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Formation en imagerie optique du cortex auditif chez la souris vigile
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une fenêtre d'observation implantée dans le crâne sous anesthésie, puis jusqu'à neuf séances d'habituation à la contention et cinq à sept séances d'imagerie maintenues de une à trois heures, pour former une quinzaine d'étudiants par an à la technique. Le porteur revendique qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'il est "essentiel" que la formation implique des animaux vivants. Les bénéfices évoqués contre les pertes sensorielles restent lointains, l'objet réel du projet étant l'apprentissage d'un outil d'imagerie.
Objectifs
Le but général du projet est d’entrainer annuellement une quinzaine d’étudiants, sous supervision d’un spécialiste, à mesurer de manière extensive et précise les représentations sensorielles de stimuli complexes dans le cerveau de souris vigiles. Ces mesures extensives sont rendues possibles par l’utilisation de techniques d’imagerie à haute densité permettant l’enregistrement simultané de plus de 1000 neurones par expérience. La formation d’étudiants dans ce domaine permettra la généralisation de cette méthodologie qui permet d’obtenir beaucoup plus de données cruciales pour la compréhension des circuits neuronaux du cerveau pour un nombre réduit d’animaux utilisées. Dans ce projet, nous mettons en place une procédure expérimentale permettant aux étudiants, sous la supervision d’un spécialiste de prendre en main les instruments nécessaires à la réalisation de l’expérience en situation réelle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra l’acquisition par une quinzaine d’étudiant annuellement d’une méthode qui représente une nouveauté technologique pour l’observation de l’activité cérébrale à la résolution neuronale. Le développement de cette méthode permettra de progresser dans la compréhension des mécanismes de la perception sensorielle et ainsi de pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques dans le domaine des pertes sensorielles.
Procédures
Les animaux sont soumis à 1 chirurgie d’implantation d’une fenêtre d’observation permanente sous anesthésie et analgésie puis à 9 séances maximum d’habituation à la contention (0.5 à 3h par séance). Enfin 5 à 7 séances d’imagerie en contention de 1 à 3 heures sont réalisés.
Impact sur les animaux
Ce projet inclut une préparation chirurgicale des souris occasionnant des douleurs et un inconfort modéré dans la période de récupération de 2 jours. Par la suite les souris sont habituées à la contention ce qui entraine un stress et un inconfort qui s’amenuisent après 3 jours d’habituation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour accéder à l’activité de milliers de neurones opérant le traitement de l’information sensorielle. Dans ce projet l’utilisation d’animaux est nécessaire pour permettre aux étudiants d’apprendre la méthodologie d’imagerie et la manipulation de l’équipement en conditions réelles. Cela permet d’éviter par la suite de nombreuses erreurs qui peuvent se faire parfois au détriment du bien-être animal. Il est donc essentiel que la formation à cette méthode implique des animaux vivants.
Réduction
Grâce à l’utilisation des méthodes d’imagerie optiques modernes permettant d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, le nombre d’animaux utilisés est minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal, et ainsi atteindre des échantillons de plusieurs milliers de neurones, permettant une précision statistique jamais atteinte. Il est donc important de développer ces techniques pour améliorer la réduction des nombres d’animaux utilisés en neuroscience. 20 animaux sont nécessaires par ans pour obtenir les dix animaux nécessaires pour le cours (4 à 5 animaux utilisés par jours et repos de 2 jour) en comptant 50% d’animaux non utilisables du fait d’aléas expérimentaux, soit 100 animaux par an.
Raffinement
La procédure expérimentale de ce projet implique une antalgie et des temps de repos appropriés pour minimiser la souffrance, un suivi quotidien des animaux, et la définition de points limites précis basés sur des indicateurs de poids, (toute perte de poids >20% est un point limite), d’aspect général et de comportement, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort s’il n’est pas possible de pallier immédiatement la souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle animal en raison de l’ensemble des outils génétiques (souris transgéniques, injections virales AAV) qui sont bien établies chez cet animal, et qui permettent d’une part de manipuler différents éléments du système nerveux de manière ciblée, d’autre part de garantir une expression large et stable de certaines protéines, comme des senseurs calciques fluorescents ou des opsines (par ex. channelrhodopsin). Dans ce projet nous utiliserons les lignées GAD2-Cre, AI14D-TDT et leur croisement qui permet le marquage spécifique des interneurones dans le cortex. Pour toutes les expériences, nous utiliserons des souris adultes (de 3 à 6 mois) afin d’étudier la perception sensorielle dans un système nerveux mature.
Etude chez la souris de la toxicité pulmonaire de nouveaux conjugués Anticorps/Drogue
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent de la bléomycine par voie nasale et une injection d'un conjugué anticorps-médicament, pour comparer la toxicité pulmonaire de plusieurs variants d'un anticancéreux en développement. Le porteur indique que l'induction d'une toxicité pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, une baisse d'activité et une perte de poids, les souris étant tuées pour analyse des poumons. Il présente ces études sur animaux comme "essentielles" avant une première administration chez l'humain.
Objectifs
Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à évaluer l’induction d’une toxicité pulmonaire chez l’animal par de nouvelles molécules développées pour être des traitements anticancéreux. Connaître ce paramètre pour un composé permet de prédire l’apparition de toxicités pulmonaires observées chez l’Homme avec ce type de traitements. Les études proposées portent sur différents variants d’un anticancéreux en développement et visent à déterminer lequel des composés présente le profil de toxicité le plus favorable, afin de le qualifier pour un développement préclinique plus poussé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’impact du design du conjugué anticorps-médicament (ADC) sur la toxicité pulmonaire. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC induisant le moins de toxicité pulmonaire, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.
Procédures
Exposition intra nasale a la bléomycine : nombre 3, durée: quelques secondes. Injection intraperitonéale de conjugués anticorps/médicament : nombre 1, durée : quelques secondes
Impact sur les animaux
L'étude de toxicité porte sur des lésions visibles en anatomopathologie et non des lésions symptomatiques: les doses selectionnées étant 10 fois plus faibles que les MTD (doses maximum tolérée) une perte de poids n'est pas attendue (partie A: avant le go/ no go). L'induction d'une toxicité pulmonaire (partie B: si go) peut entrainer des difficultées respiratoires pendant la durée de l'étude qui peuvent être caractérisées par du stress, une diminution de l'activité et une légère perte de poids. La procédure comporte de l'anesthésie en boite à induction (3 fois) et injection en intraperitoneal (1 fois). Ces manipulations peuvent entrainer du stress et une douleurs lors que l'injection de 2H maximum.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort en fin de procédure pour analyse des poumons.
Remplacement
Cette étude vise à évaluer la toxicité pulmonaire d'un composé anticancéreux, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro et in vivo ont été réalisées en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique.
Réduction
Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 10 souris par groupes.
Raffinement
Avant le début des procédures, les souris seront habituées aux expérimentateurs de l’étude, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance biquotidienne, des pesées régulières, des aliments en fond de cage, ou un traitement antalgique, ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.
Choix des espèces
La modélisation de la toxicité pulmonaire par la bléomycine est une méthode très répandue chez la souris qui permet une quatification précise de l'infiltrat immunitaire sur des coupes d'immunohistochimie. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des souris de 6 semaines ayant un système immunitaire mature pour pouvoir étudier l'inflammation pulmonaire.
Test de nouvelles associations thérapeutiques dans un modèle de contamination interne au plutonium chez le rat.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
212 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation de plutonium dans la trachée sous anesthésie, provoquant une irradiation pulmonaire chronique, puis des traitements par inhalation, injection ou gavage et des séjours en cage métabolique, pour tester des associations destinées à éliminer le radioélément. Le porteur indique que des signes précurseurs de fibrose devraient apparaître et que les animaux sont tués après six semaines ou trois mois pour prélever leurs organes. Il justifie le recours à un "organisme entier" par la biocinétique complexe du plutonium, difficile à reproduire in vitro.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est d’améliorer la prise en charge thérapeutique suite à une contamination interne avec du plutonium (Pu). Ces situations peuvent se rencontrer dans les domaines civil et militaire (travailleur du nucléaire, accident, acte de malveillance etc.). Les traitements utilisés actuellement consistent à favoriser l’élimination du radioélément (décorporation) avec une molécule capable de le piéger (chélateur), tel que l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA) dans le cas du plutonium. Cependant, ce traitement a une efficacité limitée sur les formes peu solubles de plutonium et son effet sur les conséquences biologiques induites à long terme par la contamination n’a pas été étudié à ce jour. Notre approche innovante consistera donc à combiner ce traitement de référence avec des molécules possédant des mécanismes d’action complémentaires afin de favoriser l’élimination du plutonium et de limiter ses effets biologiques. Deux molécules candidates ont été retenues pour ce projet : un anti-inflammatoire, qui devrait permettre de limiter l’inflammation résultant de la contamination et les pathologies associées (fibrose pulmonaire notamment) et un mucolytique, qui devrait favoriser l’élimination du plutonium en fluidifiant les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux. L’association de ces molécules avec le DTPA permettra, en cas de libération de Pu à partir des lésions inflammatoires par exemple, de favoriser son élimination sous forme de complexe Pu-DTPA et d’empêcher sa fixation à d’autres organes. Des expériences préliminaires prometteuses avec ces associations thérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires in vitro. Dans ce projet, nous étudierons l’influence de ces associations thérapeutiques sur la biodistribution du plutonium dans l’organisme et sur les effets biologiques induits, tels que l’apparition de fibroses pulmonaires dans le cas de contaminations pulmonaires.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu suite à ce projet porte sur l’amélioration de la prise en charge thérapeutique en cas de contamination pulmonaire par du plutonium. Cette nouvelle stratégie thérapeutique aura pour objectif de limiter les conséquences biologiques de la contamination à moyen et long terme, au premier rang desquelles l’apparition de fibroses pulmonaires. Les résultats obtenus pourront, à terme, contribuer à l’élaboration de nouvelles recommandations thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront contaminés, sous anesthésie, par une instillation intra-trachéale unique (durée maximale 5 secondes). Les traitements seront délivrés par inhalation (bi-hebdomadaire, durée 15 minutes) et/ou injection (hebdomadaire, durée maximale 5 secondes) et/ou gavage gastrique (administration unique après la contamination, durée maximale 10 secondes) après induction d’une anesthésie générale puis per os (dans l’eau de boisson) durant 6 semaines ou 3 mois.
Impact sur les animaux
Les séjours en cage à métabolisme, d’une durée de 1 à 5 jours maximum, génèreront du stress et de l’inconfort pour les animaux. Les cages à métabolisme sont des hébergements individuels permettant le recueil des excrétas (urines et selles) des animaux en vue d’analyses futures (mesures de la radioactivité par exemple). Les animaux sont placés sur des grilles sous lesquelles un système de séparation et de collecte des excrétas est installé. Ces effets indésirables seront temporaires et disparaitront lors du retour des animaux en hébergement classique. Le plutonium possède une toxicité radiologique, mais pas de toxicité chimique. Il induira une irradiation pulmonaire chronique durant 3 mois au maximum. Ce délai est trop court pour donner lieu à l’apparition de pathologies cancéreuses ou des fibroses pulmonaires déclarées. Des signes biologiques précurseurs devraient néanmoins être observés (lésions préfibrotiques, sécrétion de certaines cytokines, accumulation de collagène, etc.).
Devenir
Tous les animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés 6 semaines ou 3 mois après la contamination afin de prélever différents organes et tissus. Ces prélèvements seront nécessaires pour étudier la biodistribution du plutonium dans l’organisme et l’apparition de phénomènes inflammatoires ou fibrotiques en présence des différents traitements.
Remplacement
La contamination interne par des radioéléments résulte principalement d’une exposition accidentelle par inhalation ou via une blessure. Cette contamination interne implique un passage à travers plusieurs barrières physiologiques indicatives d’un système complexe et intégré. Les approches de décorporation doivent agir à la fois localement (au niveau du site d’entrée) et de façon globale dans l’organisme afin de diminuer la rétention des radioéléments dans les organes cibles (foie et os notamment), et de faciliter leur élimination par les voies naturelles. En raison de la biocinétique complexe des radioéléments dans l’organisme, l’évaluation de l’efficacité des traitements ne peut se limiter à étudier leurs effets sur un type cellulaire particulier ou sur un modèle in vitro non intégré. De même, les anti-inflammatoires sont des molécules agissant sur plusieurs cibles et les mucolytiques fluidifient les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux, phénomène qui ne peut être obtenu sur des modèles in vitro. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier (in vivo). Des expériences préliminaires à ce projet ont par ailleurs été menées in vitro afin de confirmer la pertinence des traitements envisagés en amont du recours à l’expérimentation animale.
Réduction
La stratégie adoptée s’appuie sur les données du laboratoire. L’expérience suggère que des groupes de 5 à 7 animaux sont suffisants pour démontrer une efficacité thérapeutique du DTPA ou d’autres traitements par voie veineuse, par voie pulmonaire ou par voie orale chez le rat après analyse statistique. Un effectif de 6 animaux par groupe a donc été retenu pour la conduite de notre projet. Pour des raisons réglementaires inhérentes au travail en installation nucléaire il n’est pas possible de réaliser une campagne de contamination sur plus de 30 animaux simultanément. Ces contraintes justifient la conduite de plusieurs campagnes de contamination. Par ailleurs, en raison de la variabilité inhérente à la préparation des solutions de plutonium et à la contamination, chaque campagne devra inclure un groupe contrôle contaminé non traité ainsi que les traitements simples avec une seule molécule (6 animaux par groupe). L’analyse statistique comparera chaque groupe traité au groupe non traité et au groupe traité avec une seule molécule (dans le cas des associations de traitements) au sein d’une même campagne.
Raffinement
Après contamination les animaux sont hébergés individuellement dans des cages à métabolisme (5 jours maximum) en plastique transparent à travers desquelles les rats peuvent se voir les uns les autres, s’entendre et se sentir. Un enrichissement de type jouet à ronger est ajouté dans les cages à métabolisme. Par la suite, les animaux sont hébergés en groupe (3 animaux par cage) avec des enrichissements matériels et nutritionnels (tunnel ou boule en plastique, bâtonnets en bois, papier, grosse croquette etc..). La contamination et le gavage des animaux seront réalisés après induction d’une anesthésie générale afin de limiter le stress et l’inconfort lié à ces actes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine minimum (ou plus si besoin pour expérimentation ou surveillance accrue). Mise en place de points limites identifiés pour ce projet et l’utilisation d’analgésique pour soulager l’animal en cas de souffrance. Une vigilance particulière sera également portée à l’apparition de potentiels symptômes respiratoires (dyspnées, essoufflements, éternuements et toux), une réponse inflammatoire pulmonaire pouvant faire suite à la contamination.
Choix des espèces
Le rat est l'espèce animale retenue pour nos études du fait de la richesse des données issues de la littérature sur la contamination par les radioéléments de la même famille que le plutonium, d'un point de vue de la biocinétique et des tests de traitements de décorporation des radioéléments. En effet, le rat est un modèle pertinent pour la contamination interne pulmonaire : sa taille, supérieure à celle de la souris, permet de réaliser des prélèvements biologiques suffisamment conséquents pour obtenir des niveaux de radioactivité mesurables et des informations exploitables sur un certain nombre de paramètres biologiques. De plus, de nombreuses données historiques obtenues sur cette espèce sont disponibles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront âgés de 4 à 6 semaines au moment de la réception car les risques de contamination interne avec des radioéléments concernent principalement les travailleurs jeunes adultes et adultes). Les rats présenteront initialement des poids allant de 150 à 200 g, de façon à faciliter leur hébergement en groupe et leur assurer un meilleur confort lors du séjour en cage à métabolisme.
Suivi IRM d’une thérapie anti-cancéreuse utilisant des alkoxyamines (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
573 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses de tumeurs implantées dans un autre établissement, elles sont suivies par IRM sous anesthésie une à deux fois par semaine avec injection répétée d'un agent de contraste, pour mesurer l'efficacité d'un anticancéreux. Le porteur précise que les nuisances viennent surtout de l'anesthésie répétée et que les souris sont gardées vivantes jusqu'à la fin du suivi avant d'être tuées dans l'établissement d'origine. Il qualifie l'usage d'animaux vivants d'"indispensable", le système immunitaire étant requis pour l'action du traitement.
Objectifs
L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d’imagerie extrêmement avantageuse car elle permet d’obtenir des images avec de forts contrastes entre les organes, sans application d’ondes ionisantes, donc de pleine innocuité. Elle est la méthode de référence pour la détection de tumeurs. Elle permet de suivre l’efficacité de traitements anti-cancéreux. A la lumière d' éléments récents sur la libération prononcée d'enzymes, il est apparu pertinent de les cibler dans le cadre d'un traitement contre le cancer. Pour cela, nous allons développer des substrats clivables par les enzymes tumorales pour tuer plus spécifiquement les cellules cancéreuses qu’une drogue de chimiothérapie classique. Ainsi l'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité thérapeutique des alkoxyamines par IRM.
Bénéfices attendus
L'IRM permet d'imager les souris à différents temps au cours du traitement tout en limitant le nombre d'animaux. Ainsi, l'efficacité potentielle des alkoxyamines pourra être détectée au plus tôt.
Procédures
L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et ne dépassera pas 1h. Les 573 animaux seront injectés 1 à 2 fois par semaine avec un agent de contraste IRM, le temps du suivi des tumeurs et métastases.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles proviennent de la chute de température, de la déshydratation, de la sécheresse oculaire et d’un potentiel arrêt respiratoire lors de l’anesthésie générale, ainsi que de l’injection de l’agent de contraste IRM.
Devenir
Les animaux sont inclus dans une autre DAP dans un autre établissement pour la 1e partie de ce projet. Dans la 2e partie du projet détaillée ici, nous souhaitons déterminer si le nouvel agent anti-cancéreux permet de réduire la croissance tumorale ou empécher la formation de métastases. Ainsi un suivi longitudinal est nécessaire. Ils seront ici uniquement imagés par IRM et donc gardés en vie jusqu'à la fin de l'étude pour être euthanasiés dans l’autre EU.
Remplacement
Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car nous souhaitons évaluer l'efficacité thérapeutique des alkoxyamines sur des tumeurs, dont le micro-environnement inclut des neutrophiles qui libèrent l'élastase (substrat des alkoxyamines). Ainsi, le système immunitaire est particulièrement nécessaire pour leur efficacité.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées (et seront réalisées) en amont, pour étudier l'effet des alkoxyamines sur chacune des cellules cancéreuses en culture. L'imagerie par IRM permet d'imager l'animal plusieurs fois pour évaluer un traitement sans avoir recours à des euthanasies à différents temps au cours du traitement pour réaliser de l'histologie. Ceci permet aussi de limiter le nombre d'animaux.
Raffinement
L'utilisation d'anesthésies gazeuses par isoflurane, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et un ballonnet pour le contrôle de la respiration pendant les procédures permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et donc de pratiquer plusieurs anesthésies par animal. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux afin de compenser la sécheresse oculaire lors des anesthésies. Une réhydratation sera pratiquée via une injection sous-cutanée de glucose 5% à chaque fin de session IRM. Pendant les sessions IRM, une sonde rectale sera utilisée pour réguler la température interne des animaux, grâce à une circulation d’eau chaude. L’agent de contraste injecté est fréquemment utilisé en clinique, et sera injecté dans les animaux à une dose 5 fois inférieure à celle humaine.
Choix des espèces
Nos IRM sont equipées d'antennes adaptées pour l'imagerie du rat et de la souris. L'utilisation de la souris nous permet de développer de nombreux modèles tumoraux. Les animaux seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 10 semaines) car nous souhaitons mimer le développement d'un cancer chez l'homme adulte.
Impact d’une exposition chronique à un mélange de faibles doses de pesticides sur l’apparition de la maladie de Parkinson et du diabète de type 2 en modèles murins, et étude des liens entre ces deux pathologies
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques reçoivent pendant 6 à 12 mois une alimentation enrichie d'un mélange de six pesticides, avec suivi de la glycémie, séjours en cage métabolique, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par injection puis prélèvements sanguins répétés, pour explorer un lien entre pesticides, maladie de Parkinson et diabète. Seuls des mâles sont exposés, et les animaux sont tués pour prélever cerveau, pancréas et autres organes. Le porteur affirme que ces liens n'ont "jamais été explorés" et écarte les modèles cellulaires ou invertébrés comme inadaptés à sa question.
Objectifs
Notre projet vise à apporter des connaissances sur les liens potentiels qui n’ont jamais été explorés à notre connaissance entre exposition alimentaire à des pesticides et des maladies humaines chroniques fréquentes, les maladies de Parkinson (MP) et le diabète, à l’aide d’un modèle « humanisé » développant une maladie neurodégénérative caractérisée par l'accumulation anormale d'agrégats de la protéine alpha-synucléine dans le cerveau. Ce projet s’inscrit dans un contexte ou certaines données épidémiologiques suggèrent que le diabète serait associé à un risque accru de maladie de Parkinson. Par ailleurs, plusieurs méta-analyses confirment le lien entre exposition professionnelle aux pesticides et MP. Dans ces conditions, notre projet envisage l’évaluation de la toxicité d’un mélange de 6 pesticides à des doses individuelles supposées ne pas exercer d’effets sur la santé chez l’homme mais rapportées pour induire en mélange un surpoids et/ou un diabète chez des souris non transgéniques. En utilisant ce mélange, nous étudierons alors le lien entre les perturbations métaboliques observées et les mécanismes qui sous-tendent le développement de la MP dans un modèle de souris transgéniques.
Bénéfices attendus
Le projet vise à apporter des éléments de connaissance concernant le rôle de l’exposition quotidienne à de faibles doses de pesticides en mélange via l’alimentation dans l’incidence des maladies neurodégénératives associées à la protéine alpha-synucléine (comme la maladie de Parkinson) et du diabète. Par ailleurs, ce projet doit permettre d'investiguer le lien entre le diabète et la maladie de Parkinson.
Procédures
Premièrement, 40 souris (10 par lot) feront l'objet d’un suivi périodique de la glycémie sur 6 mois (semaine 9, 17, et 24). Après une période de jeûne de 4-6h des prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre (3 minutes par animal). Deuxièmement, 40 souris (10 par lot) feront l’objet de prélèvements urinaires et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les animaux seront mis individuellement dans des cages métaboliques pour récupérer les urines sur une période de 24h (semaine -1, 6, 27 et 52). Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin, Pour les tests de tolérance au glucose (semaine 16, 36, et 48) après une période de jeûne de 4-6h, une injection intrapéritonéale d’une solution saline de D-Glucose stérile sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués, pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min. Par ailleurs, deux prélèvements sanguins supplémentaires seront réalisés pour un dosage ultérieur de l’insuline plasmatique qui sera mesurée 30 min avant et 15 minutes après l’injection du DGlucose. Troisièmement 20 souris (5 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels et d’un suivi des paramètres métaboliques selon les mêmes modalités que le point 2 (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les tests fonctionnels (semaine 0/1, 12/13, 25/26, 38/39 et 51/52) seront réalisés afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles de l’exposition aux pesticides, en comparaison avec le vieillissement normal. Lors de chaque test, les animaux seront évalués pendant 7 minutes. Quatrièmement 40 souris (10 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels (selon les mêmes modalités que le point 3) et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance à l’insuline) sur 12 mois. Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin pour les tests de tolérance à l'insuline intrapéritonéal (semaine 15, 35 et 47) les souris seront mises à jeun pendant 4-6h puis une injection intrapéritonéale d’une solution d'insuline (0,75U insuline/kg de poids corporel) sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min.
Impact sur les animaux
L'administration d'aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides a déjà été réalisée chez la souris sans complication observée pour elles-mêmes. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul. Les suivis envisagés sont couramment utilisés et n'induisent pas d'effet indésirable particulier en dehors de la douleur ou du stress induit par l'acte lui-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 20%), les souris seront mises à mort. Concernant les animaux qui seront soumis à un ensemble de tests fonctionnels, la planification des tests est prévue afin de limiter le stress des animaux et garantir un niveau d’activité. En particulier, lors de chaque session, les tests seront étalés sur 2 semaines et aucun suivi des paramètres métaboliques ne sera réalisé durant la période de suivi des capacités motrices des souris.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement des organes nécessaires à l'exploitation des résultats : cerveau, pancréas, foie, moelle épinière, tissu adipeux, intestin, fèces, yeux et sang.
Remplacement
L'étude des liens entre la maladie de Parkinson et le diabète de type 2 en condition d'exposition chronique à un mélange de faibles doses de pesticides à l'aide de cellules, organoïdes, modèles numériques ou modèles animaux moins sensibles (invertébrés) constituerait des approches différentes qui ne pourraient pas répondre aux questions que nous souhaitons aborder. Par ailleurs, l'étude des mécanismes moléculaires au niveau pancréatique dans un modèle murin de synucléinopathie n’a jamais été réalisée, et encore moins dans des conditions d’exposition alimentaire à un mélange de pesticides à faibles doses, pertinente au regard de l’évaluation des risques de l’alimentation humaine.
Réduction
Les animaux exposés seront tous étudiés dans les différentes expériences (tests fonctionnels, suivi métabolique) et ils seront analysés avec les différentes techniques choisies. Les souris seront mises à mort après 6 mois ou 12 mois afin de mimer une exposition d'un consommateur humain durant 15 et 30 ans. Ces choix de durée d’exposition sont également motivés par les caractéristiques spécifiques de l’évolution de la neuropathologie dans la lignée M83 d’une part et par les données déjà publiées sur l’évolution des troubles métaboliques chez la souris conventionnelle d’autre part. La quantité d'animaux par groupe de 35 animaux/groupe est le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Une fois les données relevées (comparaison de la masse des souris (en g), mesure de la glycémie, réponse au test de tolérance au glucose, réponse au test de tolérance à l’insuline, capacité motrice, étude des perturbations métaboliques et des mécanismes liés au développement de la MP) des tests statistiques sont prévus pour la comparaison des 2 groupes entre eux (exposé, non-exposé). En accord avec les récentes observations publiées, seules les souris mâles seront exposées de façon continue, à l’aliment enrichi (ou non) par le mélange de 6 pesticides pendant 12 ou 6 mois.
Raffinement
Les animaux seront suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière pour le suivi métabolique des animaux (la mesure du poids, la quantité de nourriture ingérée, tests de tolérance au glucose intrapéritonéal, prise d'urine, mesure de la glycémie) et la mise en œuvre des tests fonctionnels. Les souris seront hébergées avec un environnement enrichi. Elles auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne, aucune sur-mortalité n'avait été enregistrée. En cas de mal être: blessure, poids trop faible (si la perte de poids est de plus de 20%), déshydratation, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La lignée de souris transgéniques (M83) exprimant l’alpha-synucléine humaine sera utilisée et exposée (ou non) au mélange de pesticides via l’alimentation, parallèlement aux souris Bl6/C3H, fond génétique de la lignée M83. Les travaux sont proposés à partir de la lignée de souris transgéniques M83 exprimant l’alpha-synucléine humaine mutée A53T. Ce modèle murin, dont l’agrégation protéique est facilitée par la mutation, permettra d’évaluer l’impact du mélange sur la neuropathologie. Nos résultats préliminaires montrent la présence très précoce d’alpha-synucléine phosphorylée en sérine 129 dans les ilots pancréatiques des souris transgéniques. Les souris seront exposées à l’aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides à partir de l’âge de 4 mois (stade adulte) pour nous conformer à la publication de référence.
Effets combinés de la génétique et du microbiote intestinal sur la réponse vaccinale chez la poule pondeuse.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
400 poules pondeuses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des gavages d'antibiotiques et des prises de sang sur animal vigile, pour mesurer l'effet combiné de la génétique et du microbiote intestinal sur la réponse vaccinale. Le porteur décrit le gavage et la contention comme des sources de stress, et les animaux sont tués à 5, 13 ou 24 semaines pour prélever leur microbiote caecal. Il annonce des retombées directes pour l'industrie avicole, les résultats devant être partagés avec ses représentants.
Objectifs
Deux lignées génétiques de poule pondeuse seront élevées durant 24 semaines pour cette expérimentation. Tous les animaux seront vaccinés suivant le plan de prophylaxie classique de poules pondeuses élevées en plein air. La moitié des animaux élevés seront soumis à un traitement antibiotique, démarrant 3 jours avant la vaccination et durant 3 jours, de façon à altérer la composition du microbiote intestinal. Nous souhaitons de cette manière étudier l’effet combiné d’une altération du microbiote intestinal et de variations génétiques sur la réponse vaccinale. Les animaux seront aussi séparés en deux lots de même taille. L’un aura accès à un parcours extérieur, et l'autre restera confiné dans le bâtiment d'élevage. Nous étudierons ainsi : - 2 lignées différentes - 2 conditions (traités ou non aux antibiotiques) - 2 modes d'élevage (avec accès ou non à l'éxtérieur) Nous suivrons sur ces animaux les variations de différents paramètres immunitaires, du microbiote caecal et de la réponse vaccinale au cours du temps, afin de mesurer l’effet d’une ingestion d’antibiotiques. En plus de la vaccination, nous effectuerons donc des prélèvements peu ou pas invasifs durant la vie des animaux (prises de sang). Enfin nous donnerons les antibiotiques aux animaux par gavage pour nous assurer que tous les animaux ingèrent la même dose.
Bénéfices attendus
La vaccination est la stratégie la plus efficace pour la prévention des maladies infectieuses des animaux d’élevage. Le rôle de la génétique sur la réponse vaccinale est connu mais reste à préciser, tandis que celui du microbiote est suspecté du fait de son rôle sur la régulation de l’immunité, mais reste à prouver. Combiner la sélection génétique pour une meilleure réponse vaccinale avec une stratégie nutritionnelle modulant favorablement le microbiote intestinal pourrait être très efficace. De plus, l’élevage à l’extérieur étant souvent considéré comme l’avenir de l’élevage animal, il est essentiel d’étudier ses effets sur les phénotypes d’intérêt. Dans ce projet nous allons étudier les effets combinés des variations génétiques de l’hôte et de la composition du microbiote caecal sur les réponses vaccinales et le comportement de poules pondeuses afin d’identifier des biomarqueurs génétiques et physiologiques associés avec la magnitude des réponses à plusieurs vaccins. Pour ce faire nous créerons une altération du microbiote soit forte via un traitement antibiotique soit plus modérée via la fourniture d’un accès extérieur aux animaux. Nous étudierons d’une part l’effet du mode d’élevage sur le microbiote, la réponse vaccinale et le comportement des animaux. Nous étudierons d’autre part les liens entre composition du microbiote intestinal et réponse vaccinale et comprotement. En bref, ce projet fournira des biomarqueurs génétiques et physiologiques associés aux réponses vaccinales et au comportement chez la poule pondeuse, et il estimera l’effet d’un accès extérieur sur ces caractères. Il sera conduit sur des lignées commerciales chez qui l’intérêt de la sélection pour tous ces caractères sera directement estimé, assurant une application directe de nos résultats. Les résultats seront partagés avec des représentants de l’industrie avicole pour assurer leur transfert efficace.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu’à deux types d’intervention : des gavages toutes les 24 heures pendant les 3 jours précédant la sortie, et des prises de sangs sur animaux vigiles réalisées par des personnels qualifiés.
Impact sur les animaux
Le gavage est une procédure stressante pour les animaux. Les prises de sang pourront également être une source de stress, en raison de la contention nécessaire et de la piqûre.
Devenir
Il est prévu d’utiliser 400 animaux de 2 lignées de poules commerciales. Ils seront tous utilisés pour des prises de sang et la moitié d'entre eux seront soumis à un gavage . Ils seront tous mis à mort soit au cours de l'élevage à 5 semaines ( 72 animaux) , à 13 semaines (72 animaux) à la fin de l’expérience ( 256) afin de récupérer leurs microbiotes caecaux.
Remplacement
Pour évaluer l’effet des variations génétiques et du microbiote intestinal sur la réponse vaccinale il faut disposer de mesures individuelles sur les animaux. Par ailleurs le statut immunitaire et la réponse vaccinale impliquent des voies physiologiques dans l’organisme entier. Enfin le comportement ne peut être évalué que sur l’animal lui mêm. Le modèle le plus adapté pour évaluer les effets sus-mentionnés sur le poulet est donc le poulet lui-même.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de cette expérience a été déterminé suite à des estimations basées sur la littérature publiée sur l’effet de l’ingestion d’antibiotiques sur la composition du microbiote et sur les résultats de nos propres expérimentations visant à étudier le microbiote intestinal. Les mesures effectuées sur des lots de 24 animaux ont confirmé l’existence d’une large variabilité pour les paramètres immunitaires et la réponse vaccinale, et donc la nécessité de continuer à étudier des lots d’au moins 24 animaux. Au cours du projet actuel, nous prévoyons 50 animaux par lot car 18 seront sacrifiés avant la fin de l’expérience, si bien que les analyses statistiques seront finalement menées sur 32 animaux. Ce nombre est nécessaire pour nous autoriser à utiliser des méthodes statistiques telles que analyses de variance (ANOVA) et pour nous donner un peu de marge pour explorer la variabilité de la réponse vaccinale à des vaccins jusqu’à présent non étudiés par notre groupe . Nous testerons le contraste de différentes variables (dosages d’anticorps, paramètres immunitaires, composition du microbiote intestinal) entre groupes d’animaux traités aux antibiotiques (8 lots de 12 animaux), et non traités (4 lots de 24 animaux), et entre lignées génétiques pour un même traitement (24 animaux sans traitement, 12 avec) par analysees de variance.
Raffinement
Les poussins sont élevés en parquets collectifs, avec des enrichissements du type ficelles, balles en plastique, bloc à piquer. Ils seront visités 2 fois par jour et toute manifestation de symptômes persistants tels que définis dans le point limite engendrera la mise à mort des animaux par le personnel qualifié. A l’extérieur les parcours seront enrichis avec des palettes, pour diminuer l’anxiété des animaux et faciliter leur sortie. Les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées, notamment pour les prises de sang et le gavage.
Choix des espèces
Notre étude vise, à terme, à réduire l’incidence de maladies chez la poule d’élevage par une approche préventive combinant vaccination et nutrition. Il est donc nécessaire d’effectuer nos expérimentations chez la poule domestique (Gallus gallus), qui a des réponses spécifiques que nous devons prendre en compte. Ces animaux seront élevés de leur éclosion à 24 semaines d’âge, temps nécessaire pour s’assurer que tous les animaux aient commencé à pondre afin de pouvoir collecter différentes données individuelles de production pour tous les animaux Par ailleurs nous souhaitons évaluer la persistence dans le temps de la réponse vaccinale et cette durée d’élevage est un bon compromis entre coût de l’expérience et réalisme des données obtenues par rapport à la durée réelle de l’élevage commercial (qui est supérieure à 24 semaines).
Ecologie spatiale des chauves-souris : Effet de l’infection sur les déplacements du Petit Molosse de la Réunion (ESCAPE)
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
10 chauves-souris du Petit Molosse de la Réunion, une espèce sauvage protégée, vont être capturées puis relâchées le soir même, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque individu subit une biopsie de l'aile, un tatouage et la pose d'un radio-émetteur, ainsi que des prélèvements de salive, d'urine et de fèces, pour suivre ses déplacements par télémétrie selon son statut infectieux. Le porteur indique que la pose de l'émetteur peut modifier le vol la première nuit et présente le projet comme utile aux gestionnaires de la conservation. Les animaux sont tous relâchés dans leur milieu naturel après manipulation.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier, par télémétrie, les déplacements du Petit Molosse à La Réunion en relation avec le statut infectieux des individus. Il s’articule autour de trois questions : 1) Déterminer la surface du domaine vital, les zones de chasse, et la distance maximale parcourue. 2) Caractériser les réseaux de gîtes, en identifiant le nombre de gîtes visités et la distance entre ces gîtes. 3) Tester si l’infection a un impact négatif sur le déplacement, en comparant notamment la distance parcourue, la durée des sorties, et le nombre de gîtes visités entre individus infectés et non-infectés.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons les premières informations sur les déplacements du Petit Molosse, notamment sur les zones de chasse qu’il utilise (type d’habitat, surface, distance au gîte), ainsi que sur son comportement (durée de nourrissage, visite d’autres gîtes). Ce projet a pour ambition de permettre aux gestionnaires de la conservation d’avoir en main des données clés sur la biologie et le comportement de cette espèce protégée, afin d’adapter les mesures de gestion proposées. L’analyse d’individus infectés et non-infectés apportera des résultats inédits sur l’effet de l’infection sur le déplacement des chauves-souris. Les résultats pourront être discutés dans le contexte actuel d’émergence de maladies.
Procédures
Ecouvillon buccal, prélèvement d’urine à la pipette, prélèvement de féces avec des pinces, biopsies alaires, taouage alaire et pose d’un radio-émetteur, sur 10 chauves-souris
Impact sur les animaux
La capture et la manipulation peut entraîner un stress. La pose d’un radio-émetteur peut entraîner une modification du comportement de vol (typiquemmment la première nuit, puisque les individus « s’habituent » par la suite).
Devenir
Les chauves-souris seront toutes relachées dans leur milieu naturel, le soir même.
Remplacement
La réalisation des objectifs du projet implique l’étude d’une espèce animale sauvage (Mormopterus francoismoutoui) dans son milieu naturel. Ce projet nécessite donc la capture de cette espèce dans la nature.
Réduction
Les études de télémétrie sont très chronophages et mobilisent un grand nombre de personnes pour suivre les individus équipés. De ce fait, le nombre d’individus qu’il est possible de suivre est limité (maximum 5 en même temps). Compte-tenu de ces contraintes, et pour prendre en compte au maximum la variabilité des comportements entre individus, et entre sexes, nous avons choisi de travailler sur 5 individus mâles et 5 individus femelles, soit 10 au total.
Raffinement
Lors de la capture, les manipulateurs resteront à proximité des pièges pour les surveiller constamment, et récupérer les individus au plus vite. Ils seront hydratés et placés dans des pochons individuels proches, au calme, en présence d’une bouillote pour maintenir leur température corporelle. La manipulation des chauves-souris se fera sur le site de capture pour réduire le temps de capture et ainsi le stress. Les prélèvements d’urine, de salive et de fèces sont indolores. La biospie alaire et le tatouage sont réalisés en quelques secondes. Après la pose de l’émetteur, chaque individu sera replacé dans son pochon pour une durée de 10 minutes, puis relaché. Toutes les manipulations seront réalisées par trois scientifiques formés et experts pour la capture et la manipulation, détenteurs de l’habilitation à la capture des chiroptères délivrée par le MNHN.
Choix des espèces
L’étude des déplacements d’une espèce sauvage par télémétrie nécessite sa capture dans son milieu naturel, puis relâcher, pour suivre ses déplacements. Seuls des individus adultes seront étudiés pour limiter la variation des comportements qui peut exister entre adultes et juvéniles.
Caractérisation de la balance dopamine-sérotonine dans l’émergence de biais comportementaux chez le primate non-humain
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
6 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un antipsychotique en injection, une quinzaine d'examens d'imagerie sous anesthésie, puis une craniotomie avec pose d'une chambre d'enregistrement laissée en place pour six mois d'enregistrements et une trentaine d'injections intracérébrales sur animal vigile. Le porteur décrit un risque d'infection au niveau de la chambre et des lésions cérébrales possibles, mais conserve les animaux vivants pour un usage ultérieur en raison de leur "grande valeur scientifique". Il qualifie le modèle primate d'"irremplaçable", notamment pour certains traceurs d'imagerie.
Objectifs
L’aripiprazole est un antipsychotique de troisième génération indiqué dans le traitement de différentes maladies neuropsychiatriques présentant un déséquilibre dopamine-sérotonine, telles que le syndrome de Gilles-de-la-Tourette, la schizophrénie et les troubles bipolaires. Bien que son utilisation s’accroisse, les mécanismes d’action de l’aripiprazole restent peu compris. Les objectifs du présent projet sont d’identifier où et comment ce traitement agit dans les différentes régions cérébrales pour moduler de multiples fonctions cognitives et motrices.
Bénéfices attendus
Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la balance dopamine-sérotonine dans le contrôle comportemental. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant le mode d’action de l’aripiprazole, désormais traitement de première intention pour de nombreux patients atteints de troubles psychiatriques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’aripiprazole et des effets cognitifs induits par ce traitement ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différentes modalités d’imagerie cérébrale, nous allons avoir l’opportunité de caractériser comment la balance dopamine-sérotonine module l’activité neuronale de repos à l’échelle du cerveau entier. Cette balance étant défectueuse dans de nombreuses pathologies (ex : dépression, anxiété, schizophrénie, Tourette, addictions), nos résultats seront donc d’intérêt pour de nombreuses applications. En complément, l’apport de l’electrophysiologie va nous permettre d’étudier des aspects plus fonctionnels de l’action de l’aripiprazole et de la balance dopamine-sérotonine au niveau des neurones du striatum. Nos résultats devraient ainsi démontrer l’importance de cette structure sous-corticale dans le contrôle de certains biais décisionnels, et définir quels types de troubles émergent lorsque la balance dopamine-sérotonine devient dysfonctionnel dans cette région du cerveau.
Procédures
(i) Traitement pharmacologique systémique par aripiprazole en semi-chronique (plusieurs périodes de 2 semaines, injections en IM). Ces tests s’étendront sur 4 mois, afin de tester comportementalement plusieurs doses de traitement. (ii) Examens d’imagerie cérébrale sous anesthésie générale. L’action de l’aripiprazole sur les systèmes dopaminergiques et sérotoninergiques sera étudiée via 5 traceurs ciblant différents récepteurs (5 traceurs x 3 doses d’aripiprazole = 15 scans par animal). Ces imageries s’étendront sur une période de plus d’un an. (iii) Implantation chirurgicale d’un plot de tête et d'une chambre avec craniotomie sous anesthésie générale (1 fois,
Impact sur les animaux
La partie pharmaceutique du projet impliquant un traitement chronique par aripiprazole ne constitue pas une source potentiel de nuisances importantes. L’aripiprazole est une molécule fréquemment utilisée en clinique humaine avec très peu d’effets secondaires nuisibles, il est rapporté un effet sédatif et orexigène (augmente l’appétit) bien moindre que pour les autres neuroleptiques. Les imageries cérébrales vont nécessiter l’injection d’un produit de contraste pouvant induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques. Pour limiter ces risques, les imageries seront espacées d’au moins deux semaines et des analyses sanguines seront réalisées pour contrôler les enzymes hépatiques. Ainsi, aucun effet nuisible significatif n’est spécifiquement prévu suite à l’accumulation des imageries sur animal anesthésié. La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. La chambre d’enregistrement donnera sur une craniotomie (10 x 10mm) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode au moment des sessions d’expérimentation. La présence de cette chambre d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les phases d’imagerie, de pharmacologie et d’électrophysiologie de l’étude soit délétère pour la santé de l’animal. La partie de l’étude intégrant les examens d’imagerie et le traitement par aripiprazole étant classée en procédure légère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.
Devenir
A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives sur écran tactile. Les animaux ayant une chambre implantée seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches invasives telles que l’électrophysiologie ou des perturbations intracérébrales. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques.
Remplacement
L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude pré-clinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec de l’électrophysiologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, certains radiotraceurs TEP utilisés dans cette étude ne sont disponibles et utilisables que chez le primate non-humain, faisant de ce modèle un élément irremplaçable pour la conduite de cette étude.
Réduction
Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 6 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques pharmacologiques chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Nos approches seront réversibles et complémentaires, ce qui permettra de répéter les tests et de comparer différentes doses d’agents pharmacologiques sur les mêmes animaux pour ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les données électrophysiologiques recueillies sur quatre animaux permettront également d’atteindre un échantillon de neurones striataux importants le plus représentatif possible en fonction des différents territoires cérébraux étudiés.
Raffinement
Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant de contrôler différents facteurs tels que le poids, la prise de nourriture, le comportement social et la mobilité. Dépendamment du score des animaux sur notre grille d’évaluation comportementale, un traitement adapté sera fourni et l’étude pourra être suspendue, voir définitivement arrêtée si les points limites sont atteints. L’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité neuronale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. En combinant simultanément différentes modalités d’imagerie grâce à une caméra hybride, nous allons réduire (/2) le nombre de scans pour pouvoir collecter un jeu de données suffisants. Les animaux ne seront implantés qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Des traitements analgésiques seront utilisés en périodes pré-, per- et postopératoires. Notre grille d’évaluation de la douleur permettra d’adapter le traitement et le protocole si nécessaire en fonction de divers points limites. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiqueront comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire.
Choix des espèces
Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Phylogénétiquement, ce modèle animal préclinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. -Différents troubles comportementaux ont déjà pu être induits chez le macaque suite a une perturbation d’activité localisée au niveau du striatum antérieur. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. -Toute information physiologique ou physiopathologique obtenue chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les animaux reçus sont généralement des adolescents (3 ans). Ils arrivent souvent déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. Une recommandation sera formulée en ce sens auprès de nos fournisseurs pour favoriser des groupes sociaux compatibles.
Analyse de la réponse immunitaire innée mise en place lors d’infections respiratoires chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de la grippe ou le pneumocoque par voie nasale sous sédation, à des doses conçues pour reproduire une infection sévère qui, non contrôlée, entraîne la mort des animaux en quelques jours. Le porteur indique que les souris perdant 25 % de leur poids ou devenues léthargiques sont tuées, et que toutes sont euthanasiées pour prélever poumons et rate. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de la réponse immunitaire d'un "organisme entier".
Objectifs
Les pathologies respiratoires ont un impact médical et socio-économique très important. L’organisation mondiale de la santé classe ainsi les pneumonies et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) parmi les dix principales causes de décès au niveau mondial. En particulier, les infections respiratoires représentent plus de 2 millions de décès par an. Ces chiffres soulignent la limite des traitements anti-infectieux actuels, comme l’absence de traitement efficace sur la plupart des virus respiratoires ainsi que la résistance aux antibiotiques des bactéries qui atteint désormais des proportions dangereuses dans toutes les régions du monde. Par exemple, l’efficacité du vaccin contre le virus influenza a été démontrée depuis de nombreuses années mais les perpétuelles mutations de ce virus obligent une nouvelle vaccination chaque année. Ainsi, le virus de la grippe provoque toujours des épidémies saisonnières avec une forte morbidité et plus occasionnellement des pandémies de grande envergure. Un autre exemple est la recrudescence de pneumonies dues à la bactérie Streptococcus pneumoniae. L’immunité innée joue un rôle clé dans la réponse de l’hôte contre le pneumocoque permettant le confinement de l’infection et la destruction de la bactérie. Néanmoins, dans certains cas, le système immunitaire peut être dépassé aboutissant à une pneumonie, une méningite et/ou une septicémie. Bien que des traitements aient été développés (vaccins polysaccharidiques multivalents, antibiotiques), les pneumonies à pneumocoques restent à très forts risques de mortalité. Ainsi, les infections respiratoires ne sont actuellement en aucun cas sous contrôle. Ces données soulignent donc le besoin urgent de développer une recherche innovante visant à mieux comprendre la physiopathologie des pathologies respiratoires. Les progrès dans les années à venir devront venir de la découverte de nouvelles cibles et/ou de molécules anti-infectieuses mais également par une régulation des réponses immunitaires de l’hôte. Cette dernière approche présentant l’avantage de ne pas cibler directement l’agent infectieux et donc de s’affranchir des problèmes de variabilité des pathogènes décrits ci-dessus. L’objectif des projets de recherche que nous développons est ainsi de caractériser le rôle et les mécanismes d’activation des cellules du système immunitaire inné au cours des infections pulmonaires afin de permettre le développement de molécules immunomodulatrices ciblant ces cellules.
Bénéfices attendus
Comme décrit précédemment, d’autant plus souligné par la récente pandémie lié au pathogène respiratoire SARS-COV2, les pathologies respiratoires infectieuses sont une préoccupation majeure mondiale. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc essentielles pour améliorer le pronostic vital des personnes infectées. Une des pistes est de pouvoir optimiser notre système de défense, mais cela nécessite une meilleure connaissance de ce dernier. Dans ce contexte, notre objectif vise à mieux comprendre le rôle du système immunitaire inné dans les mécanismes de défense liés à ces infections respiratoires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur la mise en place de la réponse immunitaire pulmonaire suite à des infections d’origine virale et microbienne. Plus particulièrement, nous travaillons sur des populations de cellules découvertes récemment et résidentes dans le poumon. Cette localisation leur permet de s’activer très rapidement lors de l’arrivée d’un pathogène dans le tissu pulmonaire. Une meilleure connaissance de ces cellules pourrait permettre de 1) comprendre des différences de susceptibilité de certains patients aux infections respiratoires, 2) identifier des biomarqueurs cellulaires ou moléculaires de susceptibilité et 3) identifier des cibles thérapeutiques afin de moduler la réponse immunitaire de l’hôte et non pas en ciblant le pathogène.
Procédures
Toutes les hypothèses, issues de la littérature, seront évaluées, au préalable, sur des modèles in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (cellules issues de donneurs de sang humains). Seuls les paramètres d’intérêts seront sélectionnés afin d’être testés in vivo chez la souris. En effet, il n’existe pas de modèles in vitro ou ex vivo capables de reproduire la complexité d’une réponse immunitaire d’un organisme vivant. Afin de reproduire les infections par des pathogènes respiratoires, les souris seront infectées par des suspensions contenant soit le virus de la grippe soit la bactérie pneumocoque. Pour cela, les souris seront sédatées par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine puis quelques gouttes (40µL) de la suspension contenant l’agent pathogène ou de la solution contrôle seront déposées sur les narines des animaux afin qu’ils les respirent. Cette intervention dure quelques secondes puis les souris seront surveillées jusqu’à leur réveil (15-20 min). Ainsi les pathogènes se déposent dans les voies aériennes supérieures et peuvent infecter les cellules pulmonaires, à l’image d’une infection chez l’homme lorsque les microbes sont transmis dans des gouttelettes projetées lors d’un éternuement ou d’une toux. Deux différentes doses seront testées : une dose modérée mimant une infection modérée et une dose forte permettant de reproduire une infection sévère. Sur les animaux de la procédure 1, trois prélèvements sanguins seront réalisés en submandibulaire (1 avant l’infection et 2 à différents temps après l’infection) afin de suivre certains paramètres inflammatoires systémiques. Cette procédure dure quelques secondes. Les souris seront toujours anesthésiées avant de procéder au prélèvement sanguin. Tout au long des expériences, les souris seront soigneusement surveillées quotidiennement pour détecter les changements physiques ou comportementaux. Ainsi, le poids et les comportements, seront relevés chaque jour. La réponse immunitaire pulmonaire sera analysée à différents temps : deux temps (précoce et tardif) lors des infections par le virus de la grippe et par le pneumocoque. Pour cela, les animaux seront euthanasiés par une injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (doléthal). Après la mort de l’animal, différents fluides biologiques (sang et lavage broncho-alvéolaire) et organes (poumons et rate) seront collectés pour analyser les réponses immunitaires mises en place.
Impact sur les animaux
Dans les cas les plus graves, la mort d’un patient suite à une infection respiratoire est la conséquence soit d’un défaut de contrôle du pathogène, soit d’une inflammation massive des voies respiratoires induite par le pathogène, provoquant un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Notre modèle d’infection par le pneumocoque chez la souris est représentatif de la 1ere catégorie. En effet, il provoque une infection très aiguë et rapide qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit à la mort des animaux en quelques jours. A l’inverse, le modèle d’infection grippale reproduit très bien la seconde catégorie où les mécanismes inflammatoires sont dérégulés et aboutissent à la mort des animaux à des temps plus tardifs. Ces infections entrainent donc des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal et provoquer des troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité. Afin de mimer une infection pulmonaire par voie aérienne, les souris seront infectées par voie intranasale. Cette procédure nécessite une anesthésie générale qui peut provoquer une nuisance à l’animal (refroidissement, stress). Cette instillation pulmonaire des pathogènes entraine également l’arrivée de liquides dans les poumons. Cette procédure provoque un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. Par ailleurs, chaque injection intrapéritonéale pour réaliser les anesthésies provoque un stress et une douleur au point d’injection (piqûre).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. En effet, concernant la procédure 1, l’ensemble des animaux auront été euthanasiés lors de la procédure afin de collecter la rate et les poumons pour analyser les réponses immunitaires se développant dans ces organes. Il ne restera donc pas d’animaux vivants en fin de procédure. Concernant la procédure 2, les animaux qui survivront à l’infection seront conservés jusqu’à ce qu’ils aient récupérés entièrement leur poids. Les animaux seront alors euthanasiés car ils ne peuvent être ni replacés ni adoptés car ce sont des animaux transgéniques infectés en confinement A2. De plus, la réutilisation de ces animaux n’est pas possible car la procédure subie pourrait drastiquement modifier les résultats d’une étude ultérieure.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de mimer la complexité des réponses immunitaires à l’échelle d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe et par le pneumocoque est bien établi et maîtrisé par les expérimentateurs. Cependant, nous utilisons au laboratoire, des systèmes de culture in vitro (hybridomes de cellules immunitaires), pour étudier certains paramètres avant de réaliser des expériences in vivo. De plus, nous avons développé des modèles d’analyses des cellules humaines issues de donneurs sains ou de patients atteints par des infections respiratoires et hospitalisés dans des services de pneumologie (pathologie modérée) et dans des services de réanimation (pathologie sévère). Ces modèles nous permettent d’analyser et d’affiner certaines hypothèses avant de les tester in vivo chez la souris. Ils permettent également de confirmer chez l’Homme, les résultats obtenus chez la souris.
Réduction
Tout d’abord, nous tenons à souligner que les expériences in vitro et ex vivo chez l’Homme, limiteront le nombre d’hypothèses et donc le nombre de souris à utiliser. De plus, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Lors de nos expérimentations, nous comparerons les souris traitées aux souris non traitées, en utilisant un test statistique pour échantillons indépendants. Nous estimons à 15 % minimum la différence de nos moyennes et nous souhaitons une puissance de test de 90% minimum. Pour chaque condition, 16 souris infectées (8 mâles et 8 femelles) et 16 souris non infectées (8 mâles et 8 femelles) seront nécessaires. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée de façon pluriquotidienne par toujours les mêmes expérimentateurs afin d’habituer les animaux et pour détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. De plus, une pesée quotidienne des animaux sera effectuée. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi les points limites suivants: - Perte de 25% de leur poids initial -Etat général indiquant une douleur (animal léthargique, ne répondant plus aux stimuli externes, prostré, fermeture totale ou partielle des yeux). Les souris présentant un de ces critères seront euthanasiées.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons des souris consanguines. Nous avons choisi la souris (Mus musculus), car elle offre les avantages suivants : - La souris est l’espèce la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires limitant de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. - Les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Les résultats obtenus ex vivo sur les cellules humaines pourront être mieux extrapolés aux expérimentations in vivo. - Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. - Notre laboratoire dispose de différentes lignées de souris transgéniques adaptées à l’analyse de la réponse pulmonaire anti-infectieuse. De plus, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant.
Role de l’environnement des nerfs périphériques dans leur développement et régénération chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
2 900 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les adultes sont génotypés jusqu'à deux fois par prélèvement d'un morceau de nageoire sous anesthésie, et des alevins subissent une ablation d'un nerf moteur au laser suivie d'une observation par fluorescence, pour étudier la régénération nerveuse. Les adultes sont tués par surdose d'anesthésiant une fois la génération suivante obtenue, les alevins par anesthésie puis commotion cérébrale pour l'histologie. Le porteur affirme à plusieurs reprises que la douleur est "minimisée", en s'appuyant sur le stade précoce des alevins et la rapidité de régénération de l'espèce.
Objectifs
Les motoneurones qui résident dans la moelle épinière constituent le relai final entre le système nerveux central et le muscle squelettique, responsable du mouvement. Au cours de leur différenciation, les motoneurones émettent des axones qui sortent de la moelle épinière pour suivre une trajectoire stéréotypée pour atteindre leur cible musculaire. Ce processus est orchestré par tout un répertoire de molécules présentes dans l’environnement des axones. Après lésion des nerfs moteurs, l’environnement va à nouveau servir pour le guidage des nerfs afin qu’ils puissent retourner vers leur cible musculaire initiale. L'importance de l'environnement au cours de la régénération des nerfs moteurs sera étudié chez des jeunes alevins de poissons zèbres dont deux gènes de molécules de guidage ont été mutés. Les mutations ne devraientt pas induire de phénotype dommageable permettant l’élevage des poissons. Afin de visualiser les nerfs moteurs et les cellules impliquées dans le processus de régénération, ces poissons auront préalablement été croisés avec 5 lignées transgéniques fluorescentes. Les nerfs sont lésés par ablation laser chez les jeunes alevinsde 4 jours post-fécondation (stade non couvert par la loi sur l'expérimentation animale). Le processus de régénération sera ensuite suivi in vivo par fluorescence, de manière non invasive pendant 2 jours.
Bénéfices attendus
Depuis plus de 40 ans, le poisson zèbre a été un modèle très utilisé pour comprendre la fonction des gènes. Il a même permis de corréler entre un locus donné et une pathologie humaine. Notre étude permettra de comprendre l’importance des deux protéines de l'environnement dans le développement et la régénération des nerfs moteurs et pourra apporter des arguments supplémentaires sur leur implication potentielle dans les maladies neuro-musculaires. En effet ll'une d'entre elle a déjà été mentionné comme candidat potentiel pour des neuropathies bien qu’aucune maladie humaine n’ait été associée avec une mutation dans ce gène pour l’instant. Chez l'homme, les nerfs périphériques sont aisément lésés et leur régénération est lente et souvent incomplète. En fait, moins de la moitié des patients qui subissent une réparation après lésion récupèrent de bonnes fonctions motrices et sensorielles. L’amélioration des connaissances fondamentales dans les molécules impliquées dans la régénération des nerfs moteurs est donc essentielle et ces données auront une application dans la médecine régénérative
Procédures
Les poissons seront génotypés au maximum 2 fois durant leur vie à partir de 3 mois (âge adulte) par prélevement d'un petit échantillon de la nageoire caudale afin de déterminer les poissons homozygotes à l'aide de ciseaux stérilisés à l'alcool 70% puis rincés à l'eau stérile. Le prélèvement se fait sous anesthésie et la procédure totale dure trois minutes. L'animal est immédiatement transféré dans le bac de réveil dont l'eau est correctement aérée jusqu'à la reprise totale de ses capacités soit 1 à 2 min. La nageoire régénère naturellement en 10 jours sans que cela n'impacte sur la nage du poisson.
Impact sur les animaux
Compte tenu des données obtenues chez les souris invalidées pour les deux gènes et du fait de leur faible fonction chez l'organisme adulte, les poissons adultes homozygotes ne devraient pas présenter de phénotype dommageable. En revanche, les poissons doublement mutants pourraient être plus sensibles aux conditions d'élevage avec un vieillissement plus précoce consistant en une baisse de la reproduction et des animaux amaigris. Concernant les alevins subissant une ablation du nerf moteur, la douleur devrait être minime compte tenu du stade auquel l'expérimentation est effectué : 4 jour post-fécondation alors que le poisson est hors cadre de la législation. A ce stade, le système nerveux central n'est pas encore mature et les comportements complèxes ne sont pas encore présents. De plus la lésion d'un seul nerf moteur dans le tronc correspond à 1,7% des nerfs totaux. Des études ont aussi montré que chez des alevins de 5 jours post-fécondation (stade couvert par la législation), les marqueurs de la douleur revenaient rapidement à la normale en 24 h suivant le stimulus nociceptif. Aussi, les alevins agés de 5 jours-post fécondation ne devraient pas non plus ressentir de douleur puisque cela correspond à 24 h suivant l'ablation. Enfin, le poisson zèbre est un modèle animal qui a une forte capacité de régénération de nombreux organes comme le coeur et le cerveau. Une complète régénération du nerf moteur est observé 48 h après ablation chez le jeune alevin wt.
Devenir
Les animaux d’environ 1 an et 4 mois sont mis à mort par surdose d'anesthésiant quand ceux de la génération suivante atteignent la maturité sexuelle et sont capables de se reproduire afin de donner de nouveaux embryons, et donc alevins qui serviront à l’étude de la régénération. Tous les alevins pour l’étude de la régénération seront mis à mort par anesthésie suivie d'une commotion cérébrale afin de pouvoir réaliser des études histologiques.
Remplacement
Le processus de régénération des nerfs intervient dans un environnement complexe qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro. Nous utiliserons le poisson zèbre plutôt que le modèle de la souris déjà établi car il permet de visualiser in vivo le processus de régénération par fluorescence de manière non invasive.
Réduction
La capacité de fécondation externe du poisson zèbre permet d'obtenir facilement des embryons sans mise à mort des parents et donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre de poissons a été réduit au minimum de deux lots de 20 pour chaque lignée. Ce nombre est nécessaire à la fois pour assurer la pérénité de chaque lignée et pour permettre aux poissons de se développer correctement et d'avoir correctement accès à la nourriture. Contrairement à la souris, chez le poisson zèbre il est nécessaire d'effectuer un brassage génétique en utilisant suffisamment de couples pour obtenir une nouvelle génération. De plus, il n'y a pas de chromosome sexuel, aussi il est difficile de contrôler le ratio mâles/femelles. Enfin ce nombre de 20 poissons par bac est important pour le bien être de l'animal puisque le poisson zèbre est un animal grégaire il est nécessaire de l'élever en un nombre suffisamment important pour permettre les interactions sociales.
Raffinement
Des points limites adaptées à la procédure et suffisament prédictifs et précoces ont été établis pour éviter tout mal être de l'animal. Au cours de l'élevage, le bien être des poissons sera vérifié de manière hebdomadaire tout au long de la vie des animaux. Les animaux qui présentent des phénotypes tels que animaux ne se nourrissant pas, animaux amaigris, animaux présentant des défauts musculo-squelettique (scoliose, lordose, ...), animaux présentant un comportement indicatif d'un stress chronique (animaux isolés au fond d'un bac, décolorés, ...) seront mis à mort afin d'éviter toute souffrance. Après ablation d’un nerf moteur, le réveil des alevins sera surveillé. Un retour à l'activité motrice en absence d'anesthésiant apparait en quelques minutes. Puis l’état des alevins sera suivi quotidiennement sous stéréoscope (soit à 5 et 6 jours post-fécondation). Tout alevin présentant un défaut de flotabilité, restant au fond du puit dans la boîte 12 puits sera mis à mort.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un bon modèle pour l'étude du développement des nerfs moteurs. Le développement du système nerveux périphérique moteur est relativement simple. Concernant l’étude de la régénération des nerfs périphériques, grâce à l'utilisation de lignées transgéniques fluorescentes la régénération des nerfs peut être suivie in vivo en temps réel par fluorescence donc de manière non invasive chez les alevins. Les embryons sont obtenus sans souffrance après accouplement naturel de poissons adultes puisque la fécondation se fait ex utero. De plus chez les alevins de type sauvage, les nerfs régénèrent rapidement, en 48 h après ablation. Enfin, lorsque le nerf est sectionné par ablation laser, l'alevin est âgé de 4 jours post-fécondation, il peut encore se nourrir à partir de son sac vitellin et est ainsi indépendant. Il ne devient sous la dépendance de la loi qu’à partir de 5 jours post-fécondation alors que le phénomène de régénération a déjà commencé, ce qui signifie que la condition de souffrance est minimisé Des poissons adultes de 4 à 16 mois homozygotes et hétérozygotes adultes seront utilisés pour obtenir des embryons homozygotes ou hétérozygotes par accouplement naturel puisqu'à ce stade, ils sont pleinement fertiles. Des alevins de 4 à 6 jours post-fécondation seront utilisés pour étudier le processus de régénération. Tandis que les organes se développent rapidement chez les embryons et alevins de poisson zèbre; le système nerveux central reste encore primitif jusqu'à 5 jours post-fécondation. De plus il a déjà été montré que la régénération s'effectuait de manière rapide : en 2 jours il y a régénération complète ce qui signifie que la douleur ressentie est minimisée.
Réponse de l’épithélium broncho-alvéolaire lors d’une irradiation pulmonaire en conditions stéréotaxiques chez la souris : focus sur les cellules club
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 168 dans des procédures de gravité sévère et 576 de gravité modérée. Elles reçoivent une irradiation pulmonaire de 80 Gy sous anesthésie et des injections de naphtalène destinées à détruire un type de cellules pulmonaires, pour mesurer leur rôle dans la fibrose radique. Le porteur indique n'avoir aucun recul au-delà d'un mois sur cette association et que les lésions pourraient provoquer des difficultés respiratoires, les prélèvements étant réalisés post-mortem à un et six mois. Il reconnaît que des organoïdes pulmonaires pourraient remplacer en partie les animaux mais que le laboratoire n'est "pas armé" pour les mettre en place.
Objectifs
La qualité de la prise en charge thérapeutique du cancer inclut la qualité du contrôle tumoral et la qualité de vie des patients, avec une espérance de vie de plus en plus longue c. La radiothérapie est très efficace mais génère des séquelles pouvant compromettre sévèrement la qualité de vie. Nous étudions les effets des rayonnements ionisants sur les poumons qui sont des organes à risque pour le traitement des tumeurs thoraciques (e.g. poumon, sein). La réponse pulmonaire aux rayonnements ionisants fait l’objet de nombreuses publications, mettant en avant le rôle de plusieurs types cellulaires dans le développement des dommages radio-induits, dont les pneumocytes de type I et II et les cellules endothéliales de la microvascularisation pulmonaire. Nous avons pu identifier un type cellulaire, les cellules club, comme candidat intéressant dans la cinétique de développement de la fibrose pulmonaire. Ce sont des cellules situées sur l’épithélium bronchiolique et qui sont impliquées dans la protection de l’épithélium bronchiolique et dans la détoxification pulmonaire. Ce sont également des cellules souches potentielles, capables de se diviser et se différencier pour reconstruire l’épithélium endommagé. La protection épithéliale passe entre autres par la synthèse et la sécrétion d’une protéine (dont la diminution a été associée au développement de certaines pathologies comme la broncho-pneumopathie obstructive chronique). Dans nos travaux sur l’effet de la dose, du volume et du protocole de fractionnement sur les lésions pulmonaires, nous avons remarqué que les conditions d’irradiation aboutissant à de la fibrose pulmonaire étaient systématiquement associées à une diminution sévère du nombre de cellules club dans les bronchioles. Dans les schémas ne générant pas de fibrose, les cellules club n’étaient pas déplétées. L’objectif du projet est d’utiliser un modèle de déplétion transitoire des cellules club afin de déterminer l’impact de ce type cellulaire sur le développement des lésions radiques pulmonaires. La déplétion des cellules club est induite par injection unique de naphtalène par voie intra-péritonéale. La déplétion par le naphtalène est transitoire. Ce modèle est très utilisé dans la bibliographie et ne provoque pas de conséquence clinique notable chez les animaux.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle des cellules club dans la réponse aux rayonnements ionisants, et globalement de la réponse de l’épithélium bronchiolique, peut permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires.
Procédures
Tous les animaux : Irradiation 80 Gy, sous anesthésie (durée max 40 min) Selon les procédures et lots : - Injection intra-péritonéale sur animal vigile (unique ou répétée, jusqu’à une injection par semaine pendant 24 semaines) - Instillation nasale sous anesthésie (1 fois par semaine pendant 3 semaines) - Scanner sous anesthésie (4 minutes, max 4 fois)
Impact sur les animaux
D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation focale pulmonaire à une dose de 80 Gy ne génère pas de conséquences cliniques notables jusqu’à 6 mois post-irradiation. L’absence de cellules club au moment de l’irradiation pourrait aggraver la sévérité des lésions. Sur l’association naphtalène/80 Gy nous avons un recul d’un mois, sans effet clinique notable. Aucune donnée n’est disponible pour le point 6 mois. Si les lésions sont fortement aggravées, les animaux pourraient développer des difficultés respiratoires.
Devenir
Tous les prélèvements aux points d’étude 1 et 6 mois seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré. Il existe des modèles in vitro pouvant remplacer en partie l’utilisation d’animaux, à savoir les organoïdes pulmonaires. Ces modèles sont complexes à mettre en place et le laboratoire n’est pas armé à ce jour pour construire de tels modèles.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer les tests statistiques requis, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 8 animaux pour chaque groupe irradié pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées. Pour les groupes contrôles, 6 animaux sont suffisants. Pour les analyses en single cell RNA seq, le nombre d’animaux sera réduit à 3 à 4 par groupe, nombre suffisant pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (mise en place de grilles de score, suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, hébergement en groupe avec enrichissement).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 8 et 34 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Rôle de TRPV3 et de l’innervation sensorielle dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
360 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées sont exposées à une chaleur croissante de 33 à 44 °C mimant une canicule et à des mesures cutanées sous anesthésie, pour étudier le rôle du récepteur TRPV3 dans les défauts de thermorégulation au cours du vieillissement. L'exposition à la chaleur est arrêtée si la température rectale monte de 4 °C, et les souris sont tuées par dislocation cervicale pour des prélèvements terminaux. Le porteur qualifie ses techniques d'indolores et annonce, "à terme", des pistes de traitement pour les personnes âgées vulnérables aux vagues de chaleur.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la thermorégulation vasculaire de la peau. Avec le réchauffement climatique et le vieillissement de la population, les vagues de chaleur vont avoir un effet critique grandissant sur notre système de santé. En effet, la population âgée est particulièrement vulnérable aux épisodes caniculaires dû à une altération de la thermorégulation conduisant à une incapacité à dissiper la chaleur et pouvant entraîner de graves complications voire un décès. Bien que ces défauts soient rapportés au cours du vieillissement depuis longtemps, les mécanismes qui sous-tendent ces défauts fonctionnels ne sont pas encore connus, ce qui limite fortement les approches thérapeutiques envisageables pour les personnes âgées. Les thermorécepteurs TRPV3 exprimés dans la peau sont mis en jeu dans les processus de sensation de température et dans la thermorégulation vasculaire cutanée. Ce projet vise à caractériser le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de l’épiderme (couche superficielle de la peau) dans les mécanismes neurovasculaires cutanés de la thermorégulation au cours du vieillissement, en utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de bloquer la fonction de TRPV3 ou ayant un défaut d’innervation cutanée.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de la thermorégulation au cours du vieillissement permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de thermorégulation qui peuvent affecter la population âgée.
Procédures
Les lignées de souris nécessaires pour ce projet sont déjà disponibles et présentent à l’âge adulte jeune un défaut de réponse vasculaire au chauffage local mais ne présentent pas de trouble susceptible d'affecter leur bien-être dans les conditions d’hébergement standard. Les souris seront anesthésiées (durée environ 45 minutes) afin d’effectuer des mesures non invasives pour caractériser la fonction barrière et leur capacité vasculaire cutanée lors d’une exposition à un chauffage local ou un chauffage global mimant un épisode de canicule. Une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) sera également envisagée chez des souris vigiles afin de mesurer leur capacité à maintenir leur température interne stable dans ces conditions thermiques mimant une canicule. Les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de la peau au cours du vieillissement nous étudierons des souris d’âge différents (jeunes, matures et âgées).
Impact sur les animaux
Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Pour les mesures sur souris vigiles, l’utilisation de tubes de contention peut générer un stress qui sera minimisé grâce à une habituation préalable. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention pendant 10 minutes, deux jours différents dans les 7 jours précédents. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 des pattes ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. L’exposition à un chauffage globale de la souris va déclencher des mécanismes de thermorégulation périphériques et centraux, induire une sudation afin de préserver une température interne le plus stable possible. Notre étude précédente a montré que les souris exposées à un chauffage passif de 33 à 44°C à raison de +1°C/min induisait une augmentation de la température rectale d’environ 3°C (en vigile et sous anesthésie). Afin de limiter les effets indésirables, l’exposition à la chaleur sera immédiatement arrêtée si l’augmentation de la température rectale atteint +4°C (en vigile ou sous anesthésie). Les souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.
Devenir
Mise à mort par dislocation cervicale. Cette étude vise à comprendre le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet du vieillissement sur la réactivité vasculaire (mesures ex vivo sur vaisseaux isolés) et l'expression de TRPV3 dans la peau.
Remplacement
Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la réactivité vasculaire cutanée en réponse au chauffage qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 360. Ce nombre maximal inclut la possibilité de reproduire les expériences en cas d'imprévu, donc il est très vraisemblable que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée hebdomadaire). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les même approches (laser Doppler, iontophorèse), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique au cours du vieillissement, les souris seront utilisées à 3 âges différents (18 mois).