Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de l’Intégrité du génome, du microenvironnement et du cancer du foie dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
5 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Elles reçoivent des injections répétées, dont une injection hydrodynamique représentant environ 9 % de leur poids corporel qui dilate massivement le foie, et développent des tumeurs hépatiques pouvant entraîner asthénie et perte de poids. Le porteur précise que les animaux ne recevront pas d'analgésie avant l'anesthésie, la métabolisation par le foie risquant d'interférer avec le phénotype étudié. Il conclut que la souris est "indispensable" comme "seul modèle préclinique" permettant d'invalider ou d'induire des gènes de façon tissu-spécifique.
Objectifs
Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet sera mené pour une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Les résultats de notre projet permettront de déterminer les mécanismes moléculaires altérés conduisant au développement d’un cancer du foie. Les retombées de nos travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.
Procédures
Des animaux recevront soit une injection intra-péritonéale (une fois à 5 semaines de vie, durée 30 secondes, animal vigile), soit une injection rétro-orbitale (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute, animal anesthésié), puis recevront ensuite une injection intra-veineuse (veine de la queue) (une fois, à 6-8 semaines de vie, durée 5-7 secondes, animal vigile). Une injection intra-péritonéale sera réalisée (une fois, à 14 jours de vie, durée 30 secondes) sur animal vigile. Ces mêmes animaux seront soumis soit à une injection intra-péritonéale (une fois à 5 semaines de vie, durée 30 secondes, animal vigile), soit à une injection rétro-orbitale (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute, animal anesthésié). Certains animaux recevront une injection intra-péritonéale (une fois à 7 semaines de vie, durée 30 secondes, animal vigile) et d’autres recevront une injection rétro-orbitale (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Du fait de l’injection intra-veineuse par la veine caudale d'un grand volume de solution dans la circulation systémique, une douleur transitoire dans cette région pourra être ressentie. Par ailleurs, l’injection hydrodynamique d'environ 9 % du poids corporel en volume, conduit à une dilatation massive mais transitoire (
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 5728 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection à l’œil) sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. Les animaux ne recevront pas d'analgésiques en pré-anesthésie car leur métabolisation par le foie (notre modèle d'étude) pourrait conduire à une hépatotoxicité interférant avec le phénotype que l'on souhaite étudier. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont (1) des souris juvéniles de 14 jours car à ce stade développemental, le foie est le plus réceptif à l’activité de composés carcinogènes, (2) de jeunes adultes (5 à 7 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.
Prévention de la fibrose hépatique induite par intervention chirurgicale dans le modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie obstruant complètement le canal biliaire pour induire une fibrose hépatique, puis des injections quotidiennes pendant trois semaines. Le porteur indique des douleurs de laparotomie et des risques d'infection ou de rupture de suture. Il affirme qu'il est impossible de reproduire in vitro les effets de la fibrose hépatique sur l'organisme et retient la souris comme le modèle dont la génétique est la mieux connue.
Objectifs
La fibrose hépatique est définie comme la production et l'accumulation excessive de la matrice extracellulaire (ECM) dans le foie. La fibrose hépatique peut être causée par une multitude de différents stimuli et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la fibrose impliquent un programme très orchestré de changements moléculaires et cellulaires. En particulier, les modifications anatomiques et fonctionnelles de l'intégrité des tissus du foie sont consécutives à l’amplification des signaux inflammatoires. La fibrogènese hépatique est un problème clinique dans le monde entier. L’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition d’une protéine, impliquée dans le métabolisme des acides gras et libérée par le foie, peut prévenir la fibrose hépatique induite par la cholestase obstructive.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la fibrose hépatique, qui impact la fonction hépatique et qui est un problème clinique majeur car peut être causée par une multitude de différents stimuli toxiques.
Procédures
Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant l'obstruction complète du canal biliaire (durée environ 30 minutes/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie (avec un suivi analgésique post-opératoire de 2 jours). Tous les animaux recevront des injections (quelques secondes) sous-cutanées (animal vigile). L’expérience n’excédera pas 3 semaines (à partir de la chirurgie). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale (au maximum 1 fois par jour, tous les jours, quelques secondes).
Impact sur les animaux
La procédure de ce projet n’excédera pas 3 semaines. Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant l'obstruction complète du canal biliaire. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par cette induction. Une douleur due à la laparotomie pourra apparaitre chez la souris. Des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. La fibrose sera induite mais à ce stade les douleurs seront modérées. Le mouvement des souris et leur respiration ne seront pas impactés. Les injections n’induisent pas de douleurs à l’animal autre que la piqûre de l’aiguille et peuvent induire un stress dû à la contention.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la fibrose hépatique vu sa complexité.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 600 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
ADE : La voie de l’adénosine comme nouvelle cible thérapeutique dans les chondrosarcomes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une xénogreffe de chondrosarcome humain sous la peau, puis des injections de traitement et des mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur indique que les cultures cellulaires ne reproduisent pas le microenvironnement tumoral et affirme vouloir confirmer in vivo des molécules déjà repérées in vitro. Le projet vise à repositionner des médicaments contre ce cancer des os rare.
Objectifs
Les chondrosarcomes sont des tumeurs osseuses rares qui produisent une matrice cartilagineuse. Ces tumeurs touchent principalement les adultes et sont potentiellement fatales. Elles sont considérées comme résistantes à la radiothérapie et aux chimiothérapies conventionnelles. De ce fait, leur traitement a peu évolué au cours des 40 dernières années. Il repose sur la chirurgie et peut conduire à l’amputation d’un membre du patient. De plus, les options thérapeutiques sont limitées si la tumeur est localisée dans des zones sensibles non résecables telles que la tête et le cou ou le pelvis, ou si la tumeur métastase. C’est pourquoi il est nécessaire d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcomes. Nous avons montré in vitro que des molécules ciblant la voie de l’adénosine réduisent la croissance tumorale et induisent la mort par apoptose dans les chondrosarcomes humains. L’objectif de ce projet est d’évaluer les capacités anti-tumorales de quatre de ces molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle hétérotopique de chondrosarcome humain chez la souris immunodéprimée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité anti-tumorale de quatre molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle animal de chondrosarcome humain. Ainsi, nous identifierons si le ciblage de la voie de l’adénosine pourrait devenir une nouvelle approche thérapeutique pour le chondrosarcome, un cancer des os chimio- et radio-résistant de pronostic potentiellement sévère. Cette information est cruciale pour le développement clinique de cette thérapie qui pourrait à terme améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcome.
Procédures
Les gestes suivants seront réalisés sur l’ensemble des animaux (total 288) : - une implantation de xénogreffe en sous-cutané au niveau du flanc (moins de 2 minutes), sous anesthésie générale et analgésie - une mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse (moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant 12 semaines, sous anesthésie générale - une injection du traitement (la molécule testée ou son véhicule) en intrapéritonéal (moins de 2 minutes), 2 à 4 fois par semaine pendant 12 semaines - un suivi pondéral (pesée, moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (estimée selon notre expérience, à 6 semaines pour le développement tumoral puis 12 semaines de suivi du volume tumoral)
Impact sur les animaux
D’après notre expérience et la littérature, nous ne nous attendons pas à une perte de poids, ni à une gêne lors du déplacement de l’animal, ni à des modifications du comportement, ni à des douleurs spécifiques excepté au moment de l’injection des cellules tumorales. Pour diminuer la douleur, une analgésie sera administrée lors de l’implantation des tumeurs.
Devenir
La procédure est de classe de sévérité modérée, ce qui justifie la mise à mort des animaux à l’issue de la procédure.
Remplacement
Les expériences réalisées in vitro sur des cultures de cellules ne permettent pas de modéliser l’ensemble du micro-environnement cellulaire, connu pour modifier le comportement des cellules et affecter leur réponse aux traitements. C’est pourquoi après avoir mis en évidence in vitro des molécules aux propriétés anti-tumorales, nous souhaitons confirmer ces propriétés in vivo, sur un modèle murin plus proche de la pathologie humaine, afin de faire la preuve de concept de l’efficacité des drogues utilisées en vue de proposer d’éventuels repositionnements de médicaments actuellement utilisés pour le traitement d’autres tumeurs ou maladies.
Réduction
Nous considérons que la molécule testée a un effet anti-tumoral si elle entraine une baisse de volume tumoral d’au moins 20 % en moyenne par rapport au groupe contrôle. Pour cela, le nombre d’animaux par groupe peut être réduit à 12.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux durant toute la durée de la procédure, un suivi individuel et régulier sera effectué afin d’évaluer l’état général des souris. Les implantations de xénogreffes seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les mesures de volume tumoral seront également réalisées sous anesthésie générale. De plus, si la souris présente une perte de poids importante, les traitements seront arrêtés une à deux semaines le temps que les signes cliniques disparaissent. Si les signes cliniques perdurent, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Afin de permettre l’implantation des xénogreffes et le développement tumoral, des souris immunodéprimées (nude) seront utilisées. Les chondrosarcomes humains touchent principalement les adultes. Aussi, d’après notre expérience et les données de la littérature, des souris à un stade adulte seront utilisées.
Le rôle des plaquettes dans la rupture des anévrysmes intracrâniens
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 151 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un anévrysme intracrânien est provoqué par injection d'une molécule dans le cerveau et pose d'un dispositif augmentant la pression artérielle, jusqu'à la rupture et l'hémorragie cérébrale. Le porteur indique une mortalité attendue lors de la chirurgie et des symptômes neurologiques déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucun dispositif ne reproduit tous les paramètres de la maladie et qu'il est "nécessaire" de provoquer chez l'animal une pathologie proche de celle des humains.
Objectifs
Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. Dix anévrysmes sur 100 000 évolueront jusqu'à leur rupture, entrainant des saignements dans le cerveau, ce qui conduit le plus souvent à la mort du patient. De plus en plus d’études suggèrent que l’évolution de l’anévrysme jusqu’à sa rupture n’est pas systématique et qu’elle ferait appel à des mécanismes particuliers. Pourtant, le seul traitement aujourd'hui consiste à retirer l'anévrysme, rompu ou non, lors d'une chirurgie très risquée. Un traitement moins dangereux pourrait être mis au point si les mécanismes impliqués dans la rupture de l'anévrysme étaient identifiés. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'anévrysme intracrânien évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, qui ont un rôle connu dans la coagulation sanguine, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques menant ou non à une rupture. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leurs mécanismes de réponses lors des stades tardifs de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 15 jours chez la souris des anévrysmes rompus. Nous allons l'appliquer à des souris n'ayant pas certaines protéines nécessaires au fonctionnement des plaquettes et étudier si leur absence à un effet positif sur la maladie. Une fois les protéines plaquettaires impliquées dans la maladie identifiées, nous utiliserons des médicaments déjà utilisés chez l'Homme ainsi que des molécules antiplaquettaires en développement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre dans un premier temps d’identifier des molécules plaquettaires impliquées dans l’évolution de l’anévrysme vers sa rupture. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant l'évolution de l'anévrysme jusqu'à sa rupture chez la souris, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgicale compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.
Procédures
Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrismes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgical : un prélèvement sanguins est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (10 minutes au total). Une procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance). L'évolution du comportement plaquettaire durant l'évolution de la pathologie sera suivie par analyse sanguine. Pour analyser ce sang, 2 prélèvements sanguins supplémentaire seront réalisés sur souris anesthésiées. (un prélèvement sanguin = 1 minute)
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie d'injection de molécule dans le cerveau (J0). Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée, 24h); perte de poids postopératoire (modérée, 24h); Stress de contention pendant la mesure de pression artérielle (9 sessions de 15 min). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme :Perte de poids (2g en 24h); Apparition de symptômes neurologiques, hémorragie.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée ou à la fin de la procédure s'ils n'atteignent pas les points limites défini dans ce projet avant. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.
Remplacement
La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie due au passage de la micropipette dans un vaisseau survienne. Ceci s’exprime par une l’apparition de symptôme neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours et des points limites précoces ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile à l'animal. Du coton est mis à leur dispositon dans leur cage afin qu'ils puissent nidifier.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Homme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absente, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chacun des 6 macaques à longue queue subit une chirurgie de huit heures pour implanter un dispositif de refroidissement localisé de l'hippocampe, deux ventriculographies de trois heures, deux IRM et un scanner, puis 36 séances d'enregistrement de six heures, assis dans une chaise de contention à laquelle il est entraîné pendant au moins un mois. Ces primates sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à la fin, au terme d'une procédure sans réveil, pour analyser les lésions produites dans leur cerveau par le dispositif et le refroidissement. Le but est de mettre au point des algorithmes qui prédisent les crises d'épilepsie et déclenchent le refroidissement, en vue d'un implant humain qui pourrait fonctionner sur batterie. Le résumé ne décrit pas comment les crises sont provoquées : seule la liste des effets mentionne des crises "persistantes légères" 1 à 2 heures "après séance pénicilline", et la liste des séances d'enregistrement parle d'"injection" sans dire laquelle.
Objectifs
L’épilepsie, qui touche 1% de la population, constitue un problème de santé majeur. En dépit de nombreuses avancées thérapeutiques, seules 30% des épilepsies pharmaco-résistantes (celles qui ne répondent pas aux médicaments) sont opérables et cette option n’est envisageable que si le foyer épileptique se situe dans une zone accessible du cerveau Dans les autres cas, une autre approche thérapeutique alternative est l’arrêt des crises d’épilepsie par refroidissement du foyer épileptique. Ce phénomène, connu depuis les années 1930, a été validé chez le rongeur et testé chez le primate à l’aide de dispositifs de refroidissement appliqués à la surface du cerveau. Le présent projet a pour objectif d’appliquer cette technique de refroidissement uniquement au moment qui précède l’arrivée d’une crise épileptique sur un modèle de primate. La technique de refroidissement a l’avantage d’être réversible et d’être une procédure peu invasive, mais elle doit encore être affinée en vue d’une application thérapeutique chez l’homme. A ce jour, aucune étude n'a mis en évidence la possibilité d’utiliser la prédiction des crises d’épilepsie comme déclencheur du traitement en boucle fermée de l’épilepsie pharmaco-résistante. L’objectif scientifique de cette étude est donc de développer les algorithmes de prévision des crises épileptiques pour une administration en boucle fermée du refroidissement localisée. Ces algorithmes seront capables de détecter le risque d’émergence d’une crise d’épilepsie et de l’inhiber en activant un refroidissement localisé de la zone épileptogène.
Bénéfices attendus
A ce jour aucune étude n’a présenté une évidence incontestable que la prédiction où les pronostics des crises épileptiques est possible au-delà de l’occurrence par chance. Les pronostics générés vont produire des périodes de haute ou base probabilité d’occurrence des crises. Nous souhaitons tester l’efficacité des algorithmes via le refroidissement pendant ces périodes de haute probabilité des crises et non pas pendant les périodes de crises réels. L’hypothèse est que les effets du traitement vont être supérieurs s’ils sont appliqués en dehors des crises épileptiques convulsives déjà établies. Les bénéfices directs seront la réduction de la puissance nécessaire pour refroidir et le dosage de la quantité du froid à livrer. Avec une réduction de la quantité d’énergie nécessaire pour produire le froid, le système pourrait finalement être compatible avec une batterie implantable type « pacemaker ». Les rendements actuelles en utilisant une approche continue, ne permettent pas avoir une batterie implante à long terme. L’utilisation du refroidissement représente aussi un avantage considérable sur les systèmes actuels parce que son effet est plus important et rapide que la stimulation électrique. Les algorithmes vont être adaptés pour mieux répondre aux taches des pronostics des crises épileptiques. Ils vont être comparés à l’état de l’art et seront peu gourmands en consommation électrique. Ces algorithmes vont être évalués en utilisant un modèle de primates non humains épileptiques avec la possibilité d’optimiser les algorithmes dans le temps. Le refroidissement du foyer épileptogène est une manière efficace d’arrêter les crises, comme nous sommes en train de le démontrer dans nos études en cours. Ces modèles précliniques permettront de tester facilement l’efficacité des algorithmes pour prédire l’occurrence des crises et l’effet thérapeutique du refroidissement pendant les périodes de haut risque de crises. Les bénéfices attendus sont le développement des algorithmes de prévision des crises utilisables sur des systèmes en boucle fermée et aussi de valider l’hypothèse du départ sur la nécessité de diminuer le refroidissement pour aboutir à l’arrêt des crises.
Procédures
Imagerie par IRM : 2 d’une heure chacune Imagerie par CT scan : 1 d’une heure Ventriculographie : 2 de 3 heures Chirurgie implantation : Implantation de dispositif, durée 8 heures Prélèvements sanguins : pré et post-opératoire soit 2 des prélèvements additionnels seront réalisés si complication infectieuse Séances d’enregistrement par condition :12 injection sans refroidissement, 12 injection refroidissement intermittent « aléatoire », 12 refroidissement en boucle ferme soit 36 au total chacun durant 6 heures.
Impact sur les animaux
• Perte de poids post-opératoire : 7 jours • Douleur transitoire post opératoire : 1 jour • Stress pendant séance d’habituation : jusqu’à l’habituation • Position anormale (dos voûté) : post opératoire immédiat post anesthésie générale • Vocalisation anormale pendant la séance d’enregistrement : jusqu’à l’habituation • Signes neurologiques: parésie post opératoire transitoire : 5-7 jour post opératoire • Crises épileptiques persistantes légères (mâchonnements, salivation, mouvements répétitives de tête) : 1-2 heures après séance pénicilline
Devenir
A la fin des expérimentations et à la suite d’une procédure sans réveil, nous allons euthanasier les animaux et prélever leur cerveau pour analyser le degré de lésion produit par le dispositif refroidissant et le refroidissement en vue d’un passage à un dispositif implantable chez l’homme.
Remplacement
Le remplacement des modèles animaux en générale et des modèles primates en particulier n’est pas possible pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in vitro comme les tranches de tissus cérébrale ne permettent pas de tester un implant préclinique complet qui a pour vocation de préfigurer le futur implant humain. Dans le projet, une partie des éléments de l’implant et certaines expérimentations ont pu être menées in vitro, notamment les tests de biocompatibilité permettant d’éviter l’utilisation d’animaux. Les primates non humains (PNH) sont les modèles idéaux pour tester les dispositifs cliniques pour l’épilepsie pour la similitude existante entre la structure du cerveau humain et celle du PNH. De plus, la génération des états épileptiques et des crises sont similaires aux phénomènes observés chez le patient épileptique
Réduction
Un nombre maximal de 6 primates non humain est estimé dans ce projet pour obtenir des résultats statistiquement fiables et exploitables du fait notamment de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal sera son propre contrôle. L’analyse statistique sera effectuée par des tests non paramétriques appariés, afin de mesurer la différence des moyennes avant et après traitement sans présomption initiale d’une distribution normale de la population (précédés par des tests de normalité). Toutefois dans le respect de la règle de « réduction » des 3R, le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’au 50% si les résultats obtenus sur les premiers animaux ne sont pas concluants ce qui provoquera l’arrêt des expérimentations ou bien si l’effet est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié des animaux. Tous les efforts seront faits par les expérimentateurs pour réduire le nombre d’animaux mis en expérimentation tout en permettant d’atteindre l’objective scientifique.
Raffinement
L’état clinique des animaux sera régulièrement observé. Dès que l’animal manifestera l’une de ces réactions négatives spécifiques leur surveillance sera renforcée : perte de poids, douleur post opératoire, position anormale, vocalisation anormale, signes neurologiques, crises épileptiques persistantes. La surveillance renforcée consistera à trois observations par jour et pourra s’étendre à un accompagnement continu. Pendant cette mise en observation, le protocole de recherche sera interrompu et un protocole de soins sera mis en place. Le vétérinaire de l’installation sera alerté sans délai afin de décider de la mise en œuvre des traitements médicaux appropriés : 1. Traitement antidouleur dès les premiers signes de douleur 2. Traitement Antiépileptique si nécessaire 3. Anesthésie général pour tout soin, procédure chirurgicale, prise du sang ou imagerie. 4. Soins de la plaie chirurgicale post opératoire et suivi : Si signes d’infection présentes, les soins locaux seront augmentés en fréquence at une thérapeutique antibiotique sera mise en place 5. Entrainement a la chaise de contention pédant au moins 1 mois. L’animal doit rester calmement assis sur la contention pour la durée de la séance. 6. Les primates qui ne reproduiront pas les crises attendues, seront sortis de l’étude par anticipation. Les animaux isolés gardent un contact tactile, visuel et olfactif avec leurs congénéres ; l'enrichissement environnemental est augmenté (plus de jouets, friandises, ....) et les contacts avec les expérimentateurs accrus.
Choix des espèces
L’utilisation de primates non humains (PNH) dans l’étape finale d’évaluation préclinique est nécessaire avant un usage clinique chez l’Homme pour valider la sécurité et l’efficacité du dispositif. En effet, les PNH ont un cerveau semblable à l’Homme aussi bien sur le plan anatomique que fonctionnel (structure cellulaire, communication et connectivité neuronales, capacités cognitives etc…). En effet, un modèle alternatif ex vivo permettant d’obtenir toutes les données biologiques n’existe pas. De plus les PNH peuvent reproduire des crises d’épilepsie pharmaco résistantes similaires aux crises hippocampiques chez le patient. Notre protocole expérimental vise à arrêter les crises en utilisant des moyens implantables, comme dans un futur système clinique. Règlementairement, Le modèle animal peut être à l’origine d’essais expérimentaux nécessaires avant une expérimentation humaine. Les PNH servent donc, bien souvent, de tremplin avant une application chez l’homme. Les dispositifs médicaux implantables font l’objet de procédures d’évaluation rigoureuse avant de recevoir une autorisation de mise sur le marché. Depuis les années 80, dans tous les pays du Monde, sous la pression des politiques et de la société, une procédure, la « nouvelle approche », s’est progressivement imposée, qui codifie très précisément les différentes étapes de l’évaluation, in vitro, chez l’animal et en clinique pour permettre la mise sur le marché. Chacune de ces étapes, chacun des tests requis connaît des limites, mais au final, le système apparaît efficace, le nombre d’accidents étant particulièrement réduit, eu égard au nombre d’utilisation des dispositifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux d’un âge supérieur à 40 mois et un poids de +/- 7-10 kg, afin de pouvoir faciliter la manipulation et l’entrainement comportemental des sujets adultes.
Etude pilote d’expression du gène rapporteur dans les muscles lisses des souris après l’exposition aux vecteurs AAV (Adeno-associated Virus)
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Pour mettre en place au laboratoire une technique d'exposition des bronches à des vecteurs viraux AAV porteurs d'un gène rapporteur, 24 souris naïves reçoivent sous anesthésie gazeuse une instillation nasale de deux minutes, puis sont tuées quelques jours plus tard pour le prélèvement de leurs organes. Le porteur classe ces procédures à un niveau de souffrance léger et prévoit de traiter au salbutamol une éventuelle gêne respiratoire après l'instillation. Le projet est présenté sous l'angle de l'asthme sévère, alors qu'aucune de ces souris n'est rendue asthmatique, et le porteur affirme, pour écarter le remplacement, que l'utilisation du "modèle d'asthme chroniques murin" apportera une meilleure compréhension de la maladie. Les 24 souris forment quatre groupes de 6, comparés à des témoins sans traitement extérieurs à ces groupes, dont le résumé ne donne pas le nombre.
Objectifs
L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des symptômes non traité actuellement dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Les travaux de notre laboratoire ont déjà mis en évidence un lien entre la taille du muscle lisse bronchique et l’augmentation de la masse mitochondriale. Selon nos données, quand la masse mitochondriale dans la cellule musculaire lisse bronchique est augmentée, cette dernière prolifère plus vite. Notre but est d’utiliser une approche basée sur une diminution de l'expression de gènes candidats jouant le rôle dans le remodelage bronchique. Cette technique est réalisée avec l'utilisation de particules AAV (Adeno-associated Virus), qui vont désactiver les gènes d'intérêt. Ainsi, nous pourrons mettre en évidence leur fonctionnement dans le remodelage des muscles lisses bronchiques chez les asthmatiques. Nous souhaitons donc mettre en place cette technique dans notre laboratoire. Dans ce cadre, nous souhaitons mener cette étude pilote pour développer le protocole d’exposition de souris naïves aux vecteurs AAV possédant le gène-rapporteur. L'analyse d’expression du gène rapporteur dans les bronches nous permettra de valider les vecteurs et la méthode d’exposition des animaux aux particules AAV.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote sur le traitement de souris naïves par les vecteurs AAV nous permettra d’avancer pour déceler des gènes jouant un rôle clé dans le remodelage des voies aériennes.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’instillation intra-nasale sous l’anesthésie gazeuse (durée : 2 minutes).
Impact sur les animaux
Le risque de dyspnée (gêne respiratoire, sensation de manque d'air accompagnée d'un essoufflement) chez les animaux suite à l’instillation de solution avec les vecteurs AAV sous anesthésie gazeuses existe. Après l’anesthésie les animaux seront observées par l’opérateur et la dyspnée éventuelle sera corrigée par la nébulisation du salbutamol (1g/ml pendant 15 sec).
Devenir
L’objectif de ce projet est d’étudier l’expression du gène-rapporteur par des techniques différentes. Quelques jours après l’instillation intranasale les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.
Remplacement
En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. L’utilisation du modèle d’asthme chroniques murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.
Réduction
Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 6 souris dans chacun des quatre groupes soit 24 souris pour ce projet. Nous allons comparer les organes des souris de nos quatre groupes avec ceux des animaux témoins qui ne seront dans la procédure expérimentale et donc n’auront aucun traitement.
Raffinement
Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie générale pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupes sociaux, coppeaux et bâtons), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales de solution avec les vecteurs AAV peut être traitée par l'utilisation d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml par exemple : Ventoline®).
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes âgés de 5 à 13 semaines afin d'avoir un système respiratoire mature.
Exploration fonctionnelle de la contribution des fibres C-LTMRs dans la modulation de la douleur post lésionnelle
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
842 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant jusqu'à un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de formaline ou de carraghénane dans la patte, ou subissent une chirurgie reproduisant une douleur post-opératoire ou neuropathique, puis une étude comportementale de l'hypersensibilité mécanique dont le RNT ne précise pas les tests. Le porteur reconnaît que ces procédures entraînent un stress et une douleur inévitables. Il affirme que l'étude de la douleur sur des souris génétiquement modifiées est "indispensable" et ne peut recourir à des méthodes in vitro.
Objectifs
Notre équipe s'intéresse aux mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans les douleurs post-lésionnelles. Le but de ce projet est d'étudier la biologie d'une classe particulière de fibres somato-sensorielles: les mécanorécepteurs à bas seuil à fibre C (ou C-LTMRs, pour C-Low Threshold MechanoReceptors). Il s'agit de neurones somato-sensoriels non myélinisés capables de transduire des stimulation mécaniques à bas seuil, détectées au niveau de la peu poilue. Typiquement, chez l'homme, ces neurones interviennent dans la détection et transduction du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes, y compris certaines réalisées au sein de notre équipe, suggèrent que ces neurones sont aussi capables de moduler la douleur post-lésionnelle ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Cependant, ces conclusions ont toutes été formulées de manière indirecte et à l'heure actuelle, aucune étude n'apporte la démonstration directe de leur fonction in vivo, à l'état basal et dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. C'est précisément le but de notre projet. Il repose sur l'utilisation d'une série de lignées de souris génétiquement modifiées de manière à générer des souris triple-mutantes permettant d'activer, inhiber ou bien éliminer séléctivement les C-LTMRs in vivo, et ce, de manière inductible.
Bénéfices attendus
La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur . En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones somato-sensoriels, les C-LTMRs, dont les propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle ont été récemment suggérées. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondementales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle liée à des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques, qui pourraient avoir une application chez les patients humains. A noter que les fibres de type C-LTMR ont été egalement décrites chez l'homme.
Procédures
Une partie des animaux de notre projet sera dédiée pour définir le protocole optimal pour l'induction de l'expression d'un transgène (administration de tamoxifen par injection intrapéritonéale ou par gavage, 12 animaux). Un deuxième groupe subira des administrations d'agents inflammatoires (formaline et carraghénane en intra-plantaire, cela concerne 120 et 180 animaux, respectivement). Un troisième groupe subira une procédure chirurgicale qui crée une douleur de type post-opératoire (180 animaux). Un quatirème groupe subira une procédure chirurgicale visant à mimer une douleur de type neuropathique (180 animaux). Les animaux ci-mentionnés feront l'objet d'une étude comportementale visant à démontrer in vivo l'effet de l'activation, inhibition et déplétion des C-LTMRs sur la mise en place et la durée de l'hypersensibilité mécanique post-lésionnelle. Enfin, une dernière cohorte de 90 animaux subira une des trois procédures décrites ci-dessus, afin d'explorer des aspects mécanistiques.
Impact sur les animaux
Les animaux seront amenés à subir des administrations de composés par gavage ou bien par injection intra-péritonéale ou sous-cutanée. De plus, ils subiront des modèles lésionnels mimant une lésion inflammatoire, postopératoire ou neuropathique. Ces procédures entraînent du stress et de la douleur, qui, même si tout est mis en oeuvre pour les minimiser, demeurent inévitables.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort, soit par inhalation de dioxyde de carbone soit par l'administration de doses létales d'anesthésique, pour répondre aux besoins expérimentaux. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées et sur des souris dégénérées, leur mise en liberté est inconcevable.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. De plus, l'utilisation de la souris en tant que modèle expérimental nous permet d'étudier le rôle de populations neuronales définies dans la physiologie de la douleur, grâce à la génération de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal de l’animal. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. De plus, les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la souffrance chez l’animal.: - Modifications apportées à l'élevage afin d'améliorer le bien-être des animaux : enrichissement des cages. - Planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) permettant de diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. - Recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical ; soins pré-, per- et post-opératoires adéquats. - Etablissement des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests de comportements utilisés.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.
Le rôle des gènes SoxC dans le dévelopment du rein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes reçoivent une dose de tamoxifène puis sont tuées par dislocation cervicale entre un et sept jours plus tard, leurs embryons étant décapités pour prélever le rein en développement. Le porteur affirme avoir mis au point une culture cellulaire remplaçant l'animal pour une partie du travail, mais juge que l'invalidation simultanée de trois gènes n'est possible que sur des embryons mutants. Le projet vise à comprendre des malformations rénales congénitales.
Objectifs
Les anomalies congénitales du rein et du tractus urinaire (CAKUT) font partie des malformations les plus importantes à la naissance qui peuvent aboutir à la mort du nouveau-né. Ces malformations peuvent également engendrer, au cours de l’adolescence ou de la vie d’adulte, des pathologies rénales chroniques. Ces pathologies sont souvent associées au diabète et à une hypertension artérielle qui sont les premières causes de mortalité chez ces patients. Depuis 1990, la prévalence des maladies chroniques rénales a augmenté de 29 %. Malgré cet impact important de santé publique, à ce jour, il n’y a pas de guérison possible de cette maladie. Un groupe de 3 gènes impliqués dans ces pathologies a déjà été identifié chez la souris et chez les patients CAKUT. Notre objectif est de comprendre le mode de fonctionnement de ces derniers et de démontrer comment leur mutation conduit à des malformations rénales.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale va permettre de comprendre comment le dysfonctionnement d'un groupe de 3 gènes altère la formation du rein fœtal. Ces malformations peuvent aboutir à une mortalité précoce ou à des maladies rénales chroniques pour lesquels à ce jour, à part la dialyse ou la greffe d’organe, la médecine n’a aucun autre recours. Les éléments de réponse à cette question permettront d’approfondir notre connaissance dans ce domaine.
Procédures
Chaque animal sera nourrit par une dose unique de tamoxifène (4mg/20g de souris). Il sera mis à mort soit le lendemain soit 2, 3, 4, 5, 6 ou maximum 7 jours depuis l'administration de tamoxifène.
Impact sur les animaux
Dans ce projet d’expérimentation, nous envisageons une seule procédure qui consiste à nourrir des femelles gestantes avec une quantité unique de tamoxifène, par la méthode « alimentation par pipette » qui n’est pas invasive. Ainsi un certain volume, l’équivalent d’une goutte est placé dans la cavité buccale de la souris. Celle-ci déglutie par réflexe. L’opération est répétée jusqu'à ce que toute la solution huileuse de Tamoxifène ait été ingérée par l’animal. Ceci évite le gavage ou l’injection dans la cavité abdominale. Le tamoxifène ne cause pas d’effet secondaire sur une courte période du temps qui est au maximum de 7 jours. La seule nuisance est la contention de l’animal.
Devenir
Notre étude porte sur l'analyse du rein en development donc nous avons besoin d'avoir des embryons que nous obtenons à partir des femelles gestantes qui sont mises à mort par dislocation cervicale. Les embryons sont décapités rapidement après la mise à mort de la mère.
Remplacement
Un des objectifs de ce projet est d’identifier les partenaires directs de l'un des 3 gènes que nous étudierons. Pour réaliser cette expérience, nous avons besoin d’une quantité très importante des cellules progénitrices du rein. Afin de remplacer l’animal nous avons mis au point, dans notre laboratoire, un protocole qui nous nous permet d’obtenir des cellules progénitrices du rein en quantité suffisante sans avoir recours à l’animal. Afin d’étudier d'autres aspects du fonctionnement de ces gènes, nous aurons besoin d'invalider les trois gènes à la fois, ce qui n'est possible que sur le rein des embryons mutants.
Réduction
Nous avons besoin d’un nombre suffisant d’embryons pour éviter des grandes variations qu’il peut naturellement se produire d’un embryon à l’autre. Nous nous basons sur 20 embryons mais si nous constatons des variations moins grandes que prévues, nous reverrons le nombre d’embryons à la baisse.
Raffinement
Outre de leur fournir un environnement enrichi pour satisfaire leur besoin de rongeur et leur instinct de nidification, nous allons utiliser une méthode innovante afin de limiter douleur et stress pour l’administration de tamoxifène. Celle-ci se fait par : « alimentation par pipette » qui est moins invasive car évite le gavage ou l’injection dans la cavité abdominale. La souris sera contentionnée de manière à pouvoir déglutir normalement et à son rythme, et la solution huileuse de tamoxifène sera déposée au goutte à goutte dans la cavité buccale de la souris. Celle-ci déglutit par réflexe.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. De cette manière, nous disposons des modèles de souris qui miment les pathologies rénales chez l’humain. Nous utiliserons des femelles adultes âgées d’environ 8 semaines car c’est la période de fécondité optimum.
Effets de l’exposition aux odeurs du bouc sur l’avancée pubertaire de la chèvre
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
44 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, trente tuées à l'issue pour prélever leurs organes reproducteurs et leur cerveau, quatorze gardées en vie. Les femelles reçoivent jusqu'à trente prises de sang et un frottement de la main sur le museau, avec ou sans odeur de bouc selon le groupe, pour observer si l'odeur du mâle avance la puberté. Le porteur résume le bénéfice attendu à une meilleure caractérisation de l'avancée pubertaire caprine. Il affirme que cette question sociosexuelle n'est pas modélisable autrement que sur l'animal.
Objectifs
Nos résultats permettront de déterminer si : 1/ Les signaux sensoriels olfactifs du bouc seuls permettent le déclenchement précoce de la transition pubertaire des femelles et donc l'ovulation 2/ Les signaux sensoriels olfactifs du bouc seuls peuvent induire une maturation précoce du tractus génital et des réseaux neuroendocriniens impliqués dans la vie reproductive des femelles
Bénéfices attendus
Meilleure caractérisation de l'avancée pubertaire caprine induite par un mâle sexuellement actif.
Procédures
Tous les mâles feront l'objet d'une prise de sang une fois par semaine de fin août à fin novembre soit au total 15 prises de sang. Toutes les femelles feront l'objet d'une prise de sang deux fois par semaine de fin août à fin novembre soit au total 30 prises de sang. La réalisation d'une prise de sang sur un animal dure environ 10 secondes. Toutes les femelles feront également l'objet d'un frottement de la main sur le museau (avec ou sans stimulus suivant le groupe). La réalisation de cette procédure ne dure que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Potentiellement du stress lors de la stimulation manuelle sur le museau (avec ou sans odeur).
Devenir
Des femelles seront euthanasiées afin de récupérer les organes reproducteurs et le cerveau lorsque toutes les femelles du groupe exposées au mâle actif et au moins 50% des femelles exposées uniquement à l'odeur seront pubères. Ainsi, nous aurons plus de chances de mettre en évidence une différence entre les femelles isolées, celles en contact avec des mâles actifs et celles exposées uniquement aux poils. Les organes reproducteurs nous permettront de déterminer la maturation du tractus reproducteur tandis que les cerveaux nous permettront d’apprécier une maturation au niveau des neurones impliqués dans la fonction de reproduction (plus nombreux autour de la puberté). Des femelles (non pubères et pubères) isolées des mâles et des femelles pubères exposées à des mâles intacts seront également euthanasiées pour récupérer l’épithélium olfactif principal et l’organe voméronasal. Ces organes nous permettront de mettre en évidence une maturation olfactive dépendante de l’environnement social et/ou du statut endocrinien. On réalisera une injection d’anesthésique et analgésique avant l'euthanasie des animaux. Pour résumé : lot de femelles isolées des mâles, 10 animaux euthanasiés et 3 gardés en vie pour réutilisation; lot de femelles exposées à l'odeur mâle (poils), 12 animaux euthanasiés et 2 gardés en vie pour réutilisation; lot exposé aux boucs intacts, 8 animaux euthanasiés et 5 gardés en vie. Tous les mâles (n=4) seront gardés en vie à la fin de l'expérimentation pour une utilisation ultérieure.
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être remplacé dans ce projet étudiant l'impact des relations sociosexuelles sur la puberté car ceci n'est pas modélisable par des modèles alternatifs.
Réduction
Pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique, le nombre d’animaux a été rationnalisé à 40 femelles et 4 mâles. La taille de nos effectifs (13 à 14 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques pour comparer les aires sous la courbe des résultats de progestérone. Si les conditions ne permettent pas d’utiliser des tests paramétriques, alors nous utiliserons des tests non-paramétriques. Un test de comparaison avec 3 groupes indépendants au seuil α de 0.05 donne une puissance statistique de 100% (test paramétrique) et 96% (test non-paramétriques) avec des effectifs de n=13 pour le lot isolé et le lot exposé au mâle intact devenant sexuellement actif, et un effectif de n=14 pour le lot exposé aux poils de bouc (outil anastats). Cette puissance statistique est dans le cas où toutes les femelles exposées au mâle actif sont pubères 1.5 mois avant le groupe isolé des mâles (d’après les résultats acquis) avec en parallèle 50% des femelles exposées aux poils de boucs sont devenues pubères. 4 mâles sont nécessaires afin d'effectuer une rotation lors de l'exposition auprès des femelles et ainsi éviter un potentiel effet d'habituation pouvant impacter notre expérimentation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sur paille et bénéficieront d'enrichissement comme des caisses en bois et ballons. Des récompenses seront données aux individus lors des prises de sang dont nous avons réduit le nombre d’après les précédents protocoles. Une habituation au frottement de la main sur le museau avec récompense gustative sera réalisée avant l'expérimentation pour éviter le stress pendant cette dernière.
Choix des espèces
Chez la chèvre, la présence d'un mâle sexuellement actif peut impacter la physiologie de la reproduction et les comportements sexuels de la femelle. L'activité sexuelle du mâle semble être la condition sine qua non pour induire une puberté précoce de la femelle. Chez cette espèce, l'exposition de femelles en période de repos sexuel (anoestrus) aux indices sensoriels olfactifs de boucs sexuellement actifs peut mener à l'ovulation. Il serait donc intéressant de comprendre si l'exposition continue à ces indices olfactifs est également suffisante dans l'induction d'une puberté précoce des femelles. De plus, les indices sensoriels olfactifs du bouc sexuellement actif sont connus pour déclencher des réponses au niveau central dans le cadre d'un "effet mâle". Il est donc intéressant d'étudier l'impact sur la maturation sexuelle centrale de cette espèce dans ce contexte. Nous utiliserons des mâles adultes sexuellement matures qui stimuleront des femelles pré-pubères pour lesquelles la fonction de reproduction n'est pas encore mature et dont nous voulons observer sa régulation.
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’ischémie-reperfusion chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion puis reperfusion d'une artère cérébrale au moyen d'un filament, suivi d'une IRM et d'une série de tests comportementaux étalés sur trois semaines. Le porteur indique que le modèle reproduit des déficits sensorimoteurs et une désorientation au réveil, et applique des points limites en cas de perte de poids ou d'inactivité. Il présente le rat comme le modèle préférentiel de l'AVC et juge "indispensable" de tester chez l'animal cinq stratégies thérapeutiques financées par l'industrie.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Bénéfices attendus
Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’augmentation de la récupération fonctionnelle et de diminuer la lésion causée par l’occlusion artérielle. L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monofilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirurgical durera 15 minutes. 45 minutes plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirurgical durera 10 minutes. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suivront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post AVC. Un total de 56 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse post chirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 30%) sauf pour les SHAM au nombre de 5 par groupe, ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront 2 par cage avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Le site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, à une désinfection et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, de l'oxygène sera administré pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites.
Choix des espèces
Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par une ischémie-reperfusion. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids d’environ 300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Evaluation chez le rat, des effets initiateurs et promoteurs de la cancérogénèse colorectale d’additifs alimentaires identifiés au sein d’une cohorte humaine
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
840 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection d'azoxyméthane pour déclencher une cancérogénèse colorectale, puis les animaux ingèrent des additifs alimentaires et passent trois jours isolés en cage à métabolisme individuelle. Le porteur indique qu'aucune étude in vitro n'évalue les effets d'additifs sur le métabolisme et le microbiote d'un "organisme entier", et affirme que les agences de sécurité des aliments ont "besoin" de ces résultats. L'objet reste de tester des additifs déjà autorisés dans l'alimentation humaine.
Objectifs
Des données récentes de la littérature suggèrent que certains additifs alimentaires, retrouvés surtout dans les aliments ultra-transformés pourraient être reliés à des risques associés de cancers. Le but de ce présent projet consiste à analyser certains de ces additifs. Les résultats obtenus avec un seul additif, testé à plusieurs concentrations, sur plusieurs matrices (alimentation, eau de boisson) et sur l'initiation ou la promotion du cancer colorectal, permettra de fournir de nouvelles informations afin de guider les décisions des agences de santé publique et de contribuer à la prévention des cancers.
Bénéfices attendus
Les agences nationales de sécurité des aliments ont besoin de résultats mis à jour sur des molécules alimentaires pour pouvoir établir de nouvelles recommandations nutritionnelles en termes de prévention ou d'interdiction de certains additifs. Ce même type de recherche a déjà permis d'identifier un potentiel nouveau danger pour un additif ce qui a abouti à son interdiction suite à un avis de l’EFSA en 2020.
Procédures
Aucun prélèvement invasif n'est prévu sur les animaux, seulement la récupération des urines et des fèces. En tout début de procédure, certains groupes d'animaux seront injectés avec de l'AOM (azoxyméthane), dans le but d'induire une cancérogénèse. Cette injection unique (quelques centaines de microlitres) est réalisée en moins d'une minute par rat.
Impact sur les animaux
Les additifs testés étant déjà des molécules autorisées pour l'alimentation humaine, le risque lié à leur ingestion reste mineur. Les animaux pour lesquels la cancérogénèse aura été induite chimiquement ne sont gardés que 100 jours, ce qui correspond à un délai suffisant pour qu'il y ait une initiation de la cancérogénèse mais largement insuffisant pour qu'ils développent des tumeurs douloureuses. Les animaux sont gardés 3 jours en cage à métabolisme individuelles, ce qui induit un stress lié à la taille de la cage et à l'isolation. La durée d'hébergement dans ces cages est réduite au plus strict minimum, les cages transparentes permettent un contact visuel et olfactif des animaux et une attention très particulière est portée aux animaux lors de ce passage. Enfin l'injection d'AOM qui peut entrainer un stress pour les animaux est réalisée avec des aiguilles les plus fines possibles afin de minimiser l'impact sensoreil, les animaux seront manipulés la veille pour les habituer à la contention et réduire le stress.
Devenir
A l'issue de la procédure les animaux seront euthanasiés afin que le sang et plusieurs organes soient prélevés pour analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
Des études in vitro sur des cellules ont été réalisées en amont afin d'identifier les possibles effets toxiques des additifs qui seront testés. Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de composés issus de l'alimentation comme les additifs alimentaires, sur la physiologie et le métabolisme et le microbiote d'un organisme entier.
Réduction
Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été évalué à son minimum afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement fiables. Notre expérience sur le même type études nutritionnelles a montré qu'un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire.
Raffinement
Le bien-être de l'animal est en permanence au centre de nos préoccupations. Les conditions d'expérimentation font l'objet d'une procédure de suivi du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont surveillées quotidiennement, la nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum, la litière changée de manière hebdomadaire. Les rats étant des animaux sociaux, ils seront maintenus à 2 par cage (paroi transparente) pour ne pas souffrir d'isolement, leur environnement enrichi. Avant chaque intervention expérimentale, les animaux seront habitués à être manipulés.
Choix des espèces
Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le rat est l’animal dont la physiologie est la plus proche de la situation humaine, tant au niveau digestif que pour les processus de cancérogénèse. Pour éviter les effets hormonaux liés aux cycles des femelles, seuls les mâles seront utilisés. L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes, afin de pouvoir comparer avec nos précédentes données, il est important de ester au même stade de développement.
Caractérisation des fonctions musculaires, cardiaques et cognitive de modèles murins de dystrophies musculaires : évolution avec l’âge et effet du traitement, par transfert de gène à l’aide de vecteurs viraux
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Rats : 300
1 272 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une injection de thérapie génique par voie intraveineuse, des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie, une échocardiographie et une évaluation de la fonction musculaire sous anesthésie profonde, et courent sur un tapis stimulé par un léger courant électrique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne reproduit la biodistribution d'un virus dans un "organisme entier" ni l'évolution sur plusieurs mois, et conclut au recours aux rongeurs. Les retombées annoncées pour les patients atteints de dystrophie musculaire restent renvoyées à de futures applications chez l'homme.
Objectifs
L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches thérapeutiques pour des maladies génétiques rares, les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Les dystrophies musculaires sont des maladies dégénératives du muscle qui conduisent à une perte progressive des fonctions motrices telle que la marche. L’évaluation de l’efficacité d’un traitement va nécessiter de pouvoir suivre l’effet de l’administration sur des modèles reproduisant le plus précisément la pathologie humaine. Aujourd’hui, la plupart de ces modèles sont des modèles de rongeurs, rat ou souris. Un prérequis avant toute évaluation thérapeutique est donc de bien connaitre les modèles. L’objectif de ce projet est de réaliser des études visant à mesurer différents paramètres aux niveaux musculaire, cardiaque et cérébral dans des modèles animaux de dystrophie et d’observer l’évolution de ces paramètres dans le temps et suite à un traitement de thérapie génique.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous proposons de mieux caractériser des modèles murins de dystrophies musculaires afin de définir précisément des critères spécifiques à la pathologie et en particulier en condition d’exercice physique. L’identification de ces critères et les résultats liés à l’exercice permettront l’évaluation de l’effet thérapeutique de traitements pour de futures applications chez l'homme, et de proposer éventuellement une stratégie de physiothérapie pour améliorer la prise en charge des patients. Nous attendons que des résultats positifs sortent de ce projet sur au moins certains critères ou sur certaines évolutions. Les résultats négatifs permettront de mieux souligner les critères positifs spécifiques de la maladie et de comprendre de façon plus pertinente les conséquences des défauts génétiques entre les modèles animaux et l’homme.
Procédures
Le traitement par transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois en moins de 5 minutes, soit sur animaux vigiles avec injection dans la veine caudale, soit sur animaux anesthésiés pour l’injection au sinus (cette technique n’est appliquée que chez la souris). Dans ce cas l’anesthésie est une anesthésie gazeuse de courte durée de moins de 5 minutes. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée moins de 5 minutes. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. Pour certaines procédures permettant l’évaluation de la fonction du muscle en semi-isolé, les animaux sont analgésiés et anesthésiés. C’est une anesthésie par voie intrapéritonéale profonde de 15 à 30 minutes sans réveil de l’animal. Pour l’évaluation de la fonction cardiaque, les animaux sont soumis à une échocardiographie en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d'une durée de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour administration d’anesthésique ou d’intraveineuse pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie gazeuse, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Lors de l’’exercice de course sur tapis, un stimulus électrique de faible intensité est nécessaire pour stimuler l’animal En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères au stade avancé de la pathologie où l’on peut observer une scoliose ou une atrophie musculaire. Cependant, dans ce projet, nous utiliserons des animaux à des âges où aucune conséquence sur le comportement n’est observée. L’ensemble des animaux ne présentent donc pas de phénotype délétère. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements, qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif ne nous permet d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires, ni les conséquences de l’exercice, ou encore les fonctions cardiaque ou cérébrale. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doivent prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire, l’évolution sur des périodes de plusieurs mois, la distribution du flux sanguin, la biodistribution d’un virus dans un organisme, les processus cognitifs, etc…
Réduction
Nous utiliserons les mêmes animaux contrôles pour des expériences différentes chaque fois que possible. Tous les modèles sont sur le même fond génétique, nous pouvons donc utiliser les mêmes souris de type sauvage comme contrôles pour tous les modèles. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs selon un critère défini pour chaque modèle.
Raffinement
Le format de cage pour les rats et le nombre d’animaux par cage sont adaptés en fonction du poids des animaux. Les tests d’évaluation fonctionnelle non invasifs sont réalisés dans une salle différente de celle de l’hébergement. Afin de diminuer l’angoisse de l’animal, une phase d’entrainement sur tapis de course est réalisée pendant plusieurs jours. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil, ou l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris et rat car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer les fonctions musculaire, cardiaque ou cérébrale et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles les plus sévères.