Recherche fondamentale

3 132 souris transgéniques humanisées pour des molécules HLA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales sous-cutanées répétées et des prélèvements de sang à la veine sous-maxillaire, avant d'être tuées pour prélever la rate et d'autres organes. Le porteur vise un vaccin peptidique dit universel censé couvrir plus de 80 % de la population mondiale, un bénéfice renvoyé au développement futur. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire après vaccination ne peut être reconstituée hors d'un "organisme entier" et juge "indispensable" le recours aux souris transgéniques.

Objectifs

Une avancée majeure dans le traitement des cancers a été réalisée au cours de ces dernières années grâce à l’utilisation de l’immunothérapie. L’immunothérapie consiste à réactiver les cellules du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Bien que très efficace chez certains patients, une large proportion de personnes atteintes par le cancer ne répond pas à ces nouvelles thérapies (environ 80% des patients). De nombreuses études montrent à présent, que chez les patients traités par certaines immunothérapies, l’ajout d’une vaccination dirigée contre des cibles appelées «antigènes» présentes à la surface des cellules tumorales peut améliorer la destruction de la tumeur et induire une rémission ou une stabilisation des patients. Dans ce cas, l’efficacité de la réponse vaccinale dépend directement de la nature des antigènes sélectionnés pour cibler les tumeurs et de la capacité du système immunitaire à reconnaitre efficacement ces cibles tumorales. On appelle antigène toute substance capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Dans le cas des cancers, il s'agit le plus souvent de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par certains globules blancs, les lymphocytes T CD8 (étudiés dans le cadre de ce projet). Nous avons développé une méthode pour identifier des cibles tumorales très efficace pour détruire les tumeurs, consistant à activer le système immunitaire avec des antigènes bactériens très semblables à certains antigènes tumoraux. L’utilisation d’antigènes bactériens permet de réactiver une réponse immune similaire à celle pouvant exister lors d’une infection bactérienne et d’induire une réponse contre les tumeurs similaires à celle observée contre un pathogène étranger. Utilisés pour la vaccination des patients, ces antigènes bactériens semblables aux antigènes tumoraux pourraient devenir un nouvel outil pour le traitement des cancers. L’objectif de notre projet est de développer un vaccin thérapeutique efficace qui ciblerait la grande majorité de la population mondiale.

Bénéfices attendus

Les objectifs pour ce projet sont d'étendre nos connaissances scientifiques sur le mimétisme moléculaire peptidique à d'autres HLA et de développer un vaccin peptidique universel (pour tous).

Procédures

Les interventions auxquelles les souris seront soumises sont les suivantes pour la 1e procédure expérimentale (Immunisation par méthode prime-boost): • Vaccination par injection sous-cutanée : 2 injections à 14 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 3 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10 et 17 jours après la vaccination). Pour la procédure expérimentale n°2 (Cinétique de vaccination) : • Vaccination par injection sous-cutanée : 5 injections à 7 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 4 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10, 17 et 31 jours après vaccination)

Impact sur les animaux

Lors de l’immunisation des animaux et du suivi des cinétiques de vaccination, douleurs légères associées à une injection sous-cutanée et à des prélèvements de sang par voie sous-maxillaire (plaie réduite au point d’injection ou de prélèvement, œdème).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure seront euthanasiés en fin d'expérience afin de pouvoir prélever leur rate et autres organes pour effectuer les analyses in vitro.

Remplacement

La mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination est un phénomène complexe. Cela implique la reconnaissance des antigènes par des cellules spécifiques et la collaboration de différents types cellulaires (lymphocytes T, B et cellules présentatrices d’antigène). L’efficacité de la réponse immunitaire est favorisée par de nombreux facteurs solubles provenant du microenvironnement dans lequel l’antigène est présenté. Ces particularités (collaboration de différents types cellulaires et microenvironnement) ne peuvent pas actuellement être reconstituées en dehors d’un organisme vivant. L’étude d’une réponse immunitaire après vaccination sur organisme entier ne peut donc être remplacée et n’a pas d’équivalent expérimental n’utilisant pas d’animaux. Il est donc indispensable d’avoir recours aux modèles animaux transgéniques pour le HLA humain pour récapituler ces interactions complexes antre cellules et microenvironnement afin de démontrer la mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination. Ce projet ne vise pas à l’évaluation directe d’une réponse anti-tumorale chez l’animal. La vaccination sera réalisée chez des animaux non porteurs de tumeur.

Réduction

En amont, 2 étapes ont permis de réduire le nombre de peptide et d’animaux qui seront utilisés : 1/ Une analyse in silico et la réalisation de tests in vitro ont permis de sélectionner un nombre restreint de peptides vaccinaux immunogènes et de forte affinité pour les HLA ciblés. 2/ L’analyse in silico via l’outil en ligne tools.iedb.org/population/ a permis de déterminer que le ciblage de 3 HLA-A (parmi les 68 possibles) et 2 HLA-B (parmi les 125 possibles) permet une couverture de 80% de la population mondiale. La réduction du nombre d’animaux a été réalisée pour permettre d’obtenir un nombre suffisant de données pour répondre à la problématique. L’utilisation d’outils statistiques du calcul de puissance de test et de taille d’échantillons (https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#), permet de définir un nombre minimal d’animaux de 12 par groupe, en considérant un seuil de significativité à p

Raffinement

Le bien-être des animaux étant primordial, les souris sont acclimatées au moins 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. A réception, les souris sont hébergées par 7 maximum par cage pour les femelles et 6 maximum par cage pour les mâles. Les animaux seront maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (température, humidité, cycle jour/nuit), dans un espace suffisant, en groupe pour maintenir les interactions sociales, et avec un enrichissement environnemental permettant de répondre aux besoins physiologiques et comportementaux des souris (présence de petite maison permettant aux animaux de se cacher). Toutes les manipulations seront réalisées dans le respect de l’animal. Le temps de manipulation des animaux sera de plus réduit au maximum afin de réduire le stress des animaux et l’impact possible sur la réponse immunitaire. La procédure expérimentale (vaccination) est de classe de gravité légère et ne nécessite pas d’y associer un protocole d’anesthésie. Les prises de sang régulières seront effectuées afin de suivre l’évolution dans la circulation sanguine la reponse immunitaire, ce qui élève le niveau de la procédure à une classe modérée. Ces prélèvements de sang seront effectués à la veine sous-maxillaire, 1 fois par semaine (ou tous les 15jours), selon le chronogramme prédéfini (cf annexe). Un volume total prélevé inférieur à 10% du volume sanguin de l’animal (soit au total environ 100µL/semaine ou 200µL/15jours, pour une souris de 25g) sera effectué afin de ne pas causer de dommage aux animaux. Toujours pour le bien-être de l’animal, le prélèvement sera effectué par alternance sur les 2 côtés.

Choix des espèces

Le principe de la vaccination repose sur la présentation des antigènes par le système HLA chez l’Homme. Le système de présentation antigénique est différent d’une espèce à l’autre. Ainsi les antigènes reconnus chez la souris peuvent être très différents de ceux reconnus chez l’homme car présentés par des molécules CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) différents. Le vaccin final développé dans le cadre de ce projet représente un mélange de plusieurs peptides restreints par le HLA. Ce vaccin sera un vaccin HLA universel qui traitera une grande majorité des patients cancéreux (prédiction >80%) car ciblant les HLA du locus A et B les plus représentés chez l’homme (HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B35 et HLA-A2). Ce projet nécessite donc l’utilisation de souris dites humanisées transgéniques pour les différents HLA humains et parfaitement caractérisées pour leurs réponses aux vaccins peptidiques humains (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7 ou HLA-B35 restreint). Le modèle de souris transgéniques humanisées pour les différents HLA-A et HLA-B sont des modèles existants et relevant pour étudier l’immunogénicité de ces vaccins destinés à l’homme. Les études pourront être réalisées sur des souris adultes âgées au début de l’expérimentation de 7 jusqu’à 15 semaines, âge où le système immunitaire est mature et donc à partir duquel une réponse immunitaire peut être correctement évaluable. Pour chaque étude, des souris d’âges similaires seront utilisées (plus ou moins une semaine). En cas de variation de plus d’une semaine, les animaux seront répartis de façon équilibrée dans chacun des groupes afin d’assurer l’homogénéité des groupes.

780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie et leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie leur est provoquée par un régime alimentaire spécifique, et 255 subissent six prélèvements sanguins répétés au sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour tester des vecteurs censés bloquer les gènes de la maladie. Le porteur renvoie au conditionnel la mise au point de traitements contre la fibrose et la cirrhose. Il affirme qu'on ne peut reproduire l'architecture d'un "organe entier" autrement que chez l'animal.

Objectifs

La fibrose hépatique correspond à une cicatrisation du foie, en réaction à une agression, qui finit par entraîner un mauvais fonctionnement de cet organe. La cause première de fibrose hépatique est l'alcoolisme, mais les maladies chroniques du foie comme les hépatites, ou les maladies métaboliques liées à l’obésité, sont aussi à l'origine de fibroses. Une fibrose peut à son tour dégénérer en cirrhose, puis en cancer du foie - l'un des plus mortels. Il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement contre la fibrose. Vu l’augmentation de l’obésité dans la population, les maladies du foie vont devenir un problème mondial de santé publique dans les années à venir. L’objectif de notre projet est de développer des médicaments pour traiter la fibrose hépatique métabolique. Le principe de ces médicaments est d’empêcher les gènes responsables de la maladie de s’exprimer. Nous allons élaborer des vecteurs synthétiques capables de délivrer ces médicaments spécifiquement dans le foie pour réduire au silence les gènes impliqués dans le développement de la fibrose.

Bénéfices attendus

La fibrose hépatique n’ayant à ce jour pas de traitement, nous pensons que cette étude sera un premier pas vers la mise au point de nouveaux médicaments pour soigner la fibrose et la cirrhose hépatiques, actuellement incurables.

Procédures

Un prélèvement sanguin de 100 à 150 μL par voie retro-orbitale après anesthésie totale par un mélange kétamine (100mg)/kg/xylazine (10mg/kg) sera effectué toutes les 2 semaines sur une partie des animaux prévus dans le projet. Soit 6 prélèvements répétés sur 255 animaux. La durée du prélèvement est d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire utilisé pour induire une fibrose hépatique aux animaux entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chacune des procédures. En effet, il est indispensable de récupérer le foie et le sang des souris pour pouvoir étudier les effets des vecteurs thérapeutique sur la fibrose hépatique.

Remplacement

Les procédures expérimentales nécessaires à ce projet ont été élaborées et réfléchies afin de minimiser le nombre d’animaux tout en permettant de réaliser une étude statistique valable. Le modèle de fibrose que nous avons choisi consiste uniquement en l’apport d’une alimentation spécifique, il a l’avantage de refléter fidèlement la pathologie humaine. Avant d’être administré aux souris, les systèmes thérapeutiques développés seront préalablement testés sur des cellules en cultures. Seuls les systèmes présentant une efficacité suffisante seront testés chez la souris.

Réduction

D’après la littérature et d’après notre expérience sur le modèle CDAHFD, la variabilité des réponses à l’induction de la fibrose est très faible (sur plus de 100 souris étudiées, toutes développent une fibrose hépatique). Cependant, suivant les durées de régime, la variabilité de l’expression de certains marqueurs peut être plus ou moins marquée. Ainsi, d’après nos résultats précédents, l’étude d’une réponse aux agents thérapeutiques nécessite des lots minimum de 15 animaux pour pouvoir réaliser une étude statistique. Pour les études d’effet thérapeutique nous réaliserons dans un premier temps, l’expérience sur un lot de 10 animaux, testerons la validité statistique des résultats, et nous recommencerons l’expérience sur 5 animaux supplémentaires si nécessaire. Pour les études de biodistribution, des lots de 5 animaux sont suffisants. Ainsi, le nombre d’animaux indiqués est un nombre maximum. Le test statistique utilisé sera un test non paramétrique Mann–Whitney permettant l'analyse d'échantillons de petites tailles.

Raffinement

Ce régime entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines. Le milieu sera enrichi pour le bien-être des animaux (cotons de nidifications, bâtonnets et igloos…). Des mesures visant à réduire la douleur des animaux seront prises, les injections de médicaments seront réalisées sous anesthésie générale et un suivi attentif des animaux est prévu à chaque étape des procédures. Les animaux seront régulièrement évalués à l’aide de points limites bien définis. Pour chaque animal mis à mort, nous exploiterons un maximum de données disponibles.

Choix des espèces

Les objectifs du projet sont de tester différents agents thérapeutiques pour traiter la fibrose hépatique et d’étudier l’évolution des marqueurs de cette pathologie. Le recours à des animaux est indispensable pour atteindre de tels objectifs, puisque la fibrose hépatique prend place au niveau d’un organe entier, le foie. Il n’est actuellement pas possible de reproduire l’architecture et la complexité d’un organe entier autrement que chez l’animal. De nombreux modèles de fibrose hépatiques existent et sont bien connus chez la souris. En soumettant les animaux à un régime alimentaire spécifique, bien caractérisé par l’équipe, cela permettra de récapituler, les différentes étapes du développement et les potentielles variabilités de la maladie à l’échelle de l’organisme entier. Un tel niveau d’information ne peut pas être obtenu à l’aide d’un modèle in vitro.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par le virus de la Vaccine par voie intranasale sous anesthésie, elles reçoivent du chloramphénicol par injections répétées et une prise de sang au sinus rétro-orbital juste avant la mise à mort, pour étudier le métabolisme des lymphocytes T CD8. Le porteur indique fixer un point limite à 20 % de perte de poids, l'antibiotique n'ayant pas encore été testé dans ce contexte infectieux. Il affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend son étude in vitro impossible.

Objectifs

Lors d’une infection virale, les T-CD8s naïfs et spécifiques des antigènes viraux sont activés dans les ganglions drainant l’organe infecté. Suite à leur activation, les T-CD8s prolifèrent et se différencient en cellules effectrices qui migrent vers l’organe infecté et éliminent les cellules infectées. En parallèle, pendant la phase effectrice, un petit nombre de T-CD8 mémoires se développent, qui vont persister sur le long terme. Les T-CD8s mémoires sont capables de réagir de manière plus rapide et plus efficace en cas de nouvelle rencontre avec le même virus. La fonction des T-CD8s et la génération de T-CD8s mémoires fonctionnels sont largement dépendantes d’une succession de changements métaboliques et reposent sur une communication étroite entre la respiration mitochondriale et la glycolyse. En effet, alors que les T-CD8 naïfs (qui n'ont jamais été activés) acquièrent leurs besoins énergétiques de la respiration mitochondriale, leur activation mène à un remodelage métabolique en faveur de la glycolyse, leur permettant d’assurer leurs fonctions effectrices. Enfin, les T-CD8 mémoires possèdent un métabolisme respiratoire, accompagné d’une augmentation de la masse mitochondriale leur permettant de répondre rapidement lors d’une réponse secondaire. Bien que ces changements métaboliques soient à présent bien admis, les mécanismes sous-jacents qui les contrôlent restent peu, voire pas, connus. De manière intéressante, la respiration mitochondriale repose sur la traduction d’ARNs spécifiques et exclusivement exprimés dans les mitochondries, un processus nommé la traduction mitochondriale. L'émergence d’études sur ce sujet suggèrent ainsi un rôle spécifique de la traduction mitochondriale, dans l’établissement des réponses immunes innées et adaptatives. Ainsi, ce projet vise à disséquer, au niveau moléculaire, la contribution relative des traductions mitochondriale et cytosolique, dans le contrôle de la respiration mitochondriale et de la glycolyse, au cours des réponses T-CD8 anti-virales. Pour cela, des souris C57Bl/6J seront infectées par voie intranasale, avec le virus de la Vaccine. La traduction mitochondriale sera spécifiquement inhibée, grâce à l’utilisation de Chloramphenicol, injecté par voie intra-péritonéale. Différents temps après infection, l'analyse du nombre, du phénotype, et des fonctions des T-CD8s, sera effectuée ex vivo sur un prélèvement de sang et des organes lymphoïdes.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de combler le manque de connaissances mécanistiques concernant les besoins métaboliques des T-CD8, et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler les fonctions cytotoxiques des T-CD8 et la génération/maintenance des cellules mémoires.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection Intraveineuse (sous brève anesthésie Isoflurane) – uniquement pour la procédure 2 : 1 fois par animal – durée 30 secondes - Injection intrapéritonéale (pour anesthésie Kétamine/Xylazine) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie Kétamine/Xylazine) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - Injections Intra-péritonéales (pour traitements chloramphénicol): 1 fois par jour pendant 4 à 10 jours en fonction des groupes – durée 30 secondes par injection - Prélèvements sanguins au sinus retro-orbital (sous brève anesthésie Isoflurane) : 1 fois par animal, juste avant la mise à mort – durée 30 secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales et le stress généré par l’anesthésie et la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale. L'infection par le virus de la Vaccine est une procédure utilisée en routine dans le laboratoire dont les conséquences ne génèrent pas de souffrance sur les animaux. Le chloramphenicol utilisé dans ce projet (50mg/Kg, en IP) est un antibiotique largement utilisé chez l'humain et dans des modèles animaux. Les doses utilisées sont basées sur la littérature qui ne décrit aucune nuisance ou effet indésirable sur l’état général des animaux. De plus le chloramphénicol (qui inhibe la traduction mitochondriale) devrait, selon la littérature, avoir un impact surtout dans la génération et la survie des cellules T CD8 mémoires, et seulement un impact négligeable sur la réponse effectrice (et donc sur la capacité des animaux à contrôler l'infection). Cependant, étant donné que cette drogue sera testée pour la première fois dans le cadre d'une infection virale in vivo, un point limite de 20% de perte de poids est fixé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les organes (ganglions lymphatiques, poumons, rate etc) et effectuer ex vivo: - des analyses cellulaires pour déterminer le phenotype et la fonctionalité des lymphocytes T CD8 - des analyses moléculaires et les mecanismes impliqués dans la traduction mitochondriale, au cours de la réponse T-CD8

Remplacement

La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous utiliserons 15 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Nous utiliserons des tests de comparaison de moyennes de Student et des tests non-paramétriques pour comparer les groupes. Le calcul de la puissance des tests statistiques et nos expériences antérieures ont montré que ces nombres d'animaux par point expérimental étaient nécessaires et suffisants pour l’interprétation de nos résultats.

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections intra-nasales seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue lors de l'anesthésie; ii) nous effectuerons une brève anesthésie à l'isfluorane (3% dans une chambre à oxygène) pour les prélèvements de sang en rétro-orbital; iii) les injections I.V. au sinus rétro-orbital seront réalisée sous anesthésie à Isoflurane (3% dans une chambre à oxygène); iv) nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée) ; v) assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser, à terme, des animaux génétiquement modifiés. Dans ce projet, des souris sauvages (fond C57Bl/6J) seront utilisés.

402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dermatite atopique leur est provoquée par micropores au laser dans la peau puis application d'un allergène, une partie étant ensuite exposée à l'allergène par voie respiratoire pour déclencher une réaction de type asthme, et 104 recevant en plus de la toxine diphtérique pour détruire une sous-population de lymphocytes. Le porteur indique attendre une inflammation cutanée et pulmonaire légère et prévoit l'euthanasie selon des points limites. Il décrit la complexité de la réponse immunitaire comme rendant l'expérimentation in vivo nécessaire.

Objectifs

Les allergies (ou maladies atopiques), incluant la dermatite atopique (eczéma), l’asthme, la rhinite allergique et les allergies alimentaires sont des maladies inflammatoires complexes avec des caractéristiques communes, impliquant différents organes du corps. La dermatite atopique précède souvent le développement d’autres allergies, et sa sévérité aggrave le cours de l’allergie respiratoire. Cette évolution de la dermatite atopique vers d’autres maladies atopiques, et en particulier l’asthme, est appelée « marche atopique ». Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la mise en place de la dermatite atopique est cruciale dans le but de développer de nouveaux traitements ou de nouvelles stratégies de prévention. Les lymphocytes T sont des cellules clés du système immunitaire permettant de se défendre contre les pathogènes. Cependant ces lymphocytes peuvent entraîner différentes maladies s’ils sont dérégulés, comme par exemple les allergies. Plus spécifiquement, deux sous-populations de lymphocytes T sont dérégulées dans la dermatite atopique et la marche atopique. Ces deux populations restent cependant mal définies à ce jour. C’est pourquoi nous nous intéressons au rôle et aux mécanismes impliqués dans la génération de ces populations de cellules immunitaires au cours de la dermatite atopique et de la marche atopique. Pour ce faire, nous utilisons un modèle mimant les caractéristiques de la dermatite atopique chez la souris. Dans ce modèle, nous utilisons une technologie permettant de générer des micropores dans la peau à l’aide d’un laser (technique également utilisée chez l’Homme dans la sphère médicale) puis nous appliquons un allergène sur la peau des souris. Cette étape engendre une dermatite atopique menant une sensibilisation de la souris à l’allergène. Pour étudier la marche atopique, nous appliquons ce même protocole pour induire la dermatite atopique, puis nous allons réexposer les souris à l’allergène au niveau des poumons, ce qui entrainera une réponse allergique similaire à un phénomène asthmatique. Ceci permettra d'étudier l'asthme.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre la pathogenèse de la dermatite atopique et de la marche atopique. Plus précisément, ceci nous permettra de déterminer les signaux induisant les différentes populations de lymphocytes dérégulés dans ces maladies, ainsi que le rôle de ces cellules. Elucider le fonctionnement de ces cellules pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dermatite atopique et la marche atopique. De plus, comprendre les signaux et cellules impliqués dans la génération des lymphocytes régulateurs pourrait permettre de trouver un traitement pour booster leur production et leur fonctionnement, ceux-ci ayant normalement pour rôle de contrôler les réponses immunitaires et donc par exemple les réponses allergiques.

Procédures

Pour étudier la dermatite atopique, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Parmi ces 252 animaux, 74 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la dermatite atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote. Tous les animaux seront euthanasiés au jour 13 pour collecter les différents organes pour analyses. Pour étudier la marche atopique, 150 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Ces animaux seront ensuite exposés à l'allergène au niveau des voies respiratoires (durée de la procédure : 30 minutes). Cette procédure est effectuée tous les jours du jour 9 au jour 12 (durée totale de la procédure : 4x30 minutes = 2 heures). De plus, les fluides bronchoalvéolaires seront collectés (procédure sans réveil) au jour 13 pour étudier l'inflammation des poumons. Parmi ces 150 animaux, 30 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la marche atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote.

Impact sur les animaux

La sensibilisation à l'allergène au niveau de l'oreille des animaux conduira à une légère inflammation de type dermatite atopique sur l'oreille, se traduisant par une rougeur. Par le passé, nous n'avons pas observé d'autres effets avec ce traitement. De plus, nous avons déjà fait des injections de toxine diphtérique sur d'autres modèles, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Les animaux traités par instillations intranasales d'allergène développeront une légère inflammation des poumons. Tous les animaux seront surveillés et tout effet indésirable sera traité selon les points limites énoncés dans le but de limiter la souffrance des animaux.

Devenir

Après la procédure "Modèle de dermatite atopique" et "Modèle de dermatite atopique + injection de toxine diphtérique" , les 178 et 74 animaux (respectivement) seront euthanasiés selon la procédure autorisée pour étudier les ganglions lymphatiques et la peau. Le dernier jour de la procédure "Modèle de marche atopique" et "Modèle de marche atopique + injection de toxine diphtérique", les 120 et 30 animaux (respectivement) seront euthanasiés pour analyser les voies respiratoires.

Remplacement

L'étude de la réponse immunitaire, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique, met en jeu différents organes et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse immunitaire et le rôle de chaque cellule impliquée.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 402 souris, permettant de caractériser le rôle des lymphocytes Treg et Tfh dans les allergies, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique. Selon les expériences, les groupes comporterons 8 souris (modèle de dermatite atopique) ou 15 souris (modèle de marche atopique), ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres étudiés, à l'aide d'un test de Student (t-test). Dans la partie 4 du projet, dans un but de réduction, l'oreille droite et l'oreille gauche des souris seront traitées différement et seront comparées entre elles. Trois études pilotes seront effectuées lors de ce projet, avec un nombre réduit d'animaux, dans le but de déterminer 1) l'allergène le plus approprié, 2) quand commencer les injections de DT en fonction de l'apparition des lymphocytes Tfh, 3) quand faire les injections de DT et leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales. La sensibilisation est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter la souffrance / stress des animaux. Après ces traitements, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle avec un suivi de l'aspect général des animaux (et en particulier des oreilles), de leur posture et de leur comportement. Une grille d'évaluation de la douleur sera utilisée. Si celle-ci est importante, ils seront retirés de l'étude et pourront bénéficier de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est le modèle choisi pour étudier la dermatite atopique et la marche atopique car le système immunitaire des souris est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée mais également une immunité adaptative, ce qui permet l'étude de la réponse immunitaire spécifique d'un allergène et de la réponse mémoire. De plus, la peau des souris présente des similitudes (épiderme, derme, présence de cellules immunitaires) avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude de la sensibilisation cutanée. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.