plusieurs types cellulaires, voire plusieurs organes différents, comme le prouve sa composante immunitaire. Elle correspond à un processus impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, qui nécessite une étude au niveau de l’organisme entier.
Evaluation des effets d’un traitement pharmacologique dans un modèle murin de troubles neurodégénératifs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 128 léger. Souris transgéniques modélisant la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des injections intrapéritonéales pendant un à dix jours puis passent une batterie de tests comportementaux évaluant anxiété, mémoire et interactions sociales. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable de la molécule, déjà commercialisée chez l'humain. Le descriptif des bénéfices et du remplacement reste bref, l'essentiel de la justification portant sur la fidélité du modèle murin aux symptômes humains.
Objectifs
Ce projet a le but d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement pharmacologique dans un modèle murin de troubles neurodégénératifs, la maladie d'Alzheimer. Cette molécule est un activateur des canaux pour le potassium et n’a pas d’effets nocifs importants à la dose utilisée dans le projet. L’objectif final du projet est d’identifier une nouvelle approche thérapeutique pour la maladie d'Alzheimer avec une molecule déjà existante.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de voir l’efficacité thérapeutique d’une molécule pour un nouveau potentiel traitement de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales pendant une période de courte durée (1 ou 10 jours) et ensuite leurs comportements seront analysés pour déterminer leurs altérations comportementales. Les animaux sont soumis à une batterie de test comportementaux afin d’évaluer l’effet du traitement sur l’anxiété, la mémoire, les interactions sociales et la réponse sensorielle pour une durée totale de 5 jours.
Impact sur les animaux
Cette molécule est déjà sur le marché chez l’homme pour des pathologies musculaires. En outre, aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux suite au traitement de 10 jours avec cette molécule. Des travaux précédents ont montrés aucune perte de poids, ni altération comportemental suggérant une altération du bien-être animal. Au contraire, des données préliminaires chez un autre modèle murine ont montré une récupération de certains troubles comportementaux suite à un traitement aigu ou chronique avec la même molécule.
Devenir
Les animaux passés en tests de comportement seront sacrifiés par inhalation de CO2. Les expériences de comportements pouvant induire des modifications cérébrales et donc interférer avec les paramètres à mesurer, seuls les animaux non testés seront sacrifiés et leur cerveaux prélevés pour des études de tissus.
Remplacement
Notre projet doit impérativement être réalisé chez un modèle murin pour permettre l’évaluation des effets thérapeutiques du traitement proposé. Le but de ce projet est l’évaluation des altérations comportementales des souris génétiquement modifiées étant donné que celles-ci représentent les symptômes à traiter de cette pathologie.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé par des études pilotes précédentes avec des souris d’une autre lignée génétiquement altérés. Ces études ont démontré que n=12 est nécessaire pour obtenir une différence significative entre souris transgéniques et leur congénères WT dans la plupart des tests comportementaux et n=8 pour les principales altérations cérébrales. Cette différence significative est la base pour évaluer les effets thérapeutiques de la molécule dans le modèle murin et doit donc être utilisé pour ce projet.
Raffinement
Pour limiter au maximum le stress des animaux, ceux-ci sont habitués à l’expérimentateur (le même pendant toute la durée de l’expérience) et aux différents dispositifs utilisés. Les substances injectées n’ont à ce jour pas montré d’effet néfaste sur l’état général des animaux. Néanmoins, pour chaque expérimentation, les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler d’éventuels comportements pouvant traduire une souffrance de l’animal. Parmi ces critères : perte de poids, agressivité vis-à-vis des congénères, automutilation, diminution de l’activité des animaux en cage d’hébergement, respiration anormale (une description détaillant les points limites est fournie dans la grille de score attachée). Dans la mesure où l’animal présenterait une de ces caractéristiques, il sera isolé de ses congénères, la procedure sera arrêté et l’évolution du poids, du pelage et de la mobilité dans la cage sera surveillée. S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté afin de s’assurer qu’il ne s’agit pas d’un problème plus grave de nature infectieuse par exemple. Il sera alors exclu de l’étude et des analyses statistiques. Si jugé nécessaire sur la base de l’évaluation des points limites, l’animal en souffrance sera sacrifié par dislocation cervicale et sa mort vérifié par l’absence de respiration et de reflexes principaux. Concernant l’hébergement, les animaux sont maintenus dans des cages collectives de 3 à 10 individus (leur taille varie en fonction du nombre) avec comme enrichissement des carrés de coton (Nestlets) pour permettre la construction du nid. Chaque personne manipulant les animaux possède la formation à l’expérimentation animale (concepteur ou opérateur) et suit régulièrement la formation continue en expérimentation animale. En plus, tout le nouveau personnel reçoit un entrainement supplémentaire dans la manipulation des animaux par la responsable de l’animalerie avant d’être admis à participer au déroulement pratique du projet de recherche.
Choix des espèces
Des souris transgeniques et leurs congénères de type sauvage seront utilisés dans ce projet. Les mutations concernent les gènes codant pour le précurseur de l’amyloïde et la preseniline. Ces mutations sont nécessaires pour induire de façon precoce les principales caractéristiques (plaques amyloïdes) de la maladie d’Alzheimer. Les souris transgeniques ne présentent pas d’altérations développementales majeures par rapport à leurs congénères de type sauvage. Ce modèle nous permet d’avoir des souris présentant des déficits comparables avec les symptômes chez l’humain de façon constante évitant toute manipulation supplémentaire des animaux. Les animaux vont être utilisés à un stade adulte (entre 3 et 4 mois). L’utilisation de l’âge adulte nous permettra de vérifier la puissance du potentiel thérapeutique de notre traitement pharmacologique en vérifiant ses effets à un âge où l’apparition des plaques amyloïdes commence à s’agglutiner chez les souris transgéniques.