Recherche fondamentale

646 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une contention forcée de deux heures, une chirurgie d'implantation d'une fibre optique dans le cerveau, des enregistrements électrophysiologiques de trois heures et, pour les femelles, des frottis vaginaux répétés, afin d'observer l'activité de circuits neuronaux après un stress aigu. Les retombées annoncées pour les troubles psychiatriques humains restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que ce type d'étude ne peut être mené que sur un animal vivant et conclut qu'il n'est pas envisageable de recourir à des méthodes de substitution à l'"animal entier".

Objectifs

Ce projet a comme but principal de mettre en évidence, après un stress, des changements de l’activité des neurones dans un réseau de structures cérébrales qui participe au fonctionnement de la perception corporelle, émotionnelle et motivationnelle. En particulier, nous étudierons les altérations, induites par un stress, de l’activité des neurones dans le cortex insulaire (ou insula), une structure cérébrale impliquée dans la perception des changements corporels et une de ses cibles, le noyau accumbens, qui joue un rôle important dans l’intégration des informations émotionnelles et motivationnelles. Il est connu que l’insula et le noyau accumbens sont dérégulés dans de nombreuses maladies psychiatriques liées au stress comme l’anxiété et la dépression. Le stress est un facteur de risque important pour le développement de troubles psychiatriques. Afin de développer de nouveaux traitements pour ces troubles liés au stress, il est nécessaire de comprendre les adaptations des neurones induites par un stress. De plus, les hommes et les femmes ont tendance à réagir différemment au stress, à la fois psychologiquement et biologiquement, et des différences entre les sexes sont observées dans de nombreux troubles psychiatriques. C’est pourquoi l’étude chez des rats mâles et femelles est nécessaire à ce projet. Dans ce projet, nous étudierons l’impact d’un stress aigu sur les structures cérébrales d’intérêt immédiatement et un jour après un stress par contention. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’exposition à un stress et pourra avoir un impact sur la prise en charge des maladies psychiatriques chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont premièrement une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’exposition à un stress aigu. En effet, le stress étant un facteur important dans le développement de maladies psychiatriques, il est important de comprendre ces mécanismes de dérégulation suite à un stress afin de pouvoir agir sur le développement de ces pathologies. Ce projet nous permettra de mettre en avant des différences inter-sexe, avec un aspect temporel et potentiellement un retour à la normal de l’activité plastique de cette voie 24h après le stress.

Procédures

323 animaux, seront soumis au stress par contention, 1 fois pendant 2 heures. Toutes les femelles (323 animaux) seront soumises à un frottis vaginal avant le début des enregistrements électrophysiologiques (1 seul frottis, 304 femelles) ou après chaque enregistrements en photométrie par fibre optique (3 frottis vaginaux, 19 femelles) (2 secondes par acte). Tous les rats de l’approche éléctrophysiologique (608 animaux) seront enregistrés électrophysiologiquement (3h). Tous les rats de l’approche de photométrie par fibre optique (38 animaux) subiront une chirurgie pour l’injection d’un vecteur viral non pathogène et l’implantation à demeure d’une fibre optique (2h), puis 5 sessions d’apprentissage d’auto-administration d’eau sucrée et enfin 3 sessions de test d’auto-administration d’eau sucrée en enregistrement en photométrie par fibre optique. (1 heure pour chaque session d’auto-administration).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - stress par contention : peut entrainer une augmentation du rythme respiratoire, attendue dans les premières minutes du test. - frottis vaginal chez les femelles en conditions vigiles : gêne occasionnée. - Casque en ciment dentaire maintenant la fibre optique : gêne occasionnée. - isolement des animaux afin que les animaux ne détériorent pas le système de fixation de la fibre optique. - légère restriction de l’accès à l’eau sera effectuée pour les animaux qui seront enregistré en photométrie chez qui les biberons d’eau seront retirés 3h avant leurs sessions d’auto-administration d’eau sucrée et replacés par la suite.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue des enregistrements seront mis à mort afin de procéder à des analyses moléculaires, histologiques et/ou d’expression de protéines.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'un processus psychobiologique, peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, Nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans les émotions et les troubles associés à l’exposition à un stress. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques qui permettent de calculer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous estimons un ajout de 2 animaux par lot dus à la complexité du geste chirurgical et aux possibles mauvais placements des électrodes d’enregistrement et/ou de stimulation. Ainsi 19 animaux par lots, seront nécessaires à notre étude. 34 lots seront nécessaires pour le projet, soit 646 animaux maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi de points limites et des critères d’intervention et d’arrêt ; l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu (tunnels, stick en papier) et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux auront une période d’habituation à l’animalerie de 5 jours minimum avant toutes manipulations, ils seront d’abord hébergés à deux par cage puis ils seront hébergés individuellement pour éviter l’amplification du stress (304 rats, pendant 24h) et la détérioration du système de fibre optique (38 rats, pendant 5 semaines maximum). Les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux auront une période d’habituation aux cages d’auto-administration lors des sessions d’auto-administration d’eau sucrée pendant 5 jours avant les tests enregistrés en photométrie par fibre optique.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de la motivation dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus. Dans cette étude, nous utiliserons des rats adultes de 8 semaines ce qui est en conformité avec la majorité des expériences de comportement animal et la littérature, et ce qui limite les risques de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris juvéniles et adultes reçoivent par gavage une souche hyper-virulente de streptocoque du groupe B puis un marqueur fluorescent, avant une prise de sang et la mise à mort, pour étudier le franchissement de la barrière intestinale par la bactérie. Le porteur indique que les souris peuvent développer une méningite dès douze heures après le gavage, et évoque un risque de fausse route ou de perforation de l'œsophage lors du gavage. Il affirme que la complexité de la barrière intestinale n'est "pas modélisable in vitro" et que seule l'expérience sur l'animal permet cette étude.

Objectifs

Le Streptocoque du groupe B (SGB) est une bactérie appartenant à la flore vaginale et digestive, présente chez 15 à 30% des individus. Cette bactérie est inoffensive pour l’adulte en bonne santé, mais elle est la première cause d’infection bactérienne néonatale dans les pays industrialisés. La première étape dans l’infection par SGB est le franchissement des muqueuses et notamment de la muqueuse digestive pour atteindre la circulation sanguine. Les infections néonatales à SGB sont rares (300 cas par an en France), mais sont associées à un taux de mortalité important et à des séquelles significatives, notamment sur le plan neurologique. Les souches de SGB retrouvées dans 70% des méningites appartiennent à un clone hyper-virulent CC17. Ce projet vise à étudier les mécanismes de virulence de SGB, et notamment de comprendre comment cette bactérie peut franchir la barrière intestinale. La complexité de la barrière intestinale n’est pas modélisable in vitro à l’heure actuelle. De même les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions hôte/pathogène à différents stades de développement (nouveau-né/jeune, adulte). Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra d’étudier les mécanismes permettant à SGB de franchir la barrière intestinale. La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale par le SGB. Nous effectuerons une étude préliminaire (avec 120 souris) afin de déterminer si le sexe de la souris influe sur la réponse à l’infection bactérienne et nous testerons 2 doses différentes de bactéries ainsi que 2 souches de souris (Balb/c et C57Bl/6). Ensuite, des souris balb/c ou C57BL/6 (en fonction des résultats de l’expérience préliminaire) jeunes (3-4 semaines) ou adultes (8 semaines) seront infectées par voie orale avec une souche de SGB appartenant au clone CC17. Le franchissement de la barrière intestinale par la bactérie sera étudié par dénombrement des bactéries dans différents tissus (intestin, ganglion, sang, rate) et l’étude de l’intégrité de la barrière (perméabilité, inflammation) sera réalisée sur différents segments gastrointestinaux. Le nombre de souris utilisées sera de 120. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes responsables du franchissement de la barrière intestinale par le SGB et utilisera au total 240 souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des mécanismes responsables du franchissement de la barrière intestinale par le SGB. C’est une 1ère étude et selon les résultats attendus, nous pourrons adapter nos prochaines expériences (âge, durée d’infection par ex).

Procédures

Les animaux seront gavées 2 fois. Une 1ère fois pour le gavage de la bactérie (ou du PBS ; 100 µl) et une 2nde fois avec le marqueur fluorescent (120 µl de solution) pour la mesure de la perméabilité intestinale in vivo. Chaque gavage durera quelques secondes. Nous réaliserons un prélèvement sanguin (max 500 µl) sous anesthésie à l’isoflurane et juste avant la mise à mort et ce geste durera max 30 secondes.

Impact sur les animaux

Ces expériences seront très courtes, 24h maximum. Dans la littérature, il est décrit la possibilité de développer une méningite 12h après l’infection par gavage chez des souris Balb/c tandis que les souris C57Bl/6 sont moins sensibles à cette souche bactérienne. Nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire pour comparer les effets sur ces 2 souches en utilisant 2 doses. Nous espérons que nos souris ne développeront pas de méningite trop rapidement. Néanmoins, une attention particulière sera portée sur nos animaux tout au long de l’expérimentation. Les gavages (bactéries ou marqueur fluorescent) seront réalisés par une personne expérimentée en vue de réduire et/ou identifier un risque de fausse route ou de perforation de l’œsophage.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter différents organes pour des études ex vivo : étude de perméabilité, analyses des protéines et ARN, immunohistochimie, études bactériennes, …

Remplacement

Les modèles in vitro ne peuvent restituer ni la complexité des barrières physiologiques, ni l’intégralité du processus infectieux allant de la colonisation digestive jusqu’à la méningite, ni les interactions bactéries-hôte mises en jeu lors de l’infection. Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra de déterminer l’impact de l’infection bactérienne sur la perméabilité intestinale et le Système Nerveux Entérique. La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale.

Réduction

Compte-tenu de la littérature existante, le nombre d’animaux est réduit au minimum (5/groupe pour les tests préliminaires et 10/groupe/temps et par âge pour l’étude finale).

Raffinement

Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Un enrichissement sera apporté par l’ajout de frisottis. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l’étude (24h max). Des points limites (décrits en annexes) seront mis en place pour évaluer le mal-être des animaux (douleur, stress, souffrance). En cas d'éventuels signes de souffrance les animaux seront euthanasiés par une personne compétente ou une analgésie sera envisagée si l’on considère que cela sera nécessaire et suffisant. Si la douleur peut être traitée localement, nous administrerons un analgésique local (50 µl, toutes les 6h en s.c sur le site de la blessure ou du point douloureux), sinon, nous traiterons avec un anti-inflammatoire non stéroïdien (50 µl en s.c. d’une solution à 2 mg/ml une fois/jour pendant 48 à 72h maximum).

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale. Nous utiliserons des souris juvéniles de 3-4 semaines et des souris adultes de 8 semaines. Pour ce projet, nous avons besoin de comparer les effets entre des souris jeunes et adultes.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, qui produisent des IgA humaines dans le sang, subissent un prélèvement d'oreille pour le génotypage, des prises de sang, des gavages et des injections, et certaines une infection des muqueuses par Salmonella, qui peut provoquer diarrhées et amaigrissement. Les expériences visent à reproduire chez la souris une maladie rénale humaine, la néphropathie à IgA, et à mesurer le rôle du facteur de croissance APRIL dans sa sévérité, mais le résumé ne donne que la durée de chaque geste, sans leur nombre ni leur fréquence. Sur le remplacement, le porteur s'en tient à une phrase : "aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle".

Objectifs

Le but du projet est le développement d'un modèle de maladie rénale : la néphropathie à immunoglobuline A, chez la souris. Cette maladie rénale humaine est responsable d'une évolution vers l'insuffisance rénale terminale (dialyse ou transplantation rénale) chez 30% des patients qui en sont atteints, alors que la fréquence de la maladie est autour de 0,5% de la population. Il s'agit d'une maladie à plusieurs facteurs, génétique en partie, et faisant également intervenir le système immunitaire des muqueuses (intestin, bronches) via la production d’un type d’anticorps, nommées IgA, au niveau de ces muqueuses. Une des anomalies au cours de cette maladie est le fait que ces anticorps soient déversés anormalement dans le sang. Parmi les facteurs impliqués dans cette anomalie, le rôle d’un facteur de croissance de globules blancs produisant cet anticorps semble être très important. En effet, les patients atteints de cette maladie présentent des concentrations de ce facteur de croissance plus élevées que les volontaires sains et d’autre part une particularité génétique portant sur la production de ce facteur est plus souvent présente chez les patients. Nous disposons d'un modèle de souris produisant des IgA humain dans le sang mais aucune production de cet anticorps dans les muqueuses. Ces souris présentent des dépôts d'IgA humain dans leurs reins avec un début d'inflammation. Il s'agit au cours de ce projet, d’étudier les souris mutantes afin d'évaluer l'impact du facteur de croissance sur l’apparition d’une maladie plus sévère.

Bénéfices attendus

Si le rôle d'APRIL sur la sévérité de la néphropathie à IgA se confirme dans ce modèle, cette cytokine ainsi que ses récepteurs deviendront une cible thérapeutique évidente dans cette maladie. Des molécules visant cette voie sont déjà disponibles (ex: belimumab) pour le traitement d'autres pathologies inflammatoires (lupus). Elle permettra de mieux comprendre le rôle de l'immunité muqueuse au cours de la maladie.

Procédures

Prélèvement d'oreille pour génotypage : 30sec par animal Prélèvement sanguin: 1 mn par animal Gavage par tubage gastrique: 2mn par animal Injection: 30sec par animal

Impact sur les animaux

Possibles douleurs liées aux prélèvements sanguins et prélèvements d'oreille, classe légère, pratique courante en laboratoire Possible douleur et inconfort lié au gavage Possible troubles digestifs dont diarrhées et amaigrissements dans la procédure de challenge muqueux par Salmonella, points limites définis

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements de sang et d'organes afin d'analyser les données et obtenir les résultats.

Remplacement

Il s'agit d'un modèle physiopathologique, nécessitant un environnement in vivo, aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle

Réduction

Le nombre d'individus utilisés par génotype est le minimum d’individus indispensable pour effectuer la procédure d’expérimentation et obtenir des résultats pertinents interprétables. Le nombre d'animaux par génotype est le nombre minimal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Afin de minimiser le nombre d’individus nécessaires, un test statistique a permis à partir d’une hypothèse réaliste de prévoir le nombre de souris le plus pertinent.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée qui possède tous les éléments du raffinement. Toutes les mesures de réduction de l’inconfort animal sont prévues, à savoir la mise en place d’une anesthésie générale avant tout geste invasif, une analgésie lors des interventions potentiellement douloureuses et la mise en œuvre de points limite adaptés, conduisant à la mise à mort en cas de souffrance. Des observations quotidiennes seront mises en place tout au long du projet, et adaptées pour chaque individu.

Choix des espèces

L'expérimentation sur animaux de petite taille apporte des éléments de connaissance physiopathologique impossible à atteindre en expérimentation in vitro seule ou en clinique humaine car: - elle permet d'être à l'initiation de la maladie ce qui n'est pas possible chez l'homme (maladie peu symptomatique, souvent diagnostiquée après de longues années d'évolution). La mécanistique pathogénique ne peut donc être appréhendée qu'en expérimentation animale dans le cas de cette maladie. - le développement d'un modèle animal permettra d'identifier des cibles thérapeutiques, de tester des interventions thérapeutiques chez l'animal en vue de dégager des traitements candidats transférables en clinique humaine. - Les souris utilisées dans ce projet auront 3 mois: cet âge choisi est optimal pour l’étude de la réponse de l'anticorps (IgA) car il correspond à la phase de développement du répertoire immunologique muqueux.

4 896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales et des injections abdominales quotidiennes, une partie étant irradiée avant une injection de moelle osseuse, pour tester deux molécules censées stimuler la migration des cellules dendritiques et l'immunité anti-tumorale. Le porteur indique que les tumeurs restent de taille modérée et que l'irradiation peut provoquer diarrhée et perte de poids. Sur la réduction, il écrit qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée" pour justifier ce nombre de près de 4 900 souris, tout en affirmant que le modèle murin reste "indispensable".

Objectifs

Les cellules dendritiques véhiculent des informations provenant de tissus périphériques, qui sont souvent exposés à des menaces microbiennes, ou au développement de tumeurs, vers les ganglions lymphatiques dans lesquels les lymphocytes T nichent. Au stade immature, les cellules dendritiques échantillonnent les tissus, arborant une migration lente associé à l'internalisation de leur environnement. Lorsqu'elles rencontrent un signal de danger, elles maturent, ce qui induit la baisse de l’activité d’échantillonnage et induit la migration rapide vers les ganglions lymphatiques pour l'activation des lymphocytes T. Ce processus migratoire est strictement nécessaire pour la mise en place de réponses immunitaires adaptatives, notamment contre les tumeurs. Nous avons identifié une protéine qui est activée lors de la maturation des cellules dendritiques et qui augmente la migration des cellules dendritiques in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (immunothérapie par anti-PD1). Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, mais aussi d’une version modifiée de ce composant, A5, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seuls ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si les deux molécules A1 et A5 peuvent être utilisées pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminant dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans une première procédure visant à évaluer l’effet d’un traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée aux animaux anesthésié (1 fois au cours de l’expérience – durée de l’anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé et de son dérivé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, la première procédure servira à déterminer la dose de A1 e A5 montrant le meilleur effet. Les procédures suivantes seront alors réalisées avec ces doses optimales. De même seuls les modèles ayant donné des résultats prometteurs seront utilisés dans la suite du projet Aucune approche statistique n’a été réalisée

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score permettra de d’évaluer de manière objective l’état des animaux. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de part la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1 et A5). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.

Onze lapins vont être utilisés, dont huit réutilisés d'une étape à l'autre avant d'être tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois prises de sang et une chirurgie pouvant atteindre une heure et demie donnant accès au foie, décrite par le porteur comme une "chirurgie lourde pour le lapin", ainsi qu'un abord musculaire, pour tester un pansement hémostatique en poudre. Le porteur indique une douleur per et post-opératoire prise en charge par analgésie, et prévoit des prélèvements du foie à deux, treize et vingt-six semaines. Il affirme que le pansement doit être testé dans un environnement d'organes et de fluides corporels que le modèle in vitro ne peut reproduire.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Mais il doit présenter certaines caractéristiques : maintenir la plaie en milieu humide et chaud, être modifié selon les stades de cicatrisation, être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, ne pas être toxique et être hypoallergénique, protéger des chocs, être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanée et très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables sont utilisés comme traitement.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de poudre) sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie et sur un tissu non lésé (muscle) mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.

Procédures

-Prise de sang sur animal vigiles : 3 fois , le prélèvement est effectué après application d'un anesthésique local et dure moins d'une minute. -Chirurgie: une seule intervention comprenant un abord du foie dont la durée ne devrait pas excéder 1h30 (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès au foie, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture des plans musculaire et cutané), puis un abord musculaire sur le flanc dont la durée ne devrait pas excéder 30 minutes (incision, dissection, implantation du produit, suture).

Impact sur les animaux

L’accès au foie est une chirurgie lourde pour le lapin. Afin de limiter l’impact et de ne pas risquer un incident de chirurgie, nous avons opté pour un abord sous costal (incision sous les côtes) à la laparotomie médiane (ouverture de l’abdomen). Le risque hemorrhagique suite à la lésion hépatique reste extrèmement limité par la taille de la lésion réalisée et les moyens d'hémostase à dispositon. La douleur attendue en per et post opératoire est prise en charge par une analgésie adaptée. La chirurgie est réalisée stérilement ce qui limite le risque de complications infectieuses. Les plaies sont protégées.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort, soit parce qu’ils auront atteint un point limite soit parce qu’ils auront atteint le temps du prélèvement final : J+2 semaines EU 1/2, J+13 semaines et J+26 semaines EU 2/2. L'étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée et nécessite le prélèvement du foie.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption sur un tissu lésé et un autre non lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique sous forme de poudre permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire et cutanés en cours de chirurgie et d’observer son intégration sur le tissu à différents temps post-opératoire. Il nous est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

Nous utiliserons 11 lapins au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes, il y a 2 animaux supplémentaires prévus afin de compléter l’un des groupes si nécessaires. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé la voie d’abord sur des animaux décédés. Dans un principe de réduction, nous ferons simultanément un test de résorption sur tissus sain et un test d'hémostase/resorption sur le foie. Il s’agit d’une preuve de concept, le nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation. Après une semaine et demie d’acclimatation, une puce d'identification électronique permettant de mesurer sa température corporelle sera implanté sous la peau, puis l’animal sera habitué au passage du lecteur et au pyjama pour faciliter le suivi post-opératoire. Le vétérinaire, sur place, intervient quotidiennement dans le suivi post-opératoire et prend en charge tout symptôme clinique: complication de plaie, hypo activité etc... Il prend également la décision de recourir à une mise à mort si l'état de l'animal le nécessite ou à son exclusion si le traitement nécessaire à sa prise en charge n'est pas compatible avec la poursuite du projet.

Choix des espèces

Le lapin est un animal de taille intermédiaire, dont le foie a une taille suffisante pour supporter les scarifications prévues et l’implantation de la poudre hémostatique (le produit) en quantité thérapeutique pour obtenir l'effet pharmacologique souhaité (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés à 2.5-3 kg pour atteindre 3.5-4 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter des électrodes, puis des enregistrements de vingt minutes par jour pendant un mois dans un champ ouvert, pour étudier une atrophie du cervelet due à une mutation d'un canal calcique. Le porteur indique que les souris porteuses de la mutation peuvent développer une ataxie et une mort des cellules de Purkinje, et que la chirurgie peut provoquer une douleur modérée pendant la récupération. Il affirme que le modèle murin est "incontournable" et que les réseaux de neurones ne peuvent être obtenus en culture ni par modélisation.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation génétique conduisant à une réduction de la taille du cervelet (une atrophie) dès l'enfance (elle a été nommée atrophie céréelleuse infantile, ChCA). Cette maladie est due à un dysfonctionnement dans une protéine de transport du calcium qui se trouve à la surface de certaines cellules, notamment les cellules de Purkinje du cervelet. La mutation conduit à un plus grand influx de calcium dans les cellules de Purkinje dès l'enfance, ce qui pourrait induire la mort des cellules et donc une atrophie du cervelet. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation pourra être induite sélectivement dans les cellules de Purkinje et ainsi étudier les conséquences de cette mutation dans le cervelet. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.

Bénéfices attendus

Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle de la protéine mutée dans le développement du cervelet et le fonctionnement des cellules de Purkinje. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.

Procédures

Pour ce projet, 90 animaux subiront une chirurgie d'une durée de une heure pour l'implantation crânienne d'électrodes pour des enregistrements cellulaires. Sur ces animaux, les enregistrements (branchement d'un cable souple sur les électrodes implantées) dureront 20 minutes par jour pendant 1 mois pendant qu'ils se déplacent dans un champ ouvert.

Impact sur les animaux

Pour les animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des modifications précoces du fonctionnement des cellules de Purkinje du cervelet, puis à leur mort, ce qui peut conduire à une ataxie cérébelleuse et une réduction de la taille du cervelet (atrophie). Les chirurgies sous anesthésie destinées à implanter les électrodes peuvent induire une douleur modérée pendant la récupération.

Devenir

L'ensemble des animaux contribuant à la procédure seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des expériences sur tranches aigues ou des analyses immunohistologiques.

Remplacement

Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse pathophysiologique de la ChCA (ataxie cérébelleuse infantile). Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences ne pouvant être réalisées via une modélisation sur ordianteur ou des lignées de cellules humaines. Ainsi, les conséquences fonctionnelles de la mutation seront d'abord modélisées sur lignées cellulaires humaines et des approches in silico. Cependant, ces stratégies permettront de faire des prédictions sur l'impact de la mutation à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau. En effet, les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. De même, les conséquences motrices des dysfonctionnements du cervelet nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 90) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques de façon fiable et reproductible. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille d'observation pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésiques, une adaptation des conditions de vie et lorsqu'une douleur ou un inconfort non reversibles apparaissent, l'euthanasie.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par une recombinase est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.