Recherche fondamentale

143 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'un biomatériau, soit sous la peau, soit dans un défaut osseux du crâne créé au préalable, pour tester l'activité de vésicules extracellulaires sur la repousse osseuse. Le porteur annonce une analgésie péri et post-opératoire et n'attend que des douleurs légères, avant une mise à mort par élongation cervicale pour prélever les implants et les crânes. Il affirme qu'il n'existe pas de solution de remplacement pour une étude portant sur le tissu osseux et retient la souris, dont sont issues les vésicules étudiées.

Objectifs

En vieillissant, la communication intercellulaire entre les cellules osseuses est modifiée, et par conséquent l’équilibre entre la formation et la résorption osseuse est altéré conduisant à la perte osseuse. Récemment, des vésicules extracellulaires ont été identifiées comme un nouveau mode de communication entre les cellules osseuses, permettant la régulation du remodelage osseux. Notre hypothèse de travail est que ces vésicules extracellulaires sont impliquées dans la communication entre les cellules osseuses et qu’elles participent au processus de régénération tissulaire et au vieillissement osseux. Les vésicules extracellulaires osseuses sont obtenues par centrifugation différentielle à partir d’un broyat d’os long de souris (tibias et fémurs) prélevés sur des animaux morts (ces animaux ne sont donc pas pris en compte dans le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet). A l’issu des premières centrifugations permettant d’éliminer les débris d’os et les corps apoptotiques, la fraction obtenue est « l’extrait total ». L’ultracentrifugation de « l’extrait total » permet d’isoler la « fraction vésiculaire » et la « fraction soluble » (contenant l’ensemble des protéines solubles : cytokines et facteurs de croissance par exemple). Nous avons observé in vitro que l’extrait total permet de stimuler la différenciation des ostéoblastes, les cellules formant l’os. Nos résultats indiquent que c’est la fraction vésiculaire qui est à l’origine de cet effet in vitro. L’objectif de notre projet est de valider in vivo que l’activité ostéogéniques de l’extrait total est bien associée à la fraction vésiculaire, et non à la fraction soluble. Ainsi pour l’ensemble de cette étude, nous allons comparer l’effet de ces trois fractions entre elles. De plus, nous allons comparer l’effet de ces fractions avec celui du gold-standard, la Moelle Osseuse Totale (MOT) qui sera le contrôle positif de l’ensemble de notre étude. Afin de maintenir le matériel biologique dans les défauts osseux, les fractions seront associées à un biomatériau composé d’un mélange d’hydrogel et de granules de Phosphate de Calcium Biphasique (BCP) utilisé ici pour leurs propriétés ostéoconductrices. Ce biomatériau est déjà utilisé dans le laboratoire avec succès pour la régénération osseuse. Cette étude sera menée chez la souris dans deux contextes : en site ectopique (implantation en sous-cutané) et en site orthotopique (implantation dans des défauts osseux de calvaria).

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra pour la première fois de valider in vivo la capacité ostéogénique des vésicules extracellulaires extraites d’os dans le cadre de la régénération osseuse. Les perspectives de cette étude pourront nous apporter de nouvelles connaissances des phénomènes impliqués dans la régénération osseuse grâce aux vésicules extracellulaires dérivées d’os. A plus long terme, l’utilisation de vésicules extracellulaire pourra permettre de remplacer les thérapies cellulaires classiques et pourront être appliquées à l’Homme.

Procédures

Deux procédures chirurgicales seront réalisées. Les animaux seront soumis soit à l’implantation sous-cutanée d’un biomatériau chargé en fraction biologique (temps opératoire max : 10 minutes) soit à l’implantation d’un biomatériau chargé en fraction biologique au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de souris réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Ces procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

En se basant sur nos connaissances et nos études antérieures, nous n’attendons aucune gêne fonctionnelle, perte de poids, stress ou comportement anormal des animaux au cours de cette expérimentation. Les souris Swiss/CD1 sont décrites comme ayant une susceptibilité faible de développer les réactions inflammatoires sévères. Des douleurs post chirurgicales légères pourraient être observées. Pour cela, les animaux seront soumis à une analgésie péri-opératoire et post-opératoire par injection sous-cutanée de buprénorphine (0.05 mg/kg).

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront tués par élongation cervicale puis les implants sous-cutanés (procédure 1) ou les calvarias (procédure 2) seront prélevés et fixés pour les analyses radiologiques et histologiques mises en œuvre pour évaluer la repousse osseuse.

Remplacement

L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, d’ostéoinduction et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le biomatériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité et sa capacité d’ostéoconduction in vitro et in vivo. Pour la première procédure utilisant des implants sous-cutanés, plusieurs implantation (jusqu’à 4) seront réalisées sur le même animal pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour la deuxième procédure réalisée en site orthotopique, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de souris, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs une approche statistique (software GPower), nous a aidé à calculer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude. Les tests statistiques utilisés dépendront de la distribution des données. Pour chaque paramètre, la normalité et la distribution seront évaluées. En fonction de ces évaluations, un test de variance paramétrique (Anova) ou non paramétrique (Kruskall-Wallis) sera réalisé. Si P

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée en prémédication et jusqu’à 48 heures après la chirurgie. La surveillance régulière des animaux permettra d’évaluer des points limites selon une grille d’évaluation détaillé (Annexe). Selon les points limites identifiés, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée ou seront retirés de l’étude. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux de 5 individus par cage avec enrichissement sous forme de frisottis et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. De plus, les vésicules extracellulaires que nous étudions étant issues de souris, nous avons décidé de rester chez la même espèce pour la validation expérimentale in vivo de notre hypothèse d’étude. Les animaux inclus dans cette étude seront des souris mâles âgées de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.

5 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal sain subit six séances sous un dispositif d'assistance respiratoire avec des acquisitions tomodensitométriques avant, pendant et après, sous anesthésie générale. Le porteur cherche à vérifier l'absence de lésions pulmonaires comme des atélectasies avant de proposer le dispositif à des patients, et prévoit la mise à mort des cinq animaux pour confirmer les images par histologie des poumons. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des conditions cliniques et retient le porc pour la taille de ses poumons proche de celle de l'humain, jugeant leur prélèvement "indispensable".

Objectifs

De nombreuses pathologies respiratoires, telles que la mucoviscidose, la broncho-pneumapathie chronique obstructive ou les dilatations de bronches nécessitent une prise en charge pluridisciplinaire. La physiothérapie respiratoire est proposée aux patients souffrant d’affections respiratoires dans le but de gérer la dyspnée, contrôler les symptômes, améliorer la mobilité et la fonction, dégager les voies respiratoires et optimiser la toux. Un nouveau dispositif d’assistance en physiothérapie respiratoire a été développé. Avant de pouvoir le tester chez les patients, une étude sur l’effet du dispositif en utilisation intensive grâce à des données tomodensitométriques thoraciques avant, pendant et après traitement sur un modèle animal sain est nécessaire afin de s’assurer de l’absence de dommage sur le poumon notamment d’atélectasies, qui correspondent à un collapsus du tissu pulmonaire avec perte de volume.

Bénéfices attendus

Ce projet d'étude de la tolérance d'un dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire permettra de s'assurer de l'absence d'effets délétères sur le poumon malgré une utilisation intensive. Les résultats de cette étude permettront de proposer sereinement ce dispositifs aux patients souffrant de pathologies pulmonaires chroniques.

Procédures

Ce projet se déroule sur 5 jours après la semaine d'cclimatation des animaux. Chaque animal sera soumis à 6 sessions de 15 minutes de mise sous dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire avec des acquisitions tomodensitométriques avant, pendant et après l'utilisation du dispositif. Les 6 sessions seront réparties sur 3 jours (à J0, J2 et J4): une session en début de matinée et une en fin d'après-midi pour chaque journée expérimentale. La durée de chaque session sera d'environ 40minutes: 20 min de préparation de l'animal et 15 min de mise sous dispositif.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient survenir sont des lésions pulmonaires dont des atélectasies (collapsus du tissu pulmonaire avec perte de volume respiratoire). L'étude est menée pour s'assurer de leur absence. Les animaux seront imagés avant, pendant et après les sessions de physiothérapie respiratoire, ce paramètre sera évaluer tout au long de l'étude.

Devenir

Tous les animaux du projet (n=5) seront mis à mort à la fin de la procédure. Le prélèvement des poumons est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par les analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer les effets sur le poumon d'un dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques, le recours à l'animal est donc nécessaire pour atteindre cet objectif. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d'avoir des poumons et des bronches de taille comparable à ceux de l'Homme. Le dispositif médical testé ne serait pas compatible avec un animal de plus petite taille.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir des résultats fiables. Les sessions d'assistance respiratoire seront de 6 par animal, ce qui permettra d'avoir 30 sessions au total. La plupart des analyses dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 30 permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle et de l'effet de répétition sur chaque individu.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. L'acclimatation des animaux sera d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles sont enregistrés et permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Des controles biquotidiens en postopératoire sur toute la durée de la procédure (5 jours) seront réalisés par une personne compétente avec évaluation du bien-être et de la douleur. L'évolution du score permet de noter l'amélioration ou l'aggravation de l'état de l'animal et de prendre des mesures appropriées (points limites). Chaque paramètre est ainsi quantifiable, les scores sont additionnés et l'atteinte d'un score supérieur ou égal à 6 définit un point limite et engendre la sortie de l'animal du programme et sa mise à mort après consultation du vétérinaire référent si nécessaire. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques, le recours à l'animal est donc nécessaire pour atteindre cet objectif. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d'avoir des poumons et des bronches de taille comparable à ceux de l'Homme. Le dispositif médical testé ne serait pas compatible avec un animal de plus petite taille. De plus, l'anatomie et la physiologie de l'appareil respiratoire du Porc présentent de grandes similitudes avec l'Homme.

400 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ trois quarts conservés comme reproducteurs et le reste tué faute de porter la mutation recherchée. Le porteur crée six lignées transgéniques et mutantes pour étudier la formation du système olfactif à partir des embryons, prélevés avant cinq jours de développement. Il indique que les formes homozygotes peuvent provoquer stérilité, stress et agressivité, et prévoit de ne maintenir que des adultes hétérozygotes pour éviter ces atteintes. Sur le remplacement, il décrit des modèles mathématiques en développement mais conclut qu'une approche in vivo sur un vertébré reste "nécessaire".

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et morphométriques gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 6 Lignées pour ce projet : A. 2 lignées transgéniques : Tg(fa2h::eGFP) et Tg(8.4neurog1::nls-EOS) pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et B. 4 lignées mutantes : pitx3 , f11r.1, fa2h et oclna pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, des enzymes et pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques (maladie de Parkinson et développement du cristallin).

Procédures

Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques et mutantes à l'état hétérozygote. Cependant, nous pouvons anticiper que pour les lignées mutantes le développement des placodes craniales antérieures (cristallin, adénohypophyse et olfaction) soit perturbé. Les données bibliographiques de mutants qui perturbent le développement de l'adénohypophyse, du cristallin et de l'olfaction peuvent indiquer des effets indésirables chez les adultes homozygotes : risques de stérilité, de stress et d’agressivité. Il est important de noter que chez le poisson zèbre, ces pathologies se développent lorsque la mutation est présente à l'état homozygote et que nous maintiendrons les lignées avec des adultes hétérozygotes dans ce projet.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs. Les autres qui ne portent pas l'évébement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRIPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement dans notre projet des méthodes d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendte la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif. La perturbation de ces processus peut conduire chez l’homme à de nombreuses pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré, comme le poisson zèbre est donc nécessaire à la compréhension de ces processus dynamiques et complexes. Dans ce projet, nous générerons des poissons zèbres transgéniques ou mutants qui seront utilisés adultes à des fins reproductives.

3 328 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes puis leur greffe, pour chaque patient, ses cellules immunitaires et sa tumeur, afin de constituer des cohortes dites "avatars" servant à tester des traitements. Il indique que l'injection de cellules humaines provoque invariablement une réaction contre les cellules de la souris, avec perte de poids, de poils et de mobilité sur un à deux mois, les animaux étant mis à mort à un stade avancé pour récupérer les tumeurs. Sur la réduction, il se contente d'écrire que le nombre d'animaux "sera à évaluer au cours des expériences", justification sommaire pour un effectif de plus de trois mille souris.

Objectifs

Il est proposé d’utiliser un modèle de souris immunodéficiente afin de constituer, pour chaque patient atteint d’une tumeur, une cohorte de souris doublement humanisée/greffée (système immunitaire et tumeur) qui sera utilisée pour évaluer l’activité de thérapies, dans un délai compatible avec les contraintes cliniques, typiquement 1 mois. Les souris présentent des mutations entrainant une déficience en cellules immunitaires murines. Ces souris ont montré être des bons modèles de greffe de cellules tumorales humaines ainsi qu’un bon réservoir pour une reconstitution de système immunitaire humain. La mise en place d’une cohorte de souris porteuse de tumeur dérivée de patient (PDX) est un projet ambitieux à forte valeur ajoutée pour la recherche sur les cancers permettant d’évaluer l’activité des traitements les ciblant. Ces souris sont greffées avec des fragments de tumeur fraiche et la tumeur peut se développer dans l’environnement murin en absence de système immunitaire pouvant le reconnaitre comme étranger. Cependant, des obstacles sont présents pour optimiser l’établissement de cette cohorte : taux de prise de greffe des PDX très faible et/ou variable, temps avant apparition de la PDX (plusieurs semaines, voire mois), instabilité génétique amplifiée au cours des passages successifs des PDX dans une souris à l’autre et absence d’un système immunitaire autologue. Afin de palier à ces obstacles, les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) du patient ainsi que des fragments tumoraux, du même patient seront greffés, dans les souris sans passer par l’étape d’établissement d’une tumeur macroscopique de type PDX classique. La détection précoce de ces cellules, par les techniques d’imagerie, permettrait d’évaluer l’efficacité des traitements afin de comprendre notamment les mécanismes de résistance mais aussi d’évaluer le traitement le plus efficace parmi le choix possible actuellement et dans un futur proche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer la pertinence et la corrélation clinique des réponses aux traitements chez le patient au regard de de la réponse observable dans la cohorte avatar aux patients. En cas, de corrélation positive, cela permettre d’obtenir une preuve de concept de la pertinence d’une méthodologie comme outil de diagnostic afin de proposer aux cliniciens le traitement le plus adéquat pour chaque patient, dans des contraintes temporelles acceptables pour les cliniciens et les patients.

Procédures

Injection de thérapie deux à trois fois par semaine sur animaux vigiles ou endormis, chaque injection demande une contention de 15 à 30 secondes ; Echographie une à deux fois par semaine sur animaux endormis, le temps d'acquisition par échographie (et donc de l'anesthésie) est compris entre 10 et 20 min par souris ; Prélèvement de sang une fois au cours de la procédure sur animaux endormis, le prélévement dure entre 15 et 30 secondes (l'anesthésie environ 3 minutes). La durée pendant laquelle les animaux subiront ces interventions sera de 5 semaines à 2 mois.

Impact sur les animaux

L’injection de PBMC humain dans une souris immunodéficiente entraine, invariablement, une réaction des cellules immunitaires humaines injectées contre les cellules murines reconnues comme étant étrangères. Cette réaction entraine une perte de poids des animaux, une perte de poil et une perte de mobilité des animaux dans un délai pouvant aller d’un mois à deux mois. A un stade avancé de la maladie, les animaux doivent être sacrifiés. Aucun autre effet indésirable n’est attendu notamment par l’injection des traitements.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort car les tumeurs doivent être récupérées

Remplacement

Les méthodes actuelles permettant d’évaluer l’efficacité de thérapie personnalisé sont inefficaces, actuellement, par absence de biomarqueur fiable, permettant de choisir le traitement le plus adapté à chaque patient.

Réduction

Le nombre de souris par groupe de traitement est évalué, en fonction de la variabilité des modèles animaux. Ce nombre sera à évaluer au cours des expériences en fonction de cette variabilité.

Raffinement

Le raffinement de l’étude est : surveiller les animaux pour l’apparition de la réaction immunitaire des cellules immunitaires humaines injectées vis-à-vis des cellules murines de l’hôte qui sera monitoré deux fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont les seules modèles animaux correctement validés ayant montrés une prise de greffe de tumeurs humaines et de système immunitaire humain. Les animaux seront des adultes à partir de 6 semaines, stade qui a montré de bons résultats pour prise de greffe tumorale et immunitaire.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes et leur greffe des cellules tumorales marquées par fluorescence, par injection sous-cutanée ou intraveineuse, pour suivre la croissance des tumeurs et leur capacité à métastaser. Il indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements, que la peau peut s'ulcérer en provoquant une douleur modérée et que des métastases au foie ou aux poumons peuvent dégrader l'état des animaux, tous mis à mort en fin de procédure. Il affirme que ces cellules doivent être implantées dans un "organisme entier" et que le modèle souris est "nécessaire".

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences de suivi de pousse tumorale chez la souris immunodéficiente à partir de cellules cancéreuses modifiées pour qu'elles expriment plus ou moins une protéine au niveau de leur noyau. La quantité présente de cette protéine dans les cellules jouerait un rôle dans le comportement des cellules cancéreuses. Ces cellules cancéreuses seront également marquées par fluorescence en fonction de la quantité de la protéine exprimée. Ainsi cette fluorescence nous permettra de visualiser les différents types de cellules cancéreuse et d'observer leur évolution dans les tumeurs. Nous nous intéresserons à la corrélation entre le type de cellules retrouvées dans les tumeurs, la vitesse de croissance des tumeurs et l'agressivité des cellules cancéreuses à travers leur capacité à métastaser.

Bénéfices attendus

Nous serons en mesure d’analyser l'impact du niveau d’expression de TRa1 sur la croissance des tumeurs. Nous pourrons étudier si ce niveau d'expression module la capacité de croissance, de migration ou de mort cellulaire ainsi que l’agressivité du développement tumoral. A terme, une meilleure compréhension des mécanismes du développement des cancers permettra de mieux adapter les traitements et/ou d'envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris du projet seront greffées avec des cellules tumorales marquées par fluorescence, soit par injection ou implantation sous-cutanée soit par injection intra-veineuse. Ces greffes se dérouleront sous anesthésie, l'opération ne durant que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris immunodéprimées. Ces animaux, par leur système immunitaire défaillant, sont hébergés dans une pièce dédiée avec toutes les barrières sanitaires permettant de garantir leur bon état de santé pendant toute la durée de leur vie. Les souris subiront chacune une unique injection ou implantation de cellules tumorales. Les souris seront donc amenées à développer des tumeurs. Ces tumeurs pourraient éventuellement les gêner dans leurs déplacements. Si la peau venait à s’ulcérer au niveau d’une tumeur, cela provoquerait une douleur modérée à l’animal. Des métastases pourraient également apparaître, notamment sur le foie ou dans les poumons. L’état des souris pourraient alors se dégrader : amaigrissement, difficultés à respirer, troubles moteurs… Il y a 3 types possible d’injection dans ce projet ; une injection sous-cutanée au niveau du flanc, une injection intra-veineuse à la veine de la queue et une implantation sous-cutanée.

Devenir

Tous les animaux, des souris, seront mis à mort en fin de procédure. En effet, ils développeront des tumeurs sur le flanc et potentiellement des métastases. De plus, des analyses doivent être menées sur plusieurs de leurs tissus afin d'étudier la distribution des différents types cellulaires dans les tumeurs et d'analyses les organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité de plusieurs types de cellules cancéreuses à former des tumeurs et à métastaser. Pour cela, ces cellules doivent être implantées dans un organisme entier afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles elles se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet est de 90 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet. Nous mesurerons pour chaque animal engagé le nombre de tumeurs primaires et métastases ainsi que leur taille.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin d'identifier au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. De plus, les procédures se feront sous anesthésie générale. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant toute la durée de l'anesthésie. Une couverture analgésique est mise en place afin de prendre en charge toute douleur potentielle qu'impliquerait l'implantation des cellules tumorales. Un développement tumoral est attendu, un suivi de poids et de taille des tumeurs sera réalisé 3 fois par semaine. Des points limite qui auront pour effet l'arrêt de la procédure ont été déterminés.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (inflammation et cancer du côlon). Nous avons l'expertise au laboratoire sur ce modèle animal et nos données précédentes sur le rôle de TRa1 dans des études in vivo ont été générées chez la souris. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. En effet, dans notre projet, les études de pousse tumorale ne peuvent se faire que dans des organismes complets prenant en compte l’influence de la physiologie de l’animal et du microenvironnement. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte jeune.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules tumorales directement dans le pancréas, ce qui provoque un adénocarcinome, puis les euthanasie cinq semaines plus tard alors que toutes ont développé un cancer avancé. Il indique que ce stade terminal, marqué par une ascite et des changements de comportement, entraînerait une grande souffrance si la mort n'était pas donnée, une grille de score pouvant avancer la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la relation entre système immunitaire et tumeur.

Objectifs

Cette étude permettra de déterminer le rôle exact du TNFR2 sur l’activation du système immunitaire au sein du microenvironnement tumoral et ainsi en voir l'effet sur la croissance tumorale. Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle pour la détermination des meilleurs protocoles de traitement des tumeurs du pancréas.

Bénéfices attendus

Le TNFR2 participe à l'activation et au maintien de l'activité des lymphocytes T régulateurs. Son absence permettrait de diminuer, voir d'abroger, l'inhibition de la réponse immunitaire antitumorale au sein du micro-envonnement immunitaire. Le bénéfice potentiel est que la réponse immunitaire anti-tumorale soit plus efficace, et permette un ralentissement, voir un arrêt de la croissance tumorale.

Procédures

Il n'y a qu'une intervention effectuée. Les animaux vont subir une opération chirurgicale afin d'effectuer une greffe orthotopique. Ce type de greffe vise à introduire des cellules au sein d’un tissu de même nature. Ainsi les cellules tumorales pancréatiques sont directement injectées dans le pancréas. Cette intervention dure 5 minutes sur un animal sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Cette intervention est accompagnée par l'administration d'analgésiques, Rimadyl et Vetergesic, ceci le jour (Rimadyl et Vetergesic) et le lendemain (Vetergesic) de l'opération. Cette administration est faite par injections intra-péritonéales pour le Rimadyl et en sous-cutanée pour le Vetergesic.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales dans le pancréas va générer l'apparition d'un adénocarinome pancréatique canalaire. Les animaux ont dans les stades terminaux de l'expérimention une déficience pancréatique associée à diiférents autres symptômes (apparition d'ascites, changements comportementaux,...). Les symptômes sont bien sur suivis via une grille de suivi, nous servant à dertiminer quand le point limite de l'expérimentation est atteint.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par dislocation cervicale (ou par asphyxie au dioxyde de carbone le cas échéant), 5 semaines après la greffe des cellules tumorales. A cette date, la mort est donnée car l'ensemble des animaux a developpé un cancer du pancréas avancé. Ce stade peut entrainer une grande souffrance dans les jours qui suivent si la mort n'est pas donnée. Il s'agit d'un point limite de la procédure. Cependant les souris peuvent être sacrifiées avant suivant la grille de suivi de souffrances décrite auparavant et rattachée en annexe 2. En effet si le score de souffrance atteint 4 avant la ciquième semaine, la ou les souris sont mises à mort.

Remplacement

Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la relation entre le systeme immunitaire et la tumeur, notamment à cause de differents types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas des modèles experimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la meilleure solution pour étudier l’effet de l’absence du TNFR2 sur les cellules immunitaires, nous ne pouvons donc pas élaborer une stratégie de remplacement efficace.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient signifiants. Ce nombre, impliquant les 2 groupes, est estimé à 40 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans ce cadre. Ce calcul est détaillé sur un document rattaché à ce projet nommé annexe 1

Raffinement

Pour les strategie de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques de notre modèle. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille qu’à partir du jour 10 après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille n’apparaissent qu’à partir du jour 18 après la greffe tumorale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort. Nous donnons également deux produits analgésiques différents, dispensés avant, pendant et après l’opération pour réduire au maximum la souffrance physique

Choix des espèces

La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer du pancréas décrit dans la littérature, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’homme. De plus les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires important qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation impliquées. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et donc présentent une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 8-10 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.

28 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur pratique sur chacun une chirurgie d'une heure, avec dissection des vaisseaux fémoraux et implantation d'un greffon osseux entouré de membrane amniotique dans une poche sous-cutanée, pour tester une méthode de régénération osseuse. Le champ structuré du résumé indique les 28 lapins comme retournés à l'élevage, mais la justification écrite précise qu'ils subissent tous une euthanasie par injection intracardiaque en raison des douleurs et gênes motrices attendues, ce qui confirme leur mise à mort. Il affirme que le projet "ne peut être remplacé" par un modèle in vitro faute d'axe vasculaire fonctionnel.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses peuvent résulter de : -traumatisme, résection tumorale, infection, malformation. Le choix des reconstructions dépend de : -la taille de la perte de substance -état du site receveur (infection, irradiation) -perte de tissus mous associée -état général du patient. Ces paramètres déterminent des techniques de reconstruction de complexité variable. Les reconstructions par autogreffe présentent plusieurs avantages : ostéo-conduction, ostéo-induction et ostéogénèse(en cas de greffe vascularisée) avec une ostéo-intégration plus rapide permettant le retour à une fonctionnalité plus rapide. Cependant les inconvénients ne sont pas négligeables avec la quantité limitée d’os à prélever, les morbidités liées au site donneur (cicatrice, infection, douleur, fracture) et l’ostéo-intégration plus longue lors d’autogreffe non vascularisée. Ces inconvénients amènent à l’utilisation de substituts osseux synthétiques. Ces substituts ostéoconducteurs, ne sont pas ostéo-inducteurs ni ostéogéniques par apport nutritionnel sanguin insuffisant. Leur intégration plus lente favorise les échecs. Le greffon idéal doit donc combiner les avantages d’une autogreffe vascularisée en limitant les inconvénients. Les progrès de l'ingénierie tissulaire font des thérapies cellulaires une solution potentielle pour la régénération des tissus. Trois éléments lui sont essentiels: -le type d’échafaudage -les facteurs bioactifs -les cellules souches. L’enjeu est de trouver une combinaison optimale. Son application aux tissus osseux pourrait permettre d’obtenir une nouvelle méthode de traitement. Parmi les facteurs bioactifs, on trouve la membrane amniotique qui est une matrice extracellulaire acellulaire, non immunogène, biodégradable. Elle est fréquemment utilisée sur la surface oculaire pour améliorer sa régénération par ses propriétés cicatrisantes, antibactériennes et anti-inflammatoires. Malgré un potentiel de différenciation des cellules souches le long de la lignée ostéogénique, son application dans l’ingénierie osseuse a été peu étudiée. Notamment en association avec de l’os de banque. La problématique est : l’association d’un os de banque, d’une vascularisation et d’une membrane amniotique peut-il donner naissance à une régénération osseuse comportant une partie minérale et cellulaire ? Le but est d’obtenir un os ayant les caractéristiques les plus proches d’un os natif. Cela augmenterait le taux de succès des reconstructions osseuses en conditions difficiles

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de simplifier et/ou d’améliorer les réparations des pertes de substance osseuse dans les cas complexes ou chez les patients fragiles. Les avantages de cette technique sont: la facilité d’accès et l’abondance de l’os de banque et des membranes amniotiques, la limitation des comorbidités liées au site donneur et la limitation théorique des risques d'échec par une ostéointégration plus rapide. Les résultats attendus sont : - l’obtention d’un greffon osseux colonisé par des cellules osseuses - l’obtention d’un greffon vascularisé par angiogenèse à partir de la vascularisation axiale - le choix du greffon et la période optimale d’utilisation du greffon (J30, J60, J90 ou 120)

Procédures

Les animaux subiront une intervention sous anesthésie générale qui durera 1h. Tout d’abord une prémédication par Midazolam (0.5-1mg/kg) et Morphine (1-2mg/kg) intra-musculaire sera réalisée. Après 10 minutes de délai l’anesthésie générale sera réalisée en intra-musculaire par un mélange de Kétamine (25-50mg/kg) et Xylazine (5mg/kg). L’anesthésie générale sera complétée par une anesthésie locale de Lidocaïne (0,2mL/kg) au niveau de la cuisse. Le lapin sera placé en décubitus dorsal, rasé et désinfecté au niveau de la face supéro-interne de la cuisse gauche ou droite. Les conditions d’asepsie seront respectées (badigeon de bétadine dermique au niveau de la cuisse puis champage stérile). Une incision cutanée d’environ 3 cm de long du point médian de l'aine en direction du genou sera réalisée d’un côté. Après dissection aux ciseaux l'artère et la veine fémorale seront exposées sur 20mm de long. Une hémostase rigoureuse sera effectuée. L’artère et la veine seront enveloppées d'une HAM cryoconservée, puis insérées dans le cylindre de substitut osseux grâce à une fente longitudinale. L’ensemble ainsi décrit sera enfin enveloppé avec une seconde HAM cryoconservée. Chaque greffon (substitut osseux/HAM) sera dissimulé dans une poche sous-cutanée afin d’éviter une gêne fonctionnelle motrice. Le site opératoire sera suturé en 2 plans: un plan sous cutané puis un plan cutané. Une antibioprophylaxie intramusculaire par Duplocilline (0,3mL/kg) administrée en fin d’intervention, couvrira l’animal pendant 4 jours. Le traitement antalgique post-opératoire comprendra des AINS (Méloxicam 1mg/kg) toutes les 12h en per os pendant 5 jours. Il pourra être associé à une dose de Buprénorphine (0.05mg/kg) sous-cutané toutes les 8h pendant les 48 premières heures. En cas de non contrôle de la douleur, la Buprénorphine sera remplacée par de la Morphine (1-2mg/kg)La douleur sera régulièrement évaluée selon une échelle d’évaluation de la douleur comprenant 3 catégories : appréciation globale subjective évalué de 0 (pas de douleur) à 3 (douleur intense) observation à distance comprenant le niveau d’activité le comportement la posture au repos l’apparence et l’alimentation une réaction à la manipulation comprenant le mouvement à la sollicitation et la manipulation de la zone douloureuse Chaque sous catégorie sera évaluée de 0 à 3, un score de 1 à 7douleur légère de 8 à 14 modérée et 15 à 22 sévère. Le traitement antalgique sera instauré en fonction de la douleur

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont : - douleurs mécaniques : douleur rythmée par les mouvements et s’atténuant au repos - gène motrice - infection (désunion de la cicatrice, écoulement purulent, sepsis) - complications hémorragiques - allergie ou effet indésirable à certains produits médicamenteux - décès précoce de l’animal

Devenir

A l’issue de la procédure les lapins subiront une euthanasie par injection intracardiaque d’euthasol (pentobarbital) du fait de la procédure chirurgicale importante pouvant impliquer des douleurs et gènes motrices ultérieures.

Remplacement

Ce projet expérimental ne peut être remplacé par un modèle in vitro puisqu’un axe vasculaire avec un débit sanguin est nécessaire.

Réduction

Ce protocole expérimental n’a jamais été effectué et paraît indispensable à réaliser pour prouver son objectif. 24 lapins sont nécessaires pour apporter une preuve expérimentale. Augmenter ce chiffre n’apporterait aucun avantage scientifique. Le diminuer ne nous permettrait d’apporter aucune preuve scientifique supplémentaire. Le protocole d’anesthésie générale a déjà été effectué chez des lapins et a montré son efficacité avec un bon contrôle de leur analgésie.

Raffinement

Nous avons choisi le lapin en prenant en compte l’état actuel des connaissances. Ils proviendront d’un système d’élevage au sein même du laboratoire (aucun transport ne sera effectué). L’hébergement ainsi que le personnel sera le même de leur naissance jusqu’à leur mort (cage spacieuse, propre) afin d’augmenter autant que possible leur bien-être. Ils seront de même habitués à la présence humaine et au portage. La planification du protocole nous permet d'évaluer et d’éviter de potentiels obstacles. Pendant le protocole des soins pré, per et post opératoires adéquats seront instaurés. Le recours à l’anesthésie générale est nécessaire compte tenu de l’intervention chirurgicale importante. Une procédure d’euthanasie appropriée sera utilisée en cas souffrance, sepsis non contrôlés ou d’éventuelle situation entrainant une souffrance animale incontrôlable.

Choix des espèces

Nous utiliserons des lapins car c’est l’animal le plus utilisé dans l’étude de l’ingénierie tissulaire osseuse dans la littérature: cela nous permettra de comparer nos résultats avec ceux des travaux disponibles. De plus c’est un animal de moyenne corpulence, où il est possible de disséquer un axe vasculaire de taille convenable. La corpulence des lapins nous permettra aussi d’introduire un substitut osseux de taille adéquate pour les analyses anatomopathologiques tout en minimisant leur gêne fonctionnelle motrice. La génération osseuse est comparable chez le lapin et chez l’homme, ce qui permettra de transposer les résultats obtenus chez l’homme. La population cible pour la reconstruction osseuse est une population adulte. Nous avons besoin d’étudier la régénération osseuse sur un os mature. Nous utiliserons donc des lapins adultes de 16 semaines, ayant un poids d’environ 2.5-3 kg.

20 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur pose un cathéter dans la veine jugulaire par chirurgie sous anesthésie, puis pratique des gavages et des prélèvements sanguins répétés, pour mesurer la concentration sanguine d'une association d'antibiotiques et en optimiser la posologie en élevage porcin. Il précise que dix animaux proviennent d'une étude précédente et que chaque porc est mis à mort après trois semaines pour prélever muscle, foie et reins. Il affirme qu'aucune alternative non animale ne reproduit la cinétique plasmatique avec sa variabilité, préalable qu'il juge "indispensable".

Objectifs

L'association d'antibiotiques sulfamides/triméthoprime est classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Le ratio de doses sulfamides/triméthoprime dans la quasi-totalité des spécialités vétérinaires mises sur le marché est de 5:1. Or, ce ratio n’a pas été établi à partir de données animales, mais est une transposition directe du ratio correspondant à l’association sulfaméthoxazole/ triméthoprime (SDMX/TMP) utilisée chez l’Homme. Un biais majeur de cette transposition réside dans le fait que les vitesses d’élimination des sulfamides (illustrées par leurs temps de demi-vie plasmatiques, t1/2) peuvent être très variables selon l’espèce animale. Chez l’Homme, le SDMX et le triméthoprime ont des t1/2 assez proches, permettant de maintenir un rapport de concentrations entre les deux antibiotiques constant au cours du temps et de conserver ainsi l’effet synergique entre eux. A l’inverse, chez les animaux de rente par exemple, certains sulfamides ont des t1/2 beaucoup plus longs que celui du triméthoprime. Les sulfamides seront alors présents beaucoup plus longtemps chez l’animal, d’où une perte probable de l’effet synergique recherché et par voie de conséquence de l’efficacité de l’association. L’ensemble de ces facteurs questionne la pertinence du ratio 5:1 des formulations vétérinaires, mais aussi les posologies recommandées (doses et/ou intervalles d’administration). L’objectif principal de cette procédure expérimentale est de générer des données pharmacocinétiques (= suivi des concentrations sanguines au cours du temps) in vivo de l’association sulfadiazine(SDZ)/TMP et de SDMX/TMP chez le porc pour contribuer, par la suite, à déterminer les modalités optimales d’administration de SDZ/TMP et de SDMX/TMP par une approche de modélisation pharmacocinetique/pharmacodynamique (PKPD) (= technique permettant de relier les concentrations sanguines et l'effet observé qui est la diminution des bactéries pathogènes). Les deux sulfamides ont été sélectionnés en raison de leur différence pharmacocinétique majeure, avec un sulfamide à courte durée d’action (SDZ) et un sulfamide à longue durée d’action (SDMX). Le porc a été choisi car c’est l’une des filières les plus utilisatrices de cette association d’antibiotiques (en termes de tonnage et d’exposition).

Bénéfices attendus

La promotion de solutions thérapeutiques à base d’associations – entre antibiotiques ou entre antibiotiques et nonantibiotiques – tient une place importante dans les stratégies de lutte contre l’antibiorésistance. Lorsqu’elles associent 2 antibiotiques, ces solutions doivent viser à limiter l’émergence de résistances et non à élargir le spectre d’activité. Les formulations associant le TMP avec un sulfamide peuvent entrer dans la première catégorie, ce qui en fait une exception « vertueuse » parmi les associations disponibles en médecine vétérinaire dont la plupart ont été développées avec un objectif d’élargissement du spectre. Malheureusement, les formulations TMP/sulfamides destinées aux animaux ont été développées par transfert « aveugle » des données de la médecine humaine relatives à l’établissement d’une synergie, sans tenir compte des spécificités des espèces animales, ou des bactéries pathogènes. En outre, les données pharmacocinétiques et les études cliniques requises au moment des dépôts de demande d’autorisation de mise sur le marché (AMM) dans les années 1990 étaient minimes. Aussi, une analyse pharmacocinétique (PK) complète incluant des études pharmacocinétiques chez les espèces cibles (objectif de ce projet avec le porc) et des études pharmacodynamiques (PD) d’efficacité in vitro sur des bactéries pathogènes d’intérêt vétérinaire (futur projet) permettra de proposer de nouveaux ratios de doses et/ou de nouvelles posologies en s’appuyant sur les approches les plus modernes de la pharmacologie des antibiotiques (modèles in vitro, pharmacocinétique de population, modélisation PK/PD).

Procédures

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe grâce à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale d'une durée moyenne d'1h30 . Cet acte chirurgical peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Il est prévu l'acquisition d'un échographe afin de permettre le placement du cathéter central de façon écho-guidée, permettant ainsi de réduire la durée de l'intervention chirurgicale (de 1h 30 à 45 minutes par animaux) et de minimiser le risque infectieux (acte moins invasif). Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores, sans contention particulière et réalisé en moins d'une minute. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme (2 gavages par animal au total espacés de 10 jours au minimum) mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (entre 3 et 4 minutes)

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé de façon chirurgicale au niveau de la jugulaire externe. Cet acte chirurgicale est source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores. Le plus gros stress se fera lors des gavages qui nécessitent une contention ferme (2 gavages par animal au total) mais La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux.

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issue des 3 semaines d’expérimentation dans des conditions éthiques, et les tissus d’intérêt (muscle, foie reins) seront récoltés pour dosage des antibiotiques.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative non-animale robuste et pertinente actuellement permettant de reproduire la cinétique plasmatique (avec la variabilité inter-individuelle existante) des molécules chez des animaux vivants, préliminaire indispensable à l’approche PKPD.

Réduction

L’utilisation de 5 animaux par groupe (soit 10 au total) est un minimum pour pouvoir correctement estimer la varabilité inter-individuelle des paramètres pharmacocinétiques (clairance, etc) par une approche de population (modèle non-liéaire à effet mixte). En outre, le design en cross-over permet d’utiliser les mêmes animaux entre 2 administrations, en garantissant la fiabilité des données grâce à l’instauration d’un wash-out. Enfin, une fois le modèle PK développé, l’extrapolation à d’autres posologies se fera par des simulations numériques sans l’utilisation d’animaux supplémentaires. Une partie des animaux (n=10) provient d'une étude précédente car il n'a pas été nécéssaire de les mettre à mort, les 10 autres seront achetés.

Raffinement

Les porcs seront hébergés par 2 lors de la phase d'acclimatation (7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d'arrachement. Cependant, les barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle et/ou rouleau et/ou jouets à macher suspendus. Les prises de sang répétées seront effectuées après la pose chirurgicale de cathéters (avec recours à une anesthésie et une analgésie suffisante pour les animaux), permettant ainsi une récolte de sang non-douloureuse et limitant le stress. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat qui sera vérifié régulièrement et changé s'il est trop souillé. Un suivi-post opératoire individuel des animaux sera effectué et une analgésie sera mise en place si nécessaire (AINS +/- analgésique de type morphinique), et le début de la cinétique ne se fera que au minimum 24h après la pose du catéther. La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Cependant, des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible des molécules étudiées Porc sevrés, avant la puberté (~30kg)