Recherche fondamentale

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie locale, avec des prélèvements de sang, pour tester des molécules censées déclencher une mort des cellules cancéreuses reconnue par le système immunitaire. Le porteur décrit une croissance tumorale sous-cutanée dont il qualifie les nuisances de limitées. Il affirme que des tests in vitro existent mais n'évaluent pas la réponse immunitaire mémoire, juge l'animal vivant entier "indispensable", puis met à mort les souris pour prélever rate, ganglions et tumeur.

Objectifs

Le développement des tumeurs dépend fortement de l’interaction entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement, particulièrement avec les cellules immunitaires présentes comme les lymphocytes cytotoxiques. Ces dernières reconnaissent spécifiquement la tumeur via la présentation d’antigènes, qui sont de petites protéines spécifiques à la tumeur. Après avoir été activatés, les lymphocytes cytotoxiques peuvent détecter et détruire la tumeur. Le profil antigénique de la tumeur est donc un point déterminant dans la réponse anti-cancéreuse. Cependant, la présentation antigénique n’est pas suffisante pour produire une réponse immunitaire efficace ; d’autres paramètres sont requis. Les lymphocytes cytoxiques sont activés les cellules dendritiques, or lors de cet échange, des signaux co-stimulateurs sont requis pour finaliser l'activation. Ce paramètre est décrit comme l’adjuvanticité, et l'absence de ces signaux se traduit par l’échappement de la tumeur au près système immunitaire. Dans un contexte tumoral, l’adjuvanticité est décrite, entre autre, par l’émission de motifs moléculaires associés au danger (DAMPs). Ces DAMPs sont des biomolécules sécrétées lors de mort des cellules cancéreuses et causent une réponse inflammatoire locale. La mort cellulaire immunogène (ICD) est définie par l'induction d'un stress aux cellules cancéreuses, et aboutit à la mort de celles-ci, accompagnée de la libération de nombreux DAMPs. Ces DAMPs sont reconnus par les cellules dendritiques et initient une cascade cellulaire aboutissant à l'activation de réponse immunitaire anti-cancéreuse . Plusieurs études ont décrit certaines chimiothérapies et radiothérapies comme inductrices de mort cellulaire immunogène, ce qui renforce leurs effets thérapeutiques. Jusqu'à présent, peu de molécules ont été caractérisées comme inductrices de l’ICD. Or ces agents pourraient être pertinemment utilisés en thérapie combinatoire en oncologie, avec des immunothérapies par exemple, afin de renforcer la réponse immunitaire anti-cancéreuse, et à terme d’améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer la capacité de molécules à induire une vaccination contre 3 modèles tumoraux différents via une induction de la mort cellulaire immunologique. Cette mort cellulaire permet d’engendrer des populations de lymphocytes T spécifiques contre la tumeur. Ainsi les souris seraient vaccinées contre la tumeur étudiée, ce qui serait un bon modèle préclinique en vue de développer des stratégies identiques ou similaires dans l'espèce humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections durant toute la durée de l’expérience. Ces injections se feront après anesthésie locale sur l’un des deux flancs de l’animal, durée 5-10 minute. Du sang pourra être prélevé au niveau sub-mandibulaire après anesthésie sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine pendant la période entre la 1ère et la 2nde injection de cellules), durée: 2-3 minutes.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sur le flanc des souris, en sous-cutanée. Nuisances limitées liées à la présence de cette tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes (rate, ganglions drainants et tumeur) et d'étudier au mieux la réponse immunitaire mémoire mise en place.

Remplacement

Concernant cette étude, il existe des alternatives non-animales comme des tests elternatifs in vitro. Cependant ces alternatives nous permettent seulement de décrire la capacité de nos molécules à induire la mort cellulaire, or il nous est impossible d’évaluer leur capacité à engendrer une population celulaire spécifique. L'utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier la réponse immunitaire mémoire, et une potentielle vaccination complète contre les tumeurs étudiées. En effet, les relations entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires s’effectuent via différents organes, nécessitant toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Les traitements et procédures seront faits après tirage au sort et en aveugle. Afin réduire le nombre d’animaux, seules deux concentrations par molécule seront testées afin d’observer une vaccination in vivo. Ces deux concentrations seront déterminées au préalable via des tests de toxicité in vitro. Les témoins seront regroupés pour éviter la multiplication des groupes témoins lors du test in vivo en faisant toutes ces procédures en parallèle pour chaque modèle tumoral. Les résultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de réduire la douleur chez l’animal : - Les injections seront effectuées après anesthésie locale - Le milieu est enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse . - Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Des points limite ont été définis a priori et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Les modèles de tumeurs existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implatation chez la souris est indispensable pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale dans sa globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines (travaux sur les cancers de l'adulte).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne pendant six semaines, subissent l'ablation chirurgicale d'un rein, puis des prélèvements d'urine en cage à métabolisme et un prélèvement de sang terminal, pour étudier l'atteinte rénale du diabète. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur post-opératoire traitée par analgésiques et que le diabète peut atteindre cœur, reins et rétines. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever et analyser les reins.

Objectifs

Le diabète est la première cause de mise sous dialyse en Europe. L’insuffisance rénale est de sévérité variable au moment de la découverte de la maladie, mais la règle est que la néphropathie diabétique conduit à une altération lente et progressive des unités de filtration du rein, les glomérules. Nous recherchons les stimuli à l’origine des lésions des glomérules induites au cours du diabète. Nous avons identifié récemment un mécanisme de protection des glomérules au cours du diabète, l'autophagie. En recherchant des régulateurs de l'autophagie, nous avons identifié d'autres molécules qui sont impliquées dans une régulation négative de l'autophagie. Nous allons maintenant étudier de façon plus précise le lien entre l'autophagie et ces régulateurs dans le rein, à la fois en contexte normal et en contexte pathologique.

Bénéfices attendus

A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la néphropathie diabétique et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette complication sévère du diabète.

Procédures

Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 6 semaines (20 secondes/ jour). Une procédure chirurgicale: uni-néphrectomie (20 minutes). 6 Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute) .

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets du modèle pathologique de diabète: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes rénales.

Remplacement

Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.

Réduction

Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ avec un risque alpha de 5%, une puissance de 80%, une moyenne du groupe contrôle de 22, une moyenne pertinamment différente attendue de 26 dans le groupe traité, une déviation standard de 3 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 15 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental (pénétrance incomplète de la streptozotocine, mortalité liée à la chirurgie, point limites atteints). Nous optimisons l'utilisation des reins pour les différentes analyses réalisées dessus afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane 2%) avec une analgésie péri-opératoire (bubrénorphine 0,1mg/kg sc).

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité  de nos résultats expérimentaux.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans le tarse et sous la peau de la queue, puis une injection hebdomadaire d'un inhibiteur par voie intrapéritonéale pendant quatre semaines, pour étudier le rôle de l'interféron de type 1 dans le vitiligo. Le porteur indique que l'injection dans le tarse peut provoquer de petites plaies gênant le déplacement de l'animal, tout en affirmant n'avoir jamais observé d'effets indésirables. Les souris sont mises à mort par inhalation de CO2 pour prélever la queue.

Objectifs

Le vitiligo est une pathologie de la peau qui provoque l’apparition de taches blanches de taille plus ou moins importante et peut toucher l’ensemble du corps, y compris le visage. Ces macules blanches sont la résultante d’une altération des mélanocytes de l’épiderme qui sont les cellules responsables de la pigmentation cutanée. Environ 1% de la population mondiale souffre de cette pathologie qui affecte significativement la qualité de vie des patients. A ce jour, aucun traitement efficace et spécifique n’est disponible du fait de la complexité de cette pathologie et dont la compréhension et l’identification de nouvelle cibles thérapeutique reste un enjeu majeur. L’origine de cette pathologie reste à ce jour mal définie mais l’implication de plusieurs facteurs (génétiques, environnementaux ou encore une altération du système immunitaire chez les patients) sont identifiés. Ainsi, concernant le dérèglement du système immunitaire, notre équipe a pu mettre en évidence la présence forte et inhabituelle d’une population de cellules particulières, les lymphocytes T, au niveau de la peau et provenant de la circulation sanguine, chez le malade. L’activation de ces lymphocytes T de la peau va entrainer la forte production de molécules inflammatoires qui vont directement cibler le mélanocyte, et in fine, favoriser la progression de la maladie. Afin de comprendre comment cet excès de lymphocytes T est retrouvé, nous avons pu identifier et proposer l’importance d’un autre type cellulaire, également retrouvé en surnombre dans la peau affectée du malade, les cellules dendritiques plasmacytoides (pDC). En effet, ces pDC vont induire de fort taux d’une molécule inflammatoire. Cette forte production d’IFNa va directement agir et stimuler les autres cellules au niveau de la peau permettant le fort recrutement des lymphocytes T de la circulation sanguine dans la peau. L’activation des pDC et l’impact de la production d’IFNa semble ainsi majeur dans la progression de la maladie et pourrait représenter une cible thérapeutique de choix. Ainsi, l’objectif de l’étude proposée est : 1/ Confirmer les études in vitro sur un modèle in vivo de l’impact de l’IFNa sur la dépigmentation de la peau en évaluant l’efficacité du blocage de IFNAR (souris KO IFNAR). 2/ Etudier le rôle des lymphocytes T de la circulation dans le maintien de la maladie en déplétant ces derniers chez la souris.

Bénéfices attendus

Cette maladie ne dispose pas à ce jour de traitement efficace et il paraît important de tester de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Injections au nombre de 2 au niveau du tarse de la souris et 2 en sous cutanée au niveau de la queue, puis une injection de l'inhibiteur de S1P1 par semaine en intra peritoneal pendant 4 semaines. Les interventions sont rapides de l'ordre de 30 seconde maximum par souris. Nous ne mettons pas en tube les souris pour être plus rapide nous effectuons la procédure avec deux expérimentateurs. L’un contentionne la souris pendant que l’autre expérimentateur injecte ainsi nous évitons un stress de la souris et gagnons en terme de temps de manipulation de l’animal.

Impact sur les animaux

L'injection dans le tarse peut éventuellement provoquer de petites plaie au site d'injection ce qui peut restreindre le déplacement de la souris . Nous n'avons cependant jamais observé d'effets indésirables avec ce type d'injection.

Devenir

Mise à mort par inhalation de CO2, on prélévera la queue pour des immunofluorescences et de la cytométrie en flux pour regarder les populations cellulaires

Remplacement

Des tests in vitro sur un modèle d'épiderme 3D ont été effectués montrant l'implication de l'IFNAR sur le détachement des mélanocytes pouvant engendrer une dépigmentation.Il n’existe malheureusement à ce jour aucun système de co-culture in vitro reconstituant l’ensemble des réponses cellulaires impliquées dans la dépigmentation de la peau. Cependant, le modèle de souris nous permet d'avoir des conditions physiologiques intactes primordiales dans l'étude de la dépigmentation lier à un déréglement immunitaire. Le modèle in vivo de souris est donc une étape essentielle pour évaluer 1/l’interféron type 1 dans l’initiation de la dépigmentation associée au vitiligo et 2/l’efficacité de l’inhibition du recrutement des lymphocytes circulants dans la peau dans la repigmentation.

Réduction

Pour réduire à maximum le nombre de nos souris, nous allons dans un premier temps valider la dépigmentation de ces souris puis nous passerons à la procédure 2 de déplétion des lymphocytes T. La procédure est déjà validée sur des souris Wild Type par le laboratoire, nous devons donc nous assurer qu’elle fonctionne également sur les souris de génotype KO IFNAR.

Raffinement

Le poids, le développement d’un érythème au niveau de la zone d’injection et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement au cours de la procédure. Les animaux seront hébergés à raison de 5 souris/cage dans un environnement propice à leur bien-être (litière en copeaux de peuplier, tunnels en polycarbonate). Si un impact environnemental est observé (bagarre des mâles entre eux, signes de stéréotypie, prostration, isolement d’un animal...), l’animal sera soigné et mis en isolement. -En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie : l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al. (Lab Animal 1998). Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al. Dont le score peut atteindre 20. Le score limite que l’on se fixe est de 14. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63CE, le classement de la procédure 1 et 2 sont modérées.

Choix des espèces

Nous avons choisi les souris sauvages C57BL/6J sur lesquelles le modèle de dépigmentation a déjà été validé par notre équipe, et des souris transgéniques B6(Cg)-Ifnar1tm1.2Ees/J (IFNARKO) qui n’expriment pas la sous-unité 1 du récepteur de l’interféron type 1. Cette souche de souris mutante est utile dans les études sur la pigmentation et dans les pathologies auto-immunes dépendantes de la voie de signalisation JAK-STAT, voie impliquée dans la signalisation des interférons type 1 (notamment interféron alpha et béta). Nous débutons l’expérimentation à 5 semaines pour ce modèle animal ainsi nous évitons un biais en utilisant des souris jeunes dont le système immunitaire n’est pas altéré.

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une administration unique d'un produit test par voie orale ou rectale, puis subissent des prélèvements de sang par ponction jugulaire et intracardiaque et sont placés en cage à métabolisme pour recueillir leurs fèces. À la fin, les 12 rats sont mis à mort pour prélever foie, reins et cerveau. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang au niveau de l'"organisme entier" et juge le recours au rat entier "indispensable", sans qu'aucune analyse statistique n'appuie l'effectif.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'un produit test aprés une simple administration orale ou rectale chez le rat à la dose de 0.5 mg/kg.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer que le produit test peut s'administrer soit en voie orale soit en voie rectale et de pouvoir comparer les paramètres pharmacocinétiques en comparant les deux voies d'administration.

Procédures

Dans ce projet, il est prévu de faire des administrations rectale et orale sur animal vigile. Ces administrations seront de trés courte durée (durée d'une administration moins d'une minute). Puis des prélèvements sanguins seront réalisés dans le but de suivre la concentration dans le sang de la molécule testée. Ils seront réalisés sur animal anesthésié au préalable, par ponction directe aux veines jugulaires ( ou en intracardiaque dans le cas du prélèvement terminal). La durée d'un prélèvement de sang est de l'ordre de la minute également. Les prélèvements de sang se feront avant administration, puis à 30min, 2h, 3h, 4h et 6h aprés l'administration rectale et avant administration, 30 min, 2h, 3h, 4h et 6h aprés l'administration orale. Le volume de prélèvement sanguin sera d'environ 300 μL par prélèvement soit 1.8mL au maximum. Les prélèvements de sang se feront selon les bonnes pratiques de laboratoires et conformément à la réglementation en vigeur. La durée de la phase animale est de 6h aprés les administrations. Les administrations et les prélèvements de sang seront réalisés par un personnel expérimenté et conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront placés en cage à métabolisme pour une collecte de féces sur une durée de 6h aprés administrations. Les animaux auront un contact visuel entre eux. D'un point de vue scientifique il est necessaire de collecter les fécès pour doser la quantité de principe actif dans les échantillons.

Impact sur les animaux

Le produit test fait partie de la classe thérapeutique infectiologie. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, poils ebouriffés, prostration, site de prélèvement abimés, hématome ou saignement au site d'administration pour la voie rectale...)

Devenir

A la fin de ce projet, les 12 animaux seront euthanasiés aprés le prélèvement sanguin conformément à la réglementation en vigeur et aux bonnes pratiques vétérinaires. Des prélèvements de tissus seront réalisés. Le foie, les reins et le cerveau seront prélevés

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

12 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront réparti en 2 groupes de 6 animaux. Les animaux du groupe 1 seront administrés par voie orale et les animaux du groupe 2 par voie rectale. Aucune approche statistique n'a été réalisée

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés individuellement en cage à métabolisme pour collecter les fécès durant 6 h aprés administration. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, poils ebouriffés, prostration, site de prélèvement abimés , hématome ou saignement au site d'administration pour la voie rectale...) Le vétérinaire désigné ou suppléants toujours présents sur site pourront intevenir rapidement si besoin. Les points limites ou points d'arrêt anticipés sont: - Dégradation marquée de l'état général (ex : détresse respiratoire, décubitus) - Atteintes ou traumatismes à l'origine de douleurs sévères (ex : convulsions, mouvements ou postures anormaux... - Apparence physique dégradée, absence de toilettage (ex : prostration, poil ébouriffé ou souillé, alopécie extensive...) - Changements majeurs de comportements (ex : automutilation, agitation intense...) - Site de prélèvements sanguins trés abîmés, douleurs au niveau des sites de prélèvements - Hématomes ou saignements au niveau du site d'administration pour la voie rectale La contention des animaux sera faite par du personnel expérimenté pour éviter toute mauvaise manipulation de l'animal. Evaluation quotidienne de l'état de santé général de l'animal pour une détection précoce des signes cliniques anormaux.

Choix des espèces

Le rat, Sprague Dawley est l'espèce utilisée dans ce type d'étude. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques dans le domaine de l'infectiologie. Adultes. Rat d'environ 200-250g

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une xénogreffe de tumeur dans le pancréas par chirurgie, parfois une seconde chirurgie d'exérèse, puis des injections de nanoparticules magnétiques, une exposition à des champs magnétiques et une irradiation, pour tester une destruction locale des tumeurs. Le porteur renvoie les retombées cliniques annoncées, sensibiliser des cancers résistants et abaisser les doses de chimiothérapie, au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que la validation in vitro déjà obtenue doit maintenant passer par la souris, sans détailler d'alternative.

Objectifs

Les objectifs de cette étude consistent à analyser l’effet anti-tumoral de nanothérapies par ablation mécanique ou hyperthermie magnétique locales, consistant en l’injection de nanoparticules magnétiques suivie d’une application de champ magnétique alternatif à basse fréquence [amplitude 1 à 380 mT / Fréquence 0 à 20 Hz] ou haute fréquence [amplitude 1-50 mT, fréquence 100 à 350 kHz] en association ou non avec des agents chimiothérapeutiques, pharmacologiques ou un traitement radiothérapeutique.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur les nanothérapies pour des cancers incurables pour lesquels la clinique ne dispose pas ou peu de solutions thérapeutiques, tels que le cancer du pancréas. Ces stratégies nano-thérapeutiques pourront être associées aux traitements conventionnels (chimiothérapeutiques et radiothérapeutiques) et devraient sensibiliser ces tumeurs très résistantes à ces traitements. Les stratégies nanothérapeutiques pourraient également permettre d’abaisser la dose des traitements conventionnels (chimiothérapie, radiothérapie), réduisant ainsi leurs effets indésirables.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à une procédure chirurgicale permettant de réaliser des xénogreffes orthotopiques (intra-pancréatiques principalement, durée 15 minutes). Une seconde procédure chirurgicale sera éventuellement envisagée, consistant à l’exérèse de la tumeur principale (durée 30 minutes), antérieurement aux traitements nanothérapeutiques an association ou non avec un traitement chimiothérapeutique, pharmacologique ou radiothérapeutique, afin de mimer les conditions retrouvées en clinique humaine proposant les traitements anti-cancéreux après chirurgie. Les autres interventions consisteront en : 1) l’injection de nanoparticules, d’agents chimiothérapeutiques ou pharmacologiques (durée :

Impact sur les animaux

De nombreuses études in vivo utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer ont été menées et permettront l’utilisation de ces nanoparticules (concentration, mode d’injection…) sont induire de nuisances sur les animaux. Il existe aussi des données sur l’utilisation des champs magnétiques. Ceux-ci peuvent induire quelques effets indésirables (notamment les champs à haute fréquence). Nous prévoyons de limiter les expositions en s’appuyant sur les données de la littérature pour ne pas induire de nuisances ou limiter les effets indésirables : les temps et séquences d’exposition ainsi que les paramètres de champs seront scrupuleusement choisis pour obtenir le meilleur rapport bénéfice/risque. L’implantation de xénogreffes peut engendrer des effets indésirables sur les animaux, ainsi que la chirurgie d’exérèse de ces tumeurs. Les souris ayant subi ces procédures (xénogreffes, chirurgie d’exérèse) sont suivies quotidiennement, pesées au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance, pendant toute la durée de l’étude. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …§points limites) les animaux seraient placés en cage individuelle dans un milieu enrichi et suivis attentivement. Si leur état ne s’améliorait pas, les animaux seraient euthanasiés.

Devenir

Les animaux utlisés dans les procédures 1 à 7 et 10 sont gardés en vie pour réaliser les procédures suivantes. Les animaux utilisés dans les procédures 8 et 9 sont maintenus en vie jsuquà la fin de l'expériences consistant à analyser l'efficacité des traitements sur la croissances tumorales. Les souris seront quotidiennement observées afin d’évaluer le bien-être ou la douleur. Les points limites sont définis ci-dessous : #1 : Perte de poids de 20% par rapport au poids initial #2 : Nécrose ou ulcération des tumeurs cutanées macroscopiquement visible Tumeur cutanée atteignant 2 cm³ #3 : Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après la chirurgie En cas de dépassement des points limites, les animaux seront suivis attentivement pendant quelques jours et, si leur état ne s’améliorent pas, les animaux seront euthanasiés selon la méthode prévue décrite au paragraphe 3.3.3.

Remplacement

Nous avons validé in vitro l’efficacité de stratégies de ciblage des cellules cancéreuses, du microenvironnement ou de la matrice extracellulaire à l’aide de nanoparticules vectorisées. Nous devons maintenant valider l’efficacité de ce ciblage in vivo, afin d’optimiser ces stratégies qui feront l’objet de tests précliniques, notamment pour le dépistage et la thérapie des tumeurs. Nous avons validé que ces nanoparticules constituent in vitro un agent anti-cancéreux efficace : ciblage efficace des cellules d’intérêt, induction de mortalité et arrêt de prolifération des cellules après application d’un champ magnétique... Nous devons maintenant valider que cette efficacité thérapeutique est réelle in vivo, sur des modèles murins de cancer. Cette validation permettra d’optimiser ces stratégies (améliorer la conception de nanoparticules magnétiques, les paramètres de champs magnétiques…) qui pourront faire l’objet de tests précliniques.

Réduction

Les études in vitro ont été menées précédemment de façon approfondie afin d’anticiper au maximum les futurs résultats in vivo, de privilégier les orientations scientifiques prometteuses, et limiter le nombre d’animaux qui seront utilisées pour valider les stratégies thérapeutiques proposées dans le projet. Nous devons maintenant valider que cette efficacité thérapeutique est réelle in vivo, sur des modèles murins de cancer. Cette validation permettra d’optimiser ces stratégies (améliorer la conception de nanoparticules magnétiques, les paramètres de champs magnétiques…). Le retour aux validations in vitro, à chaque étapes-clefs (validation d’une nouvelle association de traitements nanothérapie + nouvel agent chimiothérapeutique, par exemple), seront toujours privilégiées afin de limiter les études in vivo.

Raffinement

Des tests sur un faible nombre d’animaux seront toujours envisagés, autant de fois que nécessaire, afin de définir et d’optimiser les conditions (concentrations en agents thérapeutiques, en nanoparticules, temps et séquences d’exposition aux champs magnétiques…) afin de garantir l’obtention de résultats concluants dans les études pré-cliniques menées.

Choix des espèces

Des données dans la littérature montrent une bonne tolérance des souris au protocole envisagé et la biocompatibilité des nanoparticules utilisées a été validée dans cette espèce. D’autre part, nous avons antérieurement validé que les modèles cellulaires utilisés (lignées tumorales pancréatiques humaines et murines – i.e. MiaPaca2, BxPc3, Panc1, R211…- et lignées de CAFS ou Cancer-associated fibroblasts humains et murins) permettent de réaliser des xénogreffes chez la souris nude ou C57/BL6 dans de bonnes conditions, sans souffrance de l’animal. Jeunes adultes pour les souris xénogréffées : Ce choix se justifie par la réalisation plus facile de la chirurgie chez de jeunes adultes. Jeunes adultes ou adultes pour les souris transgéniques par la nécessité d’attendre le développement d’une tumeur.

352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation du rein gauche puis un clampage du pédicule rénal droit reproduisant l'ischémie-reperfusion de la greffe, avec prélèvements de sang en rétro-orbitaire, avant mise à mort et prélèvement des organes. Le porteur décrit des risques d'hémorragie chirurgicale et une atteinte partielle de la fonction rénale. Il affirme que les méthodes in vitro sont "très limitées" et présente ses lignées de souris transgéniques comme "irremplaçables" pour finaliser une preuve de concept liée à un brevet.

Objectifs

Lors d’une transplantation rénale, des phénomènes liés à l’ischémie (I) et aussi à la reperfusion (R), séquences inhérentes à la transplantation d’organes solides, sont à l’origine de processus physiopathologiques qui vont contribuer aux lésions du greffon et au rejet de greffe. L’ischémie correspond à la phase où l’organe du donneur est isolé de la circulation sanguine et subit un défaut d’apport en nutriments et en oxygène, c’est-à-dire depuis le prélèvement chez le donneur jusqu’à la reprise du flux sanguin dans l’organe chez le receveur. La reperfusion de l’organe chez le receveur se traduit par une reprise de la circulation sanguine en lien avec le retour de l’apport en nutriments et en oxygène. L’I/R provoque des nécroses tissulaires dans le rein qui active le système immunitaire en libérant des protéines importantes qui participent au processus inflammatoire et engendrent les lésions. Ces protéines peuvent être utilisées comme cibles pour neutraliser la cascade inflammatoire et par conséquent améliorer la reprise de fonction immédiate du rein. Cette stratégie pourrait se révéler bénéfique, sur le long terme, sur la survie des greffons qui représente un enjeu majeur en transplantation. L’objectif de ce projet est d’explorer les effets de la neutralisation d’une protéine ou de son récepteur dans un modèle murin d’I/R rénale afin d’apporter une preuve de concept pour une application clinique potentielle.

Bénéfices attendus

Actuellement, la transplantation de rein constitue le seul traitement curatif des maladies rénales chroniques. Les difficultés principales demeurent la pénurie d’organes, le nombre de pertes de greffons à long terme et enfin, les complications infectieuses, tumorales et cardiovasculaires. Notre objectif est de réduire les lésions engendrées lors de la transplantation en bloquant la réponse immunitaire afin d’améliorer la reprise de fonction de l’organe et limiter la perte des greffons. A court terme, les résultats permettront d’évaluer l’efficacité de la neutralisation de l’IL-33 ou de son récepteur ST2 sur les lésions d’I/R rénales et de finaliser la preuve de concept pour le brevet déposé. A long terme, l’IL-33 ou son récepteur ST2 pourraient être utilisés comme cibles thérapeutiques pour réduire les lésions d’I/R en transplantation rénale, améliorer la réprise de fonction du greffon et ainsi réduire les rejets.

Procédures

Sur animal vigile : -injection en intra-péritonéal de 100 µl  d’anticorps ou NaCl 0,9% : 1 fois -injection en sous-cutanée de 100 µl de buprénorphine à 0,1 mg/kg : 1 fois avant l’anesthésie puis toutes les 4h post-chirurgie pendant 24h. Sur animal anesthésié par inhalation gazeuse (isoflurane) : -prélèvement sanguin 200 µl en rétrobulbaire : 1 fois J-7 avant la chirurgie et 1 fois avant la mise à mort -chirurgie : néphrectomie du rein gauche (10 min) -chirurgie : ischémie-reperfusion rénale par clampage du pédicule rénal droit (32 minutes)

Impact sur les animaux

Pendant la chirurgie sous anesthésie générale, il y a un risque d’hémorragie lié au geste chirurgical, pendant la néphrectomie au moment de la ligature du pédicule rénal et un risque au moment du clampage en lésant l’artère rénale. Suite à la chirurgie, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une atteinte partielle de la fonction rénale, une mobilité réduite, ainsi qu’une perte de poids n’excédant pas 10% dans les 24 à 48h post-chirurgie.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la procédure seront mis à mort. Des prélèvements d’organes et tissus seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires, et histologiques.

Remplacement

Les méthodes d’études in vitro sont très limitées : 1/ en raison de l’absence de vascularisation permanente du rein ou des cellules rénales qui permet la circulation des cellules immunitaires et 2/ de l’impossibilité d’étudier in vitro les multiples conséquences de l’I/R. Il est également nécessaire d’évaluer de manière intégrative la mise en jeu des éléments immunitaires dans les lésions d’I/R en utilisant un modèle animal. Le choix de la souris repose sur l’utilisation de souris transgéniques irremplaçables et à notre expertise acquise dans la lecture des réponses immunes chez la souris. De plus, l’efficacité de la neutralisation de la voie IL-33/ST2 doit être prouvée sur l’animal avant d’envisager son utilisation comme cible thérapeutique chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques de la procédure découle d’une part d’un compromis entre les questions de minimisation et d’autre part d’un calcul de puissance pour définir le nombre d’animaux par groupe suffisant pour détecter des différences statistiques biologiques intra-groupes (variabilité de 12%) et inter-groupes (différence de 20%). Un test bilatéral de Mann Whitney pour la comparaison de deux groupes et un test unilatéral Anova pour la comparaison de trois groupes et plus seront utilisés. Par conséquent, nous proposons un échantillon de 8 souris par groupe. La réalisation de ce projet de 5 ans nécessitera un total de 352 animaux.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse. Pour cela, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement, suivi per et post-chirugical), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe) et des « actions » seront mises en place en cas de problème observé (soins ou mise à mort si un point limite est atteint). Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale, par un personnel compétent formé à l’expérimentation animale, et les animaux bénéficieront d’une prise en charge antalgique pré-, per- et post-chirurgie afin de réduire au minimum la douleur.

Choix des espèces

Les résultats de nos travaux sur l’implication de l’IL-33 en I/R rénale ont été obtenus avec des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées déficientes pour l’IL-33 (souris IL-33KO) ou pour son récepteur ST2 (souris ST2KO). La validation de nos expériences de neutralisation de l’axe IL-33/ST2 par injection d’anticorps nécessitera l’utilisation de souris sauvages et de ces mêmes lignées de souris transgéniques comme contrôles positifs de référence. Les animaux seront âgés de 8 à 12 semaines, âge adulte et auquel les reins ont atteint leur morphologie finale. De plus, cet âge correspond à des animaux de poids approprié pour l’expérimentation.

Une pompe glissée sous la peau sous anesthésie générale, sept jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen, puis des tests de mémoire : 636 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer deux modes d'administration de la FENM, un dérivé de la mémantine. Certaines appartiennent à une lignée transgénique qui développe des lésions de type Alzheimer, d'autres reçoivent un peptide amyloïde pour en provoquer une forme aiguë, une injection absente de la description des procédures. Le porteur évoque des labyrinthes sans les nommer et un test d'évitement passif qui impose des "stimulus désagréables", et ne laisse dans les cages que des copeaux de carton, parce qu'un enrichissement trop important "interagit avec l'étude de la mémoire". Après les tests, toutes sont tuées par une dose létale d'Exagon et leur cerveau est prélevé.

Objectifs

Les traitements disponibles aujourd’hui pour traiter la maladie d’Alzheimer (MA) sont essentiellement symptomatiques. C’est le cas de la mémantine, un antagoniste non-compétitif du récepteur au NMDA malheureusement aujourd'hui déremboursé en France, comme tous les médicaments disponibles contre la MA. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes, la première d'entre elles étant de mettre au point des molécules similaires(antagonistes du RNMDA) mais plus actives et sans effets secondaires. La piste suivie par le laboratoire s'articule autour des dérivés directs de la Mémantine et notamment la Fluoroéthylnormémantine (FENM) qui s'est avéré être un neuroprotecteur plus efficace à dose égale que la Mémantine. Une question essentielle pour envisager le développement clinique de ce composé est de bien comprendre les spécificités et les conséquences pharmacologiques d'un traitement au long cours, notamment selon la voie d'administration et le mode d'injection. Dans la MA en effet, certains médicaments existent selon deux modes d'administrations, comme la rivastigmine (Exelon® gélule ou solution buvable vs Exelon® dispositif transdermique), mais ce n'est pas le cas de la Mémantine (Ebixa® comprimé ou solution buvable). Ce projet a donc pour but de comparer deux modes d'administrations de la FENM, par injection direct (Bolus) ou diffusion passive (Pompe). Pour cela, trois types de modèles seront étudiés dans ce projet, un modèle contrôle non pathologique afin de confirmer que les modes d'injections n'impactent pas la santé de l'animal, un modèle aigu de la maladie d'Alzheimer et un modèle transgénique de la maladie d'Alzheimer

Bénéfices attendus

Les données préliminaires obtenue au laboratoire suggèrent en effet que la FENM serait un neuroprotecteur puissant, validé pour l’instant dans un modèle pharmacologique aigue de la MA chez la souris. La molécule présenterait une efficacité supérieure à celle de sa molécule parente, la mémantine notamment sur les aspects anti-inflammatoires et une absence d’effet amnésiant direct aux doses élevées. Le but de ce projet est de consolider ces résultats dans un modèle transgénique murin de la MA, un modèle qui se rapproche des caractéristiques histopathologiques et cliniques de la MA avec une évolution progressive de la pathologie, dans le but in fine de passr à un développement clinique de la FENM.

Procédures

Les animaux auront une procédure chirurgicale permettant la pose de Pompe Alzet sous cutanée qui permet de faire diffuser le médicament dans le système sanguin. Cette procédure rapide (15 min) se fera sous anesthésie générale. Les animaux auront également des injections intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours afin d'administer le médicament sous forme de "bollus". Afin d'évaluer le statut mnésique des animaux, des tests comportementaux type "labyrinthe" seront effectués.

Impact sur les animaux

Les animaux auront une chirurgie permettant l'innoculation par diffusionn de la FENM à l'aide d'une pompe Alzet. Les animaux auront également une injection intra-péritonéale durant 7 jours. Certains tests comportementaux comme le tetst d'évitement passif engendreront des stimulus désagréables pour l'animal.

Devenir

Après la serie de tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés et le materiel biologique (cerveau) sera récuperé pour procéder à des analyses port-mortem.

Remplacement

Les modèles précliniques d’étude des mécanismes complexes de neurodégénération dans la maladie d’Alzheimer les plus performants sont des modèles murins et plus particulièrement des modèles murins transgéniques développant la pathologie progressivement après plusieurs mois de vie. Les propriétés neuroprotectrices de la FENM seront analysées en administration chronique sur un modèle transgénique de la maladie d’Alzheimer, les souris APPSwe/PS1dE9 ainsi qu'un modèle pharmacologique d'injection de peptide amyloïde‐ß[25‐35] oligomérisé.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées aux animaux se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Une veille bibliographique sera également prise en compte durant les 5 années du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement minimal du milieu, car un enrichissement trop important interagit avec l’étude de la mémoire. Les animaux auront donc seulement accès à des copeaux de cartons afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. De la naissance jusqu’à la fin de vie des animaux les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra péritonéale et par diffusion sous cutanée. Pour éviter toute souffrance aux animaux, après analyses des tâches comportementales, ils recevront une dose léthale d’Exagon au moment du sacrifice. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci sera isolé du reste du groupe ou présentera des lésions cutanées signe d’un stress. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 mâles seront utilisées pour différencier l'effet des deux modes d'administrations (bolus VS infusion). Les composés seront testés dans une large gamme de dose de 0,03 à 1 mg/kg/jour. Ces souris témoins sont le fond génétique des souris transgéniques APPPS1 utilisées pour la suite de l'étude, il est donc important de travailler avec le même fond génétique pour ce projet. Les souris APPPS1 seront par la suite utilisées pour tester l'efficacité des composés aux doses efficaces en bolus VS infusion. Cette lignée développe la pathologie progressivement avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge. Les dépôts amyloïdes, la neuroinflammation, la gliose et le stress oxydant apparaissent même plus tôt, dès 6 mois, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les souris C57/BL6 seront utilisées à l'âge de 3 mois qui correspond à l'âge adulte les souris APPS1 à l'âge de 3 mois afin de visualiser si la FENM a un effet neuroprotecteur avant l'apparition des premiers signes de la pathologie et 6 mois afin de visualiser un effet neuroprotecteur sur le comportement de ces souris.