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Urbanisation et réponse inflammatoire chez les oiseaux
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
480 poussins de mésange charbonnière vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis laissés au nid jusqu'à l'envol. Ils reçoivent une injection de LPS dans l'abdomen et deux prélèvements sanguins par ponction de la veine brachiale sur deux jours, pour comparer la réponse inflammatoire entre sites urbains et forestiers. Le porteur indique que la nichée n'est dérangée que quinze minutes au plus et que la dose de LPS reste sous le seuil d'une souffrance visible. Il précise avoir déjà appliqué ce protocole sur la même espèce sans compromettre l'envol.
Objectifs
Les villes sont le lieu d’implantation souvent spontanée d’un nombre croissant d’espèces animales et végétales. L’habitat urbain impose portant aux organismes des contraintes environnementales très contrastées par rapport à leur habitat naturel d’origine, dans lequel elles ont évolué. La quasi disparition des milieux naturels, les pollutions sonores et lumineuses sont parmi les marqueurs les plus évidents de l’environnement urbain qui exerce donc des pressions écologiques a priori singulières sur les populations naturelles. Ces pressions impactent un grand nombre de facettes du phénotype des individus et de nombreux travaux montrent que le comportement, la morphologie ou certaines fonctions physiologiques des organismes sont affectés, de même que leur reproduction qui apparait moins dynamique par comparaison avec ce qui est observé en milieu naturel. L’immunité est une fonction majeure pour maintenir l’intégrité des organismes. Son rôle est prioritaire dans les interactions hôtes-pathogènes, et une modification de son expression sous l’effet de l’anthropisation des écosystèmes (dont l’urbanisation est un extrême) peut impacter les espèces, et également influencer la circulation d’agent infectieux. Lors d’un travail précédent sur la Mésange charbonnière (un oiseau forestier devenu très commun en ville), nous avons montré que la réponse inflammatoire était négativement affectée par l’habitat urbain par rapport à l’habitat forestier. L’objectif de ce projet est de retravailler une comparaison de la réponse inflammatoire chez cette espèce, mais à partir de 4 paires de sites villes/forêt situés dans 4 zones géographiques et des contextes biogéographiques différents (Strasbourg, Dijon, Toulouse, Montpellier). Nous comparerons donc la réponse inflammatoire des poussins au nid de mésanges charbonnières, entre un site urbain et un site forestier de référence, pour chacune des 4 zones géographiques mentionnées plus haut.
Bénéfices attendus
Nous proposons de tester l’influence de l’habitat urbain sur une composante de l’immunité chez une espèce d’oiseaux d’origine forestière et bien implantée en ville. L’ambition est de voir si les premiers résultats obtenus sont généralisables. Si nous détectons une réponse immunitaire plus faible en milieu urbain, cela ne permettra pas d’inférer sur le processus impliqué (« simple » impact d’un environnement difficile, réponse plastique ou/et adaptive des organismes à une modification des bénéfices et des coûts associés à l’immunité relativement à d’autres fonctions biologiques et à un risque environnemental propre à la ville ?). Mais cela permettra d’appréhender la sensibilité des populations urbaines au risque infectieux qui peut rapidement changer, avec des conséquences possible sur le statut des populations urbaines et leur rôle potentiel de réservoir à pathogènes dans des zones par définition densément peuplées par les humains.
Procédures
Les oiseaux seront l’objet d’une injection intrapéritonéale de 0.01 mg de LPS (soit en moyenne 0.06g/Kg) dilués dans 50 µl de PBS et de deux prélèvements sanguins sur deux jours, par effraction de la veine brachiale à l’aide d’un aiguille stérile 27G.
Impact sur les animaux
Deux effets indésirables sont en principe envisageables. La première est le dérangement de la nichée. Avant l’âge de 15 jours, les poussins qui sont déjà emplumés ne risquent pas de quitter prématurément le nid avec une faible aptitude au vol et une très faible probabilité de survie à très court terme. Par contre, l’activité de nourrissage des parents est interrompue. Les opérations réalisées sont organisées de manière à minimiser cela à quelques minutes (15 au plus) ce qui est sans conséquence dans la mesure où les parents reprennent leurs activités dès que l’observateur s’éloigne un peu du nichoir. La deuxième est l’inconfort lié à l’injection de LPS, mais la dose injectée est minimisée de manière à déclencher une réponse inflammatoire sans générer de syndrome comportemental signalant une souffrance. De nombreux travaux réalisés (et notre propre expérience) montrent cela. De plus, à dose équivalente, les oiseaux apparaissent moins affectés par une injection de LPS que les mammifères. Enfin, les poussins ne sachant pas voler et n’étant pas très habiles dans leurs mouvements, leur manipulation ne nécessite pas de contention particulière ce qui évite ou en tout cas réduit fortement les nuisances potentiellement associées à la manipulation. Notons que nous avons déjà appliqué un tel protocole il y a plusieurs années sur la même espèce sans que cela ne compromette la fin du séjour au nid et l’envol des poussins traités.
Devenir
Après la procédure expérimentale, les poussins sont laissés libres au sein de leur nichée (qu’ils n’ont pas quitté) pour poursuivre leur séjour au nid jusqu’à l’envol.
Remplacement
L'objectif étant de tester un phénomène en population naturelle, sous action de ensemble de facteurs environnementaux, les modèles de laboratoire et les modèles in vitro n’offrent pas les conditions favorables à la poursuite de cet objectif.
Réduction
Pour chaque site, nos nichoirs hébergent près d’une centaine de nichées de Mésange charbonnière, ce qui au total conduit à 800 nichées potentiellement utilisables. Chaque nichée comptant en moyenne 6 à 7 poussins, cela donne un effectif total d’au moins 4800 poussins. Avec au total 480 poussins (240 contrôles et 240 traités LPS) inclus dans l’expérience, nous appliquons une démarche de réduction à partir des deux leviers suivants : Quatre poussins (2 LPS et 2 PBS) sélectionné au hasard sont inclus dans l’expérience. Deux poussins par traitement par nichée représentent le minimum pour apprécier la variabilité intra-nichée qui a du sens d’un point de vie biologique et statistique. Quinze nichées dont la phénologie sera décalée dans le temps afin de manipuler au plus 2 nichées par site/jour représentent l’effectif calculé pour en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour la fiabilité des résultats.
Raffinement
Plusieurs choix de protocole relèvent d’une démarche de raffinement en plus du fait bien sûr que les poussins resteront au sein de leur nichée durant l’expérience. Au-delà du processus aléatoire de sélection des nichées expérimentales, les nichées contenant des poussins visiblement affaiblis ou/et chétifs pour leur âge (chose parfois observée) ne seront pas retenues pour l’expérience. Seuls des poussins ne présentant pas de signes d’affaiblissement seront donc inclus. L’âge (13/14 jours) auquel les poussins seront manipulés est suffisamment avancé pour qu’ils soient bien développés (thermorégulation effective, corps totalement couvert de plumes, masse très proche de la masse adulte, croissance osseuse quasi achevée) et supportent donc aisément les traitements, mais pas trop pour que la contention soit sans effort ni dispositif particulier. Les injections (LPS/PBS) et premiers prélèvements sanguins auront lieu en fin de journée, entre 18h et 20h, et les seconds prélèvements sanguins auront lieu 14h plus tard, donc entre 6h00 et 8h00. Ainsi, l’exposition au traitement dont l’action est courte aura lieu essentiellement pendant la phase nocturne, période naturellement sans activité (nourrissage ou autre). Les poussins inclus dans l’expérience seront traités les premiers au sein de leur fratrie. Les quelques minutes nécessaires à la manipulation du reste de la fratrie (pour baguage et mesures morphométriques) permettront de vérifier leur comportement (tonicité, « activité » avant de refermer le nichoir et de laisser les activités de la famille reprendre leur cours. Pour minimiser la durée de dérangement par poussin (maximum 15 minutes), la moitié de la nichée est retirée du nichoir (qui est refermé ensuite) et emmenée dans un véhicule climatisé situé à quelques dizaines de mètres. Cela permet (i) aux adultes de poursuivre très vite leur activité de nourrissage auprès de l’autre moitié de la nichée restée dans le nichoir, et (ii) de manipuler les poussins dans de bonnes conditions protégées des aléas extérieurs. Une fois manipulée, la première moitié des poussins et replacée dans le nichoir alors que la seconde moitié est retirée pour être à son tour manipulée (baguage, mesures) dans les mêmes conditions puis remise en place. Ainsi, l’interruption des activités des adultes au nichoir est réduite à quelques minutes et chaque poussin ne se trouve pas dans des conditions perturbées au-delà de 15 minutes.
Choix des espèces
La Mésange charbonnière représente une espèce d’oiseau modèle assez classique pour les études en populations naturelles car c’est une espèce très commune qui accepte volontiers les nichoirs artificiels. Comme la plupart des espèces d’oiseaux elle n’affiche supporte très bien les interventions des observateurs sur les nichées, sans risque de désertion pour peu que certaines règles de base soient respectées (en particulier, pas de capture des adultes au nid lorsque les poussins ont moins de 7 jours). Enfin, cette espèce d’origine forestière a colonisé les villes où elle est très abondante également ce qui offre la possibilité d’une comparaison entre populations urbaines te populations forestières. Les individus utilisés seront des poussins de 13/14 jours. A ce stade, les poussins seront suffisamment âgés pour être bien développés (thermorégulation effective, corps totalement couvert de plumes, masse très proche de la masse adulte, croissance osseuse quasi achevée, …), mais pas trop pour que la contention soit sans effort ni dispositif particulier et pour qu’ils risquent de quitter prématurément le nid suite à l’intervention.
Etude de l’effet de biothérapies ciblant l’interleukine-4 (IL-4), l’IL-13, les IgE ou les mastocytes sur les défenses antiparasitaires
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 416
416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.
Objectifs
Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.
Bénéfices attendus
L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).
Impact sur les animaux
D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.
Remplacement
Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).
Evaluation de l’efficacité et des mécanismes d’action de nouveaux traitements des lymphomes T dans différents modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous la peau une greffe de fragment de tumeur prélevé chez un patient, puis des traitements par voie orale ou sous-cutanée, la tumeur pouvant provoquer de la souffrance. Le porteur teste de nouveaux traitements de lymphomes T avant un éventuel passage à l'humain et affirme que les lignées cellulaires ont un "intérêt très limité". Sa rubrique sur le raffinement se réduit à l'annonce de points limites et d'une grille de surveillance.
Objectifs
Notre projet a pour objectif d’évaluer de nouveaux traitements des lymphomes chez la souris, avant un éventuel passage à l’Homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de sélectionner les traitements les plus efficaces (seuls ou en association) et les mieux tolérés chez la souris, puis de mettre en place un essai clinique chez l’Homme afin d’évaluer la tolérance et l’efficacité de ces nouveaux traitements.
Procédures
1) Greffe d'un fragment d'une tumeur humaine primaire, qui sera placée sous la peau des souris après courte incision sous anesthésie générale. 2) Administration des traitements : les souris recevront différents traitements, seuls ou en combinaison, par voie orale ou sous-cutanée. Au total, il y aura 4 expériences pour la procédure 1 et 3 pour la procédure 2. Chaque expérience durera 3 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Le principal effet indésirable est lié au développement de la tumeur sous-cutanée, qui peut induire de la souffrance. Nous serons donc très attentifs au bien-être des animaux. Afin de ne pas causer de souffrance, la mise à mort sera pratiquée lorsque le volume de la tumeur atteindra un certain volume ou en cas de signes cliniques. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi clinique minimal 2 fois/semaine sera mis en place afin de surveiller l’apparition de signes de souffrance. Le cas échéant, l’animal sera mis à mort. De cette manière, la souffrance liée au développement de la maladie sera réduite au minimum.
Devenir
Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Les cellules tumorales des patients sont fragiles et ne peuvent être utilisées au laboratoire pour évaluer de nouveaux traitements. L’utilisation de lignées cellulaires de lymphomes a un intérêt très limité, car les cellules sont différentes des cellules tumorales des patients. Pour être au plus proche de la pathologie humaine, nous greffons directement un fragment de tumeur de patient sous la peau des souris. Ce modèle est difficile à mettre au point et très précieux. Il permet d’évaluer de nouveaux traitements chez les souris, avant leur évaluation chez l’Homme.
Réduction
Ce projet nécessitera 630 souris sur 5 ans. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum, après estimation des effectifs, afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement significatifs et cliniquement pertinents, à l’aide de simulations informatiques (invivostat).
Raffinement
Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux et avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale.
Choix des espèces
Les souris sont très utilisées dans la recherche en général, et spécifiquement dans la recherche contre le cancer. De nombreux modèles ont été développés, proches de la pathologie humaine, permettant d’évaluer de nouveaux traitements contre le cancer. Cela permet aussi de comprendre les mécanismes d’action de ces traitements, et de pouvoir les améliorer pour les rendre plus efficaces et mieux tolérés.
Etude des circuits neuronaux impliqués dans les comportements autistiques et épileptiques de souris déficientes en canaux sodiques Nav1.2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une mutation liée à l'autisme, elles subissent une chirurgie cérébrale d'environ une heure avec pose de fibres optiques, puis des tests comportementaux courts ou un enregistrement électrique de six heures. Le porteur stimule des zones du cerveau par la lumière pour tenter de corriger le comportement et qualifie cette approche in vivo d'"indispensable". Il déclare des effets indésirables limités à un "léger stress" lié à la chirurgie.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique représentent un ensemble de pathologies neurodéveloppementales touchant 1 enfant sur 160 dans le monde. Les symptômes sont répartis en 2 grandes catégories : apparition de déficits dans l'interaction et la communication sociale et des comportements moteurs inappropriés, répétitifs et stéréotypés. Ils apparaissent à partir de 3 ans et se prolongent chez l’adulte. Bien que de nombreuses causes tant génétiques qu’environnementales, aient été mises en évidence grâce aux études actuelles, le mécanisme commun expliquant le développement de la pathologie reste encore à utiliser. Pour cela, l’utilisation de modèle animaux reste donc cruciale. Notre équipe étudie notamment l’influence d’un gène identifié chez les patients comme faisant partie des plus fréquemment muté (SCN2A). Il code pour une protéine impliquée dans l’activité électrique des neurones. Ce projet se base sur l’étude d’un modèle de souris portant une mutation du gène SCN2A entrainant une diminution de l’excitabilité neuronale et dont les troubles comportementaux reproduisent ceux retrouvés chez les patients. Ce projet se déroulera sur 5 ans et propose d’identifier les régions cérébrales impliqués dans différents comportements autistiques chez ces souris (communication sociale et anxiété). Pour cela, nous utiliserons une protéine (activable par la lumière) pour stimuler différentes zones cérébrales d’intérêt à l'aide d'un laser pendant les tests. Cela aura pour but de compenser la présence de la mutation et le manque d'excitabilité des neurones, ce qui rétablira le comportement si les zones cérébrales étudiées sont impliquées.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes menant au développement de l'autisme et/ou de l'épilepsie chez le modèle animal est indispensable pour expliquer l'apparition des symptômes et leur développement au cours du temps chez l'Homme. La mise en évidence de zones cérébrales et de certaines connexions neuronales spécifiquement impliquées dans les différents troubles comportementaux observés permettent à la fois de comprendre le fonctionnement naturel des comportements étudiés (ex: communication dans un contexte social) et d'avoir des cibles précises sur lesquelles avoir une action thérapeutique précoce pour limiter ou empêcher l'apparition des symptômes.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'environ 1 heure (injection de l'outil permettant la production de la protéine activable par la lumière dans les zones cérébrales d'intérêt et pose de fibres optiques permettant de l'activer), puis à un test comportemental (de 3 ou 5 min) ou à un enregistrement de l'activité électrique des neurones = électrocorticogramme (6 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à ce projet sont peu nombreux. En effet, l'étape de chirurgie est la seule susceptible de causer un léger stress à l'animal. En outre, toutes les mesures seront prises pour éviter toute souffrance à l'animal lors de cette étape. Nos tests comportementaux sont peu stressants car ils sont basés sur des comportements naturels d'exploration, sont de courtes durées (3-5min) et se déroule avec une faible luminosité environnante contrôlée pour ne pas ajouter un stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux utilisés lors des procédures seront mis à mort pour prélever les cerveaux dans le but de vérifier le bon positionnement des injections de l'outil, des fibres optiques et des électrodes.
Remplacement
Nous avons établi notre projet de recherche en tenant compte de la règle des 3R. Ainsi, afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations sur animal vivant, quand cela sera possible, des études sur culture de neurones ou tranches de cerveau. Cependant, les études fonctionnelles basées sur la stimulation des neurones et leur impact sur la réponse comportementale ne peuvent être réalisées que sur animal vigile. Cette approche in vivo est donc indispensable pour modéliser et étudier au mieux le phénotype clinique associé aux Troubles du Spectre Autistique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été réduit au maximum tout en nous permettant d'obtenir des résultats interprétables. Nous comparerons pour chaque test 4 groupes d'animaux : souris sauvages et mutantes, avec ou sans stimulation lumineuse. Nous avons calculé nos besoins en animaux via une méthode statistique adaptée. Un maximum de 20 animaux seront donc utilisés par groupe pour les procédures. Les 2 sexes seront utilisés pour réduire la production nécessaire en termes de nombre d'animaux (mâles pour la communication sociale et femelles pour le test d'anxiété).
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Les procédures chirurgicales seront réalisées par des expérimentateurs habilités à pratiquer la chirurgie dans des conditons optimales pour le bien-être des animaux (prise en charge de la douleur, soins pré/post opératoire, suivi quotidien, etc.). Un autre exemple de mesure de raffinement sera l'administration d'un anti-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant la période post-opératoire. Un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis, par application d'une grille de critères. Exemples: Désinfection de plaies, administration d'antalgique, injection de solution saline glucosée pour l'hydratation, manipulation de l'animal, séparation de congénaire agressif ou euthanasie.
Choix des espèces
Nous utilisons une des rares lignées de souris génétiquement modifiées actuellement disponibles pour l'étude de notre mutation in vivo. Nous travaillerons sur des souris ayant une réduction de 50% de la production de notre protéine d'intérêt (espèce très largement utilisée pour les études comportementales) obtenues à partir de croisements de souris mutantes avec des souris sauvages. Les protocoles utilisés ont été choisis par rapport à la littérature basée sur la même espèce. Les animaux seront utilisés à 2 stades de développement : Jeunes et Adultes. Les Troubles du Spectre Autistiques apparaissant chez l'enfant autour de 3 ans et se maintenant à l'âge adulte, ces deux phases sont à étudier pour comprendre les circuits neuronaux impliqués dans l'apparition des comportements autistiques, leur développement ainsi que les possibles adaptations neuronales (changements physiologiques ou pathologiques) se mettant en place au cours du temps.
Evaluation des effets des champs électromagnétiques sur la thermorégulation selon les conditions d’expositions à différents âges chez des rats mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
432 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés à un champ électromagnétique de type 5G deux heures par jour pendant une à trois semaines, avec des mesures non invasives de température de la queue et de prise alimentaire, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Le porteur cherche des effets sur la thermorégulation à différents âges et déclare n'avoir observé aucun effet indésirable notable lors d'expositions antérieures. Les retombées annoncées, revoir la législation ou "rassurer la population", restent conditionnelles et lointaines.
Objectifs
Depuis novembre 2020, les opérateurs ont l’autorisation d’émettre des champs électromagnétiques (CEM) de type 5G. Pour cela, en France, 3 bandes réparties entre les 4 opérateurs en 2020 pourront être utilisées, dont deux le sont déjà pour la 4G : 700 MHz et 2,1 GHz, auxquelles viendra s’ajouter la bande de 3,5 GHz. Au 1er novembre 2020, 54 000 sites d’émission contenant parfois plusieurs antennes étaient installés en France, soit 30 000 de plus qu’il y a 5 ans. L’extension de l’exposition à ces rayonnements pose la question des effets sanitaires, notamment au regard de la jeune population, qui pourrait présenter une vulnérabilité plus grande aux CEM en raison de la taille, l’immaturité tant cérébrale, que métabolique, endocrinienne ou immunitaire des enfants. Cette vulnérabilité anatomique conduit à ce que les ondes pénètrent plus profondément dans l’organisme d’un enfant que dans celui d’un adulte, majorant ainsi l’exposition. Il est donc important de rechercher si les expositions pourraient produire des effets susceptibles de se répercuter (voire s’accentuer) à l’âge adulte. Dans ce contexte, nous voulons tester si une exposition de type 5G induit des modifications physiologiques. Pour cela, nous étudierons les fonctions physiologiques pour lesquelles nous avons observé des modifications lors d’exposition à 900 MHz : la température cutanée de la queue et la prise alimentaire. Ainsi, dans ces précédents travaux, après 5 semaines d’exposition aux CEM de 900 MHz, les animaux présentaient une vasoconstriction périphérique et une prise alimentaire augmentée qui sont des réponses typiques au froid. Afin d’étudier les effets d’une exposition de type 5G à une intensité de 1,5 V/m (intensité estimée sur les bases des données d’exposition 4G), nous analyserons ces 2 fonctions physiologiques lors d’une exposition à 3,5 GHz en les comparant avec les résultats issus d’un groupe non exposé (groupe contrôle) et d’un groupe exposé à 900 MHz (groupe contrôle positif) lors de différentes durées d’exposition (d’une à trois semaines), à différents âges (3, 8 et 13 semaines) chez des animaux mâles et femelles. Au maximum, 432 animaux seront étudiés, répartis dans 54 groupes constitués de 8 animaux chacun.
Bénéfices attendus
Une précédente étude menée au laboratoire PériTox avait été une des premières études françaises à montrer des effets des CEM de faible intensité sur la régulation thermique. Cette étude avait été citée dans les rapports « Radiofréquences et santé » (ANSES, 2013) et « Radio Frequency fields: Environmental Health Criteria Monograph » (OMS, 2015). Pour ce projet à court terme, nous souhaitons développer la même stratégie en communiquant les résultats à une très large échelle auprès de la communauté scientifique (congrès scientifiques nationaux et internationaux, publication dans des revues scientifiques généralistes) et d’agences mandatées par l’Etat pour réaliser des expertises sur les avancées récentes des travaux sur les effets des CEM. A long terme, si des effets sont observés, nous espérons qu’ils permettront de revoir la législation et d’abaisser les valeurs limites d’exposition de la population. Au contraire, si aucun effet n’est observé, les résultats pourront rassurer la population et notamment les différents collectifs et associations des personnes hypersensibles aux champs électromagnétiques.
Procédures
Les animaux seront exposés à un champ électromagnétique 2h par jour (2 sessions d'une heure) pendant 1, 2 ou 3 semaines selon les groupes d'animaux. Les différentes mesures effectuées seront réalisées en utilisant des techniques non invasives (comportement alimentaire en pesant l'alimentation et température cutanée en utilisant une caméra infrarouge). Il n'y aura donc aucune procédure chirurgicale. Un seul prélèvement sanguin sera réalisé à la fin de la procédure sous anesthésie générale avant la mise à mort. Il faut moins d'une minute pour prélever le sang nécessaire avant l'arrêt cardiaque. Une fois l'animal déclaré mort, différents organes d'intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
Dans le passé, nous avons exposé des rats à 900 MHz pendant 5 semaines afin d’étudier les effets sur différentes fonctions physiologiques. Durant l’exposition, aucun effet indésirable notable n’avait été observé (comportement, poids corporel, prise alimentaire).
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin intracardiaque qui induira la mort.
Remplacement
La fonction étudiée dans ce projet est la thermorégulation. Il existe des mannequins qui permettent d’étudier les échanges thermiques entre le corps et l’environnement mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les modifications de la régulation thermique. De plus, cette fonction est en étroite relation avec d’autres fonctions physiologiques (sommeil, fonction cardiovasculaire). Ces interactions ne peuvent être étudiées qu’à l’aide d’un modèle in vivo car il n’existe à ce jour pas de modèle in vitro capables de modéliser ces interactions.
Réduction
Le nombre de groupes se justifie afin d’étudier un maximum de paramètres pouvant influer sur les effets observés. Nous nous limitons à étudier 8 animaux par groupe. Ce nombre se justifie par de précédentes études menées dans le laboratoire : 4 animaux permettent d’observer une tendance à une diminution de la température de la queue sans atteindre le seuil de significativité alors qu’avec 8 animaux nous nous assurons d’observer une éventuelle diminution significative de la température de la queue. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel Statview. La normalité de la distribution des données sera vérifiée avec le test de Kolmogorov-Smirnov. Si les données suivent la loi normale, des tests paramétriques seront réalisés. L’analyse de variance (ANOVA) sera utilisée pour tester les effets des différents paramètres (âge, sexe, fréquence et durée d’exposition). Les différences entre les séries expérimentales seront également testées afin de s’assurer que tous les animaux d’un même groupe ont des réponses uniformes. Lorsque la valeur de F sera significative, un test de Fischer sera appliqué. S’il existe des interactions entre plusieurs facteurs, un test t des Student sera réalisé. Le seuil de significativité sera fixé à 0,05.
Raffinement
Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer un score. Selon la valeur du score, une action sera réalisée pour soulager au maximum l’animal. Pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel, différents enrichissements (cylindres en carton et lanières de papier kraft) seront présents dans chaque cage. Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. Les paramètres physiologiques étudiés in vivo seront mesurés sans contrainte pour l’animal : la température cutanée de la queue sera mesurée avec une caméra infrarouge et la prise alimentaire par une balance reliée à la mangeoire.
Choix des espèces
Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à une contrainte. - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude des systèmes neurophysiologiques (comme le sommeil) qui sont particulièrement bien référencés dans la littérature (Revel et al., 2009). - l’hébergement dans les chambres climatiques au sein du laboratoire sont adaptés depuis plusieurs années pour cette espèce. L’exposition sera évaluée chez des animaux ayant 3 âges différents. La population juvénile étant potentiellement plus sensible aux CEM, des animaux âgés de 3 semaines seront étudiés, âge minimum d’animaux sevrés. Afin d’évaluer les effets sur une population adolescente, des animaux âgés de 8 semaines seront étudiés, âge de la maturation sexuelle. Enfin des animaux adultes âgés de 13 semaines seront étudiés afin d’évaluer si les effets observés disparaissent à l’âge adulte.
Qualité nutritionnelle de protéines animales issues de co-produits carnés en vue de leur valorisation en alimentation humaine
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
10 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque porc subit une chirurgie de deux heures pour la pose d'une canule dans l'intestin et d'un cathéter veineux, qu'il garde vingt-trois jours en cage individuelle, avec un risque d'infection et de plaies. Le porteur teste la valeur nutritionnelle de trois protéines issues de coproduits carnés en vue de leur usage en alimentation humaine. Il tue les animaux à l'issue au motif que la canule les rend inutilisables et impossibles à placer.
Objectifs
Etudier in vivo chez le porc en croissance la qualité nutritionnelle des protéines issus de co-produits carnés en évaluant la digestibilité standardisée et la cinétique de mise à disposition des acides aminés plasmatiques, afin de développer l’utilisation de ces ingrédients en alimentation humaine.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’évaluer in vivo chez le porc en croissance la valeur nutritionnelle de trois ingrédients protéiques, afin de développer l’utilisation de ces ingrédients en alimentation humaine. Les trois ingrédients protéiques que nous étudions dans le cadre de ce projet sont actuellement une source non exploitée en alimentation humaine, bien qu’ils soient tout à fait conformes à la réglementation en la matière. Afin de favoriser leur utilisation en alimentation humaine, notamment pour l’enrichissement protéique, il est nécessaire au préalable d’évaluer leur qualité nutritionnelle. Cela permettra de les positionner par rapport à d’autres sources protéiques telles que les protéines de lait ou de soja, pour lesquelles des données sont disponibles dans la littérature. La valorisation de coproduits tels que ceux étudiés dans ce projet est une des voies permettant de limiter l’impact environnemental des productions agricoles et d’augmenter les ressources protéiques de bonne qualité nutritionnelle.
Procédures
Tous les animaux (n=10) subiront une opération chirurgicale d’environ 2 h sous anesthésie générale afin de leur poser une canule au niveau iléal et un cathéter veineux qu’ils garderont tout au long de l’étude (soit pendant 23 jours). Le cathéter et la canule sont nécessaires pour réaliser des prélèvements sanguins et digestifs sur une période de 9h après l’ingestion des repas, tout en limitant les interventions sur les animaux. Une attention particulière sera portée à la surveillance de l'état de santé des animaux pour limiter les effets indésirables suite à la pose de la canule et/ou du cathéter lors de la chirurgie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront isolés individuellement dans des cages ce qui limitera leur interaction sociale. Cependant, la distanciation sociale sera réduite, car les contacts visuels, auditifs, olfactifs seront maintenus entre les animaux. De plus, les animaux sont susceptibles de subir des effets indésirables suite à la pose de la canule et/ou du cathéter lors de la chirurgie, tels que des infections, des plaies, blessures, inflammation, fièvre, diarrhées, sorties de cathéter et/ou de canule. Une attention particulière sur la surveillance de l'état de santé des animaux sera réalisée via le protocole chirurgical établi.
Devenir
Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans le cadre d’autres protocoles expérimentaux, ni placés, du fait de la pose de canules maintenues sur une longue durée (23 jours). L’euthanasie à l’issue de l’expérimentation sera donc réalisée dans l’intérêt des animaux, dans des conditions permettant de leur éviter toute souffrance inutile.
Remplacement
Le projet s’intéressant à des réponses biologiques, l’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable. En effet, les modèles de digestion in vitro ne permettent pas à ce jour de reproduire à l’identique la complexité physiologique du vivant. Les mesures et indicateurs qui en sont extraits ne peuvent donc pas établir de manière certaine et indiscutable la qualité nutritionnelle des protéines alimentaires. Le porc en croissance a été choisi de par sa proximité physiologique avec l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude (n=10) a été choisi de manière à avoir suffisamment de puissance statistique pour évaluer la qualité nutritionnelle des aliments protéiques. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un plan randomisé (carré latin ajusté) sera appliqué, dans lequel chaque animal sera son propre contrôle. Ainsi, chaque animal testera les trois repas test et un repas non-protéique.
Raffinement
Les compétences et expériences des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Une attention particulière sera accordée à la gestion de la douleur pendant toute la durée de l’expérimentation. Les porcs pourront avoir un contact olfactif, sonore et visuel avec leurs congénères. Des observations quotidiennes de l’état de santé général des animaux seront réalisées tout au long de l’expérimentation. Les cages seront régulièrement enrichies par des objets de nature variable (jouets en plastique, tapis).
Choix des espèces
Le modèle « porc en croissance » est actuellement celui validé pour la mesure de la digestibilité iléale standardisée des acides aminés (AA). C’est donc ce modèle que nous proposons d’utiliser pour évaluer de manière aussi réaliste que possible la qualité nutritionnelle des trois ingrédients protéiques testés. La validité de ce modèle en substitution des études chez l’Homme est confirmée d’après un corpus d’études relativement nombreuses et concordantes.
Le métabolome sanguin, une nouvelle piste pour contrer les troubles psychiatriques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
810 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 660 tuées pour prélever leurs organes et 150 autres réutilisées ou tuées selon les besoins. Les souris subissent un protocole de défaite sociale de dix jours qui provoque des comportements de type anxieux, puis des tests comportementaux évaluant mémoire et émotions. Le porteur emploie des mâles "agresseurs" d'une seconde lignée pour infliger ce stress et affirme que le modèle murin est "nécessaire" pour tester des métabolites sanguins. La perfusion intracardiaque finale se fait sous anesthésie profonde.
Objectifs
Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, unique cellule immunitaire du cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet est basé sur des découvertes récentes de l’implication de la communication entre les organes périphériques (intestin, microbiote intestinal, foie notamment) et le cerveau dans les maladies neurologiques et psychiatriques. Il va donc permettre de venir étayer ces nouveaux concepts en testant directement comment des molécules produites par les organes périphériques peuvent contrer la neuroinflammation et les troubles comportementaux. Ce projet va donc servir de base pour d’autres études visant à intervenir non plus uniquement sur le cerveau mais aussi sur le fonctionnement d’autres organes pour améliorer la santé mentale. Comme décrit en 3.3.2.1 (objectifs du projet) cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
Les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque de liquide physiologique ou de fixateur après anesthésie profonde (sans réveil).Les souris C57Bl6/j vont par ailleurs subir un protocole de stress validé d'une durée de 10 jours. Par ailleurs, ces souris seront amenées à réaliser des tests comportementaux visant à évaluer leurs capacités mnésiques et émotionnelles. Ces tests sont d'une durée de 5 à 15 minutes au maximum. Chaque souris sera soumise à 5 tests espacés d'au moins 4 jours.
Impact sur les animaux
De par sa nature et son objectif le protocole de stress de défaite sociale que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les souris seront de toute façon suivi comme suit : Les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Les évaluations objectives de douleur après chaque session de défaite sociale sont effectuées systématiquement afin de déterminer si les animaux ont besoin d'analgésiques.
Devenir
L’ensemble des 660 souris mâles adultes C57Bl6/j ayant participé au procédure de défaite sociale ou de test d’acceptabilité seront mise à mort afin de prélever et étudier différents organes (cerveau, foie, rein, intestin…) Les 150 souris mâles adultes Swiss CD1 (procédure 2) seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible.
Remplacement
La sélection des métabolites à tester a été drastiquement réduite par un travail in silico visant à ne sélectionner que les métabolites avec une haute probabilité d’action cérébrale. Par exemple, la présence de récepteurs au niveau cérébral et l’implication des molécules dans des voies de signalisation / métaboliques impliquées dans les troubles psychiatriques et neuroinflammatoires étaient des pré-requis à la sélection des molécules. L’objectif du projet étant de tester les effets comportementaux de ces molécules dans le contexte des maladies psychiatriques il est nécessaire d’utiliser un modèle murin.
Réduction
Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 810 Mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse. L’étude d’acceptabilité aura pour objectif d’éliminer toute dose ayant des négatifs ou toxiques sur l’animal. Par ailleurs deux doses seront utilisées en commencant par la plus faible, si celle-ci a un effet alors la dose plus élevée ne sera pas testée. Cette approche permettra donc de supprimer des expériences inutiles et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris Swiss CD1 agresseurs seront employées durant plusieurs sessions consécutives de défaites sociales. A la fin des deux protocoles successifs, les CD1 seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'elles n'auront pas reçu de traitements particuliers. Elles ne seront mises à mort que si nul n'en a l'utilité.
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (carré de coton ou maison en carton). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin et coton), les animaux recevront une injection sous-cutanée de buprénorphine (0.05 mg/kg) si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs (voir définition des points limites en dans les procédures expérimentales), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. L’étude d’acceptabilité aura aussi pour objectif d’éliminer des métabolites ou des dosages qui pourraient entrainer un inconfort chez l’animal. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur comme la perfusion intracardiaque nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études de défaite sociale notamment car c’est la souche communément utilisée, de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. Les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie à l’âge de 8 semaines et auront donc 3 semaines d’acclimatation avant de démarrer les protocoles de défaite social. Les souris CD1 seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte.Les expériences de comportement démarreront sur des animaux agés de 12 semaines et plus. L’âge de 12 semaines est utilisé car la maturation cérébrale y est terminée. Cela permet de diminuer la variabilité qui pourrait être observée en utilisant des animaux plus jeunes. Par ailleurs, l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été mise au point sur des animaux de cet âge-là. Ce choix permet donc d’assurer une reproductibilité des procédures, de diminuer la variabilité inter-individuelle et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaire.
Atteintes microcirculatoires et modification de la cinétique des anti-infectieux aux cours des états de choc par péritonite chez le porcelet anesthésié et ventilé.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
100 porcelets vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porcelet subit pendant treize heures l'induction d'un choc septique par péritonite, une ouverture chirurgicale de l'abdomen et la pose de cathéters, pour mesurer la diffusion des anti-infectieux dans les tissus. Le porteur précise qu'un réveil est impossible car le choc et les souffrances d'organes seraient douloureux. Il indique aussi que ces animaux servent à former des médecins réanimateurs, formation qu'il présente comme "indispensable" à leur pratique.
Objectifs
Les états de choc sont la principale cause de décès des patients de réanimation. Ils sont à l'origine d'atteintes vasculaires responsables d'un mauvais fonctionnement des organes. Mieux comprendre les facteurs influençant ce mauvais fonctionnement des organes pourrait modifier le pronostic des patients. Deux types de traitements sont couramment utilisés. Le premier est le remplissage vasculaire (RV). Il consiste à perfuser au malade des produits pour augmenter son volume de sang. C'était l'objet de travaux précédents qui portaient sur l'évaluation de l'efficacité de différents liquides de RV pour traiter les états de choc infectieux chez le porcelet endormi (anesthésié) et sous respirateur. L'autre principal traitement des chocs infectieux est la prescription de médicaments pour tuer les bactéries ou les champignons (antibiotiques et antifungiques) responsables de l'infection. L'efficacité de ces médicaments dépend de leur quantité dans le sang et de leur capacité à aller dans les organes. L'objectif de ce projet consiste à étudier la concentration des anti-infectieux dans un modèle de choc infectieux pour mieux comprendre leur répartition lors de l'infection et pouvoir adapter les doses et les temps d'injection. Il s'agit de la deuxième étape d'étude sur cette thématique, faisant suite à un premier modèle de choc créé par injection intraveineuse de toxine de la bactérie Eschérichia Coli. Dans cette nouvelle étude nous avons décidé de tester un modèle de choc plus physiologique en induisant une péritonite (infection abdominale). Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcope laser. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.
Bénéfices attendus
L'augmentation de la perméabilité vasculaire observée lors du choc septique et l'oedème tissulaire qui en découle influence la diffusion et la concentration des anti-infectieux dans l'organisme. Connaître cette atteinte microvasculaire et la modification de la pharmacocinétique des anti-infectieux lors du choc septique est fondamentale pour la prise en charge optimale des patients. L'étude pharmacologique nécessite un modèle reproductible stable, permettant une modélisation fiable. Le modèle porcin remplit toutes les conditions pour permettre de répondre à cette problématique. De plus, les groupes étudiés vont permettre de continuer l'étude de la micro-circulation par microscopie confocale lors du choc septique.
Procédures
La procédure complète se déroulera sur 13 heures : 1 heure environ pour la préparation de l'animal, 4 heures pour l'induction du choc septique, et 8 heures pour la collecte des données. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. La phase la plus douloureuse est la réalisation d'une microlaparotomie au niveau abdominal pour la mise en place d'une sonde urinaire. Elle sera réalisée après l'injection intraveineuse de sufentanil afin de prévenir la douleur. Cette ouverture chirurgicale permet également d'avoir accès au mésentère de l'intestion grêle afin de réaliser des images par Cellvizio (endomicroscope confocal laser) pour l'évaluation de la porosité des vaisseaux (ces images sont réalisées après injection intraveineuse de dextran 70 kda couplé à la fluorescéine).
Impact sur les animaux
Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc induit. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcopie confocale. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il s'agit d'une étude descriptive qui a pour objectif de démontrer une théorie pharmacocinétique. Il n'existe pas de méthode alternative permettant d'atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.
Réduction
L'étude de la pharmacocinétique (devenir du médicament dans l'organisme) des anti-infectieux se fait par modélisation mathématique qui nécessite 8 données pour chaque temps de prélèvement. Afin d'anticiper des pertes dues à l'état de choc mais qu'il est difficile de prévoir, il a été décidé de relever ce nombre à 10. Ainsi pour chaque anti-infectieux, nous utiliserons un groupe de 10 porcelets et chaque animal sera son propre témoin. En considérant l'étude de 2 anti-infectieux par an, nous envisageons d'utiliser 20 animaux par an, soit 100 animaux sur 5 ans. L'ensemble des analyses statistiques sera effectuée par une équipe de médecins statisticiens agréés qui a validé ce modèle de cinétique dans des publications internationales. De plus, les animaux de ce projet permettront en parallèle de former les médecins réanimateurs à la réalisation de gestes sous échographie et à la prise en charge du choc infectieux, indispensable à leur pratique professionnelle et requise pour la validation de leur formation.
Raffinement
Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine. - Contact et observations quotidiennes par les soigneurs (apparence physique externe, comportement , réponses comportementales aux stimuli externes...). Toute anomalie est remontée au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. - Environnement adapté et enrichi : les animaux sont hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. - Procédure expérimentale réalisée par du personnel qualifié et expérimenté. L’animal reste sous anesthésie générale jusqu'au décès. Au cours des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément Lors des quelques gestes invasifs et possiblement douloureux, un morphinique sera utilisé (SUFENTANIL 10 μg/h). La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. C'est la raison pour laquelle tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Choix des espèces
Le porc est un bon modèle d'étude cardio-vasculaire proche de la physiologie humaine. Le comportement hémodynamique et la vascularisation sont également proches de l'Homme, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. De plus, notre équipe de recherche a acquis une expérience de plusieurs années sur ce modéle de grand animal permettant d'optimiser au mieux le modèle. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.
Implication du réseau neuronal thalamo-cortical et des AhR dans la migraine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées et subissent des tests comportementaux d'allodynie mécanique, d'aversion à la lumière, d'anxiété et de dépression, certaines une chirurgie stéréotaxique avec implantation d'une lentille intracérébrale reliée à un microscope miniature. Le porteur étudie le rôle du réseau thalamo-cortical et des récepteurs AhR dans la migraine, avec une piste alimentaire et probiotique. Toutes sont tuées par injection de pentobarbital puis dislocation cervicale.
Objectifs
La migraine est la 6ème cause de handicap dans le monde. Elle est associée à une allodynie cutanée et à une photophobie, en plus d’autres maladies concomitantes qui rendent difficile le traitement. La migraine est influencée par les aliments et le microbiote intestinal. Les métabolites dérivés de l’activité bactérienne régulent le fonctionnement cognitif, et son impliqués dans les processus de neurodégénérescence. Dans ce contexte nous nous intéressons au tryptophane (Trp), acide aminé essentiel. Une réduction de son ingestion augmente l’intensité des nausées, de la douleur et de la photophobie pendant la crise migraineuse. Environ 6% du Trp est transformé par le microbiote en dérivés indoles, agonistes endogènes des récepteurs d’aryl d’hydrocarbone (AhR). L’AHR est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la neuroinflammation et la neurotoxicité. Son activation via les indoles a des effets protectifs et antiinflammatoires. Cependant, l’implication des indoles et des AhR dans la migraine est très peu connue. Le premier objectif est d’étudier leur rôle dans le déclanchement et/ou la chronicisation de la migraine ainsi que dans la comorbidité avec des troubles sensoriels et affectifs dans un modèle de migraine chez la souris. D’autre part, durant la crise migraineuse le message nociceptif issu des méninges et de la rétine converge au niveau du thalamus puis il est transmis vers les régions corticales. Ce circuit suggère le rôle du thalamus dans l'allodynie et la photophobie au cours de la migraine. Cependant, l’implication des neurones thalamiques et la manière dont ils intègrent l’information demeure une question jamais examinée à ce jour. Le deuxième objectif est d’étudier comment le message nociceptif est traité au niveau thalamique et cortical durant et entre les crises de migraine ainsi que d’évaluer l’implication des indoles et les AhR dans ce circuit neuronal.
Bénéfices attendus
Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau des noyaux thalamiques et du cortex. Cette altération implique les récepteurs AhR et les métabolites indoles comme principaux agonistes endogènes. Les différentes techniques utilisés dans ce projet permettront de révéler de nouveaux mécanismes moléculaires et de plasticité neuronale jamais abordés dans le cadre de la migraine et les troubles sensoriels associés. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence le rôle des AhR dans l’initiation et la chronicisation de la migraine ainsi que la vulnérabilité du circuit thalamo-corticale à la neuroinflammation, permettant de trouver des nouvelles cibles thérapeutiques adaptés au patient et centrées sur une approche alimentaire et probiotique à long terme.
Procédures
Procédure 1 : [1] injection intrapéritonéale (i.p.) soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) suivie d’une injection i.p. du traitement pharmacologique (1-2 fois/jour sur 3 jours consécutifs selon le protocole expérimental) ; [2] mesure de l’allodynie en réponse à une stimulation mécanique non nociceptive (une fois par jour, pendant 3 h, sur 2 jours consécutifs) ; [3] mesure de l’aversion à la lumière (10 min, une seule fois) ; [4] mesure du comportement anxieux (une fois par jour, pendant 10 min, sur 3 jours consécutifs) ; [5] mesure du comportement dépressif (pendant 15 min, une seule fois) ; [6] injection i.p. de pentobarbital sodique pour la mise à mort de l’animal (une seule fois). Procédure 2 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) suivie d’une injection i.p. du traitement pharmacologique (1-2 fois/jour sur 3 jours consécutifs selon le protocole expérimental) ; [2] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois). Procédure 3 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) ; [2] anesthésie avec isofluorane (environ 20 min, une seule fois) ; [3] chirurgie stéréotaxique (environ 20 min, une seule fois) ; [4] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois). Procédure 4 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) ; [2] anesthésie avec isofluorane (environ 20 min, 2 fois avec 1-2 semaines d’intervalle) ; [3] : chirurgie stéréotaxique (environ 20 min, 2 fois avec 1-2 semaines d’intervalle) ; [4] : installation du microscope miniature sur le support crânien fixé dans l’intervention précédente (une fois par jour, pendant 1-3 jours par semaine, durant 2 mois ; chaque session dure 10-30 min) ; [5] mesure de l’allodynie (une fois par jour, pendant 10-30 min) ; [6] mesure de l’aversion à la lumière (une fois par jour, pendant 10 min) ; [7] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois).
Impact sur les animaux
D’une part, les animaux soumis à une restriction/implémentation de Trp risquent de présenter une altération du régime alimentaire qui peut impliquer des perturbations de leur comportement et bien-être. Les études préliminaires avec le régime carencé en Trp indiquent une perte non significative du poids lors des premiers jours mais qui ne s’aggrave pas avec la suite du protocole. Les animaux n’ont pas présenté d’altérations de l’agressivité, le cycle du sommeil ni du stress, parmi d’autres évaluations. D’une autre part, certains animaux vont suivre une chirurgie d’implantation d’une lentille microendoscopique au niveau cérébral, qui sera ponctuellement connectée à un système miniature de microscopie au moment de l’expérience. La douleur occasionnée pour cette procédure sera prévenue et/ou traitée avec des antalgiques. Quelle que soit l’expérience réalisée, une évaluation de l’état physique de chaque souris sera effectuée chaque jour et avant chaque manipulation, afin de détecter le plus rapidement possible tout signe traduisant le mal-être de l’animal. Dans le cas où l’animal montre des signes cliniques, soit il pourra être soigné sans compromettre les résultats, soit nous procèderons à la mise à mort dans le cas échéant. En plus, des points limites spécifiques pour chaque procédure seront mises en place.
Devenir
À la fin de chaque procédure ou expérience, les animaux seront euthanasiés avec une injection intrapéritonéale (i.p.) de pentobarbital sodique (dose supérieure à 150 mg/kg). Afin de confirmer la mort, nous réaliserons une dislocation cervicale.
Remplacement
Notre projet étudie l’effet de la dérégulation du métabolisme du Trp et ses dérivés indoles sur les récepteurs AhR au niveau du réseau thalamo-cortical dans le cadre de la migraine. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer les protocoles et procédures décrits ci-dessous. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Dans le cas de l’évaluation comportementale, l’expérience préalable de notre laboratoire nous permet de réduire le nombre d'animaux par groupe à 10 (compte tenu aussi du fait qu’environ 20% des animaux ne sont pas sensibles à l'ISDN, et que certains animaux ne répondent pas au traitement administré). Dans le cas de l’évaluation immunohistochimique suite au marquage du réseau neuronal, nous allons réduire à 5 animaux par groupe expérimental. Dans les études de RT-PCR et de quantification par HPLC des niveaux plasmatiques et cérébrales de Trp et ses métabolites, nous allons extraire les échantillons de tissu des mêmes animaux afin de réduire au maximum le nombre de souris. Cela nous permettra de réaliser une corrélation entre l’expression génique et le taux des molécules étudiées. Quelle que soit la procédure à réaliser, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin de tirer des conclusions statistiquement fiables et pertinentes avec un pouvoir d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique (test t de Student pour une comparaison entre deux groupes ; ANOVA suivie d’un test de comparaison multiples, tel que le test de Dunnet ou le test de Tukey, pour des comparaisons de plus de 3 groupes). Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques (test de Wilcoxon pour des comparaisons entre mesures répétées précédentes d’un même groupe ; test U de Mann-Whitney pour des comparaisons entre deux groupes indépendants ; test de Kruskal-Wallis pour des comparaisons entre plus de trois groupes). La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05.
Raffinement
Afin d’assurer le bienêtre et le confort des animaux, les souris seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier pour réaliser leur nid). Une évaluation de l’état physique de l’animal sera réalisée avant chaque manipulation expérimentale pour détecter toute lésion, signe clinique ou comportemental traduisant l’inconfort, le stress, ou une maladie (liés ou non à l’étude). Un tableau d'évaluation avec les critères suivants permettra d'objectiver la décision : dégradation de l’état physique, manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue). Dans le cas où l’animal montre au moins un de ces signes cliniques, soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contra la douleur, désinfection des blessures, réhydratation par administration de saline sous-cutané, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à la mise à mort dans le cas échéant. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques, il sera sacrifié. Des points limites (précisés ci-dessous) seront mis en place pour chaque procédure
Choix des espèces
Puisque ce projet est la suite d’une étude en cours de réalisation actuellement, nous continuons à utiliser le même modèle animal. Sur le plan génétique, la souris est très similaire à l’homme et permet l’extrapolation et comparaison des résultats obtenus au laboratoire avec les études cliniques (dans la mesure du possible). De plus, elle possède des nombreux atouts pour l’élevage en laboratoire : une descendance nombreuse, un développement rapide et une taille réduite. D’ailleurs, la souris est idéale en raison de la disponibilité des knockouts génétiquement modifiés dont les souris AhR-/- que nous allons utiliser. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes (5-12 semaines d’âge) car l'étude n’a pas pour objectif de travailler sur les jeunes (système nerveux en cours de développement) ou chez l'animal âgé.
Etude in vivo de l’effet des anticorps anti-MHC I sur les plaquettes sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de plaquettes dans le sinus rétro-orbital et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue, puis un prélèvement terminal à l'aorte abdominale sous anesthésie. Le porteur étudie l'élimination des plaquettes transfusées chez un receveur devenu réfractaire et affirme que ces processus "ne peuvent être étudiés qu'in vivo". Il croise deux lignées de fonds génétiques différents pour reproduire la différence entre donneur et receveur.
Objectifs
Les plaquettes sanguines jouent un rôle fondamental dans les processus d’hémostase. C’est ce qui nous permet d’éviter les hémorragies en cas de blessures ou de lésions. Quand le taux de plaquettes circulantes chute en dessous de 10.000 plaquettes par μL de sang chez un patient, le risque d’hémorragie interne devient important et une transfusion peut être envisagée. Une complication post transfusionnelle connue est la production d’anticorps anti¬plaquettes par le receveur dirigés contre les plaquettes du donneur. Ainsi, si receveur développe de tels anticorps de nouvelles transfusions seront inefficaces sur un plan thérapeutique puisque les plaquettes du donneur seront détruites par ces anticorps et très rapidement éliminées de la circulation : on dit alors que le patient est en état réfractaire. Cette problématique est particulièrement importante chez des patients dont les pathologies nécessitent des transfusions plaquettaires récurrentes. Objectif : Des études préliminaires ont permis d'avancer dans la compréhension du mode d'action des anticorps produits par le receveur et responsables de l'élimination des plaquettes transfusées. Ce projet nous permettra d'évaluer une approche pharmacologique ayant pour but d'éviter que les plaquettes transfusées soient éliminées trop rapidement de la circulation du receveur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont d'apporter des connaissances sur les mécanismes d'élimination des plaquettes transfusées lorsque le receveur rejette sa transfusion et qu'il y a donc une inefficacité thérapeutique transfusionnelle appelée également état réfractaire. Les perspectives de ce travail sont denvisager des solutions thérapeutiques chez l'homme et une meilleure prise en charge des patients multitransfusés.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements sanguins à l'aorte abdominale (prélèvement terminal sous anesthésie) ou des prélèvements sanguins à la queue (petits volumes prélevés, sous anesthésie ). Les prélèvements à l'aorte sont des prélèvement terminaux donc unique par définition. Prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié : Les prélèvements sanguins à la queue sont réalisés 5 min, 30min, 2h, 24h et 48h après la transfusion de plaquettes, soit 5 prélèvements de 10 µL sous anesthésie gazeuse sur le même animal.
Impact sur les animaux
Pour réaliser ce projet, 304 souris au maximum devront être utilisées et mis à mort à la fin du projet. Cependant, les procédures réalisées sont modérées et seront effectuées dans le strict respect des règles mises en place pour veiller au bien être des animaux. Les animaux subiront un stress au moment de l'anesthésie (contention de l'animal pour lui injecter l'anesthésiant) mais ce geste n'est pratiqué que par des expérimentateurs habilités à réaliser ce geste (donc rapidement). Une douleur peut être ressentie au niveau du site d'injection des plaquettes dans le sinus rétro-orbital d'où l'utilisation d'un collyre contenant de la tétracaine pour limiter la douleur.
Devenir
Les animaux de la PE n°1 seront soit mis à mort (lot n°1: prélèvement sanguin terminal à l'aorte abdominale) soit utilisés pour la PE n°2 (lot n°2) Les animaux utilisés dans les PE n°2 et n°3 seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
Les événements initiaux conduisant à la production d’anticorps anti-plaquettes et aux états réfractaires ne peuvent pas être étudiés chez des patients transfusés. Nous voulons évaluer l'effet d'une stratégie thérapeutique. Ces processus mettent en oeuvre simultanément des interactionsentre les vaisseaux, le sang et la circulation sanguine. Ces événements sont intégrés et ne peuvent être étudiés qu’in vivo.
Réduction
Les mises au point réalisées en amont pour vérifier que ce protocle d'alloimmunisaton conduit à un état réfractaire permettra de n’utiliser que le minimum de souris dans les groupes de souris immunisées. Les nombres d'animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés avec la contrainte d'obtenir des observations suffisamment représentatives. Des expériences préliminaires au laboratoire nous ont permis de fixer à 5 le nombre de souris par conditions testées, ce chiffre tient compte de la variabilité inter-individus.
Raffinement
Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec du coton et de la frisure, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Ils ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les individus sont hébergées par groupe de 6 par cage. Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux.-Accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture -Anesthésie de l’animal afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. -Injection d’analgésique le cas échéant. -Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Ils veilleront au bien être des animaux grâce à l'utilisation d'une grille de scoring et à la défintion de points limites permettant d'éviter toutes douleurs ou souffrances inutiles de l'animal. Ce projet nécessitera 304 souris au maximum
Choix des espèces
Puisque nous souhaitons mimer la différence qui existe entre un donneur et un receveur qui conduit à la production d'anticorps par le receveur, nous devons travailler avec des souris de fond génétique différents et très bien caractérisés au laboratoire (C57BL6/J et BALB/c). De plus, le modèle d’alloimmunisation post transfusionnelle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire ce qui rend l’utilisation de la souris dans ce projet très pertinente. Les animaux sont utilisés au stade adulte, pubère âgé de 7 à 12 semaines afin de pouvoir étudier l'effet des anticorps sur un individu au système immunitaire mature.
Etude de l’effet d’une molécule enzymatique sur un modèle murin de l’épilepsie myoclonique progressive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie avec implantation d'une pompe de diffusion, puis huit jours d'isolement, et présente une perte de neurones et un déficit de mémoire évalué par un test de labyrinthe en Y. Le porteur utilise une lignée 5xFAD, qu'il décrit à la fois comme modèle d'Alzheimer et de la maladie de Lafora, pour tester une molécule enzymatique. Les souris sont expédiées vers une société privée qui les tue à réception, et le bénéfice annoncé se limite à une "meilleure compréhension" de la maladie.
Objectifs
La maladie de Lafora (ML) représente une forme fréquente et particulièrement grave d’épilepsie myoclonique progressive. Ses premières manifestations surviennent à l’adolescence : la personne perd soudainement conscience et tombe avant de présenter des contractions musculaires généralisées. Cette première phase est suivie d’une seconde période durant laquelle le patient présente des spasmes rapides des quatre membres suivie d’une décontraction généralisée des muscles. Après un délai variable d’inconscience, la personne se réveille. L’évolution est dominée par une détérioration cognitive majeure et rapide, dont les premiers symptômes peuvent précéder les troubles moteurs. Le décès survient généralement 4 à 10 ans après les premiers symptômes dans les formes typiques. L’utilisation d’un modèle rongeur, vertébré présentant des structures cérébrales comparables à l’Humain, permet l’étude de ces dernières et des circuits neuromusculaires associés afin de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie de Lafora. L’objectif de ce projet est de tester une molécule enzymatique thérapeutique (VAL) sur ce modèle murin. Pour le modèle murin utilisé (souris 5xFAD : MMRRC Strain #034840-JAX) : Ces souris transgéniques 5xFAD surexpriment la protéine mutante humaine précurseur bêta-amyloïde (A4) 695 (APP) avec les mutations suédoises (K670N, M671L), de Floride (I716V) et de Londres (V717I) de la maladie d'Alzheimer familiale (FAD) avec la préséniline humaine 1 (PS1) hébergeant deux mutations FAD, M146L et L286V. Les deux transgènes sont régulés par le promoteur Thy1 de la souris pour entraîner une surexpression dans le cerveau. Les souris 5XFAD récapitulent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent constituer un modèle utile de neurodégénérescence intraneuronale induite par Abeta-42 et de formation de plaque amyloïde. De plus ces animaux présentent des formes d’épilepsie similaires à la maladie de Lafora, ce pourquoi nous les utilisons.
Bénéfices attendus
Meilleure compréhension de la maladie de Lafora.
Procédures
Tous les animaux subiront une opération chirurgicale sous anesthésie de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour l’étude de la maladie de Lafora, le modèle murin utilisé est le modèle 5xFAD. Ces souris lorsque reproduites en hémizygotes (un organisme est dit hémizygote pour un gène particulier si ce dernier n'est présent qu'à une seule copie) sont viables et fertiles et présentent des déficits cognitifs et de mémoire ainsi que des épisodes d’épilepsie. Ces animaux subissent une chirurgie avec implantation d’une pompe de diffusion et sont isolés pendant 8 jours à la suite de cette chirurgie. Ces animaux présentent une perte de neurones et une déficience de la mémoire dans le test du Y-maze (test du labyrinthe en Y). Les souris transgéniques 5xFAD possèdent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent être des modèles utiles de la neurodégénérescence intraneuronale induite par l'Abeta-42 et de la formation de plaques amyloïdes. Pour limiter la souffrance, un analgésique [Meloxicam (Metacam™), 0.03 ml, 5mg/kg] est administré par voie intrapéritonéale avant la chirurgie et pendant les 3 jours (si nécessaire) suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. Concernant le stress et l’anxiété, les animaux voient et sentent leurs congénères même s’ils sont isolés. La cage est enrichie avec un nid végétal. Les animaux sont manipulés avant et après la chirurgie pour minimiser le stress et l’anxiété.
Devenir
A la suite des opérations de chirurgie, les animaux seront envoyés à la société Neuroservices Alliance localisé à Aix en Provence. Les animaux seront envoyés à cette société avant l’apparition du phénotype dommageable. Cette société s’occupera de l’euthanasie des animaux dès leur réception ainsi que des prélèvements.
Remplacement
Ce protocole nécessite l’utilisation d’animaux. En effet, l’identification des structures cérébrales et des circuits neuromusculaires impliqués dans la maladie de Lafora nécessite l’utilisation d’un cerveau intact chez l’animal vigile. Des méthodes in vitro telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neurones qui sont le sujet de nos travaux. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 10 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 60 animaux pour la réalisation de ce protocole.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans diverses maladies myocérébrales. De plus, nous utilisons ici un modèle transgénique présentant un fort intérêt scientifique. Les animaux seront utilisés entre 4 et 9 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Évaluation de l’efficacité d’une trithérapie dans le cancer du foie chez l’enfant
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des médicaments deux fois par semaine pendant sept à neuf semaines, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs. Le porteur teste une trithérapie contre l'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, et prévoit de répéter voire de refaire l'ensemble de l'étude, ce qui porte l'effectif à 280. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité de la tumeur in vivo.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence par chimiothérapie est inefficace dans 20 % des cas. Nos données en laboratoire montrent que l’action combinée de 2 drogues en sus de cette chimiothérapie de réfèrence permet d’éliminer très efficacement les cellules tumorales du foie en laboratoire. Dans ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de cette trithérapie chez l’animal. Ces travaux de recherche nous permettrons aussi d’étudier pourquoi certaines drogues sont efficaces et pas d’autres et comment les cellules tumorales arrivent à résister à chacune de ces drogues lorsqu’elles sont utilisées seules. En effet, ces informations sont cruciales pour comprendre comment fonctionnent ces molécules et quelles propriétés les rendent efficaces. La découverte et la validation de nouveaux traitements des tumeurs du foie chez l’enfant permettront de faire un pas important pour soigner les enfants souffrant de ce cancer, en particulier ceux en rechute ou en échec thérapeutique.
Bénéfices attendus
Démontrer que l’association de ces trois médicaments bloque la formation de tumeur d’hépatoblastome chez la souris plus efficacement que chaque drogue utilisée seule ou combinée deux à deux.
Procédures
Implantation de cellules tumorales en sous-cutanée sur 280 animaux. Suivi des animaux pendant 7 à 9 semaines. Administration de médicaments 2 fois par semaine. Mesure de la tumeur au pied à coulisse 3 fois par semaine. Pesée des souris deux fois par semaine.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sur les animaux sont l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée et la pousse de la tumeur pendant plusieurs semaines.
Devenir
Les 280 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.
Réduction
Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). Le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence interlots avec 50% d’écart type intra lots est de 10. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si la dose d’utilisation d’une des drogues doit être réajusté, l’étude sera refaite une fois. Nous prévoyons d’utiliser 280 souris dans ce projet du fait que nous avons 7 groupes de 10 souris (7 conditions de traitements), que l’expérience sera refaite deux fois et que l’étude globale sera refaite une fois si la dose d’une drogue doit être réajustée. Nous allons bien sûr tout faire pour que les doses choisies des trois drogues soient les bonnes dès la première série d’analyses et que l’étude ne soit pas refaite, ce qui aurait comme conséquence une réduction de moitié du nombre de souris.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux définis par un chercheur référent en 1998. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément à la directive européenne 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures.
Choix des espèces
1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations de l’Animalerie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les points limites adaptés pour le modèle de souris utilisé sont décrits dans l’annexe 1.