Recherche fondamentale

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie intranasale, sous anesthésie, par les bactéries Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus, puis tuées par dislocation cervicale six à quarante-huit heures plus tard pour prélèvement d'organes, afin d'étudier le rôle d'une protéine, la cochline, dans la réponse immunitaire. Le porteur indique que l'infection provoque douleur, fièvre et perte de poids pendant la durée de l'expérience. Il juge l'utilisation d'animaux "essentielle" car l'étude ne peut être menée sur des lignées cellulaires.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est un enjeu mondial majeur dans le traitement contre les infections bactériennes. Stimuler le système immunitaire de l'hôte représente une alternative prometteuse afin de diminuer l'antibiorésistance. Les mécanismes endogènes contrôlant l'immunité antibactérienne restent insuffisamment compris, en partie parce que les protéines potentiellement impliquées dans une telle régulation restent peu étudiées. Un exemple est la cochline, protéine de la matrice extracellulaire. Il a récemment été décrit que la protéine circulante cochline (codée par le gène Coch) augmente la réponse innée de l'hôte contre deux bactéries Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. L’absence de cochline entraîne un défaut de contrôle de la propagation bactérienne au site d’infection (poumon) et sa dissémination dans l’organisme (sang, rate), et une diminution de la survie des souris à ces modèles infectieux. L’absence de cochline est associée à une diminution du recrutement de cellules immunitaires innées. Il a aussi été montré que l'administration de cochline recombinante limite la colonisation bactérienne de lésions cutanées dans un modèle murin d’épidermolyse bulleuse. Ainsi, le ciblage de la « voie cochline » présente un fort potentiel thérapeutique contre les infections bactériennes dans le contexte de l’accroissement des antibiorésistances.

Bénéfices attendus

A court terme, le projet consiste à décrire de façon très complète les défauts de la réponse immunitaire dans les souris transgénique n’exprimant pas la cochline suites aux infections bactériennes. Ce projet permettra donc la caractérisation complète et détaillée de « la voie cochline ». A plus long terme, le ciblage de la voie cochline pourra apporter une option thérapeutique innovante visant à augmenter la réponse de l’hote notamment lors d’infections bacteriennes résistantes aux antibiotiques.

Procédures

Les animaux seront pesés (vigile), identifiées par marquage caudal au feutre (vigile) puis traités pour limiter la souffrance avec du paracétamol dans l’eau de boisson 12h avant infection puis pendant tout le temps de l’expérience (vigile). Les animaux seront alors anestésiés par injection intrapéritonéal (vigile) pendant une dizaine de minutes au cours desquelles ils seront infectés en intranasal avec les bactéries Pseudomonas Aeruginosa ou Staphylococcus Aureus Newman. Après 6h-48h suivant les expériences, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale (vigile) ou injection intrapéritonéale (vigile) pour prélèvement de différents organes et échantillons post-mortem

Impact sur les animaux

Douleur induite par une infection bactérienne pulmonaire, fièvre, perte de poids, activité et mobilité réduite. Ces effets dureront au maximum 48h (temps d’expérince le plus long avant mise à mort)

Devenir

Chaque procédure nécéssitant l’analyse sur des organes vitaux (poumon, rate) les souris devront être mises à mort à la fin de chaques procédures.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse du système immunitaire et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles. Ainsi pour limiter le nombre de souris utilisées, nous réaliserons les procédures expérimentales préliminaires avec 4 souris par groupes pour déterminer, à l’aide d’un calcul de puissance, le nombre adéquat de souris pour les autres procédures. Pour les procédures expérimentales de détermination de la dose infectieuse , nous ne testerons pas toutes les doses proposées en même temps mais testerons en premier 2 doses et testerons ensuite des doses à la hausses ou à la baisse parmi celles proposées en fonction des résultats préliminaires obtenus. Pour les procédures d'expérimentations les nombres indiqués correspondent au maximum. Les nombres de souris par groupe seront revus à la baisse en fonction des résultats des procédures préliminaires permettant des calculs de puissance. De plus les résultats des groupes contrôles négatifs (sans infection) pourront être utilisés pour les différentes procédures.

Raffinement

Nous avons optimisé les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et le stress subis par les animaux. En particulier, nous avons mis en place une surveillance adaptée lors des procédures afin de ne jamais induire un dépassement de point limite de souffrance. Afin de limiter la douleur lors de l’infection intranasale, nous anesthésierons les souris par injection intrapéritonéale (dans l’abdomen). Pour limiter la douleur post-infection nous administrons par voie orale via l’eau de boisson du paracétamol (doliprane 2.4% à 0.6mL/L) qui sera maintenu pendant toute la durée de l'expérimentation. Afin de limiter le mal-être et l'angoisse des animaux, nous mettrons en œuvre des mesures d'acclimatation de 5 jours après leur arrivée en zone d'hébergement, et nous maintiendrons au maximum les groupes sociaux.

Choix des espèces

Le rôle de cochline dans la réponse immune a été établi par 4 publications utilisant la souris. Utiliser le modèle souris nous permettra donc de ne pas répéter des expériences inutiles en étudiant la littérature existante, et de comparer aisément nos résultats avec ceux de nos confrères afin de progresser plus rapidement. De nombreux anticorps spécifiques reconnaissant les marqueurs du système immunitaire murins nous permettent de faire des études sur ce modèle. Les animaux auront entre 5 et 8 semaines de vie à leur arrivée en zone expérimentale. Après une semaine d'acclimatation, ils entreront en procédure. Nous travaillons avec des souris adultes pour nous affranchir d'éventuels problèmes d'immaturité du système immunitaire lié au développement.

6 615 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de cellules de mélanome, sous la peau, dans la veine caudale ou par injection intrasplénique sous anesthésie, puis des injections d'inhibiteurs trois fois par semaine pendant jusqu'à soixante-dix jours, pour tester des molécules censées lever la résistance aux traitements du mélanome. Le porteur décrit des tumeurs pouvant provoquer nécroses cutanées, perte de poids et prostration avant l'atteinte des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de s'affranchir" de la souris faute de méthode reproduisant des interactions aussi complexes.

Objectifs

Malgré les progrès dans le traitement des patients atteints de mélanomes avec les thérapies ciblées (TT), combinaison d’inhibiteurs (vémurafénib/tramétinib ou dabrafénib/cobimétinib), et les immunothérapies (ICT) (nivolumab, pembrolizumab et/ou ipilimumab), plus de la moitié des patients développent des résistances à ces traitements. De nouvelles approches thérapeutiques pour permettre de contourner ces résistances et resensibiliser les patients aux traitements deviennent alors nécessaires. Notre équipe a montré que l'altération du paysage épigénétique est un événement clé associé à la plasticité des cellules de mélanome et à l'acquisition de résistances. L'épigénétique est l'étude de l'activité des gènes sans modification de la séquence d'ADN. Nous avons étudié le rôle de l’épigénétique sur les résistances des cellules de mélanome au TT et aux ICT. In vitro, nos résultats montrent que l’inhibition de répresseurs transcriptionnels (appelés CtBP1 et CtBP2) et du modificateur épigénétique (appelé G9a) est capable de resensibiliser les cellules de mélanome résistantes aux TT et aux ICT. L’objectif du projet est de valider in vivo, chez la souris, les résultats montrant la re-sensibilisation des cellules de mélanome aux TT et/ou ICT. Par ailleurs, les mélanomes métastasent facilement aux poumons, au foie et dans les os, entre autres, causant le décès des patients. La localisation des métastases influence les réponses aux traitements, qui peuvent être différentes en fonction de l’environnement pulmonaire, hépatique ou osseux. Nous étudierons donc l’effet des drogues épigénétiques sur le développement des métastases dans divers organes. Ainsi, nous validerons nos résultats montrant une diminution de la capacité métastatique des cellules de mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une validation in vivo, chez la souris des observations faites in vitro, sur la capacité des drogues épigénétiques à resensibiliser les cellules de mélanomes résistantes aux thérapies ciblées. Il permettra aussi de vérifier les effets de ces drogues dans le contexte d’un système immunitaire complet et de vérifier que les drogues utilisées n’affectent pas le système immunitaire. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos approches thérapeutiques (inhibiteur épigénétique en association avec les thérapies ciblées ou les immunothérapies).

Procédures

Pour les procédures 1 et 5 une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 1 et 648 souris procédure 5, au total 1512 souris). Pour les explorations métastatiques, les souris seront injectées 15 min avant l'imagerie par voie intra-péritonéale avec de la D-luciferine puis anesthésiées avec de l'isoflurane selon le protocole préconisé (voir procedure expériementale). Pour les procédures 2 et 6, la formation de métastases pulmonaires grâce à l’injection veine caudale sera suivie par bioluminescence 24h après l'injection (=confirmation du signal) puis 2 fois par semaine pour suivre l'évolution des métastases, puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 2 et 648 souris procédure 6, au total 1512 souris). Pour les procédures 3 et 7, une injection intrasplénique de cellules sur souris sous anesthésie générale (anesthésie environ 1h et acte chirurgicale environ 30min), puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 3 et 648 souris procédure 7, au total 1512 souris). Le suivi des métastases se fera comme pour la procedure 2 et 6. Pour les procédures 4 et 8, une injection intracardiaque de cellules sur souris sous anesthésie générale (environ 30min), puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (1188 souris procédure 4 et 891 souris procédure 8, au total 2079). Le suivi des métastases se fera comme pour la procedure 2 et 6.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des drogues thérapeutiques, soit par l’acte chirurgical initial. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des drogues pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..). Le site d’injection IP sera surveillé et changera de côté pour chaque injection. En cas d’altération au site primaire d’injection, l’injection suivante s’effectuera de l’autre côté. En cas de rougeurs des deux côtés, l’injection sera reportée au tour suivant. L’acte chirurgical (injection intracardiaque, injection intra splenique) pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site de l’opération. La cicatrice sera surveillée. En cas de persistance des signes décrits ci-dessus, l’animal sera sacrifié. Il a été montré dans la littérature que la combinaison de DMSO + PEG 300 + Tween 80 ne présente aucune toxicité pour l’animal et a déjà été administré chez les patients atteints d’un cancer. (Kalepu & Nekkanti, Acta Phamaccutica Sinica B, 2015). Les drogues A et B ont déjà été testées in vivo par des pairs et les concentrations utilisées sont réduites par rapport aux données de la littérature (Chen et al., Journal of Cancer, 2021, doi: 10.7150/jca.50255).

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Les études in vitro que nous avons réalisées dans un premier temps ont montré l’efficacité des drogues épigénétiques dans l’induction de la mort ou l’arrêt de la prolifération des cellules de mélanome cutané ainsi que dans l’inhibition de leur capacité invasive.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test de puissance statistique dans le cas où la différence de moyenne de chaque groupe est supérieure au moins d’un quart à notre écart type (1.25 fois notre moyenne contrôle) et une puissance de 0.9 et un risque de 0.01. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 6615 souris. Les groupes contrôles sont mis en commun pour les différents traitements avec les inhibiteurs afin de réduire le nombre d’animaux. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs/métastases et organes (tels que le foie, la rate, les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, certaines procédures ou parties de procédures pourront être abandonnées, ou le nombre d’animaux réduit, en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et seront observées deux ou trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum grâce à un suivi longitudinal précis et quantifiable par imagerie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant de similitudes génétiques avec l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien connu, une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Nous utiliserons un modèle de souris C57BL/6J (pour les cellules de mélanome murin) et Nude (pour les cellules de patients). Grâce à un système immunitaire très faible, la souris nude pourra recevoir des cellules humaines sans risque de rejet. D’autre part, ce modèle de souris est commercialisé, bien établi et d’importantes études ont déjà été réalisées à partir de ce modèle. Pour les procédures expérimentales, les souris C57BL/6J et Nude sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation. Concernant les souris Nude, déprimées en cellules T, il a été montré qu’après 10 semaines il pouvait y avoir un retour d’une petite proportion de cellules T dans ces souris. En effectuant les injections à 7 semaines, la prise tumorale aura eu lieu avant le possible retour de la population des cellules T, et les tumeurs grossiront principalement en absence de la population T sur une majeure partie de l'expérimentation. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature (Ohanna et al, Genes&Dev, 2011; Bonet et al, Journal of Biological Chemistry, 2012 ; Ohanna et al, Oncotarget, 2013).

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques sous la capsule rénale ou par voie intraportale et des injections répétées, après induction d'un diabète, pour tester une molécule censée améliorer la survie des greffons. Le porteur renvoie l'application clinique au conditionnel, les résultats devant "facilement" être transposés, tandis que les souris sont rendues diabétiques puis opérées. Il indique avoir mené des essais in vitro préliminaires mais affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet d'aller plus loin.

Objectifs

Notre projet porte sur l'application préclinique de nouveaux composés ciblant une voie innovante que nous avons identifiée chez les mammifères, et dont les inhibiteurs peuvent prévenir les lésions tissulaires induites par l'ischémie associées au processus de transplantation. Après avoir démontré leur efficacité dans un modèle préclinique de transplantation rénale et d'accident vasculaire cérébral, notre objectif est d'évaluer leur utilité dans la transplantation d'îlots pancréatiques, connue pour être une thérapie curative du diabète de type 1. Les applications cliniques ont clairement montré que cette procédure améliore le contrôle glycémique chez les patients mais elle présente certaines limites liées à la survie des Îlots.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est de déterminer l'efficacité de notre traitement pour améliorer le rendement, la survie et la fonctionnalité des îlots avant et après transplantation. Les résultats pourront ainsi être facilement transposés à la clinique.

Procédures

Les animaux receveurs seront soumis à une procédure chirurgicale de transplantation soit sous la capsule rénale (procédures 1 et, 2) soit par voie intraportale (procédure 3). Les actes chirurgicaux seront effectués une seul fois par animal et dureront le moins longtemps possible (20-30 minutes max). Les animaux bénéficieront d'un suivi journalier dans les premiers jours post-opération. Les animaux seront soumis à des injections IP (avec aiguille G25), selon la procédure, avec des produits (médicaux ou pharmacologiques) qui n’entrainent aucune souffrance physique.

Impact sur les animaux

Les souris diabétiques développeront l'hyperglycémie typique de cette pathologie qui sera monitorée par bandelettes. Le traitement pharmacologique préconisé dans les procédures utilise un produit déjà breveté qui ne cause aucune toxicité pour l'animal. Les animaux receveurs qui subiront une procédure chirurgicale seront attentivement suivis afin d'éviter toute complication post-opératoire (infection, inflammation et douleur).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasie à la fin de chaque procedure ou lors qu'ils attaignent le point limite identifié.

Remplacement

Des études préliminaires sur lignée cellulaire (INS-1E) et îlots primaires isolés de souris nous ont permis 1) d'établir la concentration optimale du produit pour obtenir la meilleure survie et fonctionnalité des îlots pancréatiques et 2) de démontrer la capacité de notre composé à protéger les îlots en culture des phénomènes d’anoxie. Toutes ces étapes d'optimisation ont été effectuées in vitro avec un nombre très limité d'îlots par rapport aux expériences de transplantation. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude.

Réduction

Les études d'optimisation in vitro nous ont permis de réduire le nombre de souris nécessaire pour les procédures chirurgicales. En plus, selon les résultats obtenus dans les procédures 1 et 2, nous pourrons éventuellement choisir un seul type de préparation d'îlots avant transplantation (pré- ou per-conditionnement), en réduisant le nombre des souris nécessaires dans la procédure 3. Le nombre de souris utilisé dans l'étude est strictement calculé pour obtenir des résultats statistiquement concluants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui entraineront l'euthanasie de l‘animal par dislocation cervicale. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et à la zone de chirurgie pour les animaux transplantés.

Choix des espèces

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude. En effet, la complexité des organes ne peut être récapitulée in vitro, ni le modèle d’ischémie et reperfusion. Les alternatives d’anoxie et d’hypoxie in vitro sont limitées dans leur mise œuvre et dans la pertinence des résultats obtenus. Les animaux seront utilisés entre 8 et 10 semaines post-natales qui est par expérience l’âge optimal pour la chirurgie.

6 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, cinq gavages, quatre injections et des prélèvements de sang, puis est tuée pour analyse des tumeurs et organes, afin d'étudier le rôle du microbiote intestinal dans la réponse aux traitements anticancéreux. Le porteur renvoie au développement de médicaments à base de bactéries comme bénéfice attendu, tandis que des tumeurs sont induites chez chaque souris. Il affirme la "nécessité d'un organisme entier" porteur de tumeur et juge ces modèles "indispensables".

Objectifs

L’efficacité des traitements anticancéreux ciblant le système immunitaire fait actuellement l’objet de nombreuses études cliniques. Ces traitements permettent une réinduction de la réponse immunitaire qui se trouve supprimée par les cellules cancéreuses. Cependant, certains patients développent une résistance à ce traitement. Des résultats obtenus au sein de notre laboratoire ont démontré le rôle crucial du microbiote intestinal dans l’activation du système immunitaire permettant d’améliorer l’effet de thérapies anticancéreuses. Chez les patients atteints d’un cancer, de nombreux facteurs entraînent un déséquilibre du microbiote qui pourrait être impliqué dans la résistance aux traitements. En effet, des données publiées ont démontré que la prise de traitements antibiotiques impacte l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Par ailleurs, des données générées par des études cliniques chez des patients atteints de cancer ont identifié certaines bactéries associées à l'efficacité des traitements anticancéreux. En conséquence, ce projet a pour but de caractériser le rôle des bactéries isolées du tube digestif des patients atteints de cancer (et de leurs produits actifs (métabolites)) et d'évaluer leur capacité à moduler la réponse aux thérapies anticancéreuses chez des souris porteuses de tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment certaines bactéries améliorent l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Il permettra de développer de nouveaux médicaments contenant des bactéries pour améliorer les réponses aux traitements anticancéreux chez les patients atteints de cancer. En effet, beaucoup de patients développent des résistances à ces thérapies. Des essais cliniques utilisant des bactéries vivantes sont en cours de réalisation.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection de cellules tumorales durant toute la durée de l’expérience (sous anesthésie, durée: 5 minutes ). Ces injections se feront après anesthésie générale gazeuse. 5 gavages oraux espacés à intervalle de 3 jours seront effectués (durée: quelques secondes). 4 injections sous anesthésie locale seront pratiquées (durée 20 minutes, incluant l'anesthésie locale). Du sang pourra être prélevé au niveau submandibulaire après anesthésie générale sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine), durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Croissances tumorales. Nuisances limitées liées à la présence d'une tumeur par animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses sur les tumeurs et organes.

Remplacement

Les procédures expérimentales mises en jeu ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants (nécessité d’un organisme entier, vivant, avec un système immunitaire complexe, proche de l’homme, porteur de tumeur). Les modèles de souris traitées par antibiotiques nous sont indispensables pour étudier les interactions avec le microbiote intestinal et les mécanismes qui régissent l'efficacité des thérapies anticancéreuses. Les modèles in vitro de lignées cellulaires testés ne permettent pas de récapituler la complexité des interactions entre l’hôte, le cancer, son microbiote intestinal, son système immunitaire et des thérapies anticancéreuses.

Réduction

Les groupes seront constitués d’un minimum d’animaux assurant la fiabilité des résultats en termes de statistiques. Le nombre de prélèvements pré- et post-mortem seront optimisés dans le souci du confort de l’animal afin d’étudier le plus de paramètres possibles et ainsi d’éviter la répétition d’expérimentation. Deux bactéries ou selles de volontaires sains seront testés simultanément pour limiter le nombre de groupes contrôle et référence.

Raffinement

Le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. L’inoculation des cellules tumorales se fera sous anesthésie générale. L’injection intra-péritonéale des traitements anticancéreux ainsi que les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Une surveillance accrue du comportement des animaux sera effectuée et mis au regard de points limites.

Choix des espèces

La souris est un mammifère et un modèle décrit, validé, facile à mettre en œuvre et admis dans la communauté scientifique. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Des femelles seront utilisées car les modèles de tumeur ont été obtenus à partir de souris femelles. Les précédentes expériences publiées ont été validées à l’aide de souris femelles ayant atteint l'âge de maturité sexuelle. Les souris seront donc utilisées à partir de l’âge de 7 semaines, période à laquelle la maturité sexuelle est atteinte chez les souris.

124 bars européens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tués pour prélèvement de tissus après la première saison de reproduction et 76 gardés en vie et réutilisés pour suivre leur reproduction sur cinq ans. Chaque poisson subit une vingtaine de manipulations sous anesthésie, biométrie, prises de sang et biopsies ovariennes ou vérification de la présence de sperme, à raison d'une par mois quatre mois par an. Le porteur décrit une exposition prolongée à une eau acidifiée pour mesurer les effets du changement climatique sur la reproduction. Il affirme qu'il "n'existe pas d'alternative" à l'expérimentation puisqu'il cherche les mécanismes physiologiques dépendant du pH.

Objectifs

Les émissions de CO2 causées par l'homme vers l’atmosphère sont absorbées par les océans, entraînant une acidification des océans, correspondant à une baisse des valeurs de pH de l’eau océanique. Le GIEC (Groupement d’Expert Intergouvernementaux sur l’Evolution du Climat) prévoit une baisse de 0,4 unité de pH pour 2100, soit un pH de 7,6 contre 8 aujourd’hui. Cette acidification de l’eau affecterait le fonctionnement du système nerveux central des poissons marins, avec un impact indirect sur la maturation sexuelle et la reproduction. Les dernières études scientifiques démontrent que les bars élevés depuis leur naissance dans une eau avec un pH abaissé à 7,6 ont une période de ponte plus tôt dans l’année et la qualité des gamètes diminue également chez les deux sexes. Dans ce contexte, ce projet vise à étudier les effets intergénérationnels sur la maturation sexuelle et la reproduction du bar européen d’une exposition à long terme à l’acidification pendant 5 saisons de reproduction successives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer les effets à long terme et intergénérationnels de l’acidification océanique sur les reproductions successives d’un poisson marin à fort intérêt écologique et économique. Les connaissances ainsi acquises contribueront à l’évaluation des effets du changement climatique sur les organismes marins et pourront potentiellement faire évoluer la stratégie de gestion et de conservation des écosystèmes marins.

Procédures

Les poissons seront soumis à des manipulations répétées (biométrie, prise de sang, biopsie ovarienne/vérification de la présence de sperme), une fois par mois pendant 4 mois par ans (en janvier, février, mars et avril) et durant 5 ans consécutifs. Soit pour 1 poisson 20 manipulations de 5 min en 5 ans.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont modérés. La pêche des poissons peut entraîner un léger stress car les poissons sont sédatés dans leur bac avant d’être pêchés et anesthésiés. Après l’anesthésie, les manipulations s’enchaînent (biométrie, prise de sang, biopsie ovarienne pour les femelles ou massage abdominale pour les mâles) en moins de 5 minutes par poisson. L’intervalle d’un mois est suffisant pour la réalisation de ces manipulations répétées sur un même individu sans que cela n’engendre aucun signe de souffrance, de perte d’appétit ou de retard de croissance. On ne s’attend pas à avoir de nuisances dues à la répétition de ces gestes (4 fois par an et pendant 5 ans successifs) car ce sont des gestes réalisés en routine pour l’élevage commercial et le contrôle de la reproduction de cette espèce.

Devenir

A la fin de la première période de reproduction (en avril de la première année du projet) 6 mâles et 6 femelles par bassin (c’est-à-dire 48 animaux en total) seront mis à mort pour faire de prélèvements tissulaires. Les animaux restant (124-48=76) seront gardés en vie afin de suivre leur reproduction le temps du projet (5 ans). Cette décision a été prise par le responsable du projet en accord avec la SBEA.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous cherchons précisément à identifier les mécanismes physiologiques contrôlant la reproduction des poissons qui dépendent des conditions de pH de l’eau.

Réduction

Le nombre de poissons a été déterminé à partir de premières données (biochimiques) issues d’expérimentations précédentes (avec les poissons de la génération F0). Des calculs de puissance statistique reposant sur des analyses de variance (ANOVA pour mesures répétées et modèles mixtes linéaires) ont été réalisés en ce sens afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux permettant une analyse statistique rigoureuse avec un nombre minimal de réplicats (2 bassins par traitement), compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des réponses hormonales entre les individus. De plus, le bar étant une espèce grégaire (qui vit en banc), ce nombre correspond au maintien d’une densité minimale compatible avec le bien-être animal et le bon déroulement de l’expérience (i.e. n’induisant pas de perturbations physiologiques pouvant fausser l’étude).

Raffinement

Les poissons seront mis à jeun 48h avant la procédure pour éviter la défécation et les vomissements. Les manipulations (biométries, prises de sang, biopsies ovariennes et massages abdominaux) sont regroupées afin de ne pas multiplier les anesthésies. Les poissons sont sédatés dans leur bac, puis pêchés délicatement à l’épuisette vers le bac d’anesthésiant. Le bac d’anesthésie contient un bullage qui permet d’apporter un maximum d’oxygène aux branchies et d’éviter toutes formes d’hypoxie. Les manipulations hors de l’eau dure moins de 5 minutes. Les poissons sont manipulés avec soin, ils sont posés sur un linge humide et épais pour protéger leurs écailles. Un linge humide est déposé sur les yeux pour les protéger et limiter le stress. Après les manipulations, les poissons sont placés dans un bac de réveil avec une légère sédation. Quand les mouvements respiratoires et l’équilibre sont revenus, ils sont transférés dans leur bassin d’élevage. Une attention particulière sera portée aux poissons les heures suivant les manipulations.

Choix des espèces

Les expériences proposées utiliseront le bar européen (Dicentrarchus labrax) comme modèle animal. Il existe une grande quantité d’informations disponibles concernant la zootechnie, la biochimie, le comportement et l’endocrinologie du bar ce qui permet d’envisager une étude approfondie des effets de l’acidification sur la physiologie de cette espèce. Les données obtenues par ce projet seront comparées à celles obtenues précédemment chez les bars géniteurs (F0) du lot utilisé dans ce projet (comparaison intergénérationnelle). Des stades adultes seront utilisés pendant la saison de reproduction, afin de répondre à l’objectif principal du projet : l’étude de la maturation sexuelle en fonction des traitements, qui implique nécessairement l’utilisation de poissons adultes matures des 2 sexes.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime enrichi en graisses pendant cinq semaines, reçoivent des injections quotidiennes pendant onze jours, un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries isolées de patients atteints de la maladie de Crohn, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélèvement du tube digestif. Le porteur indique attendre une perte de poids et une inflammation intestinale légère à modérée, suivies au moyen d'une grille de souffrance notée sur quinze points. Il juge le recours à la souris "nécessaire" pour étudier l'infection dans un "organisme entier", à partir de résultats obtenus jusque-là in vitro.

Objectifs

La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin qui touche plus de 2,5 millions de personnes en Europe. Cette maladie digestive, pour laquelle aucun traitement curatif n’existe à ce jour, altère considérablement la qualité de vie des malades. Des facteurs génétiques, environnementaux et bactériens sont impliqués dans le développement de cette maladie. Notamment, des bactéries particulières sont anormalement retrouvées dans le tube digestif des patients. Les mécanismes menant à l’implantation des bactéries dans l’intestin des patients sont encore méconnus. Cependant, il semblerait que d’autres facteurs soient impliqués dans le développement de cette maladie tels que des facteurs épigénétiques. Aux vues de dérégulations épigénétiques observées chez les patients, nous avons émis l’hypothèse que certains acteurs épigénétiques (HDAC), dérégulées par un régime alimentaire enrichi en graisses, joueraient un rôle dans cette susceptibilité accrue des patients à être colonisés par les bactéries. Ainsi, ce projet a pour but de valider des résultats obtenus dans des modèles de cellules en culture dans un modèle in vivo de souris. Dans ce projet, des souris seront nourries avec un régime enrichi en graisses et infectées avec des bactéries provenant de patients afin de déterminer si ce type de régime dérégule les HDAC et de valider le rôle des HDAC lors de l’infection intestinale par les bactéries. Cette étude permettra également de tester des molécules potentiellement d’intérêt thérapeutique pour traiter les patients atteints de maladie de Crohn.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de confirmer les résultats obtenus in vitro dans des modèles de cellules en culture où il a été observé que les HDAC régulaient l’entrée des bactéries dans les cellules de l’hôte. Il est attendu que les résultats confirment le rôle majeur joué par ces HDAC au cours de l’infection et qu’ils permettent de déterminer si un facteur environnemental tel qu’un régime alimentaire enrichi en graisses peut déréguler ces HDAC. Ce protocole expérimental permettrait également de démontrer un potentiel bénéfice des molécules testées. À plus long terme, l’analyse des différents échantillons recueillis au cours du protocole permettrait de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’infection dans un contexte de régime alimentaire enrichi en graisses ce qui pourrait mener à la découverte des nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour les patients.

Procédures

Les animaux suivront un régime alimentaire enrichi en graisses tout au long du protocole soit 5 semaines. Ils seront également traités par injection intra-péritonéale avec les molécules à tester tous les jours durant 11 jours. Les souris recevront un antibiotique à faible dose via l’eau de boisson durant 2 jours et l ’infection des animaux avec les bactéries isolées de patients se fera par voie orale, via un unique gavage intragastrique (durée contention + gavage estimée < 1 min). Un prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital sera également réalisé, une seule fois, sur animaux anesthésiés (durée contention + prélèvement estimée < 2 min).

Impact sur les animaux

À partir des travaux antérieurs menés sur souris infectées par ces bactéries les effets indésirables attendus sont une perte de poids légère dans les jours suivant l’infection (environ 5%) et le développement d’une inflammation intestinale légère à modérée. Les symptômes liés à l’inflammation intestinale sont relativement légers mais une surveillance quotidienne (y compris dimanches et jours fériés) des animaux par un personnel formé sera réalisée dans le but de détecter tout comportement douloureux. La souffrance des animaux sera évaluée à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation digestive et le comportement (score sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Devenir

À l’issue de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés par inhalation à l’isoflurane puis euthanasiés par dislocation cervicale car différentes sections du tube digestif seront prélevées et les bactéries associées aux muqueuses seront dénombrées. De cette manière, les bactéries adhérentes aux muqueuses seront quantifiées précisément et spécifiquement.

Remplacement

Les modèles de cellules en culture in vitro ne permettent de travailler que sur une ou deux lignées cellulaires à la fois. À l’inverse, un modèle de souris in vivo va permettre d’étudier l’interaction entre les bactéries et l’intestin dans un organisme entier, complexe composé du microbiote intestinal et du système immunitaire de l’hôte. Le recours à un modèle murin est donc nécessaire pour notre projet pour étudier l’impact d’un régime alimentaire enrichi en graisses associé à différentes molécules sur la colonisation intestinale par les bactéries et sur l’inflammation intestinale afin de pouvoir conclure pleinement sur le bénéfice des molécules testées pour une potentielle utilisation chez les patients atteints de maladie de Crohn.

Réduction

Le nombre de 7 animaux par lot a été déterminé lors de précédentes études d’infection avec les bactéries. Ce nombre d’animaux devrait permettre d’obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement significatifs. Les expériences ont été conçues de manière à ne pas démultiplier les lots témoins. Le nombre d’animaux pour ce projet a été réduit au minimum (140 animaux) sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de bactéries présentes dans les fèces des souris reflètent le nombre de bactéries associées à la paroi intestinale. Ainsi, la quantification des bactéries au cours du temps dans les fèces des animaux réduit le nombre d’animaux à euthanasier à différents temps post-infection pour comptabiliser les bactéries présentes dans l’intestin. Aussi, un maximum de prélèvement sera réalisé sur les animaux lors de l’euthanasie ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d’éviter le surpeuplement qui est une source de stress, les souris de chaque lot seront séparées dans des cages de 530 cm² (3-4 animaux/cage), soit > 80 cm² pour des souris de 25-30 g. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les conditions d’hébergement seront : température 20-24°C, hygrométrie 50 ± 10%, cycle 12h/12h, éclairage 350/450 lux. Un enrichissement leur sera proposé sous la forme de maison et tube en polycarbonate teinté rouge afin de diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité à l‘animal. Les injections par voie intra-péritonéale, l’infection par voie orale ainsi que le prélèvement de sang seront réalisés par des personnels témoignant de la qualification nécessaire. Lors du prélèvement sanguin via le sinus rétro-orbital, les souris seront anesthésiées afin de réduire stress et douleur potentiellement générés par cet ace. Les animaux peuvent développer une inflammation intestinale légère à modérée lors de ce projet. Les animaux seront donc surveillés quotidiennement (y compris dimanches et jours fériés) par un personnel formé pour évaluer leur souffrance à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation intestinale ou le comportement (sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle d’étude choisi est la souris. Il s’agit d’un des modèles le plus utilisé et les expériences antérieures pour étudier l’infection intestinale par les AIEC ont été réalisées sur des modèles murins également. Cela permettra ainsi de comparer les résultats obtenus avec de précédentes études. L’étude sera réalisée sur des animaux de 8 à 10 semaines, âge auquel les études antérieures de colonisation par les AIEC sur modèle murin ont été réalisées.