Recherche fondamentale

75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenus sous anesthésie gazeuse jusqu'à deux heures et demie, ils reçoivent un candidat-médicament par cathéter dans la veine caudale et subissent jusqu'à dix micro-prélèvements de sang sur 24 heures avant d'être tués pour récolter les échantillons. Le porteur décrit ces micro-prélèvements comme indolores mais reconnaît un stress possible, et signale un risque d'hypothermie ou d'arythmie en cas de défaillance du matériel. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit l'ensemble des phénomènes d'absorption et d'élimination et juge l'approche animale "indispensable".

Objectifs

Le développement de nouveaux médicaments requiert d'étudier le devenir de la substance active dans l’organisme afin de déterminer sa distribution, son métabolisme et son élimination. Ces propriétés influencent la posologie du médicament : dose et fréquence d'administration. L’objectif de ce projet est de mesurer la concentration sanguine de candidats-médicaments en fonction du temps afin de déterminer le volume de distribution, la concentration maximale observée, le temps de demi-vie, la clairance et la valeur d’exposition des candidats-médicaments chez le rat.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner les candidats présentant une concentration élevée et durable dans le sang, alliée à un métabolisme lent et une faible élimination. Ces caractéristiques sont indispensables pour garantir la distribution du candidat-médicament à sa cible et une bonne efficacité. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Cela permettra de réduire drastiquement le nombre d'études nécessaires pour ne mesurer ensuite que l’activité des candidats-médicaments les plus prometteurs et épargnera la vie de centaine d'animaux, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament efficace pour le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse durant plusieurs dizaines de minutes (maximum de 2h30), l'insertion d'un cathéter avec aiguille dans la veine caudale (sous anesthésie, l’aiguille est ensuite éliminée) et des micro-prélèvements de sang répétés à l'extrémité de la queue (maximum 10 prélèvements). La procédure durera un maximum de 24h puis les animaux seront mis à mort afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse durant la perfusion intraveineuse des candidats-médicaments dans la veine caudale et les premiers prélèvements de sang (maximum de 2h30). En cas de défaillance du matériel, une hypothermie ou une arythmie pourrait survenir si elles ne sont pas détectées à temps. Les derniers micro-prélèvements de sang sont réalisés dans la veine caudale, à l’extrémité de la queue, sur les animaux vigiles et non contraints. Ces micro-prélèvements, d’une durée de 1 à 2min, sont indolores mais peuvent être stressant pour quelques animaux qui peuvent manifester leur impatience ou inconfort. Un maximum de 10 micro-prélèvements de sang seront réalisés sur une durée maximum de 24h. D’autre part, une toxicité imprévue d’un candidat-médicament pourrait être mise en évidence et entrainer l’arrêt immédiat de la procédure.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.

Remplacement

Les candidats médicaments auront été sélectionnés préalablement lors des tests in vitro pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un médicament car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animal reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la concentration sanguine en fonction du temps sera réalisée chez le rat, car c’est l’espèce la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La procédure développée et validée permet la réalisation de micro-prélèvements de sang répétés chez un même animal. Cela permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour la détermination de la pharmacocinétique. Elle est effectuée par un technicien rompu à ces manipulations, ce qui garantit une excellente reproductibilité et de limiter encore le nombre d’animaux engager dans les études. Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace de la pharmacocinétique d’un candidat-médicament à l’aide de trois animaux pour un candidat médicament.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Le rat étant un animal social, les rats seront maintenues par groupes sociaux dans des cages enrichies de tubes en carton et de bâtonnets à ronger. Une période d'aclimatation et d'habituation d'une semaine sera respéctée. Les rats seront anesthésiés le temps de la perfusion pour éviter tous risque de blessure et assurer une perfusion efficace et parfaitement repoductible. Le rat sera placée sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés sur les animaux vigiles et non contraints a même de signifier librement tout manquement à leur bien-être. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour visualiser tous signes de toxicité imprévue qui seraient immédiatement suivi de l’arrêt de la procédure.

Choix des espèces

Les rats permettent l’étude des cibles thérapeutiques et des candidats-médicaments et sont suffisamment gros pour qu'une perfusion soit réalisée avec des volumes et des débits comparables à ceux utilisés chez les patients en clinique (0,25 à 2ml/kg/h). Les rats auront minimum 6 semaines, stade adulte, pour débuter les protocoles, car les systèmes immunitaires, nerveux et circulatoires sont matures.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une ligature imprégnée de la bactérie Porphyromonas gingivalis est posée autour d'une dent et renouvelée tous les trois jours pendant 28 jours, pour provoquer une parodontite, suivie d'injections d'une molécule anti-inflammatoire. Toutes sont ensuite tuées par ponction du sang dans le cœur pour prélever les tissus. Le porteur affirme n'observer aucune modification de l'état de santé des souris et présente cette espèce comme la plus utilisée pour l'étude de cette maladie.

Objectifs

La parodontite est une maladie inflammatoire chronique très fréquente (47% de la population adulte américaine). Elle entraine une destruction des tissus de soutien des dents, générant des édentements précoces et une difficulté à la réhabilitation orale. Elle est déclenchée par un déséquilibre du microbiote (plaque dentaire) avec une infection par la bactérie Porphyromonas gingivalis. Les parodontites sont une source chronique de passage de bactéries dans le sang et d'une inflammation généralisée de faible intensité, favorisant des maladies inflammatoires à distance (ex : maladies cardiovasculaires). Il n'existe pas de cibles thérapeutiques de l'inflammation pour le traitement des parodontites, ni de biomarqueurs pour évaluer précocement et mieux suivre des malades, notamment ceux atteints d'autres maladies inflammatoires chroniques. Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans les lésions parodontales et semblent clés dans le développement des parodontites. Récemment, il apparait qu’il existe des sous types de neutrophiles aux fonctions pro-inflammatoires ou pro-résolutives de l'inflammation. Certaines drogues sont des inhibiteurs d'un facteur de la survie et l’activation du neutrophile, et permettent d’inhiber spécifiquement les neutrophiles pro-inflammatoires. Notre objectif est de déterminer si l’inhibition des neutrophiles pro-inflammatoires par administration d’une telle drogue permet de diminuer l’inflammation et la résorption osseuse dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite pendant 4 semaines, selon un protocole validé dans la littérature et maitrisé par notre équipe. Nous caractériserons la destruction du parodonte chez des souris injectées par cette drogue en comparaison de souris injectées avec l’adjuvant de la drogue et de souris contrôle (injectées avec un tampon neutre).

Bénéfices attendus

Notre projet est le premier à tester les conséquences d’une inhibition ciblée des neutrophiles pro inflammatoires par la drogue dans la pathogénie de la parodontite. Il pourrait ouvrir sur des pistes thérapeutiques régulant l’inflammation de la parodontite pour laquelle plus de 30% des situations échappent au traitement conventionnel (traitement qui repose actuellement exclusivement sur le contrôle de l’infection). De plus, une modification par lune drogue ciblant des neutrophiles circulants primés (activés) par l’inflammation parodontale et qui peuvent influer sur des processus pathogéniques à distance, tels que l’athérosclérose, sera recherchée et serait très prometteuse en prévention des comorbidités de la parodontite. Enfin, la parodontite est un modèle parfait de maladies inflammatoires choniques au cours de laquelle la régulation des neutrophiles est primordiale. Elle partage des mécanismes pathogéniques communs avec, par exemple, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la polyarthrite rhumatoïde : les résultats de ces travaux permetteraient donc d’ouvrir des perspectives dans l’étude de la pathogénie et de stratégies thérapeutiques d’autres maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Avant chaque expérimentation, les souris sont anesthésiées par une anesthésie générale par voie intra-péritonéale (IP) de Kétamine 100mg/kg-Xylazine 10mg/kg en solution injectable dans du sérum physiologique. L'intervention chirurgicale sera effectuée selon une procédure qui dure environ 10 min/souris. La procédure consiste en la pose répétée d’une suture de soie chirurgicale 6-0 imprégnée d’une solution de 109 CFU/mL de P gingivalis. Après chaque pose de ligature, les souris sont placées dans un environnement chauffé (tapis) et surveillées jusqu’à leur réveil. Cette procédure est répétée tous les 3 jours pendant 28 jours pour induire une inflammation chronique locale et une destruction du parodonte. Entre chaque renouvellement, les souris seront maintenues dans des cages dans un environnement enrichi avec nourriture et eau ad libidum. Au bout de 14 jours ; une destruction parodontale peut etre observée du coté ligature +/- P gingivalis pour tous les animaux. A 14 jours, les groupes recevront des injections de la solution diluante ou de la drogue pendant les 14 jours suivants, en parallèle de la poursuite du modèle de parodontite expérimental. Les groupes contrôles recevront un volume équivalent d’une solution neutre.

Impact sur les animaux

Notre expérience ne nous montre aucune modification observable de l’état de santé des souris suite à la réalisation des anesthésies par isoflurane et examen radiologique de précision micro-Computed Tomography (micro-CT), comme suite aux anesthésies générales et pose de ligature : aucune de perte de poids, de modifications comportementales, ni de modifications de l’apparence physique pour les animaux contrôles comme pour les animaux injectés avec la solution diuante n’ont été observées. Une prise de poids en accord avec les conditions d’élevage est observée démontrant que les souris se nourrissent correctement. La dose de drogue administrée est évaluée en accord avec la littérature scientifique). Une vigilance accrue sera mise en place pour les groupes d’animaux traités avec cette drogue.

Devenir

A l'issue de la procédure,tous les animaux sont mis à mort par exsanguination cardiaque sous anesthésie et analgésie profonde, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car c'est le seul moyen à l'heure actuelle d’étudier les différents aspects de notre projet, c’est-à-dire analyser l’inflammation du tissu parodontal complexe. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude des parodontites, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie.

Réduction

Une publication sur la comparaison des modèles de parodontite expérimentale avec ligature +/- P gingivalis chez la souris montre une différence significative sur la perte osseuse et l'inflammation parodontale avec 5 souris/groupes (test statistique d’analyse de variance Turkey suivi d’un test t de Student). Le suivi longitudinal par micro- CT sur souris vivante de la perte osseuse induite nous permet aussi de rationaliser le nombre de souris. Une souris supplémentaire par groupe est prévue en cas de mort prématurée au cours de l’expérimentation. Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques sont également basés sur notre expérience pour ce type d’étude. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet et de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

La procédure ne conduit pas à des altérations évidentes des souris. Le suivi quotidien des animaux et la mise en place de points limites permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de la parodontite et tout particulièrement pour l’approche moléculaire et histologique. De nombreux outils d’analyses, qu'ils soient commerciaux ou dans notre laboratoire, sont développés et adaptés à ce modèle. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer colorectal, sous la peau ou par injection dans la rate pour induire des métastases, puis des injections de microbulles et des ultrasons deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte des points limites. Le porteur cite parmi les atteintes la douleur de la chirurgie du ventre et la dégradation de l'état général liée à la croissance de la tumeur. Il affirme qu'à cette étape le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle in vitro ou in silico.

Objectifs

Evaluer différents types de microbulles pour la délivrance d’un protocole de chimiothérapie, l’irinotécan (libre et encapsulé) par action combinée de microbulles et d’ultrasons (appelé également sonoporation).

Bénéfices attendus

Optimiser le modèle murin de métastases hépatiques de cancer colorectal Optimiser la procédure d’imagerie CT des métastases hépatiques de cancer colorectal Améliorer l’efficacité thérapeutique de l’irinotécan libre et encapsulé pour le traitement du cancer colorectal

Procédures

Procédure 1 Evaluation de microbulles de gaz pour la délivrance d'une chimiothérapie par sonoporation dans un modèle murin de cancer colorectal sous-cutané chez la souris 1- identification par puce – insertion sous cutanée du trocart –anesthésie gazeuse– 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 2- injection sous cutanée de cellules tumorales – anesthésie gazeuse - 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 3- i.v. microbulles gaz et/ou chimiothérapeutiques et/ou ultrasons (

Impact sur les animaux

- Le stress lié à la manipulation des animaux - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale - La douleur induite par la chirurgie abdominale - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale

Devenir

Procédure 1 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude. Procédure 2 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons réalisé des expériences sur des cellules cellulaires dont les résultats sont particulièrement encourageants et nécessitent d'être validés avec un modèle préclinique. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in silico.

Réduction

Grâce à un plan d’expérience, les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 20 souris (10 mâles et 10 femelles). Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si ces différentes thérapies permettent une diminution significative de la croissance, du métabolisme et de la perfusion tumorale (Puissance de test: 80%, Seuil de risque: 0.05).

Raffinement

Les nuisances ou effets indésirables des procédures 1 et 2 seront évalués par le personnel de zootechnie et par les responsables de l’étude. Les animaux seront observés une fois par jour afin d’évaluer leur stress/leur douleur après les différentes procédures réalisées sous anesthésie gazeuse (Vetflurane). - Le stress lié à la manipulation des animaux : Les souris seront hébergées en présence d'un objet d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique) en groupe. Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale. Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale : L’animal est réchauffé par une couverture chauffante. - La douleur induite par la chirurgie abdominale : La douleur sera prise en charge par une analgésie adaptée (Buprénorphine 0.05 mg/kg et lidocaïne) en pré- et post-opératoire. - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale : Le poids sera mesuré tous les deux jours et les animaux seront observés tous les jours selon les critères ci-dessous : (1) Détérioration générale de l'état sanitaire, altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir et de boire, locomotion réduite, dos vouté et yeux enfoncés). (2) Cachexie associée à une perte de poids de 17% du poids total de l'animal. (3) Symptomologie évocatrice : Saignements, urines ictériques, dyspnées ou sibilances… La manifestation d'un seul de ces signes cliniques conduira à une euthanasie par dislocation cervical après anesthésie au vetflurane (5%) par une des personnes en charge de l'étude. Une analgésie ne pourra pas être administrée aux animaux pendant la croissance tumorale car cette première influence cette dernière.

Choix des espèces

Dans la littérature et pour la lignée cellulaire CCR choisie pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes. Dans la littérature et pour les lignées cellulaires CCR choisies pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes de 6 semaines environ pour un poids de 20 g.

1 386 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale par la bactérie de la coqueluche, hébergés avec des animaux sains pour étudier la transmission, puis tués pour prélever nez et poumons. Le porteur indique une surveillance quotidienne du poids et du comportement, une perte de plus de 20 % du poids pouvant déclencher la mise à mort. Il présente le hamster comme un modèle permettant, contrairement à la souris, d'étudier la transmission par aérosol, et revendique le recours à l'animal pour valider son vaccin vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier une phase critique de la coqueluche qui est la phase de transmission et la potentialité de notre vaccin vivant à protéger contre l’infection bactérienne par aérosolisation naturelle.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d’étudier et comprendre la phase de transmission de Bordetella pertussis dans un modele Hamster et de potentialiser notre vaccin vivant pour définir la protection médiée contre une infection par transmission naturelle par infection nasale.

Procédures

1) administration intranasal de Bordetella chez le hamster (5 min par animaux). Les animaux seront euthanasiés 0, 3, 7, 14,21, 28 et 56 jours post administration pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 2)exposition des animaux sains à l'infection par co-hebergement avec les animaux infectés. Le temps de co-hebergements est de 0, 7, 14, 28 et 56 jours, ensuite les animaux sains et infectés initialement seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 3) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3h et 7j après ce challenge, les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons. 4) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront mis en contact avec des hamsters préaleblement infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3 heures, 14 jours, 28 jours et 56 jours après la mise en contact les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà démontré que l’infection nasale par BPZE1 dans un modèle hamster ne provoque aucun symptôme bien que les bactéries puissent coloniser le nez pendant 56 jours. En revanche bien que la littérature montre une résistance naturelle des hamsters à Bordetella bronchiseptica, nous ne connaissons pas la virulence des souches cliniques de Bordetella pertussis ni des souches de Bordetella parapertussis dans le modèle hamster.

Devenir

Les hamsters seront mis à mort à la fin de chaque expérience pour la récupération des nez et poumons ou à l'atteinte des points limites

Remplacement

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. Les modèles in vitro ou in silico ne suffisent pas pour comprendre les phénomènes de colonisation et d’induction de l’immunité induits par l’infection. En outre, dans l’optique de positionner le vaccin BPZE1P comme protecteur contre une infection naturelle, son efficacité doit être validée par une expérimentation animale in vivo. D'autre part l'etude de la phase de transmission necessite de mettre en contact (cocconing) les animaux infectés avec des animaux sains pour tenter de mimer une infection naturelle, cette etape ne peut etre reproduite in vitro.

Réduction

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse.

Raffinement

Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. nous serons extrêmement vigilants sur le respect de la notion de points limites. Chaque jour, les critères de souffrance seront évalués (changement comportemental, prostration, etc.) à l’aide d’une grille de cotation. Dans le cas où le score atteint le seuil limite fixé, l'animal sera mis à mort. Les résultats de la procedure 2 nous permettra d'affiner les points de prelevement d'organe pour la procedure 5 ce qui limitera le nombre d'animaux utilisés. Le bien-être animal sera vérifié quotidiennement au travers de : - Contrôle du poids de l’animal (si une perte de poids de plus de 20% était observée, nous procéderions à l’euthanasie des animaux concernés) - Comportement général de l'animal (prostration, isolement dans la cage ou au contraire hyperactivité) - Aspect physique, en particulier si le poil est hérissé ou si la respiration est rapide ou saccadée (puisque Bordetella pertussis responsable de la coqueluche est une maladie respiratoire).

Choix des espèces

Le modele animal utilisé pour étudier Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche chez l'humain, est depuis plus de 30 ans le modèle murin. En effet cette bactérie colonise transitoirement le nez et le poumon de la souris. Cependant, la pathologie humaine de la coqueluche met en évidence une infection des voies aériennes supérieures (nez, trachée, bronche) mais très rarement l’entièreté du poumon. Le mode d’infection utilisé pour le modèle murin semble être trop intrusif pour mimer complètement l’infection naturelle humaine. D’autre part, malgré de nombreux essais, le modèle murin ne permet pas d’étudier la phase de transmission car les souris ne toussent pas et n’aérosolisent pas la bactérie. En revanche, le modèle hamster a été mis en évidence comme permettant l’aérosolisation de particule virale du SARS-COV2 et permet l’infection d’animaux naïfs présents dans la même cage avec une séparation physique. l'age de 3 semaines et le sexe sont liés au fait que des hamsters males de 3 semaines ont deja ete utilisés dans un autre protocol APAFIS#27475-2020100514546435 v3 et nous voulons puvoir comparer les resultats experimentaux avec ces deux projets l'age de 3 semaines est aussi liée au fait que les animaux qui seront vaccinés a deux reprises par le vaccin acellulaire auront alors 11 semaines lors du challenge avec les souches de Bordetella

La buprénorphine est prévue à partir du score 2 de la grille de surveillance, et toute souris qui atteint le score 3 est tuée sur-le-champ par dislocation cervicale, les autres l'étant au cinquième jour de l'infection. 1 200 souris femelles adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles subissent soit une injection sous-cutanée de bactéries issues de la peau humaine, qui peut provoquer des abcès, une infection généralisée et de la douleur, soit une plaie de 4 mm faite au punch puis infectée, avant deux prélèvements de sang derrière l'œil, au deuxième et au cinquième jour. Il s'agit de comprendre comment ces bactéries colonisent durablement la peau de patients atteints de maladies génétiques de la peau, comme l'épidermolyse bulleuse, et de tester des molécules anti-inflammatoires et antibactériennes, un travail qui, selon le porteur, "pourra contribuer à mieux traiter les patients".

Objectifs

Il existe des maladies génétiques telles que les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton caractérisées par une fragilité de la peau (génodermatoses). Les patients atteints de génodermatoses présentent des plaies qui sont infectées par des bactéries du microbiote cutané s. Les patients atteints des formes les plus sévères d’epidermolyse bulleuse présentent de larges décollements cutanés et développent des plaies infectées chroniques qui peuvent entraîner des cicatrices et une fibrose. Il est probable que la multiplication des bactéries sur la plaie, appelée "colonisation critique" dans la pratique clinique, entrave la cicatrisation et favorise l’inflammation locale et générale. En outre, les infections cutanées répétées favorisent les carcinomes spinocellulaires agressifs sur les sites exposés à des blessures continues. Les protéines (cytokines, chemokines, facteurs de croissance) exprimées au niveau de la plaie par les différentes populations cellulaires de la peau (kératinocytes, fibroblastes, cellules immunitaires) sont essentielles au processus de guérison et sont susceptibles d'être influencées par la colonisation par les bactéries du microbiote cutané. L'impact des différents types de souches bactériennes adaptées à l'hôte sur les signaux pro-inflammatoires et profibrotiques dans le contexte des plaies est mal connu. Les Objectifs scientifiques sont (i) comprendre pourquoi et comment les souches bactériennes issues de la peau humaine parviennent à coloniser de façon chronique la peau des patients atteints de pathologies de la barrière cutanée (ii) identifier les liens entre l'infection cutanée et les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte. Les objectifs cliniques sont (i) tester l’impact de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes sur la colonisation bactérienne des plaies et sur les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte(ii) identifier les marqueurs de virulence bactérienne.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des infections chroniques de la peau chez les patients atteints d’altération de la barrière cutanée, comme les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton, en exploitant des souches bactériennes issues de la peau humaines. Nous comparerons 2 modes d’infection pour évaluer l’impact local des souches (infection de plaies) et leur capacité à disséminer à partir d’un abcès (infection sous-cutanée). Ceci nous permettra de mieux comprendre le rôle des bactéries dans les lésions localisées et dans les lésions compliquées d’infection disséminée. Il est fondamental de comprendre l'impact des infections. Notre projet vise à identifier des marqueurs de sévérité des infections chroniques de la peau pour une meilleure anticipation et gestion des complications chez les patients. Notre projet prévoit aussi de tester des molécules visant à inhiber l'inflammation et la fibrose de la peau ce qui pourra contribuer à mieux traiter les patients. En outre, notre projet peut aider à fournir une compréhension physiopathologique plus large des mécanismes complexes qui sous-tendent les dermatites chroniques également associées à des infections cutanées, comme la dermatite atopique et les plaies chroniques non cicatrisantes des diabétiques.

Procédures

Au cours de l’ensemble des procédures, les interventions réalisées sur les animaux seront : (i) Procédure 1 : Inoculation bactérienne sous-cutanée (1minute par animal). (ii) Procédure 2 : Lésion artificielle et inoculation bactérienne (15minutes par animal). (iii) : Anesthésie (3 fois au cours de chaque procédure, 5minutes par animal). (iv) Prélèvement sanguin rétro-orbitaire (2 fois au cours de chaque procédure, volume de 30 à 60ul de sang, 3 minutes par animal). (v) mise à mort par dislocation cervicale (quelques secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances infligées chez la souris sont (i) inoculation par injection sous – cutané, réalisée sous anesthésie gazeuse peut provoquer une infection profonde pouvant provoquer des abcès ou une infection systémique possiblement douloureuses (ii) la réalisation d’une plaie artificielle de 4mm par punch biopsy sous anesthésie peut entrainer une douleur. (iii) les prélèvements de sang rétro-orbitaire, réalisé sous anesthésie, à J2 et J5 peuvent engendrer une douleur. Pour le respect du principe des 3R la durée et les doses des infections seront réalisées selon les protocoles préétablis pendant une période d’infection de 5 jours ou la perception du stimulus qui causent la douleur sera surveillée par les critères relatifs au bien-être animal, selon une grille de score.

Devenir

Tous mis à mort par discolcation cervicale à J5 de l'infection.

Remplacement

Des expériences in vitro seront réalisées lorsque cela est possible pour démontrer le rôle précis de certains types cellulaires (keratinocytes, neutrophiles). Toutefois, les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d’obtenir des modèles d’infection impliquant de nombreux types cellulaires interagissant les uns avec les autres et impossible à reproduire in vitro. En effet, au cours de l’infection les interactions entre les cellules de la peau (keratinocytes et fibroblastes) et les cellules immunitaires (neutrophiles, cellules de Langerhans, lymphocytes..) ont un rôle fondamental dans la capacité de l’hôte à éradiquer les bactéries pathogènes. De plus, l’infection est caractérisée par des symptômes uniquement observables chez l’animal (abcès). Il est donc impossible de reproduire efficacement un processus biologique aussi complexe impliquant le système immunitaire uniquement par des études in vitro. L’expérimentation animale est donc un élément clé de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous utiliserons des souris femelles adulte s. Le nombre de souris qui sera inclus dans chaque groupe sera le plus faible possible pour pouvoir assurer la reproductibilité des expériences et répondre aux questions scientifiques . Le nombre d'animaux sera de 12 souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs. L’application de tests statistiques ( Student test, Anova) efficaces sur le nombre des échantillons collectés réduira l’utilisation des animaux dans les différentes conditions expérimentales.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation du décret n°2013-118 et adaptées. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement des animaux par la mise à disposition de la nidification, de maisonnette et de bâtonnets en bois à ronger. Les animaux disposent de nourriture, d’eau et de litière. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux et de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance journalière et une durée limitée à 5 jours. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est sensibilisé à la détection des signes de souffrance des animaux et qualifié sur le plan réglementaire, technique en continu. Pendant la période de quarantaine les animaux seront familiarisés par la prise en main et la contention par l’expérimentateur. Pour limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le test des réflexes à la douleur (pincement du coussinet de la patte), les prélèvements sanguins rétro-orbitaire sont réalisés sur souris anesthésiées à l'isoflurane. La fréquence est de 2 prélèvements à J2 et J5 de l’infection en alternant les prélèvements des yeux. Afin de limiter la souffrance infligée lors des prélèvements sanguins, de l’ocry-gel sera appliqué en préventif sur l’œil prélevé, 5 min avant le prélèvement rétro-orbitaire. Des antalgiques sont prévus en pré-opératoire et en cas de souffrance en post -opératore si le score est égal à 2 (injection sous cutanée de 50ul de buprénophine à 0,05mg/kg). En cas d’atteinte de point limite égal à 3 , nous procèderons immédiatement à la mise à mort par une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Au cours des quarante dernières années, la recherche sur les maladies infectieuses a fait de la souris un modèle de choix pour les maladies infectieuses humaines, permettant la mise au point de traitement efficaces et de réponses scientifiques. La pathologie de la peau développée suite à l’injection de bactérie chez la souris est très similaire à celle développée chez l’homme. Un autre facteur important la petite taille de l’animal, la courte gestation et la grande taille des portées rendent les souris facile à élever que tout autre mammifère actuellement utilisé pour la recherche sur les maladies infectieuses. Les souris adultes seront utilisées afin que le système immunitaire soit mature.