Recherche fondamentale

984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras, soumises à des cycles de perte et de reprise de poids, à des gavages de tamoxifène ou de doxycycline et à des prélèvements sanguins répétés, certaines isolées cinq jours en cage de calorimétrie, pour étudier les cellules progénitrices du tissu adipeux. Le porteur écrit que "chaque animal sera exploité afin d'apporter le maximum d'information". Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces fonctions et que seule une approche in vivo permet de les explorer.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer l'implication des progéniteurs du tissu adipeux dans les fonctions du tissu adipeux et les conséquences métaboliques à l'échelle des tissus adipeux et systémiques Nous chercherons (i) à identifier des acteurs moléculaires importants dans la fonction fibrotique et inflammatoires de progéniteurs et (ii) à savoir si moduler la fonction des progéniteurs suffit à améliorer en locale les fonctions du tissu adipeux et le métabolisme systémique dans le contexte de l’obésité et des variations pondérales.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'identifier les acteurs moléculaires critiques de la fonction des progéniteurs du tissu adipeux, ce qui permettra à terme de développer des stratégies innovantes pour permettre de limiter les désordres métaboliques qui sont associés à l'obésité. De plus, nos résultats permettront également de trouver des moyens d'optimiser la perte de poids et ses effets métaboliques.

Procédures

Les animaux seront rendus obèses à l’aide d’un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines. Chez les animaux anciennement obèses, la perte de poids) est permise soit par le remplacement du régime gras par du régime chow sans restriction calorique et donc disponible ad libitum ; soit par une restriction calorique modérée opérée alors que les animaux sont toujours sous régime gras. Dans ces 2 cas de figure, la perte de poids s’étend sur une période de 4 semaines. Pour le modèle yoyo, l’obésité est induite par un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines, ensuite une perte de poids est induite par le remplacement du régime gras par du régime chow (ad libitum) pendant 4 semaines. Puis une ré induction de l’obésité est opérée par une réexposition au régime gras pendant 4 semaines. Chez les souris minces, obèses, anciennement obèses ou yoyo, pour l'étude du contrôle de la glycémie, les animaux seront mis à jeun pendant 4 heures et ils subiront des prises de petits volumes de sang (environ 150ul). Ainsi qu'un gavage ou une injection ip en début d'expérience. Le test de tolérance au glucose ou le test de sensibilité à l’insuline durent environ 2,5 heures. Chaque gavage ou injection dure moins de 20 secondes. Les prises de sang durent moins de 30 secondes. Pour les besoins de certains modèles OGM inductibles, les animaux se verront administrer du tamoxifène par gavage (5jours successifs, 150ul en moyenne, chaque gavage dure moins de 20 secondes) ou de la doxycycline (ajoutée au régime gras pendant 8 semaines ou ajoutée au régime chow pendant les 4 semaines de perte de poids). Afin d'étudier l'homéostasie énergétique, certains animaux seront analysés en cage de calorimétrie pendant 5 jours, ce qui nécessite l’isolement des animaux au cours de la période d’analyse. L’analyse de composition corporelle par RMN ne dure pas plus de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables du projet sont ceux liés à l'induction de l'obésité. En effet, la consommation d'un régime enrichi en lipides tel que celui utilisé ici peut mener à une élévation du taux de cholestérol sanguin, une altération de la glycémie et de la réponse au glucose, qui sont des facteurs de risque cardiovasculaire

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les différents tissus adipeux.

Remplacement

Dans le tissu adipeux, la fonction cellulaire des progéniteurs va être déterminée par le microenvironnement tissulaire complexe. De plus, nos données montrent que l’état d’activation des progéniteurs va en retour avoir des conséquences histologiques et fonctionnelles sur le tissu adipeux. Ainsi, il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire les fonctions des progéniteurs in situ. L’évaluation de l’activité des cellules progénitrices du tissu adipeux en réponse à des changements d'environnement métabolique sont des processus biologiques et physiopathologiques complexes qui ne peuvent être explorés que par des approches expérimentales in vivo.

Réduction

Chaque animal sera exploité afin d’apporter le maximum d’information. Si possible, nous utiliserons les données de manière transversale entre les protocoles afin de réduire le nombre d’animaux. Lorsque cela est possible techniquement, sans affecter la qualité des données recueillies, les modèles de souris partageant un même groupe contrôle seront étudiés en même temps afin de réduire le nombre d’animaux. L’approche de croisement pour produire les animaux génétiquement modifiés est optimisée pour qu’une majorité des animaux produits soient utilisés. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. 984 animaux sont impliqués

Raffinement

Les animaux sont regroupés à 4-5 animaux par cage et le milieu est enrichi avec des bandes de papier et des abris en carton à usage unique. Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire la sévérité et l’intensité de la douleur, ainsi que le stress généré au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur et le stress, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un suivi quotidien sera réalisé afin de veiller au bon état de santé des animaux. De plus, la mise en place de points limites permettra de repérer au plus tôt tout problème. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux ainsi que de les habituer aux manipulations et ainsi de générer moins de stress lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose).

Choix des espèces

Le modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. La présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Nos études requièrent que les animaux soient sexuellement matures avec un métabolisme adulte. Les souris seront donc mises sous régime à partir de l’âge de 8 semaines.

96 cailles japonaises vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de plumes et de sang, et pour une partie un protocole de stress chronique associant chaleur, exposition à une silhouette de prédateur avec diffusion de cris, et confrontation à un objet nouveau, pour étudier l'effet du stress sur le vieillissement cellulaire. Le porteur indique que ce protocole vise à perturber l'homéostasie des oiseaux et à provoquer une angoisse, sans souffrance physique attendue selon lui. Les cailles sont tuées par dislocation cervicale sans anesthésie pour prélèvement de tissus.

Objectifs

L’évolution de nos sociétés modernes expose de façon croissante les animaux et les humains à une multitude de stimuli stressants. Chez l’humain et l’animal, il est connu qu’une exposition accrue au stress et à l’augmentation associée d’hormones glucocorticoïdes peuvent accélérer le vieillissement, mais les mécanismes physiologiques sous-jacents restent mal connus et débattus. Les télomères qui sont les extrémités protectrices de nos chromosomes raccourcissant avec l’âge et l’exposition à divers stress cellulaires, sont un marqueur cellulaire de vieillissement chez les vertébrés endothermes. Leur longueur et la vitesse à laquelle ils raccourcissent sont des prédicteurs de la survie et longévité chez l’hommes et de nombreuses espèces aviaires. L’exposition à divers stress environnementaux est connue pour accélérer le raccourcissement des télomères, mais des questions importantes restent non élucidées et sont le but de ce projet de recherche. Premièrement, il n’est pas clair si les effets du stress chronique sur le vieillissement cellulaire sont directement et/ou uniquement liés à l’augmentation chronique des hormones glucocorticoïdes, ou bien à d’autres bouleversements de l’homéostasie intervenant lors d’une exposition chronique à un environnement stressant. Deuxièmement, les mécanismes cellulaires liant exposition au stress et accélération de la vitesse d’érosion des télomères restent débattus. En effet, il a initialement été suggéré que l’augmentation des glucocorticoïdes avait pour conséquence de favoriser un état de stress oxydant qui est connu pour accélérer l’érosion des télomères, mais cette hypothèse a récemment été remise en question par la ‘metabolic telomere attrition hypothesis’. Cette dernière stipule que le raccourcissement des télomères lors d’un stress chronique est la conséquence d’une reprogrammation du métabolisme cellulaire (y compris du fonctionnement mitochondrial via la répression de mTOR (mechanistic target of rapamycin)) favorisant la restauration de la balance énergétique en conditions de stress. Apporter une réponse à ces deux premiers points permettra de savoir quelle stratégie thérapeutique potentielle pourrait être employée pour limiter les effets délétères du stress sur le vieillissement cellulaire. Enfin, nous n’avons pas tous la même sensibilité par rapport au stress. Déterminer si la sensibilité individuelle au stress influence l’impact du stress sur le vieillissement cellulaire est le troisième objectif de ce projet.

Bénéfices attendus

Le projet apportera des bénéfices en termes de connaissances fondamentales concernant : - l’origine de l’effet du stress sur l’accélération du vieillissement cellulaire - les mécanismes cellulaires sous-tendant l’effet du stress sur le vieillissement cellulaire - l’importance de la sensibilité au stress sur le vieillissement cellulaire Ces connaissances fondamentales sont notamment nécessaires dans une optique de mise au point d’interventions limitant les effets délétères du stress chronique sur le vieillissement (e.g. supplémentation en antioxydants si le stress oxydant est un point central vs. supplémentation en rapamycin si l’inhibition de mTOR est identifié comme un facteur clé), aussi bien chez des animaux d’élevage que chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à trois types d’interventions : - Prélèvement de plumes de poitrine (4x étalé sur 40j) - Prélèvement sanguin à la veine alaire (5x étalé sur 40j) - Contention de 10min pour induction d’un stress de contention (1x sur les groupes CONT et STRESS, 12x sur le groupe STRESS, c’est à dire 2x/semaine, car partie prenante du protocole de stress chronique modéré) Les animaux du groupe STRESS seront également soumis à : - Stress thermique de chaleur (passage de 21°C à 30°C) pendant 4h une fois par semaine, soit 6 fois au total - Stress de prédation (silouhette de prédateur au plafond et playback de vocalisations) pendant 2h une fois par semaine, soit 6 fois au total - Stress lié à la présence d’un nouvel objet pendant 4h une fois par semaine, soit 6 fois au total

Impact sur les animaux

Les protocoles de stress chronique et d’augmentation des glucocorticoïdes sont conçus pour engendrer une perturbation de l’homéostasie des animaux pouvant ralentir modérément la croissance des individus (non-observé aux doses choisies, voir références ci-dessous) et créer une potentielle angoisse, mais théoriquement pas de souffrance physique. Ils ont déjà été employés avec succès chez le modèle aviaire choisi, et ce à des stades de développement équivalent et à des degrés plus sévères : glucocorticoïdes dans l’eau de boisson : https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2007.06.423 ; stress chronique multifactoriel: https://doi.org/10.1016/j.bbr.2011.08.010. L’induction d’un ‘stress‘ modéré chez les animaux n’est pas un effet indésirable mais l’effet désiré dans le cadre de la question scientifique de ce projet.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale (sans anesthésie) pour permettre le prélèvement de tissus (principalement muscle pectoral et foie, mais les autres organes tels que le cerveau, le cœur et les organes reproducteurs seront aussi collectés et conservés à -80°C pour de potentielles mesures en collaboration avec d’autres laboratoires). Une partie des tissus fraichement collecté sera utilisée pour l’évaluation du fonctionnement mitochondrial, et une partie stockée à -80°C pour la détermination de la longueur des télomères, du stress oxydant, et de l’expression génique de plusieurs cibles par RT-qPCR (e.g. mTOR, nr3c1). Cette étude sur tissus est nécessaire pour évaluer la potentielle conservation des effets des hormones glucocorticoïdes et de l’exposition au stress entre organes, ce qui ouvrirait la porte à l’utilisation future des cellules sanguines comme cible principale peu invasive pour l’évaluation de l’impact de ces facteurs sur la physiologie du vieillissement.

Remplacement

Le projet vise à comprendre l’effet du stress sur le vieillissement cellulaire et les mécanismes physiologiques/cellulaires sous-jacent. L’exposition à un environnement stressant engendre une multitude de bouleversements physiologiques qui implique différentes cellules et différents organes, mais également les communications inter-cellulaires et inter-organes, ce qui ne peut pas être reproduit via des approches substitutives à ce jour.

Réduction

Le nombre d’individus utilisé a été réduit au minimum nécessaire (32/groupe) à l’obtention de résultats statistiquement appropriés aux objectifs (détection d’un effet modéré Cohen’s d = 0.50). Cela a été possible grâce à deux éléments clés : - L’utilisation partielle d’un suivi longitudinal où chaque individu sera échantillonné (sang et plumes) avant d’entrer en procédure, ce qui permettra de corriger les données similaires obtenues post-traitement par la variabilité interindividuelle initiale - L’utilisation de trios d’individus ayant les mêmes parents, ce qui permettra d’augmenter la puissance statistique pour détecter des effets liés au traitement pour les paramètres présentant une héritabilité moyenne à forte ; l’héritabilité des télomères étant forte chez la caille japonaise (h2 ~ 0.65)

Raffinement

Les différentes phases du protocole ont été conçues avec soin pour favoriser le bien-être des animaux expérimentaux aussi bien avant l’entrée en protocole, que pendant les procédures : -incubation/éclosion en conditions optimales chez l’éleveur spécialisé - transport à un âge (jour 5) résultant du meilleur compromis entre précocité (nécessaire pour le projet) et robustesse des poussins (nécessaire pour le bien-être) - transport par un transporteur agréé (SLAT services) à une température optimale (+26°C). - phase d’habituation au nouvel environnement de stabulation (5j), boxes de stabulation dédiés aux oiseaux entièrement rénovés - stabulation en groupes mixtes au sol en densité modérée et adaptée (boxes de 3.5m2 pouvant accueillir 32 individus 150g), nourriture et eau ad libitum - enrichissement structurel (cachettes, brises-vue, capsules de bouteilles plastiques) et enrichissement alimentaire (litière dense propice au fouissage, vers de farine dispersés 1x/jour dans la litière) selon https://doi.org/10.1080/00071660601084333 - suivi quotidien par un personnel qualifié (3 animalières + porteur de projet) et tenue d’un cahier de suivi - Tenues de couleur spécifique pour le personnel lors de l’induction de stress chronique par contention, ajout de nouvel objet, etc. - Attention particulière portée à l’état du plumage et à la posture des oiseaux lors des visites quotidiennes (indicateurs majeurs du bien-être chez cette espèce) - Écartement de la procédure d’un animal si signe de souffrance et/ou gain de masse < 20% du gain de masse du groupe contrôle (= points limites) - Procédure d’euthanasie réalisée par le porteur du projet car expérimenté sur cette espèce

Choix des espèces

La caille japonaise (Coturnix japonica) est un excellent modèle aviaire pour les études en laboratoire, notamment dans un contexte d’étude du vieillissement. Leur cycle de vie court (50-60j entre l’éclosion et la maturité sexuelle) permet de réaliser des études couvrant toute la vie ‘précoce’ des individus en un temps réduit, et comme la grande majorité du raccourcissement des télomères intervient durant la croissance, notamment chez ce modèle aviaire, c’est de ce fait le modèle le plus adapté au questionnement scientifique du projet décrit dans ce document. Les animaux seront utilisés au stade poussin (début de procédure à 10j), car la majorité du raccourcissement des télomères est observé lors de la croissance (éclosion au jour 60) des individus comme précédemment démontré chez cette espèce.

1 772 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuée à l'issue et douze réutilisées. Des cellules de leucémie aiguë myéloïde, de lignées ou issues de patients, leur sont injectées, parfois directement dans le tibia sous anesthésie, pour évaluer de nouveaux traitements. Le porteur cite des effets attendus tels que douleur au point d'injection, douleurs chroniques, perte de poids et développement tumoral, et affirme qu'il n'existe "aucune autre méthode probante" pour remplacer l'animal en préclinique. Les souris sont tuées en fin de procédure pour analyse de l'implantation de la leucémie.

Objectifs

La Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM) est une hémopathie maligne traitée principalement par chimiothérapie conventionnelle associé à une forte toxicité et un taux de rechute important. Le projet porte sur l’évaluation de nouveaux traitements et de nouvelles cibles dans les LAM préalablement identifiés et validés in vitro sur modèles cellulaires. Il n’existe actuellement aucune autre méthode probante se substituant à l’expérimentation animale pour les évaluations précliniques. Ce projet est développé par un laboratoire académique et financé dans les tutelles et des associations de lutte contre le cancer et les leucémies. L’étude in-vivo validera les cibles et les candidats médicaments dans des modèles murins C57BL/6 ou NOD-SCIG -gamma (NSG).

Bénéfices attendus

Les retombées du projet sont de valider les effets anti-leucémiques / différenciateurs de nouveaux composés à visée anti-tumorale et de valider de ouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans la leucémie aigue myéloïde.

Procédures

Certains animaux auront une injection en intra-tibial des cellules leucémiques sous anesthésique (isoflurane) et analgésique (buprenorphine). La durée de l'intervention est de 3 à 5 minutes et est effectuée en transcutané sans ouverture. Le nombre de souris minimum (mise au point et xénogreffes de cellules de patients PDX) sera au maximum de 572 animaux. Si les résultats des étapes de mise au point des modes d'injection (intra-péritonéal, intra-veineux ou intra-tibial) pour les lignées leucémiques humaines montrent la nécessité d'effectuer les procédures expérimentales en injection intra-tibiale, ce nombre passera au maximum à 1436 animaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une possible une douleur transitoire au point d’injection, des douleurs chroniques, une perte de poids >15%, le développement excessif d'une tumeur ou grosseur au point d’injection sans que la charge tumorale n’excéde 10 % du poids normal de l'animal sujet aux expériences thérapeutiques, ou qui gêne les mouvements normaux de l’animal ou qui est ulcérée, la perte d’alimentation brutale ou encore une tension abdominale signe de splénomégalie ou d’ascite induisant une forte prise de poids et liée au développement de certains modèles de leucémies aigues myéoïdes, des tremblements, secousses, convulsions, boiteries ou décubitus permanent.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour analyse de l'implantation de la leucémie des modèles leucémiques ou des effets des traitements. Les souris controles seront trop agées à l'issues des procédures pour éventuellement être réutilisées dans les procédures d'implanation des cellules leucémiques.

Remplacement

L'objectif est d'évaluer les effets anti-cancéreux et/ou différentiateurs de nouveaux composés anti-cancéreux. La souris est le modèle animal le plus largement utilisé par la communauté scientifique en oncologie et étude de effets antitumoraux in vivo. Le modèle murin immunodéficient est le seul disponible pour la mise en place de modèles de leucémies induites à partir de lignées ou cellules humaines. Certaines lignées utilisées sont des lignées murines : le modèle murin syngénique sera alors utilisé.

Réduction

Le nombre d’animaux sera de 3 par groupe pour les étapes de mise au point des modèles et à 8 par groupe pour les expérimentations proprement dites, nombre modulé selon une évaluation statistique par tests non paramétriques pour atteindre une valeur statistique de p-value

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe afin d’éviter le stress de l’isolement et avec des enrichissements du milieu. Le personnel est compétent pour déterminer si l’animal n’est plus dans sa zone de confort et la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre plateforme garantit l’amélioration des soins et des conditions de vie des souris. Si l'un des points limites est atteint (perte de poids, détérioration irréversible de l’état de l’animal impactant sa survie, perte d’alimentation brutale, forte prise de poids, tremblements, secousses, convulsions, boiteries, décubitus permanent), l'animal sera euthanasié pour arrêter ou empêcher des souffrances.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus largement utilisé par la communauté scientifique en oncologie et étude des effets anti-tumoraux in vivo. Le modèle murin immunodéficient est le seul disponible pour la mise en place de modèles de leucémies induites à partir de lignées ou cellules humaines. Certaines lignées utilisées sont des lignées murines : le modèle murin syngénique doit alors être utilisé. Animaux injectés à 4-8 semaines (optimum de prise de leucémie décrit dans la littérature et validé antérieurement au laboratoire).

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, une inhalation et une irradiation reproduisant l'exposition à des substances génotoxiques comme l'acétaldéhyde, le formaldéhyde ou les UV, pour étudier la réparation de l'ADN et le risque de cancer. Le porteur indique que les irradiations peuvent provoquer une inflammation aiguë de la peau et affirme que l'exposition aux produits mutagènes sera trop courte pour causer des lésions visibles. Les souris sont ensuite tuées pour analyse des tissus et organes.

Objectifs

Les ultraviolets et les psychotropes comme le tabac ou l’alcool contribuent au développement de tumeurs. L’exposition à la lumière UV ainsi qu’aux drogues récréatives endommagent l’ADN des cellules humaines et augmentent le risque de cancers dans la population en induisant des mutations sur l’ADN. Les altérations produites par ces substances nuisibles à l’ADN sont pris en charge par des systèmes de protection de l’ADN tels que la réparation par excision de nucléotides (NER) et, à défaut, par les polymérases translésionnelles (TLS). Des lésions non réparées entraînent des mutations qui augmentent le risque de cancers. Ces produits communément présents dans de nombreuses drogues récréatives, tels que l’acétaldéhyde, le formaldéhyde et le benzo(a)pyrène, ainsi que l’exposition prolongée et chronique aux UVs, produisent une large gamme de lésions à l’ADN qui sont réparées par le NER. Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare causée par une déficience constitutive du NER. Les patients XPs ont un risque de cancer de la peau 10 000 fois plus élevé, dû à leur inaptitude à réparer les dommages induits par les UV. Il a été montré que les patients XP ont un risque de cancer interne plus de 100 fois plus élevé. Les processus mutationnels impliqués ne sont pas bien compris. Il est possible qu’ils soient dus à l’action de sources mutationnelles interne ou externe au corps, telles que l’acétaldéhyde ou le formaldéhyde. De plus, une augmentation du risque de cancers corrélé à des mutations délétère sur un allèle (mutation inactivant une copie d’un gène, c’est-à-dire une mutation hétérozygote) de gènes du NER a été montrée dans des modèles murins et humains. La consommation excessive des psychotropes cités pourrait impacter le risque de cancer chez des porteurs de ces mutations NER dans la population générale. Certaines populations présentent ces mutations hétérozygotes de manière particulièrement fréquente, allant de 0,5 à 2% de la population. L’évaluation de la susceptibilité aux cancers associés à l’abus de ces substances, ainsi qu’à l’exposition excessive aux UV est donc de haute pertinence clinique. Notre projet vise à identifier les conséquences au niveau de l’ADN et des mutations engendrées par l’exposition chronique d’animaux adultes et pendant la grossesse à ces substances cancérigènes et au rôle joué par le NER et la voie des TLS.

Bénéfices attendus

Identifier la quantité et le type de mutations engendrés par ces sources cancérigènes chez nos souris nous permettra de préciser les diagnostiques fait pour les cancers humains, ainsi que la mise en évidence d’une potentielle population particulièrement à risque pour l’exposition à ces substances.

Procédures

Gavages: nombre= 3, durée = 2 minutes . 4 injections intrapéritonéales :30 secondes:. Inhalation (1), durée: 10 minutes. Irradiation (1) : durée: 14 minutes.

Impact sur les animaux

Les irradiations sont susceptibles de provoquer des inflammations de la peau de manière aigue et contenue à la zone d’irradiation. L'exposition aux produits mutagènes ne sera pas d'une durée suffisante pour provoquer des lésions macroscopiques qui entraîneraient des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux se révèle essentielle pour l’étude de la mutagenèse dans un contexte prénatal. En effet il est impossible de répliquer ce processus complexe de développement ex vivo. Pour ce qui est de la tumorigenèse induite par les UV, les études In vitro, bien que points de départ nécessaires et importants, ne nous permettent pas de modéliser ni de prendre en compte le processus complexe qu’est la tumorigenèse chez un être vivant complet, avec toutes les interactions entre organes.

Réduction

Notre projet n’étudie pas de caractéristiques quantifiables sur les animaux mêmes, mais sur des séquençages fais à partir de tissus récupérés sur ces animaux. De ce fait, les statistiques elles-mêmes sont fait sur les résultats de séquençage, et ne prennent pas en compte le nombre d’animaux. Nous avons besoin de 10 individus différents par génotypes et traitements pour rendre nos statistiques robustes sur l’analyse haut débit.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux, ceux-ci sont suivis quotidiennement par le même manipulateur et les mêmes animaliers. Pour les interventions et procédures des anesthésies seront effectuées. Un traitement d’appoint sous forme de crème analgésique est prévu en cas d’inflammation cutanée suite aux expositions aux ultraviolets. Des points limite et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les 9 modèles nécessaires sont tous d’ores et déjà existants chez la souris sur un fond génétique C57BL/6 et/ou BALB/c. L’organisation du système vasculaire de la souris et les relations avec le microenvironnement tumoral sont très proches de celles observées chez l’Homme. L’utilisation de la souris permet d’obtenir des effectifs suffisants et des lots homogènes permettant une reproductibilité des résultats. Les stades choisis sont justifiés par les maladies qui peuvent apparaître, suivant les carcinogènes, à différents stades de la vie dans l'espèce humaine. Des femelles et mâles à maturité sexuelle (à partir de 8 semaines) pour les expériences sur les animaux adultes et pour permettre un maintien de la lignée. Des femelles pour les traitements au cours de la gestation. Pour analyser la mutagenèse prénatale après exposition aux différentes génotoxines, nous aurons besoin d'individus âgés de 2 à 3 semaines.

65 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Chaque lapin subit une chirurgie d'environ vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, dans le but d'offrir ce dispositif à des chercheurs dans le cadre de prestations ou de collaborations. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'est attendue et que les animaux supportent très bien le cathéter et le gilet. Le projet installe le cathéter pour faciliter les prélèvements et injections des expériences ultérieures auxquelles ces lapins seront soumis.

Objectifs

Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 65 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2022.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.

Impact sur les animaux

La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.

Remplacement

Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.

Réduction

Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 65 sur 1 an.

Raffinement

Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de lymphome leur est implantée sous la peau par chirurgie sous anesthésie, puis suivie par des séances d'imagerie IRM sous anesthésie, jusqu'à quatre par animal, pour démontrer l'intérêt de cette imagerie en oncologie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraîne la mise à mort de l'animal. Les souris sont tuées en fin de procédure pour congélation ou fixation des tumeurs.

Objectifs

Le projet présenté vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) en oncologie . L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée en clinique. Nous attendons de l'IRM qu'elle permette de raffiner les études précliniques et ainsi à terme d'optimiser la règle des 3R, mais également qu'elle permette de travailler avec des modèles tumoraux inaccessibles aux méthodes classiques. Le projet présenté rentre dans ce dernier cas de figure. Il porte sur le suivi par IRM d'un modèle de lymphome implanté en sous-cutané chez la souris immunocompétente. Ce modèle présente un intérêt fort pour comprendre les mécanismes d'apparition de résistances aux anticorps thérapeutiques, mais ne peut pas être étudié avec des méthodes conventionelles. En effet, après l'implantation sous cutanée du modèle tumoral, se développe à l'emplacement soit une masse tumorale, soit une masse inflammatoire, qui ne peuvent pas être discriminées par les méthodes d'observation et de mesure. L'IRM permettra de faire cette discrimination. Le projet prévoit d'utiliser 30 souris, 10 pour amplifier la modèle tumoral in vivo, 20 pour l'analyse IRM.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de caractériser un modèle de cancer du sang, le lymphome B, afin de développer un variant permettant de comprendre les mécanismes d’apparition de résistances à un anticorps thérapeutique. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive en oncologie préclinique, technique dont la précision permettra à terme d'optimiser les 3R dans ce contexte.

Procédures

-implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum -anesthésie fixe durant l’IRM durée maximale 30 minutes de kétamine/Xylazine sur un total de 2/semaine durant 2 semaines soit 4 injectionx maximum.

Impact sur les animaux

- Perte de poids constatée : plus de 10% non améliorée par ajout de nourriture humide en maximum 24h ; une perte de plus de 20% qui serait liée à l'évolution de la croissance entrainera une mise à mort de l’animal - implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute administration d’antalgiques au préalable ; - croissance de tumeurs sous-cutanée au niveau du flanc - anesthésie fixe durant l'IRM pour une durée maximale de de 30 minutes,4 séances maximum espacées de 3 jours au minimum

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de chaque procédure (soit pour congelation des tumeurs pour le stock soit pour fixation en formol).

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire que sur l’organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement au taux d’anomalies de croissance tumoral. Nous utiliserons 10 souris + 20 souris soit 30 souris totales, et ferons une étude statistique d’analyse de contingence et un test de Fischer pour comparer avec une situation normale.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final des tumeurs seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie. La procédure d’imagerie IRM se fera sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.