Recherche fondamentale

2 700 souris, soit 1 200 adultes et 1 500 souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent une vingtaine d'injections, sont maintenus tête fixée jusqu'à une heure et équipés d'électrodes cérébrales, avant une perfusion cardiaque terminale, pour étudier le rôle de l'ocytocine dans les comportements maternels. Le porteur indique que les souriceaux sont brièvement séparés de leur mère, parfois sédatés, puis tués car ils ne peuvent être gardés sans elle. Il affirme que l'étude d'animaux vigiles en comportement rend l'in vitro et l'in silico impossibles.

Objectifs

L’ocytocine (OXT) est un neuropeptide synthétisé par les neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN), principalement connu pour son rôle dans la lactation et l’accouchement suite à sa libération dans la circulation sanguine. Cependant, des études récentes mettent en évidence les effets de l’OXT sur le système nerveux central, notamment sur les comportements sociaux et maternels. Chez les rongeurs, l’olfaction joue un rôle central pour les interactions entre individus et en particulier entre adultes et leurs progénitures. Dans le système olfactif, le cortex piriforme (PIR) est un des premiers et principal relais en aval du bulbe olfactif. Il présente chez la souris une densité exceptionnelle de récepteurs à l’OXT par rapport à d’autres régions cérébrales, notamment chez les femelles, avec une densité accrue chez les mères par rapport à des femelles vierges. Aux vues de cette forte expression chez les mères, nous avons fait l’hypothèse que l’OXT dans le PIR est nécessaire à la mise en place de comportements maternels chez des souris femelles. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons réaliser des expériences en présence de souriceaux âgés de 1 à 10 jours, et manipuler la transmission oxytocinergique dans le PIR pour tester le rôle de l’OXT au niveau comportemental ainsi qu’au niveau des réponses neuronales.

Bénéfices attendus

Chez les Mammifères, la mise en place des comportements maternels est essentielle pour la survie des petits et de l’espèce en général. Chez l’Homme, il est notamment connu que le lien entre mère et enfant est facilité par la neurohormone nommée oxytocine, libérée dans la circulation sanguine de la mère lors de l’accouchement. Nous savons également que les odeurs jouent un rôle important et bénéfique dans le lien entre mère et enfant, un lien qui peut être affecté dans certaines situations, notamment lors de certains accouchements par césarienne (les taux d’oxytocine libérés sont alors plus limités). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau s’adapte lorsqu’il s’agit de mettre en place des comportements maternels et le rôle des odeurs dans ce processus. A terme, il pourrait permettre de mettre en place des stratégies pour faciliter l’établissement de ces comportements chez l’Homme dans des situations problématiques liées à la maternité. Cette perspective est d’autant plus réaliste que l’administration d’ocytocine par voie intranasale est déjà réalisée chez des enfants autistes pour améliorer leurs relations sociales.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence de souriceaux. Elles seront soumises à des injections et à des phases de contentions pendant les périodes d'habituation et d'expérimentation (environ 20 injections par souris, moins de 3min par injection/jour). Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir certaines souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. La durée de contentention par maintien de la tête en position fixe n'excédera pas 1h et sera réalisée après une habituation progressive. A la fin de l'expérimentation, les souris seront soumises à une perfusion afin de préserver les tissus cérébraux et d'effectuer des contrôles histologiques (durée de la procédure inférieure à 20min, réalisée sous traitement anesthésique et analgésique).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet seront mises en présence de souriceaux (ou d’odeurs de souriceaux) et nous observerons leur comportement pour quantifier leur capacité à en prendre soin. Les souriceaux pourront être brièvement séparés de leur mère le temps de réaliser ces tests, ce qui correspond à un stress modéré car réduit dans la durée. Pour limiter ce stress, nous prévoyons aussi de sédater ou anesthésier les souriceaux, ce qui nécessite d’injecter des substances médicamenteuses via des injections sous-cutanées réalisées à l’aide d’aiguilles très fines. Afin de pouvoir tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements, nous utiliserons des méthodes qui permettent de cibler les neurones capables de libérer de l’ocytocine ou bien les neurones qui répondent à l’ocytocine lorsqu’elle a été libérée. Pour cela, nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés au préalable (injections réalisées dans un autre établissement) et des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires. Ces injections représentent potentiellement une légère nuisance pour les animaux car elles nécessitent de les maintenir immobiles pendant la durée de l’injection (contention). Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Les souris pourront être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée.

Devenir

Les 1200 souris adultes pourront être mises à mort par perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale avec traitement antidouleur adapté. La préservation du tissu nécessite que cette procédure de perfusion soit réalisée et permet ainsi de réaliser des contrôles histologiques en fin d’expérimentation. Cette procédure, en utilisant la voie circulatoire sanguine, favorise la pénétration du fixateur dans les tissus de manière homogène et suffisamment rapide pour empêcher la détérioration du tissu cérébral en condition d'anoxie (normalement engendrée par l'arrêt cardiaque). Les 1500 souriceaux seront aussi euthanasiés à la fin des procédures car ils ne peuvent être gardés en absence de leur mère.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements maternels : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 2700 (1200 souris adultes et 1500 souriceaux) sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris dans des tests comportementaux différents, avec ou sans intervention sur le système ocytocinergique. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences et raffiner notre approche statistique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’effet positif de l’oxytocine sur les comportements sociaux a notamment été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme. Les odeurs jouent un rôle important dans le lien mère-progéniture, aussi bien chez l'Homme que chez la Souris. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Des souriceaux entre P1 et P10 seront utilisés comme stimuli au cours des expérimentations car elles visent à comprendre les bases neurobiologiques des comportements maternels.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne créant un défaut osseux sous anesthésie, puis un suivi par imagerie avant mise à mort échelonnée jusqu'à 60 jours, pour étudier le rôle d'une molécule de l'inflammation dans la cicatrisation osseuse. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, hémorragie et rarement une hypertension intracrânienne constituant un point limite. Il affirme que les modèles in vitro et ex vivo ne reproduisent pas la complexité cellulaire ni l'apport vasculaire, rendant le recours à un modèle in vivo nécessaire.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de caractériser le rôle d’une molécule clé de l’inflammation (interleukine 33) dans la réparation osseuse. En effet l’interleukine 33 est une cytokine (protéine soluble jouant un rôle de signal) jouant un rôle important dans le maintien de l'éauilibre des tissus et dans la défense contre les infections parasitaires. Le dérèglement de cette cytokine est impliqué dans de nombreux phénomènes allergiques et inflammatoires chroniques. Cette molécule est plus présente dans l’os ostéoporotique et joue un rôle protecteur chez la femme ménopausée1. En revanche son rôle dans la cicatrisation osseuse après une fracture ou une chirurgie orthopédique reste inconnu. Cette étude scientifique nous permettra de mieux comprendre son rôle dans la réparation osseuse pour pouvoir moduler ses effets lors de la phase inflammatoire de la cicatrisation osseuse et pour, in fine, améliorer la réparation osseuse. Enfin, nous voulons connaitre l’influence de l’âge sur l’expression de cette molécule pour pouvoir améliorer la prise en charge clinique de la cicatrisation osseuse chez les patients âgés et affiner la prise en charge pour une médecine plus personnalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le contexte des recherches en immuno-ostéologie. En effet, ces expérimentations permettront, dans un premier de temps, de mieux comprendre l’influence de l’âge sur le profil inflammatoire après des résections osseuses de différentes tailles. Par ailleurs, ces études vont permettre d’améliorer nos connaissances sur l’influence d’IL33 dans ce processus de cicatrisation osseuse. Enfin, les bénéfices à long terme d’un tel projet sont l’amélioration de la prise en charge des patients jeune et âgés souffrants de pertes osseuses importantes et une meilleure prise en charge de la cicatrisation osseuse chez les patients jeunes et âgés.

Procédures

Tous les animaux (320 souris) seront soumis à J0 à une chirurgie de la calvaria (procédure 1), conduite sous anesthésie générale de 30-45 minutes. Une analgésie pré- et post-opératoire (3 jours) sera fournie. Les animaux seront mis à mort à J2, J9, J14, J30 et J60 post-opératoires. La moitié des souris mises à mort à J60 (32 souris) sera également soumise à une analyse en bioluminescence de l’inflammation (procédure 2) à J2, J9, J14, conduite sous anesthésié gazeuse de 30 minutes. Il s’agit d’une procédure indolore. L’autre moitié des souris mises à mort à J60 (32 souris) sera soumise à une analyse au microscanner de la formation osseuse à J2, J9, J14, J30 et J60, conduite sous anesthésié gazeuse de 30 minutes. Il s’agit d’une procédure indolore.

Impact sur les animaux

La chirurgie sur calvaria de souris peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, hémorragie, stress, ou un comportement anormal causé par une hypertension intracrânienne. Ces effets indésirables seront potentiellement observés en per-opératoire ou post-opératoire immédiat (jusqu’à 3 jours). L’hypertension intracrânienne est une complication rare et constitue un point limite. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire immédiat peut-être également observé occasionnellement. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire), qui constitue également un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs dans notre étude (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). Les anesthésies nécessaires à l’imagerie non invasive en micro-CT et en BLI vont également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil.

Devenir

Suite à la chirurgie sur la calvaria tous les animaux seront gardés en vie. Les animaux seront mis à mort aux temps terminaux de l’étude : J2 (64 souris), J9 (64 souris), J14 (64 souris) J30 (64 souris) J60 (64 souris). Suite à l’analyse en bioluminescence (procédure 2, 32 souris) à J2, J9 J14, ou en microscanner (procédure 3, 32 souris) à J2, J9 J14, J30 les animaux seront réveillés et gardés en vie. A J60, les animaux seront mis à mort juste après l’examen (sans réveil).

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénoués de système vasculaire. Or la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier le rôle d’IL33 dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Compte tenu des écarts constatés pour les différents paramètres de la réparation osseuse étudiés par notre équipe, le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir un test statistique significatif (puissance de test 90%, seuil de signification < 0,05) est de 6 /groupe /temps / type d’analyse, mais le nombre d'animaux inclus dans les expérimentations sera de 8/groupe /temps / type d’analyse, afin de conserver une puissance statistique malgré la perte inopinée de certains animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux, l’os de calvaria prélevé lors de la chirurgie à J0 sera utilisé comme contrôle T0. De plus, la réparation osseuse et l’inflammation seront étudiées par différentes techniques (biologiques, imagerie multimodale) au sein du même animal, permettant de maximiser la contribution scientifique de l'animal mis à mort. Afin de réduire le nombre de procédure subies par les animaux, seuls les animaux mis à mort à J60 seront soumis l’imagerie non invasive en micro-CT J2, J9, J14, J30 et J60 et en BLI à J2, J9, J14. Les variables quantitatives seront testées pour leur normalité (test de Kolmogorov-Smirnov). Si les variables suivent une loi normale, elles seront analysées par des modèles de régression linéaire générale basés sur l’analyse de variance et les effets significatifs testés par un test post-hoc (LSD-Fisher). Sinon, un test non-paramétrique de Kruskal-Wallis sera utilisé pour une comparaison globale entre les groupes et un test de Mann-Whitney pour une comparaison de groupes deux par deux.

Raffinement

L’état général de l’animal et du site chirurgical seront évalués grâce à un tableau scoré. Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. Suite à la procédure chirurgicale des points surveillés et scorés (feuille de score) sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques cette procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Des soins et une médication analgésique appropriés post-opératoires seront mis en place pour s’assurer de l’absence de douleurs ou d’inconfort. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si les points limites sont atteints, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), papier et dôme cartonné afin de contribuer au fouissement des animaux. Les souris initialement hébergées ensemble (3 ou 4 souris/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. Les animaux seront également observés visuellement quotidiennement par les zootechniciens.

Choix des espèces

Souris C57/BL6 : Modèle de défaut de calvaria de référence dans la littérature internationale, fiable, reproductible, peu couteux ; souche la plus décrite dans la réparation osseuse et l’analyse de l’inflammation 1 Souris adultes de 8 semaines (jeunes) : âge optimal pour analyser la réparation osseuse ; à ce stade aucune influence de la croissance sur le crâne. Souris adultes 18 mois (âgées) : âge optimal pour analyser l’effet du vieillissement sur la réparation osseuse.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un mélanome à métastases pulmonaires, elles reçoivent des injections intraveineuses, des inoculations intranasales d'un parasite et des prises de sang, pour identifier les cellules immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale. Le porteur indique que la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et que la mort survient rapidement après l'apparition des symptômes, la mise à mort étant planifiée juste avant. Il reconnaît qu'une approche in vitro a été développée en amont mais affirme qu'elle ne reproduit pas un modèle de régulation complexe.

Objectifs

Les premiers résultats publiés montrent que l’injection intratumorale de tachyzoïtes de Neospora caninum et de N. caninum modifiés pour sécréter de l’IL15 permet le contrôle du développement d’une tumeur sous-cutanée solide EG-7 par action oncolytique, induction d’une forte réponse immunitaire et reprogrammation de l’environnement tumoral. De même, l’efficacité de N. caninum dans un modèle murin de mélanome à métastases pulmonaires (B16F10) a été démontrée par voie sous-cutanée, intraveineuse et intranasale avec une très bonne protection antitumorale induite par voie intraveineuse et intranasale. Le modèle de mélanome à métastases pulmonaires est à la fois un modèle plus relevant d’un point de vue clinique humaine puisqu’il s’agit d’un cancer contre lequel nous avons besoin de développer de nouvelles approches thérapeutiques efficaces, mais aussi un modèle nous permettant d’étudier la réponse antitumorale induite par N. caninum dans un modèle métastatique. La réponse antitumorale induite par N. caninum dans ce modèle a été caractérisée, il nous faut maintenant déterminer si les populations cellulaires qui sont recrutées dans les poumons des souris traitées sont indispensables à la réponse antitumorale et de confirmer ainsi leur rôle. Le rôle des populations cellulaires présentes dans les poumons sera étudié par déplétion locale de ces dernières (n=420souris).

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet nous pourrons identifier les cellules immunitaires dont le rôle est primordial dans la réponse antitumorale induite par N. caninum. En effet, si nous observons un développement tumoral après traitement par N. caninum chez les souris ayant une population cellulaire déplétée, nous pourrons conclure que le rôle de cette population cellulaire est primordial dans la réponse antitumorale. En plus de déterminer quelles populations cellulaires sont impliquées dans la réponse antitumorale, nous pourrons aussi déterminer dans quelle mesure elles sont impliquées.

Procédures

Lot témoin non traité : 1 injection intraveineuse (1 minute), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur au niveau pulmonaire peut induire chez la souris une souffrance due à une difficulté respiratoire. Les effets indésirables pouvant apparaitre sont : - Signes cliniques modérés : Agitation/Agressivité, Hypomobilité/hyporéactivité, stéréotypies, Poil piqué, Coloration anormale de la peau, Flacidité musculaire généralisée, Gonflement abdominal, Zone ano-génitale souillée, Perte de poids inférieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Diminution/absence de prise de nourriture. - Signes cliniques : Akinésie, Tremblements généralisés, Convulsions, Persistance du pli cutané, Voussure du dos/dos cambré, Difficultés respiratoires, Perte de poids supérieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Absence de prise de nourriture> à 2 jours. L’apparition des symptômes précède de peu l’apparition des points limites et la mort de l’animal, qui surviennent rapidement (généralement en deux à trois jours). Dès l’apparition des symptômes sur l’une des souris du lot contrôle, l’ensemble des animaux des animaux sera mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Si les points limites cités précédemment sont atteints, les animaux seront mis à mort sans délai. D’après notre expérience, le développement de la tumeur sans traitement devrait conduire à l’apparition des symptômes cités précédemment vers J30 et conduira à la mise à mort des animaux sans délai. Ce délai d’apparition des symptômes est pris en compte lors du développement du protocole expérimental et la mise à mort des animaux est planifiée pour être réalisée quelques jours avant l’apparition des premiers symptômes pour éviter toute souffrance aux animaux.

Devenir

Afin de pouvoir étudier la réponse immunitaire induite par N. caninum lors du traitement des nodules pulmonaires et de déterminer l’impact de l’absence d’une population cellulaire spécifique sur cette réponse immunitaire, nous devons mettre à mort les animaux pour collecter les poumons et étudier la réponse locale dans cet organe. Il n’existe à ce jour aucune méthode nous permettant de nous affranchir de la mise à mort des animaux.

Remplacement

Une approche in vitro a été développée en amont afin de valider notre hypothèse de travail et l’utilisation des composés sur des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle de la tumeur mais cela ne reproduit pas un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques (disponibles sur Anastats.fr) garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature. L’étude statistique des résultats sera réalisée avec le test non paramétrique Kruskall-Wallis pour l’étude des réponses immunitaires humorale (titre en anticorps) et cellulaire (dosage de cytokines) ainsi que pour l’étude du développement tumoral.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les normes réglementaires, en animalerie A2 à raison de 5 souris maximum par cage sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique des points limites.

Choix des espèces

Les souches de souris immunocompétentes sont adaptées à la greffe de cellules tumorales syngéniques présentant le même fond génétique que la souche de souris utilisée. Dans le cadre de précédentes études chez la souris, l’utilisation de protozoaires en tant que thérapie antitumorale a montré des résultats probants. Adulte. Il n’y pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.