Recherche fondamentale

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées d'une semaine à vingt-quatre mois, elles subissent des prélèvements de sang deux fois par mois et des injections intrapéritonéales, pour étudier le vieillissement des vaisseaux sanguins. Le porteur présente les manipulations lors des prises de sang et des injections comme les seuls effets indésirables. Les rubriques réduction et raffinement reprennent mot pour mot le texte de la rubrique remplacement, sans mesure propre à chacune, avant mise à mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons 1/ caractériser l’endothélium vasculaire vieillissant 2/ explorer le rôle de médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système d’hémostase (thrombose, coagulation et fibrinolyse). Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation du vieillissement vasculaire Dans cet axe, une étude pilote sera menée pour la mise au point des immunomarquages de sénescence et de caractérisation. Pour ce faire, un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites jeune (1 semaine à 1mois) et un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites âgées (12 ou 24 mois) seront utilisées (n=10).

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’apporter de la connaissance sur le vieillissement vasculaire ainsi que l’impact de la physiologie plaquettaire et de l’endothélium, inconnu à ce jour et peu réalisable sur les humains à la vue de la diversité du système vasculaire. En effet, il est irréalisable d’obtenir sur le même individu des biopsies endothéliales (veines, artères et capillaires), à cause des méthodes invasives et des conséquences délétères (hémorragies). Par ailleurs, le second axe permettra de déterminer un composé diminuant ou stoppant le vieillissement vasculaire. Ces travaux serviront à l’ensemble de la population en général et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets. éral et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets.

Procédures

Prélèvements sanguins sur animeaux vigiles, 2 fois par mois. La durée de la prise de sang est de maximum 2minutes Les injections en intraperitoneale durent maximum 1minute.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent.

Devenir

Au cour de l'étude, les souris feront l'objet d'un suivi quotidien et de prise de sang bi mensuel. Al fin de l'etude, tous les animaux seront mis à mort afin de faire une etude des tissus murins.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Réduction

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Raffinement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 1 semaine à 24 mois. Les souriceaux a une semaine de vie presentent un arbre vasculaire incomplet au niveau des retines et permet d'avoir un temps de reference "jeune". Les vaisseaux sanguins cerebrales sont matures chez les souriceaux de 1 semaine. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (1 semaine à 1mois) et souris vieillissante de 3 à 24mois. Ces dernieres ont un stade de developpement complet.

2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une stimulation magnétique du cerveau après une hypoxie. Selon les procédures, elles subissent une privation d'oxygène de quarante minutes à six semaines, quatorze jours de stimulation magnétique et des tests comportementaux, sous sédation profonde. Le porteur décrit des inconforts transitoires liés à l'hypoxie, à la stimulation et aux injections, et affirme que le cervelet ne peut être étudié hors d'un système nerveux entier. La plupart des souris sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 180 femelles ayant servi de mères sont renvoyées à l'élevage pour être réutilisées.

Objectifs

Notre projet testera les effets neurologiques de la stimulation cérébrale non invasive pour améliorer les déficits fonctionnels. Ces connaissances permettront d'optimiser des protocoles de stimulation et trouver des traitements potentiels. Nous analyserons les effets de différents patrons de stimulation magnétique répétée à faible intensité (LIrTMS), qui modifient la plasticité neuronale et améliorent le comportement chez les animaux pathologiques. Les fonctions cérébrales seront évaluées avec des tests de comportement, et les modifications structurales et fonctionnelles chez les mêmes animaux pour minimiser le nombre d’animaux utilisé. Ce traitement peut changer la signalisation cellulaire, modifier des réseaux neuronaux, et provoquer une réparation post-lésionnelle dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Nous cherchons des protocoles pour traiter une pathologie commune chez l’Homme, l’hypoxie cérébrale. Nous étudierons le cervelet parce qu’il est particulièrement sensible à l’hypoxie; sa structure, sa fonction et son développement sont très bien décrits; son dommage lors du développement est associé avec les maladies neurodéveloppementales; et il est touché par le vieillissement.

Procédures

4 interventions au maximum. Procédure 1 : 40 minutes d’hypoxie ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 12 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 2 : hypoxie 6h/jour x 10 jours ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 14 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 3 : hébergement en cages hypoxie pendant 6 semaines, hypoxie intermittente 6h/jour ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 60 minutes dans 1 journée ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes

Impact sur les animaux

Les interventions individuellement induisent une douleur en deca de la douleur engendrée par une simple injection faite selon le bon pratique vétérinaire. La succession de ces interventions nous emmène à demander l’autorisation du projet avec degré de gravité modérée. Les effets indésirables possible sont : inconfort transitoire en début d’hypoxie ; inconfort lors de la stimulation; inconfort lors des tests de comportement ; inconfort lors de l’injection d’anesthésiants et analgésiants. La surveillance quotidienne permet de s’assurer du bien être des animaux et lorsqu’un point limite (comme décrit) est atteint, les responsables du projet sont avertis et prennent une décision sur le devenir de l’animal, en lien avec la structure du bien être animal, et le vétérinaire référent.

Devenir

Nos études sont designés pour obtenir un maximum d'information biologique et comportemental d'un nombre minimum de souris. La plupart des souris sujet à l'hypoxie et la stimulation non invasive est testé en comportement puis perfusé, et les cerveaux des autres sont prélévé pour les études moléculaires. 180 souris femelles, les mères des portées des nouveaux-nés impliqués, seront remis dans l’animalerie, pour qu’elles soient re-utilisées pour l’élevage et diminuer donc le nombre total d’animaux.

Remplacement

Comme toute structure du système nerveux central, les connexions complexes entre les neurones ne peuvent pas être entièrement remplacé par des méthodes de culture ni des modèles mathématiques. Les déficits de comportement dus à une mutation associée avec les troubles autistique, ou à la suite d'une hypoxie perinatale, et l'amélioration de ces déficits ne peuvent être étudiés hors contexte de l'ensemble du système nerveux et donc avec des animaux vivants.

Réduction

2700 animaux total seront impliqués dans cette étude de 4 années. Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire pour les trois procédures, pour diminuer le nombre d'animaux utilisé. Les tests de comportement nécessitent normalement 10 animaux par groupe, et les études d'expression génique nécessitent 5 animaux par groupe.Un calcul de puissance a été fait pour déterminer ces nombres d'animaux.

Raffinement

Avant le début des interventions, nous habituons les animaux au contact humain en pratiquant du « handling » quotidien pendant une semaine ; ceci diminue leur peur et leur angoisse. Pendant la stimulation non invasive (LIrTMS) les animaux ne montrent aucun signe d’angoisse. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les points limites sont définis pour chaque procédure, en cas de dérèglement physiologique ou souffrance de l’animal. Tout acte invasive est fait uniquement après administration des médicaments analgésique ou anésthetiques adaptés.

Choix des espèces

La souris est très utilisée pour des expériences sur le système nerveux car cette espèce partage un nombre de propriétés biologiques avec l'Homme. Sa petite taille et l'existence des lignées de souris transgénique facilitent les aspects pratiques de l'expérimentation. Il existe de protocoles standardisés du comportement, ce qui permet de mieux comparer les résultats obtenus par différentes équipes de recherche. La majorité des animaux seront utilisés pendant les premier mois de développement postnatal, les âges clés pendant le développement du cerveau. Les ages ont été choisi pour être équivalentes au 1) le 3ème trimestre de gestation chez l’Homme ; 2) jeune adulte ; ou 3) adulte agé.

3 045 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une protéine contre l'anorexie liée aux chimiothérapies ou au stress. Selon les groupes, elles subissent une microcoupure hebdomadaire de la queue, jusqu'à six injections intraveineuses, une contention de deux heures par jour pendant deux fois quinze jours, un jeûne de 48 heures ou l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et qualifie le stress lié à la contention et au jeûne de transitoire. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever leurs organes.

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim, stimulant le comportement alimentaire par des mécanismes périphériques. Cette protéine agit comme un stimulateur lipogénique et un stimulateur de l'appétit efficace chez la souris. De plus, il a été montré que son injection chez la souris entraine une inhibition du processus autophagique. Une étude bio-informatique à montrer l’existence de plusieurs isoformes exprimées de façon différentielle dans l’organisme de la souris. Cette protéine apparaît comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’anorexie du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la présence de cette protéine (en fonction de son mode d’administration) peut empêcher : (i) l’anorexie (perte ou la forte diminution de l'appétit) associée aux traitements avec des agents chimiothérapeutiques ; (ii) ou l’anorexie associée à un stress psychologique/physique important.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l’anorexie induite par les chimiothérapies ou par un stress mental trop important dans l'espèce humaine. Ceci pourrait avoir des retombées thérapeutiques dans ces cas par la suite.

Procédures

Sur tous les animaux, une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue sur animal vigile au début de l’expérience sera réalisée pour analyse sur le sang (durée: quelques secondes), puis une fois par semaine pendant 46 jours. Pour certains animaux, au maximum 6 injections i.v. par souris (20 secondes) ou une injection intravasculaire hydrodynamique par souris (6-8 secondes). Pour d'autres animaux : 1 contention de 2h par jour pendant deux fois 15 jours dans un cylindre acrylique permettant la respiration. Pour d'autres animaux: Une période de jeûne de 48h et 1 injection intranpéritonéale (20 secondes). Pour une des procédures, les souris subiront une chirurgie légère par implantation de pompe osmotique sous anesthésie générale avec analgésie (durée 15 minutes).

Impact sur les animaux

L’ effet indésirable principal prévu pour les animaux est la perte de poids. Les animaux seront transitoirement stressés lors des périodes de contentions de 2 heures ou les périodes de jeûne.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour la perte ou la récupération de poids.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie et analgésie des animaux pour toutes les procédures expérimentales (locale ou générale selon les cas), utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. Du fait du but des recherches prévues, les animaux seront au stade adulte, étant des bons modèles pour les maladies à étudier. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie de quinze minutes pour implanter des cellules cancéreuses dans le foie, puis un suivi de dix semaines pendant lequel se développe une atteinte cardiaque, avant euthanasie. Le porteur indique une douleur post-opératoire et un possible œdème abdominal lié à la maladie cardiaque induite. Il juge le recours à un "organisme entier" vivant "indispensable" pour étudier l'effet d'une tumeur du foie sur les valves du cœur, et met à mort toutes les souris pour analyser leur cœur.

Objectifs

Au cours de ce projet, nous nous intéresserons aux tumeurs neuroendocrines du foie qui constituent une famille de cancers caractérisée par la production d’hormones dont la sérotonine. L'exposition des valves du cœur à la sérotonine est à l'origine d'une maladie cardiaque dite cardiopathie carcinoïde. Il s'agit d'une maladie rare associée à une mortalité élevée chez l'Homme. La sérotonine produite par la tumeur va entrainer des modifications majeures de la structure des valves du cœur. A ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux efficace pour traiter cette maladie cardiaque. Les connaissances sur la maladie demeurent limitées. L’objectif de ce projet est de créer un modèle de souris reproduisant la maladie telle qu’elle se manifeste chez l’Homme. Ainsi, nous souhaiterions obtenir un modèle de tumeur du foie produisant de la sérotonine et entrainant des changements de la structure des valves cardiaques chez la souris. Un tel modèle nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de la maladie

Bénéfices attendus

La création d’un tel modèle reproduisant précisément la cardiopathie carcinoïde telle qu'elle se manifeste chez l'Homme, permettra d’évaluer l’effet de l’administration de divers traitement médicamenteux chez la souris avant de les introduire chez l’Homme. Il n'existe en effet à ce jour aucun traitement médicamenteux de la maladie. Un tel modèle permettra par ailleurs une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie.

Procédures

Les souris subiront une unique intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes au niveau du foie pour implanter des cellules cancéreuses sous anesthésie générale. Après un suivi de 10 semaines, les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’atteinte cardiaque apparue dans l’intervalle.

Impact sur les animaux

Stress lié à l'intervention chirurgicale, au déplacement des cages vers la salle d'intervention. Douleur post-opératoire. L'apparition d'une atteinte cardiaque carcinoïde pourrait s'accompagner d'oedèmes. Il s'agit d'une accumulation d'eau au niveau de l'abdomen de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure afin de prévenir la souffrance liée à la propagation du cancer, et de pouvoir analyser le coeur des souris. Cette analyse permettra de chercher des signes en faveur de l'apparition de la maladie cardiaque carcinoïde.

Remplacement

L'utilisation d'un animal pour ce projet est indispensable car il est nécessaire de recourir à un organisme entier vivant. En effet, nous souhaitons étudier l’effet sur les valves du cœur d’une tumeur du foie. Le recours à un organisme vivant entier est indispensable pour pouvoir étudier un tel effet. Nous étudions parallèlement des échantillons de valves obtenues chez des patients malades ayant une cardiopathie carcinoïde, opérés. Cette approche permet seulement d'observer les anomalies de la valve mais ne permet pas d'évaluer l'efficacité de traitements médicamenteux.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique

Raffinement

Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'intervention. Les animaux seront observés quotidiennement. En plus du suivi quotidien visuel, un suivi clinique sera mis en place. Ainsi une grille de suivi sera utilisée mentionnant précisément les points limites à surveiller. Les points limites seront donc évalués à l'aide d'une grille de score au moins une fois par semaine. Les animaux sont hébergés sans isolement, avec enrichissement dans chaque cage. La douleur post-opératoire sera systématiquement prise en charge par l'administration d'un traitement antalgique au début de l'intervention. En cas de d'apparition de signe de douleur lors du suivi, un traitement antalgique sera immédiatement administré. Une surveillance quotidienne des points de suture sera réalisée. En cas d'atteinte des points limites, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Nous disposons de lignées de cellules cancéreuses de souris et les protocoles pour modifier ces cellules sont simples et reproductibles. Pour toutes ces raisons, la souris est le modèle expérimental le plus adapté. Les rares études épidémiologiques chez l'Homme indiquent une prévalence accrue des atteintes cardiaques chez l'adulte jeune. Les enfants et les sujets âgés sont moins atteints par la maladie. Nous utiliserons par conséquent des souris âgées de 8 à 12 semaines en début de procédure pour se rapprocher au maximum de la condition de la maladie chez l’Homme.

3 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour enregistrer l'activité de leur cortex pendant des tâches visuomotrices. Chaque animal subit deux chirurgies d'implantation d'électrodes d'environ douze heures, une IRM sous anesthésie, une restriction hydrique partielle entraînant une perte de poids, et une contention quotidienne en chaise d'une à trois heures, cinq jours par semaine, pendant quatorze à quarante-huit mois. Le porteur décrit un stress lié à la capture à la canne, au masque de contention et à l'isolement post-opératoire, ainsi qu'un risque de douleur et d'infection autour des électrodes. Le champ structuré du devenir est vide, et le texte indique que les animaux sont mis à mort pour vérifier la position des électrodes, sauf ceux réutilisés dans un autre projet ou, pour les femelles, renvoyés à l'élevage.

Objectifs

Les comportements sensorimoteurs résultent de traitements parallèles dans de multiples aires cérébrales. Le cortex pariétal « associatif » joue un rôle central dans les transformations sensorimotrices, mais les aires longtemps considérées comme purement visuelles peuvent être modulées par un mouvement de la main, et les aires considérées purement motrices peuvent être activées par des stimuli visuels. Cela suggère l’intervention de nombreuses boucles proactives et rétroactives entre les aires pendant ces comportements. Ce projet a pour but d’explorer les dynamiques intra- et inter-aires des réseaux corticaux fronto-pariétaux impliqués dans la planification de l’action et les processus attentionnels nécessaires à la mise en place et l’exécution des comportements sensorimoteurs. Ces dynamiques sont largement influencées par l'état du cerveau et ce projet les comparera au cours de différents états cérébraux allant de l'anesthésie et de l'état de repos à l'attention sélective et aux différents niveaux de prévisibilité. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrements électrophysiologiques intracorticaux (potentiels d’actions des neurones individuels et potentiels de champs locaux). Les données seront recueillies chez des macaques rhésus en utilisant des matrices d’électrodes laminaires chroniques. Deux aires motrices et deux aires pariétales ayant une complémentarité fonctionnelle somatosensorielle et visuelle seront enregistrées simultanément. Ce modèle animal sera utilisé pour l’analogie qu’il partage avec l’homme au niveau de la structuration du réseau fronto-pariétal, de l’organisation laminaire des couches corticales, et de la coordination sensorimotrice et visuelle lors de l’exécution motrice. Les données recueillies seront partagées avec la communauté scientifique, pour permettre de compléter et étendre les connaissances existantes sur l'organisation corticale, au-delà de nos objectifs scientifiques dans ce projet spécifique. Elles pourront notamment permettre d’étendre et d’affiner les modèles computationnels récents pour décrire les réseaux corticaux qui sous-tendent l’attention et la planification du mouvement.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu, à court et moyen terme, est l’élargissement des connaissances sur les réseaux fronto-pariétaux impliqués dans les comportements sensorimoteurs. Le jeu de données récolté sera d’une précision spatiale et temporelle inédite et couvrira différents états cérébraux. Les objectifs sont de : (i) Caractériser les réseaux fronto-pariétaux fonctionnels. Cela comprend la dynamique des réseaux intra-couches corticales, inter-couches corticales et inter-aires, et cela au travers de différents états cognitifs allant de l’anesthésie à l’attention sélective au cours de la réalisation d’une tâche visuomotrice. (ii) Quantifier la contribution des réseaux fronto-pariétaux à la communication neuronale ascendante et descendante. (iii) Caractériser la dynamique des activités neuronales unitaires dans et à travers différentes aires fronto-pariétales et couches corticales. Cela comprend les fréquences et la variabilité d’occurrence des potentiels d’action des neurones supposés excitateurs et inhibiteurs. Ces informations pourront être comparées à celles rapportées pour les aires sensorielles des primates et d'autres espèces de mammifères. (iv) Fournir ces jeux de données à la communauté scientifique pour contraindre/valider/étendre les modèles computationnels existants.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images, sous anesthésie, 1 fois pour une durée d'environ 4h. - Chirurgies d'implantation de matrices d'électrodes, sous anesthésie, 2 chirurgies pour une durée d'environ 12h chacune. - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements électrophysiologiques, environ 1h30 (jusqu'à 3h), 5 jours par semaine, durant 14 à 48 mois. - La prise de l'animal en chaise pour microstimulations, 20 sessions d'environ 1h30 (jusqu'à 3h). - La prise de l'animal en chaise pour enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie gazeuse, 20 sessions (habituation + enregistrement) d'environ 2h (jusqu'à 3h).

Impact sur les animaux

Ce projet utilisera des macaques rhésus qui entreront dans une procédure avec une sévérité classée modérée. La plupart des étapes de la procédure utilisée sera susceptible de créer une nuisance aux animaux. i) Les premières fois où les animaux seront mis en chaise pour leur venu dans le laboratoire pourront causer du stress lié à la prise de l’animal à l’aide d’une canne et à son déplacement depuis sa cage d’hébergement jusqu’à la chaise primate. Cela durera d’une à deux semaines bien qu’une habituation des animaux à la canne soit préalablement réalisée. ii) La restriction des mouvements de la tête des animaux à l’aide d’une masque de contention, nécessaire pour l’enregistrement des mouvements oculaires et électrophysiologiques, sera également source de stress lors des premières mises en place du masque. Pour cela, le masque est constitué de pièces détachables permettant de procéder à une habituation progressive. Nous pouvons tout de même prévoir plusieurs semaines de stress liées à la mise en contention dans le masque. iii) La restriction hydrique partielle liée au besoin expérimental pourra engendrer une perte de poids durant toute la durée de l’expérience. Les animaux seront donc pesés au minimum deux fois par semaine et surveillés quotidiennement afin de prévenir toute perte anormale de poids. iv) Malgré le traitement antidouleur, l’anesthésie et l’intubation de l’animal nécessaires aux procédures d’IRM et de chirurgie d’implantation des matrices d’électrodes pourront créer de la douleur post-opératoire à l’animal durant plusieurs jours. v) Malgré la médication post-chirurgicale et l’inspection/nettoyage quotidien de la zone opérée, l’animal pourrait ressentir de la douleur et développer une infection liée à l’implantation des matrices d’électrodes. vi) Afin de laisser l’animal cicatriser, il devra être isolé durant une semaine du contact physique de ses congénères après l’opération d’implantation des matrices d’électrodes et cela pourrait créer du stress. vii) Durant les enregistrements sous anesthésie partielle mais pendant lesquels l’état d’éveil sera maintenu, un masque délivrant le gaz anesthésique sera fixé à la tête de l’animal et cela pourrait augmenter le niveau de stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. L'objectif de la mis a mort est de prélever le cerveau de l'animal en fin de projet afin de préciser par une analyse post-mortem la localisation et l'état de préservation des zones corticales ayant fait l'objet des enregistrements électrophysiologiques. En particulier, deux scenarios peuvent nécessiter une analyse post-mortem de la localisation et l'état de préservation des zones enregistrées. 1) Les données obtenues chez différents animaux sont très dissimilaire, mettent en question la bonne implantation dans les zones ciblées, ou le bon positionnement des matrices sur une zone corticale permettent une implantation perpendiculaire aux couches corticales. 2) Une mauvaise qualité des signaux électrophysiologiques, ou une forte détérioration des signaux à travers le période d’enregistrement peut suggérer un dommage important du tissue cortical autour des matrices. Cela sera important à considérer pour l’analyse des données, et pour une future utilisation du même dispositif chez d'autres animaux. Si chez certains animaux, après la fin de l'enregistrement des données, on estime qu'il n'est pas nécessaire de procéder à une vérification post-mortem, les animaux seront gardés en vie. Dans ce cas, le connecteur et les câbles pour les matrices seront coupés, laissant les matrices en place. La base de connecteur, sera explantée du crâne et la peau sera fermée et suturée. Apres une récupération complete de leur état de santé et de bien-être général, les animaux gardés en vie peuvent 1) si possible, être inclus dans un autre projet basé sur un dispositif expérimental similaire, permettant d’éviter l’utilisation des autres animaux naïfs. Les animaux réutilisés seront déjà habitués au contexte expérimental (interactions quotidiennes avec l’homme, mise en chaise, travail dans le dispositif expérimental). Sinon, 2) en particulier les femelles peuvent retourner dans un établissement éleveur pour être inclues dans une programme d’élevage.

Remplacement

Le projet implique l'utilisation d'animaux car à ce jour, il n'existe pas d'alternatives expérimentales permettant de répondre aux objectifs. Aucune simulation informatique ou culture cellulaire ne peut remplacer le modèle animal vivant pour l'étude des substrats neuronaux de comportements visuomoteurs complexes. Les techniques électrophysiologiques utilisées dans le projet, permettant une mesure de l'activité de neurones unitaires, bien qu'utilisées en milieu clinique, restent trop invasives pour être utilisées chez l'homme pour des approches expérimentales.

Réduction

Les procédures chirurgicales prévues comportent un certain risque. En outre, la qualité des enregistrements à long terme est difficile à évaluer, car l'implant que nous utiliserons est récent. Nous prévoyons d'inclure un maximum de trois animaux dans cette étude. Si nous obtenons suffisamment de données (neurophysiologiques et séances comportementales) pour une analyse statistique satisfaisante chez deux animaux, nous n'utiliserons pas de troisième animal. Pour chaque animal, l’enregistrement avec plusieurs matrices multi-électrodes permettra de mesurer l’activité de populations neuronales dans plusieurs structures corticales. Le nombre de neurones enregistrés peut varier d’une matrice à l’autre en fonction du succès de la procédure d’implantation. La richesse des enregistrements multi-électrodes offre la possibilité de réaliser de très nombreux types d’analyses portant sur les potentiels d’actions de neurones isolés (modulation de fréquence de décharges ou de synchronisation entre neurones dans différentes périodes de la tâche ou dans différentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l’activité, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d’actions. La répétition des séances d’enregistrement sur une durée de 2 à 12 mois a pour objectif d’augmenter le nombre de neurones différents enregistrés dans chaque structure. Cette augmentation permet d’augmenter la puissance statistique de nos analyses, et d'évaluer la stabilité des modulations neuronales et comportementales détectées à travers plusieurs mois. La durée totale des enregistrements pour un animal est étroitement dépendante de la qualité du signal lors des premiers enregistrements et de sa stabilité sur long terme. De fait, elle ne peut être définie à priori.

Raffinement

La cage et volière de l’animal est enrichi de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires de l'animal et aussi le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après un délai minimal d'une semaine et selon l'état de récupération, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. Le IRM anatomique pre-chirurgicale permet de mieux planifier l’implantation des matrices chroniques, pour bien atteindre les aires corticales ciblées. L'utilisation du masque de contention au lieu d’un plot de tête fixée sur l’os est moins invasive. Les matrices multi-électrodes de nouvelle génération permettent des enregistrements simultanés de neurones dans différentes aires et couches corticales, ce qui implique une réduction d'études et de sujets utilisés, comparé aux recherches effectuées avec des électrodes simples. Le connecteur pour l’implant dans le deuxième hémisphère sera connecté sur la même base de connecteur, déjà fixée sur l’os.

Choix des espèces

L’espèce macaque rhésus est l’espèce de primate non humain utilisée préférentiellement par des laboratoires de recherche étudiant les processus visuomoteurs. Ce choix s’appuie sur la proximité des systèmes visuel (vision diurne binoculaire et trichromatique) et moteur (utilisation du bras pour saisir et manipuler les objets) ainsi que celle de l’anatomie fonctionnelle du cerveau entre les macaques et l’homme. L’utilisation répandue des singes rhésus a permis l’optimisation des procédures d’entraînement ainsi que celle de la gestion de leur alimentation, de leur hébergement et des soins vétérinaires. Les macaques rhésus s’adaptent rapidement aux protocoles de conditionnement comportemental et présentent des performances comportementales très similaires à celles observées chez l’homme. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du développement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses utilisées pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie.

720 souris et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour élever et infecter des moustiques Anopheles vecteurs du paludisme. Les lapins sont exposés vingt minutes par semaine pendant six mois aux piqûres d'environ 500 moustiques femelles, les souris à quarante piqûres par semaine pendant deux mois, certaines étant en outre infectées par des parasites Plasmodium. Le porteur présente ces piqûres et les prélèvements de sang associés comme les seuls effets indésirables. Il justifie le gorgement sur animaux vivants par la difficulté de certaines lignées à se nourrir sur membrane, et met à mort lapins et souris à l'issue de chaque cycle.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire régulièrement des moustiques femelles du genre Anopheles pour l’étude des interactions Plasmodium-Anopheles. Selon les questions scientifiques, il s’agira soit de colonies bien établies, soit de nouvelles lignées récemment établies ou à établir à partir de populations sauvages. Trois programmes scientifiques sont en cours. Programme 1 : Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae (souche Yaoundé) conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants. Programme 2 : Analyse fonctionnelle de gènes d’Anopheles arabiensis dont l’expression est régulée par P. falciparum et Plasmodium vivax. Programme 3 : Infection d’Anopheles darlingi par P. vivax pour le cyclage au laboratoire de ce parasite.

Bénéfices attendus

Globalement, le projet contribuera à une meilleure compréhension des interactions Anopheles-Plasmodium avec pour objectif principal la recherche de stratégies nouvelles et innovantes pour lutter contre la transmission du paludisme. Spécifiquement le programme 1 (Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants) doit permettre d’identifier des facteurs de type épigénétique impliqués dans la susceptibilité du moustique Anopheles gambiae, vecteur majeur du paludisme en Afrique sub-saharienne, à P. falciparum et guider vers le choix de nouvelles stratégies de contrôle des populations de ce moustique sans avoir recours à des insecticides. Le programme 2 a pour objectif une meilleure connaissance des gènes du moustique spécifiquement régulés par P. vivax, un parasite négligé mais d’importance croissante en Asie et Amériques et ainsi orienter les programmes de stratégie de blocage de la transmission de ce parasite, tel que des vaccins bloquant la transmission. Le succès du programme 3 (cyclage au laboratoire de P. vivax) ouvrira un pan nouveau de recherches, notamment pour agir sur les formes quiescentes du parasite au niveau du foie, sensibles à une seule famille de molécule (primaquine et tafénoquine), qui présente de nombreux effets indésirables chez les patients déficients en G6PD. Sur le plan transmission de P. vivax, ce programme permettra de compléter les études développées dans le programme 2, facilitant et accélérant la validation des gènes d’intérêt du moustique.

Procédures

Dans la procédure 1, les lapins sont exposés pendant 20 minutes à une cage contenant environ 1000 moustiques (donc seulement 500 sont des femelles), une fois par semaine, pendant 6 mois. Dans la procédure 1, les souris sont exposées pendant 20 minutes aux piqures de moustiques, à raison de 40 anophèles femelles par souris, une fois par semaine, pendant 2 mois. Dans la procédure 3, les souris reçoivent une injection intra péritonéale (quelques secondes), puis subissent un prélèvement d’un micro-volume de sang par une micro incision à l’extrémité de la queue de la souris à l’aide de ciseaux stérilisés (quelques secondes par prélèvement), puis sont exposées aux femelles adultes d’Anopheles, pour un repas de sang sous anesthésie générale (injection intrapéritonéale/ quelques secondes par injection ; repas sanguin pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables sur les animaux peuvent être dus à l’inconfort lié aux piqures par moustiques et la quantité de sang qu’il leur sera prélevé à cette occasion.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure : au bout de 6 mois pour les lapins, au bout de 2 mois pour les souris non infectées par Plasmodium, 3 à 5 jours après l’infection pour les souris infectées par des Plasmodium de rongeurs

Remplacement

Le choix de nourrir les moustiques sur animaux et non par gorgement sur membrane est guidé par la difficulté de lignées à se gorger sur membrane (An. arabiensis, An. darlingi) et l’impact potentiel d’altérer l’effet maternel étudié chez An. gambiae souche yaoundé (programme 1). En effet le comportement et la physiologie du moustique sont très sensibles à l’origine du sang, aux odeurs émises par les animaux et au mode de piqure. Par ailleurs des souris infectées par un Plasmodium de rongeur (P. berghei ou P. yoeli) sont utilisées comme substitut à des infections avec les parasites infectant l’homme (P. falciparum ou P. vivax) difficiles à produire au laboratoire.

Réduction

Le nombre requis d’animaux découle de la longue expérience de l’équipe qui veille à respecter les recommandations 3R. L’utilisation d’un même lapin au-delà de 6 mois résulterait à une production réduite de moustiques incompatible avec les objectifs scientifiques du fait de l’apparition d’un taux trop élevé d’anticorps anti-salive de moustiques ayant pour conséquence une perte de qualité des repas sanguin pour les moustiques et donc une perte en nombre de descendants moustique. Il en va de même pour les souris, auquel s’ajoute l’effet cumulé d’une anesthésie hebdomadaire qui amènerait à avoir recours à des doses d’anesthésiant plus importante et les conséquences possibles sur le bien-être de la souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales d’hébergement répondant aux normes européennes, avec une surveillance de l’état général (observation de la mobilité, du pelage, et de la couleur des oreilles) et du poids. Avant et après chaque repas sanguin des suppléments alimentaires sous forme de gel seront proposés aux animaux.

Choix des espèces

Le choix des lapins et souris pour maintenir ou produire des lignées de moustiques anophèles est guidé par la qualité du sang fourni par les animaux vivants et le fait que certaines lignées ne se gorgent que très faiblement à travers une membrane produisant des progénitures dont la taille est incompatible avec les programmes scientifiques. Le programme 1 interroge une composante épigénétique pour laquelle une modification du mode de gorgement des moustiques (Lapin versus poche de sang) pourrait être dommageable sachant que de nombreux paramètres peuvent être impliqués dans l’expression de signatures épigénétiques. Stade de développement des animaux : souris et lapins adultes jeunes car les animaux vieux sont difficiles à « piquer » et leur poids est trop important et pour les souris hôtes de Plasmodium, pour leur sensibilité aux parasites.

1 402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à des additifs alimentaires de la vie in utero à l'âge adulte, elles subissent deux tests comportementaux au sevrage et huit à l'âge adulte, dont le porteur ne précise pas la nature. Il affirme que ces tests ne durent que quelques minutes et n'induisent pas de stress majeur, et que l'exposition alimentaire ne peut être étudiée que sur des animaux vivants. Toutes les souris sont mises à mort pour des analyses biochimiques et cellulaires.

Objectifs

Le projet porte sur l’étude de l’impact d’une exposition chronique à des additifs alimentaires sur la mise en place du cerveau et de ses fonctions depuis la vie in utero jusqu’à l’âge adulte, en observant la régulation et les fonctions microgliales ainsi que le développement cérébral et le comportement

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats permettra de mettre en avant l’importance de la période périnatale ou non dans l’exposition aux additifs alimentaires, d'explorer le devenir périnatal des additifs alimentaires, et d’en évaluer les effets sur les fonctions cérébrales des descendants, jusque dans leurs intéractions directes. Ceci permettra de d’accroitre les connaissances scientifiques sur les additifs alimentaires qui sont largement critiqués voir prohibés dans l’alimentation et de valider ou non leur lien avec des altérations comportementales, neurologiques et moléculaires.

Procédures

Tests comportementaux au sevrage (2 tests) et à l’age adulte (8 tests) – quelques minutes par test

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de réaliser des analyses biochimiques et cellulaires lors des différents temps d'exposition proposés dans le projet.

Remplacement

L’étude de l’exposition à des additifs alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant la différence entre plusieurs groupes.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l'inconfort (manipulation régulière et hébergement en cage collective avec enrichissement, utilisation d'antalgiques) des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement (test comportementaux et électrophysiologie). Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu’ils soient capables de procréer et leurs descendants seront utilisés au sevrage ou à l’âge de 3 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions cérébrale, ainsi que son maintien chez l’adulte.