Recherche fondamentale

390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 78 réutilisées ensuite et les autres tuées pour prélever la queue et la rate. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections sous les coussinets des pattes puis dans la queue, avant l'application d'une crème sur la zone dépigmentée, pour tester un inhibiteur contre le vitiligo. Le porteur reconnaît que l'injection dans le tarse peut entraîner une perte partielle de mobilité ou une infection de la plaie. Il indique qu'aucun système de co-culture in vitro ne reconstitue l'ensemble des réponses de la dépigmentation, ce qui rend selon lui le modèle souris "essentiel".

Objectifs

Le vitiligo est une pathologie de la peau qui provoque l’apparition de taches blanches de taille plus ou moins importantes et peut toucher l’ensemble du corps, y compris le visage. Ces macules blanches sont la résultante d’une altération des mélanocytes de l’épiderme qui sont les cellules responsables de la pigmentation cutanée. Environ 1% de la population mondiale souffre de cette pathologie qui affecte significativement la qualité de vie des patients. A ce jour, aucun traitement efficace et spécifique n’est disponible du fait de la complexité de cette pathologie et dont la compréhension et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques restent un enjeu majeur. L’origine de cette pathologie reste à ce jour mal définie mais l’implication de plusieurs facteurs (génétiques, environnementaux ou encore une altération du système immunitaire chez les patients) sont identifiés. Afin d’expliquer la perte des mélanocytes au cours du vitiligo, il a été récemment montré chez les patients atteints de vitiligo un défaut dans le système d’adhésion des mélanocytes au niveau de la peau, entrainant leur perte et ainsi la dépigmentation. Nos travaux ont montré qu’une protéine, la métalloprotéase MMP9, était impliquée dans ce défaut d’adhésion. De plus, la MMP9 a un rôle dans l’activation du système immunitaire, notre système de défense. Nous pensons donc un inhibiteur de MMP-9, seul ou en association avec des traitements en cours d’essais cliniques chez l’homme, représente une stratégie prometteuse pour bloquer la réponse inflammatoire et stabiliser le mélanocyte à la membrane basale de l’épiderme.

Bénéfices attendus

La validation de la métalloprotéinase matricielle MMP-9 comme une cible thérapeutique d’intérêt majeur dans le vitiligo et autres dépigmentations post-inflammatoires et le développement d’un inhibiteur de la MMP9 pour application topique. De plus, une association d’un inhibiteur de MMP-9 avec un inhibiteur de Janus Kinase (JAK) semble également une stratégie prometteuse pour bloquer la réponse inflammatoire et stabiliser le mélanocyte à la membrane basale de l’épiderme. Le projet pourrait permettre d’utiliser un inhibiteur de MMP-9 en application topique dans le vitiligo, une maladie dont les besoins thérapeutiques sont majeurs.

Procédures

Les souris auront à subir deux injections en sous cutanée sous les coussinets des pattes postérieures à une semaine d'intervalle et ensuite deux injections en sous cutanée au niveau de la queue à une semaine d'intervalle également. Le traitement des souris consistera à une application par massage de la crème au niveau de la queue (zone de dépigmentation).

Impact sur les animaux

Nous avons déjà validé le modèle de souris vitiligo par immunisation sans observer de signe indésirable. Bien que non observés, des erythémes au niveau du sites d'injection de la queue peuvent être observés. L’application en topique des inhibiteurs ne devrait pas engendrer d’effets nocifs sur les souris. Cependant,l’injection dans le tarse peut engendrer une perte partielle de mobilité de l’animal ou l’infection de la plaie

Devenir

A l'issue des procédures les souris seront mis à mort et nous prélèveront les queues et les rates pour analyses.

Remplacement

Au préalable nous avons évalué l’impact d’un inhibiteur de MMP-9 associé ou non au Ruxolitinib en application topique in vitro dans notre modèle 3D de dépigmentation induite en condition inflammatoire. Il n’existe malheureusement aucun système de co culture in vitro reconstituant l’ensemble des réponses cellulaires impliquées dans la dépigmentation de la peau. Le modèle de souris est donc une étape essentielle pour évaluer l’intérêt thérapeutique d’un inhibiteur de MMP-9 associé ou non à un inhibiteur de JAK tel que le Ruxolitinib.

Réduction

L’étude in vitro au préalable permet de choisir les doses optimales des inhibiteurs à tester sur l’animal et donc de réduire la quantité totale de souris. Nous allons dans un premier temps valider la dépigmentation des souris puis nous identifierons dans la seconde procédure la dose adéquate de JNJ0966 pour réduire cette dépigmentation. Dans un troisième temps l’association avec le Ruxolitinib sera étudier puis nous évaluerons l’intérêt d’une thérapie prévisionnelle. Ces 4 procédures sont importantes pour réduire au mieux le nombre minimal d’animaux afin d’obtenir des analyses comparatives et statistiques suffisantes à la démonstration de l’effet des traitements inhibiteurs utilisés.

Raffinement

Le développement d’un érythème au niveau de la zone d’injection et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement au cours de la procédure. Les animaux seront hébergés à raison de 5 souris/cage dans un environnement propice à leur bien-être (litière en copeaux de peuplier, tunnels en polycarbonate). Si un impact environnemental est observé (bagarre des mâles entre eux, signes de stéréotypie, prostration, isolement d’un animal...), l’animal sera soigné et mis en isolement. La durée de l’isolement dépendra du comportement de l’animal, en cas de plaie le vétérinaire suivra la guérison et jugera de l’état de l’animal. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie : l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgénique B6.Cg-Tg(KRT14-Kitl*)4XTG2Bjl/J de 4 semaines. Ces souris ont un phénotype noir car elles présentent des mélanocytes au niveau de l’épiderme sur tout le tégument (l’expression du ligand de Kit au niveau du promoteur épidermique kératine-14 permet la rétention des mélanocytes au niveau épidermique) ce qui permet de mieux observer la dépigmentation. De plus, par la persistance des mélanocytes, ces souris ont la capacité à repigmenter. Nous utilisons des souris jeunes de 4 semaines pour s'assurer que le système immunitaire n'est pas altéré du fait du vieillissement de la souris.

266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet enchaîne laparotomie de femelles gestantes, électroporation d'embryons in utero et injections intracérébrales de vecteurs viraux, l'objet étant de mettre au point une méthode d'imagerie du cerveau par bioluminescence. Le porteur précise que tous les animaux recevant une substance neuroexcitatrice développeront une crise d'épilepsie et que les nouveau-nés rejetés par leur mère seront tués. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative non-animale" à l'étude des activités neuronales et que le travail doit se faire sur "l'animal entier".

Objectifs

Les fonctions cérébrales reposent sur l’activité de populations largement interconnectées de neurones très divers, dont la complexité nécessite l’étude in vivo qui préserve l’interconnexion entre neurones et entre structures cérébrales. Ces études in vivo requièrent le plus souvent de ménager un accès à travers le crâne pour insérer des électrodes ou effectuer des mesures optiques dans l’encéphale. Le but de ce projet est d’utiliser la bioluminescence pour développer une imagerie trans-crânienne à invasivité minimale des activités neuronales chez la souris in vivo. En effet, la bioluminescence permet d’obtenir, à l’échelle de populations de neurones ciblés, des informations sur les activités moléculaires et cellulaires grâce à l’utilisation de biosenseurs codés génétiquement. Elle repose sur l’utilisation d’une luciférase (protéine à activité enzymatique) exprimée par transfert de gène, et d’un substrat (luciférine) injecté par voie intrapéritonéale ou intraveineuse, dont la dégradation par la luciférase produit des photons. La bioluminescence présente un fort contraste et fournit des données très quantitatives ; elle est non-toxique et permet des enregistrements de longue durée (heures/jours). Il existe maintenant des biosenseurs dont la luminescence rouge traverse le crâne. Par comparaison avec d’autres biosenseurs luminescents, les biosenseurs choisis pour ce projet fonctionnent à des doses largement subtoxiques de luciférine, et n’émettent quasiment pas de lumière en l’absence d’activité neuronale.

Bénéfices attendus

A terme, ce type d’imagerie permettrait un suivi non-invasif de l’activité cérébrale sur des mois dans des modèles murins de pathologies neurologiques ou psychiatriques humaines. Il serait ainsi possible d’analyser l’évolution pathophysiologique des activités cérébrales et l’implication des différents types de neurones dans cette évolution, afin de mieux comprendre et soigner ces pathologies chez l’humain.

Procédures

1) Laparotomie des femelles gestantes sous analgésie et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 2) Electroporation in utero (sous analgésie et anesthésie générale gazeuse) de biosenseurs luminescents non pathogènes dans les cellules pyramidales du cortex cérébral d’embryons de souris, afin de comparer leurs performances pour l’enregistrement optique des activités cérébrales. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 3) Injections intracérébrales par stéréotaxie de vecteur viraux luminescents sous analgésie et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 4) Injections intracérébrales par stéréotaxie de substance neuroexcitatrice (4-aminopyridine) sous anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 40 min maximum. 5) Enregistrement in vivo par bioluminescence des activités cérébrales sur animal vigile et sur animal anesthésié. Durée d’enregistrement 30 min. 6) perfusion intracardiaque afin de réaliser des études histologiques et de quantifier l'expression des biosenseurs.

Impact sur les animaux

Les procédures de chirurgie peuvent être à l’origine d’une perte de poids transitoire (inférieur à 20% de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seules ces chirurgies permettent de cibler spécifiquement des régions corticales. Tous les animaux recevant une injection de substance neuroexcitatrice développeront une crise unique d’épilepsie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de vérifier par immunomarquage l’expression des biosenseurs.

Remplacement

Le cerveau est un organe très complexe qui comprend des milliards de neurones de centaines de types différents, dont chacun établit des milliers de connexions avec d’autres neurones, et qui sont rassemblés en structures largement connectées entre elles et/ou avec d’autres organes. En raison de cette complexité, il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative non-animale à l’étude des activités neuronales qui sous-tendent les fonctions cérébrales. C’est pourquoi ce projet, qui propose de développer une méthode d’imagerie trans-crânienne des activités de populations neuronales, avec une invasivité minimale, doit être réalisé in vivo sur l’animal entier.

Réduction

Les expériences de bioluminescence et de transfert de gène réalisées précédemment dans l’unité nous ont permis d'optimiser le nombre d’animaux nécessaire. Nous utiliserons 266 animaux pour ce projet. Ce nombre est très largement inférieur au nombre d’animaux qui serait nécessaire en cas d’utilisation de lignées transgéniques. L’électroporation in utero sera réalisée sur femelle gestante de la lignée C57BL/6, qui porte peu d’embryons (en moyenne 7), assure un meilleur accès pour l’électroporation de chaque embryon, et donc une proportion de nouveau-nés électroporés élevée (en moyenne 3 animaux électroporés par portée) et un rendement d’électroporation par individu assez homogène. Ceci réduit le nombre de nouveau-nés non-électroporés et la variabilité des résultats, et donc le nombre total d’animaux utilisé. Les animaux non-électroporés seront utilisés pour la procédure avec transfert viral. Compte tenu de la variabilité observée dans les rendements d’électroporation in utero et de transfert viral, nous avons estimé à 10 le nombre d’animaux nécessaires pour la plupart des conditions testées afin de révéler des différences significatives. Le nombre d’animaux a été porté à 20 pour deux des conditions testées afin de permettre une analyse plus détaillée des différences quantitatives et qualitatives attendues. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés à l’analyse des petits échantillons. Les expériences d’imagerie permettant une acquisition des résultats en temps réel, le nombre d’animaux sera réduit au maximum grâce à une analyse quotidienne des données. Enfin, les expériences prévues étant échelonnées sur les 8 premières semaines de la vie post-natale, les résultats obtenus à un âge donné permettront d’optimiser les expériences conduites à un autre âge et de limiter le nombre d’âges testés, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés 5 à 7 jours dans une zone d’hébergement A2 avant la procédure. Ils sont hébergés par fratrie ou en groupe de 2 à 4, en portoir ventilé dans un environnement à température (20-24°C) et hygrométrie de 55% contrôlées, avec cycle diurne/nocturne de 12h, et eau et nourriture fournies ad libitum. Les animaux sont dans un environnement enrichi par la présence de matériau végétal pour édifier un nid. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Ils sont visités chaque jour et manipulés par l’expérimentateur pour réduire le stress le jour de la procédure. Les animaux ne sont séparés que le temps de la procédure et de la récupération post-opératoire. Pendant la chirurgie, l’animal est sous anesthésie générale induite par l’isoflurane et placé sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’animal reçoit une injection d’un analgésique et d’un anesthésique local pour prévenir la douleur pendant et après la chirurgie. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Après chirurgie, l’animal reçoit en SC une injection de solution saline afin de prévenir la déshydratation. Les animaux sont placés dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant à 37°C jusqu’à leur réveil. Lorsque l’animal a récupéré, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le Structure locale de bien-être animal et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, une surveillance accrue permettra de détecter tous signes de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les nouveau-nés seront observés en continu durant l'heure qui suit le retour à la mère pour vérifier la prise en charge maternelle. En cas de rejet, le nouveau-né sera euthanasié. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une surdose d’anesthésique.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système nerveux central avec celui des humains, de l’existence de lignées génétiquement modifiées permettant de cibler l’expression des biosenseurs dans des populations neuronales spécifiques, et de l’existence de nombreux modèles de pathologies neurologiques ou psychiatriques humaines auxquels la méthode d’imagerie non-invasive des activités cérébrales que nous développons pourra être appliquée. Les animaux seront utilisés pour des enregistrements optiques réalisés en semaines postnatales 1 à 8 afin de tester l’effet de l’épaississement de l’os crânien avec l’âge sur l’imagerie de l’activité cérébrale par bioluminescence trans-crânienne. En effet, la croissance du crâne de la souris ralentit fortement après la 7e semaine. Les électroporations s'effectueront sur des embryons au stade embryonnaire E13.5 afin de générer des animaux exprimant les biosenseurs luminescents de la naissance à la semaine 3. Les injections stéréotaxiques de virus recombinant seront réalisées durant les semaines 3 à 7 postnatales afin de générer des animaux exprimant les biosenseurs luminescents durant les semaines 4 à 8 postnatales.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'ataxie de Friedreich, elles reçoivent une anesthésie par injection puis une électromyographie mesurant l'activité du nerf sciatique, l'objet étant d'améliorer la détection d'une onde difficile à enregistrer. Le porteur indique que ces souris développent des déficits moteurs dès cinq semaines et une mortalité par crises d'épilepsie vers vingt semaines, et prévoit de les tuer à quinze semaines. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet ces mesures et qu'il est "indispensable" de les réaliser sur l'animal.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative progressive incurable à ce jour. Cette maladie se manifeste par des troubles de l’équilibre et de la coordination des mouvements volontaires (ataxie) liés à une dégénérescence des neurones sensitifs. L’ataxie de Friedreich rare touche environ 1 personne sur 50 000, soit environ 1 300 patients en France. Apparaissant généralement vers l’âge de 9–14 ans, son évolution et ses symptômes varient d’un patient à l’autre. Toutefois, une incapacité à marcher survient généralement 10 à 20 ans après les premiers symptômes. L’électromyographie (EMG) permet d’analyser l’activité électrique des nerfs et des muscles chez l'Homme. En complément de l’examen clinique, il aide au diagnostic de différentes pathologies nerveuses et musculaires. L'EMG est utilisée chez la Souris pour étudier les maladies neuromusculaires. Après stimulation électrique du nerf sciatique, la réponse électrique au niveau du muscle du pied est enregistrée. Deux ondes sont présentes dans cette réponse électrique, une onde motrice (onde M), correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres motrices du nerf sciatique, et une onde sensitive (onde H) correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres sensorielles du nerf sciatique. Cette onde H est difficile à détecter à l’heure actuelle. L'objectif de ce projet est d'améliorer la détection de cette onde grâce à un électromyographe plus performant et des modifications du protocole d’enregistrement. Pour valider cette nouvelle méthode d’enregistrement, nous souhaitons mesurer l'onde H chez des souris génétiquement modifiées qui présentent une diminution de l’amplitude de l’onde H à partir de l’âge de 5 semaines et qui sont utilisées pour la recherche de nouvelles thérapies contre l'ataxie de Friedreich.

Bénéfices attendus

L'optimisation de la mesure de l'onde H permettra d'améliorer la détection de la dégénérescence des neurones sensitifs et ainsi de mieux caractériser l'effet de potentiels traitements sur cette dégénérescence présente dans l'ataxie de Friedreich. En améliorant la qualité des études précliniques, nous augmenterons les possibilités de trouver une thérapie efficace chez l'Homme pour traiter l'ataxie de Friedreich.

Procédures

Les animaux seront soumis aus interventions suivantes: - Injection intra-péritonéale du mélange kétamine - xylazine (durée = 5 secondes). - Electromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes). - Injection sous-cutanée d'antisedan (durée = 5 secondes).

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement modifiées permettant d'étudier l'ataxie de Friedreich, présentent une mortalité liée à l'apparition de crises épileptiques à partir de l'âge de 20 semaines, âge qui ne sera pas atteint au cours de notre protocole, les animaux étant euthanasiés à l'âge de 15 semaines. Par ailleurs, des déficits de coordination motrice apparaissent à l' âge de 5 semaines. Ces déficits augmentent au cours du temps et à l'âge de 15 semaines, ces animaux présentent des troubles de la démarche marqués mais non délétères. De la nourriture en gelée sera placée sur le sol de la cage durant toute l'étude. Ce modèle a été décrit de manière précise par une équipe de recherche sur notre site, notamment dans son décours et sa sévérité. Lors de l'EMG, si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Si un animal présente des difficultés respiratoires, l'expérience sera également stoppée.

Devenir

Les souris utilisées commencent à mourir à l'âge de 20 semaines. Tous les animaux seront mis à mort à l'âge de 15 semaines.

Remplacement

L'électromyographie est couramment utilisée chez l'homme pour étudier les neuropathies. Ces neuropathies sont généralement associées à des troubles moteurs visibles. Les modèles murins de ces neuropathies présentent également des troubles moteurs. Pour étudier l'efficacité thérapeutique d'une molécule d'intérêt, ces troubles moteurs sont évalués au cours du temps et les mesures électromyographiques viennent compléter les phénotypes observés. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique sur la coordination motrice. Il est donc indispensable de pouvoir réaliser des mesures électromyographiques sur l'animal.

Réduction

Pour cette étude, nous avons prévu d'utiliser 12 animaux par groupe expérimental. Ce nombre de 12 animaux par groupe a été établi par étude de puissance sur les mesures électromyographiques réalisées précédemment dans notre laboratoire. Il constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. La latence et l'amplitude de l'onde H seront les paramètres analysés et nous comparerons les résultats obtenus chez les souris génétiquement modifiées avec ceux obtenus chez les souris non génétiquement modifiées. Nous utiliserons 24 souris au total pour cette étude.

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole et à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement d'un modèle d'intérêt pour étudier l'ataxie de Friedreich. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les souris utilisées pour modéliser l'ataxie de Friedreich montrent une diminution progressive de l'amplitude de l'onde H à partir de l'âge de 5 semaines. Un premier EMG sera réalisé à l'âge de 5 semaines, avant que l'amplitude de l'onde H ne commence à diminuer. Un deuxième EMG sera réalisé à l'âge de 15 semaines, lorsque l'amplitude de l'onde H est fortement diminuée chez ces souris. Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole , à l'âge de 15 semaines, avant l'apparition des crises d'épilepsie.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent l'implantation chirurgicale d'un micro-endoscope au-dessus du nerf optique sous anesthésie, une partie recevant en plus du tamoxifène ou une injection d'AAV dans la rétine, avant des séances d'imagerie répétées jusqu'à dix fois dans l'année, certaines sur animal éveillé. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une inflammation et une douleur transitoire et que l'injection dans l'œil peut le léser. Il affirme que l'étude du couplage neurovasculaire exige de travailler sur "l'animal entier et normal" et que de nombreuses données in vitro se sont "révélées fausses".

Objectifs

Le but du projet de notre équipe est d’analyser les bases cellulaires de l'hyperémie fonctionnelle dans le nerf optique, c'est à dire le lien entre l’activation nerveuse et l’augmentation réflexe du flux sanguin, lien qui est à la source de l’imagerie fonctionnelle cérébrale de type fIRM chez l’homme. Plus précisément, nous souhaitons caractériser les différents types cellulaires participant à la régulation de ce phénomène. Pour cela, nous irons étudier dans le nerf optique de souris anesthésiées, sédatées ou éveillées, les liens entre les réponses cellulaires et vasculaires, suite à des stimulations visuelles.

Bénéfices attendus

Dans la plupart des neuropathies optiques l’atteinte fonctionnelle cellulaire précède la mort cellulaire. La réponse de l’électrorétinogramme est un bon marqueur non-invasif du signal de sortie généré par les cellules ganglionnaires et son altération reflète un dysfonctionnement de ces cellules. Notre projet permettra de caractériser le signal de sortie de cellules (en direction du cerveau) au niveau de la partie intracrânienne et myélinisée du nerf optique in situ. Nous étudierons la propagation électrique du signal nerveux, le couplage neurovasculaire et la réponse métabolique du nerf au cours d’une stimulation visuelle physiologique. Cette approche, jamais tentée précédemment, sera établie dans un premier temps chez l’animal normal, aboutissant à l’établissement d’un nouvel outil préclinique. Dans un deuxième temps, cet outil permettra de comparer le fonctionnement du nerf optique intracrânien normal et pathologique, et surtout, de tester diverses approches de neuroprotection.

Procédures

Une partie des animaux (120 animaux) recevra une dose de tamoxifène injectée par voie intra péritonéale sur 3 jours (1 injection/jour). Tous les animaux subiront une seule procédure chirurgicale d’une heure sous anesthésie profonde et en conditions stériles. La chirurgie d'environ 1h consistera en l’implantation d’un micro endoscope au-dessus du nerf optique. Pour cela les animaux recevront des doses d’analgésiques avant et après la chirurgie. Une partie des animaux (80 animaux) recevra une unique injection d’AAV dans la rétine d’un seul œil, sous anesthésie gazeuse. L’injection ne dure que 10 minutes. Les animaux sont observés en microscopie biphotonique éveillés, sédatés ou anesthésiés. Les animaux observés éveillés effectuent au préalable une habituation progressive de plusieurs jours au poste d’enregistrement. Les cessions d’enregistrements durent au maximum 2 heures. Les animaux reçoivent juste avant l’enregistrement une injection de colorants par voie intra veineuse rétro-orbitale, sous anesthésie générale. Durant les cessions, les animaux peuvent être soumis à des stimulations visuelles de 1 à 30 secondes : grille contrastée sur un écran placé devant l’œil de l’animal. Les animaux seront observés jusqu’à 10 fois selon les observations, durant l’année qui suit la procédure chirurgicale. Après les cessions d'imagerie, une partie de animaux (60 souris) est mise à mort lors d'une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde pour pouvoir prélever leurs cerveaux. A la fin du projet tous les animaux sont mis à mort.

Impact sur les animaux

- L'injection de tamoxifène intrapéritonéale pourra induire une perte de poids transitoire. - L'acte chirurgical pourra provoquer une inflammation locale ainsi qu'une douleur transitoire. - L'injection d'AAV dans le vitré de l'oeil peut entrainer une lésion de l'oeil si le geste n'est pas effectué correctement. - L'imagerie peut provoquer un stress durant le temps de l'expérience particulièrement chez l'animal éveillé. – Lors d'une perfusion intra-cardiaque, un animal peut souffrir si l'anesthésie n'est pas suffisante.

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés à la fin du projet, selon différentes méthodes en fonction des besoins expérimentaux, pour vérifier l'exactitude des données obtenue en imagerie.

Remplacement

Jusqu’à présent, le nerf optique a été étudié in vitro. Toutes études métaboliques et celles s’attaquant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal entier et normal. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées fausses ou non utilisables en recherche clinique.

Réduction

Nous utiliserons 360 animaux dans notre projet. Les procédures mises en place pour ce projet participent à réduire le nombre d'animaux en expérimentation, en utilisant une technique comme l'injection d'AAV qui nous permet de marquer d'autres types cellulaires de manière peu invasive et sans utiliser plus d'animaux, et en travaillant sur des animaux chroniques qui sont réutilisés pour plusieurs expériences d'imagerie (jusqu'à 10 expériences / animal). Par ailleurs, nous nous engageons à réduire l'utilisation d'animaux autant que possible en développant les analyses statistiques et les modèles mathématiques.

Raffinement

Durant notre projet, nous prêterons attention à raffiner la méthodologie utilisée : - en améliorant les conditions expérimentales par l'administration d'anesthésiques (kétamine/médétomidine, dexmédétomidine et lidocaïne) et analgésiques (buprénorphine) chaque fois que nécessaire (chirurgie, soins postopératoires, injection dans l'oeil et imagerie sous anesthésie/sédation) - en introduisant des points limites à chaque acte expérimental qui permettent d'éviter toute souffrance à l'animal et sa mise à mort lorsque celle-ci ne peut être prise en charge - en garantissant des conditions d'hébergement appropriées aux animaux (ajouts d'enrichissements dans les cages et contrôle stricte des paramètres environnementaux) - en effectuant une surveillance quotidienne du bien-être des animaux, par un personnel formé et une surveillance régulière par un membre de la SBEA.

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative possible à l'utilisation d'animaux vivants dans l’étude du couplage neurovasculaire. La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Les souris seront utilisées entre P45 et 2 ans. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.

524 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'autisme, elles apprennent une tâche comportementale de 200 essais par jour sous contention partielle de la tête, avec un accès à l'eau restreint à un hydrogel pour les motiver et une perte de poids plafonnée à 10 pour cent. Le porteur décrit ces contraintes comme brèves et réversibles et n'attend pas d'effet indésirable majeur. Il affirme qu'un modèle animal est "absolument nécessaire" pour reproduire la complexité des circuits neuronaux et écarte les approches sur cellules ou sur la mouche.

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements stéréotypés répétitifs et les réactions sensorielles atypiques. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 54 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence du trouble du spectre de l'autisme (TSA), les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les anomalies du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la base neurobiologique des TSA est cruciale pour la gestion des symptômes des TSA et pour le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l'identification de biomarqueurs diagnostiques. L'objectif global de ce projet est de développer de nouveaux biomarqueurs physiologiques et comportementaux chez les modèles génétiques murins de TSA. Ces mesures seront ensuite utilisées pour le développement et l'élucidation de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette étude, nous avons choisi de nous concentrer sur une région du cerveau qui est très bien conservée entre la souris et l'homme. Pour mener à bien nos études, nous proposons de développer et d'exploiter une nouvelle tâche comportementale qui nous permettra d’identifier, à la fois les altérations comportementales ainsi que les modifications physiologiques liées à une altération du fonctionnement du cerveau des souris portant certaines modifications génétiques lié à l’autisme. Ces mesures nous permettront, par la suite, mesures physiologiques afin de mettre en évidence les mécanismes cellulaires et physiologiques associés aux altérations comportementales et cognitives liées à l’autisme. Enfin, nous testerons la capacité de cette tâche à mesurer les conséquences d'une intervention pharmacologique. Pour cette dernière, nous utiliserons une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 54. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur la vie quotidienne des personnes concernées, comme la capacité à s'intégrer dans une salle de classe, à tolérer certains vêtements, à manger certains aliments. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sous-tendent les difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'élucidation des mécanismes moléculaires, cellulaires et des circuits qui sous-tendent les perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyperréactivité sensorielle, ou de biomarqueurs permettant d'évaluer le succès de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception sensorielle tactile. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive , basé sur les récompenses, où ils subiront une session de 200 essais par jour. En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau. Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête. Cette habituation commencera par une exploration libre de la chambre d'enregistrement, puis se poursuivra par une très brève immobilisation initiale. L'habituation se poursuivra très progressivement pendant une semaine, permettant à l'animal d'apprendre que cette immobilisation sera brève et réversible. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Pendant cette période, chaque animal restera dans le dispositif pendant 30 minutes, une fois par jour.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effet indésirable majeur. Pour réaliser les expériences, les animaux doivent être motivés à consommer de l'eau. Pour cette raison, leur accès à l'eau pendant la journée sera limitée et uniquement sous forme d’hydrogel. Des études antérieures suggèrent que la souris est capable d'adapter son comportement et sa physiologie lorsqu'elle se trouve dans des régions arides. Nos études préliminaires n'ont montré aucune conséquence négative de cette restriction. D'autre part, les animaux seront habitués à une contention partielle (immobilisation de la tête). Cette habituation se poursuit très progressivement, permettant à l'animal de s'adapter à cette contrainte et d'apprendre que cette manipulation sera brève et réversible. Cet apprentissage très progressif est nécessaire afin de réduire au maximum le stress lié à une contention partielle et le rythme d'entraînement est adapté pour chaque animal.

Devenir

À la fin des expériences comportementales, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adapté à notre projet, parce que cet organisme manque la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Une première étude pilote a été réalisée pour établir les protocoles comportementaux ainsi que les protocoles techniques nécessaires au suivi des réponses neuronales. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales et physiologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Tous les animaux seront d'abord soumis à la tâche de détection tactile, puis seront entraînés à la tâche de discrimination tactile. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Ces mesures nous permettront de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Dans cette étude, nous tiendrons compte de toutes les connaissances disponibles concernant le bien-être des animaux et nous surveillerons systématiquement les animaux pour détecter tout signe de douleur, de souffrance ou de détresse. Les expériences seront conçues et menées de la manière la plus humaine possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits neurophysiologiques chez les modèles de souris de l’autisme. Aucune souffrance inhérente n'est prévue pour les souches utilisées lors de ces expériences. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude, car les expériences comportementales exigent que les animaux se sentent à l’aise et ne sont pas soumis à une douleur ou une détresse inutile ce qui peut être préjudiciable à l'interprétation de notre expérience. Afin de minimiser la douleur, la souffrance, l'angoisse ou les dommages durables pour les animaux, toutes les procédures seront effectuées avec une technique soigneuse et un équipement adapté, par un personnel autorisé, compétent et formé de manière appropriée. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : des tunnels de cages domestiques seront utilisés pour transférer les animaux et une fois que les animaux seront habitués à l'expérimentateur, ils seront manipulés en utilisant la technique qui prend en compte le bien- être de l’animal. Tous les animaux seront pesés quotidiennement et la ration d’eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10%. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de s'assurer que tous les comportements normaux des animaux se poursuivent. Les animaux sont hébergés en cage collective. Les animaux seront progressivement habitués à la contention partielle afin de réduire à minimum le stress.

Choix des espèces

Ce modèle (la souris transgénique) a été sélectionné pour rester cohérent avec les études antérieures utilisant les modèles genetiques de troubles neurodéveloppementaux. Les rongeurs ont un système neuronal très développé, présentent des comportements compliqués et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant une variété de réponses comportementales. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». 8 semaines au début de la procédure expérimentale. Justification: Conformément aux études précédentes, les animaux auront 8 à 10 semaines au début de la période de apprentissage.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries dix-sept semaines avec un régime obésogène, elles reçoivent un gavage quotidien pendant cinq semaines, des prélèvements de sang et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour évaluer des métabolites du lycopène de la tomate contre l'obésité. Le porteur mentionne un stress lié à l'isolement pendant les tests et une douleur possible aux incisions de la queue et au perçage des oreilles. Il renvoie les retombées à un programme plus large visant "in fine" à améliorer les désordres métaboliques, et retient la souris comme modèle "reconnu" du métabolisme.

Objectifs

La consommation de lycopène, un caorténoïde de couleur rouge et présent en grande quantité dans la tomate, est classiquement associée à des effets bénéfiques sur la santé cardiométabolique. Cependant, les métabolites actifs du lycopène étaient inconnus jusqu’alors. Nous avons pour la première fois identifié plusieurs métabolites du lycopène qui montrent des effets positifs in vitro. Notre objectif est maintenant de montrer que les effets de ces dérivés du lycopène permettent de limiter le développement de la masse grasse et de l’insulino-résistance dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre l'impact métabolique du lycopène en identifiant ses métabolites actifs. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les désordres métaboliques associés à l'obésité par le biais d'approches nutritionnelles utilisant des métabolites actifs de molécules naturelles.

Procédures

Les animaux seront nourris durant 17 semaines avec une régime obésogène. De la 12ème à la 17ème semaine, un gavage sera réalisé quotidiennement, afin de controler parfaitement la dose de molécules administrée. Un prélèvement de sang sera réalisé en semaine 12, une mesure de prise alimentaire sera réalisée en semaine 12 et 16. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en semaine 15 et 16.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors de l'ITT, de l'OGTT (durée estimée à 3 heures au maximum pour chaque procédure). Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors de la distribution des métabolites du lycopène ou des doses de glucose (OGTT) et d'insuline (ITT).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet quei seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques des métabolites du lycopène.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en métabolites du lycopène sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique (lidocaïne/prilocaïne 5%) sera appliquée localement lors du perçage des oreilles pour identification et avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Et une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'applicatiob des points limites et la mise en application de critères d'arret.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un diabète de type 2, puis à des injections intrapéritonéales répétées de glucose et d'insuline et à des prélèvements de sang à la queue. Le porteur décrit une douleur légère possible liée au modèle et annonce une mise à mort finale pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" pour démontrer in vivo l'implication d'une protéine avant d'en faire une cible thérapeutique.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique que consiste à un excès de masse grasse et à une modification du tissu adipeux. Elle est due à différents facteurs, tel que l’alimentation, la prédisposition génétique et aussi à facteurs environnementaux. Une des consequences métaboliques majeures de l’obesité est le développement du diabète de type 2. Afin de pouvoir traiter le diabète, une meilleure compréhension du dialogue entre les cellules est nécessaire. L’implication du système immunitaire dans la physiopathologie du diabète de type 2 n’est pas connue, ainsi, nous souhaitons ici comprendre l’interaction du système immunitaire avec le pancréas dans l’installation et le maintien de la pathologie. Nous avons mis en évidence la présence de la cytokine IL34 chez l’homme et la souris au niveau des îlots pancréatiques. Son expression se trouve augmentée dans des pancréas issus de patients atteints de diabète de type 2. Suite à ces observations, nous avons créé une lignée de souris déficientes en IL34 au niveau du pancréas. Le modèle a été mis en place par croisement entre une lignée IL34LoxP et PdxCre. Ainsi, nous cherchons à comprendre l’impact de l’inhibition de la cytokine au niveau du pancréas dans des conditions physiologiques et pathologiques de diabète de type 2 en comparant les souris IL34 KO avec les souris IL34 contrôles issues du croisement.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier la cytokine d’intérêt comme un nouveau biomarqueur ou une nouvelle cible thérapeutique dans le diabète de type 2. Il aiderait également à mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans la pathologie au niveau du pancréas et plus particulièrement des îlots de Langerhans.

Procédures

Le test de tolerance au glucose et à l'insuline (GTT et ITT) nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris, 1ip de glucose et 1ip d’insuline 1 fois par mois, durée environ 3 seconds). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Pour chaque prélèvement, les animaux sont anesthésiés localement au niveau de la queue (lidocaïne, sous forme de pommade). Ces tests seront effectués au début du protocole, après 1, 2, 3 et 4 mois de regime.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une régime alimentaire riche en graisse et sucre afin d’induire le diabète de type 2 lié à l’obésité. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La réaction attendue dans le modèle de diabète peut être de douleur légère. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux seront aussi nécessaires. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Le prélèvement sanguin à niveau de la veine caudale, sous anesthésie locale, permet de récupérer des quantités minimes de sang pour l’évaluation répétée des paramètres circulants, sans traumatisme et sans douleur. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer cette protéine comme cible thérapeutique, nous devons démontrer son implication in vivo. En effet, seule la suppression de celle-ci dans un modèle in vivo nous assure de son implication dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.

Réduction

Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (120 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience (mise à mort de l’animal). Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques seront donnés. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

Les modèles de diabete de type 2 chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J et les souris KO pour IL34 au niveau du pancréas sont de fond génétique C57BL/6J. Des souris de 4 semaines environ seront utilisées. A cet âge les animaux peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.