Recherche fondamentale

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie pour l'implantation d'un capteur sous-cutané porté dix-sept jours, toutes courent ou marchent sur un tapis, puis sont endormies profondément pour des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien. Le porteur indique que l'étude vise à savoir si certains neurones de la moelle épinière thoracique participent à la régulation cardiovasculaire, un objectif de connaissance fondamentale sans application annoncée. Les animaux sont mis à mort pour collecter un maximum de tissus.

Objectifs

Cette demande d’autorisation de protocole s’inscrit dans un projet plus large qui vise à déterminer si les neurones présents autour du canal central dans la moelle thoracique et qui sont en contact avec le liquide céphalorachidien (cellules appelées LCR-cNs) font partie du système nerveux autonome sympathique (SNAS) en charge, entre autres, de la régulation cardiovasculaire. L’objectif de ce projet sera donc de regarder la pression artérielle de base et sa modulation lors d’un exercice moteur chez des souris dont les LCR-cNs seront spécifiquement invalidés pour le gène codant pour une protéine appelée PKD2L1 qui leur confère une sensibilité aux déformations mécaniques et aux variations de pH. En parallèle de ces expériences, nous regarderons l’effet d’un exercice physique sur la composition du plasma sanguin et du LCR chez la souris. Les molécules identifiées seront alors testées sur l’activité des LCR-cNs en tranches par des approches électrophysiologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de savoir si l'activité de certains neurones de la moelle épinière thoracique sont capables de moduler la commande nerveuse du système nerveux autonome et de participer à la régulation du tonus cardiovasculaire. Ces neurones constitueraient ainsi un système sensoriel intrinsèque à la moelle épinière qui pourrait informer directement les réseaux neuronaux des changements métaboliques de l’organisme sans obligatoirement passer par les structures présentes dans l’encéphale. Les informations recueillies fourniront de nouvelles données sur l’organisation de la moelle épinière et son implication dans la régulation des fonctions vitales.

Procédures

Certains animaux subiront une chirurgie peu invasive d’une heure environ pour suivre leurs paramètres cardio-vasculaires dans le temps et courront sur un tapis, 15 minutes pendant 4 jours d’affilé (n=28) Ces animaux porteront un capteur en sous-cutané pendant 17 jours. D'autres marcheront (n=24) ou courront (n=48) à 2 vitesses différentes (24 animaux par vitesse), pendant 15 minutes. Enfin les 24 marcheurs, 48 coureurs et 24 sédentaires seront profondément endormis avant des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie peu invasive mais seront suivis avec une analgésie adaptée. Les animaux marcheront ou courreront pendant 15 minutes sur un tapis roulant après une phase d'entrainement où aucun système aversif ne sera utilisé

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures car nous travaillons à mieux comprendre des systèmes biologiques aujourd'hui mal connu et il est important de collecter un maximum d'information via les prélèvements de tissus.

Remplacement

Cette étude in-vivo fait suite à plusieurs années de recherche ex-vivo sur des moelles épinières extraites. Malgrès les nombreuses connaissances accumulées, il est impossible de mettre en évidence les interactions entre les populations de cellules de la moelle épinière étudiées ici et le reste de l'organisme sans réaliser des expérimentations in vivo.

Réduction

Afin de cibler très précisément des questions soulevées par le projet, des études préliminaires sur moelles extraites ont été faites et ont permis de grandement limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus le nombre d'animaux a été reduit au minimum afin d'avoir des résultats statistiquement viables à exploiter . Enfin pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté (télémétrie ). Ainsi, chacun des animaux sera son propre contrôle (avant et après exercise physique). Le nombre d’animaux a été établi sur la base des minimums nécessaires pour effectuer des tests statistiques robustes et des données bibliographiques dont nous disposons.

Raffinement

La technique de télémétrie permet à l'animal d'être libre de ses mouvements dans la cage. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (anesthésie et analgésie), les conditions d'asepsies seront respectées (stérilisation du matériel) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé . Les animaux seront vus quotidiennement et seront évalués suivant une méthode d'évaluation validée avec des points limites gradés et précis. Toutes les cages seront enrichies avec du matériel de nidification et un tunnel en carton.

Choix des espèces

La souris est une espèce dont le génome est parfaitement connu et que l'on peut très facilement manipuler. Ainsi dans le cadre de notre étude, la lignée cellulaire à étudier a été ciblée en supprimant un gène cible. De plus, la souris est une espèce dont la gestation et la phase juvénile est courte, permettant ainsi d'avoir régulièrement des animaux au génotype voulu. Les animaux seront utilisés adultes (autour de 7 semaines). Nous devons attendre que les animaux fassent 22gr pour leur implantation en télémétrie (recommandation du fabriquant) mais nous ne voulons pas avoir des animaux trop âgés par soucis technique (implantation facilitée chez les individus jeunes).

16 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches embryonnaires leur sont injectées dans les testicules par chirurgie pour y former des tumeurs bénignes, analysées ensuite au microscope. Le porteur indique que l'ensemble du projet a jusqu'ici été mené sur cellules en culture, sans animaux, et que le recours à la souris vise à démontrer un résultat réclamé dans la phase de finalisation pour publication. Les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection ou dès l'atteinte des points limites.

Objectifs

Contexte. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) apparaissent au début de l’embryogénèse et sont à l’origine de la formation de tous les tissus qui constituent les embryons. Les cellules ES peuvent être cultivées en laboratoire indéfiniment, tout en conservant leurs 2 propriétés principales. 1) l’auto-renouvellement qui permet à une cellule ES de se diviser en 2 cellules filles identiques. 2) La pluripotence, c’est à dire la capacité à changer d’identité pour se transformer en toutes les cellules constituant les organes. Comprendre comment les cellules ES conservent leur identité ou en changent est donc essentiel pour différents champs d’application de la biologie et de la médecine car cela contribue aussi bien à améliorer la médecine de la reproduction qu’à mieux comprendre certaines pathologies humaines telles que le cancer. Hypothèse. Depuis 2018, une protéine a été identifiée pour son implication dans un mécanisme biologique essentiel qui aboutit à la fabrication des protéines, appelé traduction. Il a été établi que cette protéine est très exprimée dans les cellules ES et est essentielle pour qu’elles conservent leur capacité à se diviser à l’identique mais pas pour leur capacité à changer d’identité (pluripotence). Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules ES en culture et doivent maintenant être confirmées par des expériences in vivo qui miment le développement embryonnaire. Description du modèle. Toutes les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules ES de souris, aussi les tests in vivo doivent être réalisés chez la souris afin de limiter les biais d’analyse entre différentes espèces. Le test in vivo consiste à injecter des cellules ES dans les testicules de souris mâles adultes. Les cellules ES injectées vont former des tumeurs bénignes non disséminantes et constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules ES qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires différenciés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées. Objectif. Le projet a pour finalité de déterminer si la perte de la protéine impliquée dans la traduction dans les cellules ES entraîne une modification de leur capacité à changer d’identité in vivo afin de confirmer les nombreuses observations qui ont été réalisées sur des cellules ES de souris in vitro.

Bénéfices attendus

L’étude des processus responsables du développement précoce des embryons chez l’homme et chez les mammifères contribue à l’amélioration de la prise en charge de l’infertilité (par ex., fécondation in vitro). Un des modèles biologiques les plus étudiés pour mieux comprendre ces processus sont les cellules souches embryonnaires (ou cellules ES). Les cellules ES présentent le gros avantage de pouvoir être cultivées en laboratoire tout en conservant leur capacité à former tous les tissus qu’on retrouve dans les embryons qui se développent. Pour améliorer nos connaissances de la biologie du développement des embryons, il est donc essentiel de décortiquer les mécanismes qui contrôlent l’activité des cellules ES et donc les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes dans ces cellules ES. De plus, ces mécanismes fondamentaux peuvent être conservés dans d’autres types de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules ES présente un enjeu majeur aussi bien pour la recherche fondamentale en biologie, pour la médecine de reproduction et pour la cancérologie. Au cours d’une étude portant sur le rôle du mécanisme responsable de la synthèse des protéines dans les cellules ES chez la souris, et un tout nouveau facteur a été identifié comme jouant un rôle essentiel dans ce mécanisme. Grâce à des approches in vitro, c’est à dire, sur des cellules en culture en laboratoire, ce facteur a été montré comme essentiel pour préserver les propriétés des cellules souches. Ce facteur est présent dans d’autres types de cellules souches (cellules ES humaines, cellules souches adultes, cellules souches cancéreuses) et pourrait donc jouer un rôle important dans le développement des embryons humains et dans certains types de cancers tel que le cancer du colon où il est fortement exprimé.

Procédures

Les souris seront soumise à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 10-15 min sous anesthésie générale et traitement entalgique pour éviter toute douleur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à postériori causées par l’animal lui-même par démangeaisons, iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules ES dans les testicules.

Remplacement

Jusqu’à présent, tout le projet a complètement été réalisé grâce à des expériences en laboratoire sur cellules ES de souris, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans sa phase de finalisation pour publication, il nous est demandé de démontrer par d’autres approches que les cellules ES que nous étudions, maintiennent leur capacité à générer des embryons. Cela ne peut être réaliser sans le recours à des modèles animaux.

Réduction

Le nombre de souris utilisées sera réduit à 16 (2 groupes de 8 souris) pour les raisons suivantes : 1) Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. 2) Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de tissus adultes au sein des tumeurs bénignes mais nous ne recherchons d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules ES développent des tumeurs bénignes dans les testicules. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 8 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tératomes analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.

Raffinement

Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (2 à 3 fois par semaine) afin de détecter tout signe de souffrance qui conduirait à la mise à mort de ces souris. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés pendant l’expérimentation avant, pendant et après la procédure opératoire.

Choix des espèces

L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches embryonnaires de souris. Bien que nous ayons montré que le rôle de la protéine candidate est conservé dans les cellules souches embryonnaires humaines et dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de souris, il nous apparaît donc plus opportun de réaliser les expériences de formation de tératomes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches embryonnaires dans les tératomes. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de tératomes.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par asphyxie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés en cage métabolique puis mis à jeun seize heures, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des farines de quatre insectes destinées à l'alimentation humaine. Le porteur reconnaît que l'environnement appauvri et la privation de nourriture induisent une angoisse et un stress modérés. Il affirme que ces effets nutritionnels ne peuvent être évalués in vitro ni maîtrisés directement chez l'homme.

Objectifs

Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de poissons (dont la disponibilité diminue) et de viandes. Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à̀ la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets organiques et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Suite aux résultats obtenus dans une étude préliminaire précédemment autorisée, il a été identifié une première farine d’insectes, source de protéines et enrichie en certains oligo-éléments (fer). Dans ce contexte, cette étude a pour objectif d’approfondir les effets observés en évaluant les impacts sur d’autres nutriments (fibres, acides gras, acides aminés) mais aussi en évaluant des impacts physiologiques (activité anti-inflammatoire, effet prébiotique, effet sur l’immunité). De plus, 3 autres types de farines provenant d’autres insectes seront étudiées et comparées.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le statut nutritionnel en minéraux, oligo-éléments, vitamines, acides aminés, acides gras essentiels et le statut antioxydant de ces farines d'insectes seront supérieur à une alimentation standard, ce qui mettra en évidence un potentiel bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées en alimentation humaine en substitut aux protéines d'origine animale.

Procédures

Les rats seront placés en cage métabolique pendant 40 heures au total. Durant les 24 premières heures, les rats recoivent eau et aliments spéciaux sans restriction. Ensuite, les rats seront placés à jeun pendant 16 heures toujours en cage métabolique, l'eau sera accessible sans restriction durant cette période. A l'issue de la procédure expérimentale, les rats seront mis à mort par asphyxie.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole et la mise à jeun pendant 16h, ceci classe la procédure en classe gravité modérée selon les recommandations réglementaires (https://www.legifrance.gouv.fr/loda/id/LEGITEXT000027038877/2020-09-23/) : en effet, l'environnement apauvri (pendant 2 jours) et la privation alimentaire (pendant une journée) induisent une angoisse et un stress modérés.

Devenir

Les rats seront mis à mort par asphyxie afin de recueillir tissus et organes qui doivent être analysés pour obtenir les résultats scientifiques escomptés.

Remplacement

L'étude des effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (42 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres, ce qui ne serait pas possible si l’étude était réalisée directement chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. De plus, nous souhaitons tester des farines issues de quatre insectes qui présentent des propriétés nutritionnelles différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à proposer pour l'alimentation humaine.

Raffinement

Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera ajouté au maximum 30 % de farines d’insectes. La formulation finale des aliments permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels, caloriques et physiologique des rats (aliments sous forme de croquettes à ronger). Les animaux seront hébergés dans des cages individuelle, dans un environnement adapté et contrôlé dépourvu de pathogènes. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies sans restriction excepté pendant les heures de jeun. Le milieu sera enrichi pour pallier l'isolement. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle animal a été choisi en tenant compte de la littérature récente. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des rats. Nous nous appuyerons sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. De plus, ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude préliminaire précédemment autorisée réalisée sur des rats. Nous utiliserons de jeunes rats âgés de 6 semaines au démarrage de l’étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc adapter notre modèle animal à cette tranche d'âge.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées à un allergène par injections intrapéritonéales puis intranasales sous anesthésie, avant des mesures respiratoires réalisées après trachéotomie sans réveil, pour produire des lignées de cellules de muscle lisse bronchique. Le porteur indique un risque de dyspnée corrigé par nébulisation de salbutamol. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du remodelage bronchique, tout en présentant ces cultures cellulaires comme un moyen de réduire à terme le nombre de souris.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autre des altérations de l’épithélium, des modifications de la matrice extracellulaire, un épaississement de la membrane basale, une hyperplasie des cellules à mucus, et une augmentation de la taille du muscle lisse bronchique (MLB). La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. Les muscles lisses des bronches d’asthmatique se caractérisent par l’excès de prolifération cellulaire dont les mécanismes sont encore inconnus. Les travaux de notre laboratoire ont déjà mis en évidence un lien entre la taille du muscle lisse bronchique et l’augmentation de la masse mitochondriale. L’augmentation de la masse mitochondriale est un support pour la prolifération des cellules du muscle lisse bronchique. L’étude sur les cellules musculaires lisses bronchiques en culture offre une possibilité de mieux déceler les mécanismes sous-jacents à l’augmentation de la masse mitochondriale des MLB et à son influence sur le remodelage bronchique. Le but de ce travail est de produire les lignées primaires de MLB à partir des bronches de souris témoins et asthmatiques sensibilisées soit à l’ovalbumine soit aux acariens. Ces cellules primaires seront analysées avec les techniques très variées. Les résultats ainsi obtenus seront comparés avec ceux obtenus avec les lignées primaires de MBL humaines de témoins et asthmatiques. Cette approche nous indiquera les mécanismes communs jouant le rôle primordial dans l’asthme. Cela permettra également d’apercevoir les différentes caractéristiques des MLB suite au fait d’être allergique aux acariens ou à l’ovalbumine.

Bénéfices attendus

L’obtention des cultures primaires des MLB des souris asthmatiques et témoins permettra considérablement élargir le champs techniques d’études de remodelage bronchiques. Les résultats ainsi obtenus seront comparés avec ceux obtenus avec les lignées primaires de MBL humaines des témoins et asthmatiques. Cette approche in vitro nous indiquera les mécanismes communs jouant le rôle important dans l’asthme. Cela permettra également de repérer la différence dans les caractéristiques des MLB suite au fait d’être allergique aux acariens ou à l’ovalbumine.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections intrapéritonéales de l’allergène et à 9 injections intranasales sous l’anesthésie gazeuses (2 minutes). A la fin de protocole les mesures des paramètres respiratoires seront effectuées sur les animaux trachéotomisés (protocole sans réveil sous anesthésie).

Impact sur les animaux

Le risque de dyspnée chez les animaux suite à l’instillation de l’allergène sous anesthésie gazeuses existe. Après l’anesthésie, les animaux seront observés par l’opérateur et la dyspnée éventuelle sera corrigée par la nébulisation de salbutamol.

Devenir

L’objectif de ce projet est la récupération des bronches des animaux asthmatiques et témoins afin de produire les lignées primaires de MLB. La première phase nous permet de développer l’asthme murin. Lors de la seconde phase, les mesures des paramètres respiratoires seront faites et les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. L’utilisation du modèle d’asthme chronique murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes. Les lignées primaires des MLB nous permettront d’utiliser plusieurs techniques additionnelles pour déceler les causes de la maladie. Au final, cela permettra de réduire le nombre des souris de l’expérimentation animale dans l’étude de l’asthme.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 10 souris dans chacun des trois groupes pour trois productions des lignées primaires en question. Le nombre défini est le nombre minimal de souris qui peut être utilisé pour l'obtention de données scientifiques robustes.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations, analgésie et anesthésie pour les mesures des paramètres respiratoires), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupes sociaux, copeaux et bâtons), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales d’allergène, peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml). La dernière phase du projet, comporant les mesures des fonctions respiratoires est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique adaptée, sans réveil pour l'animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes adultes âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.

345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections d'agents de contraste radiomarqués et un prélèvement de sang intracardiaque suivi de la mise à mort, pour étudier la détection du zinc par imagerie. Le porteur indique un suivi par grille de score, avec mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si les signes cliniques s'aggravent. Il affirme que la complexité des tumeurs pancréatiques ne peut se modéliser que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans le pancréas : le zinc est relargué avec l’insuline et est impliqué dans le diabète mais aussi dans le cancer pancréatique. C’est estimé que le cancer du pancréas deviendra la deuxième cause de mortalité liée au cancer au cours de la prochaine décennie, dans les pays occidentaux. Son pronostic actuel est extrêmement mauvais avec un taux de survie global à 5 ans de seulement 3% en raison de l'absence de symptômes spécifiques et de l'absence de diagnostic précoce. Des chercheurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au zinc. Après complexation avec le zinc présent au niveau du pancréas, il va s’ensuivre une variation du signal sur l’image du pancréas. Des études précédentes, déjà validées par le ministère, ont permis l’obtention de preuve de concept de la détection IRM de Zn2+ in vivo dans le cadre du diabète et dans le cadre de l’adénocarcinome de pancréas. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. L’objectif de cette saisine est d’étudier la biodistribution in vivo (par tomographie d’émission monophotonique, TEMP) et ex vivo (prélèvement d’organes post-mortem à des temps précis), des agents de contraste développés (et validés en IRM) en souris saines et souris modèle de cancer de pancréas (modèles adénocarcinome et insulinome), à l'aide des analogues marqués à l'111In ou à l'165Er, deux émetteurs gamma possibles de visualiser par TEMP.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette demande est donc d'évaluer la possibilité de détecter et quantifier le zinc par TEMP, grâce à des agents de contraste dédiés, développés par le client, dans des souris témoins saines et modèles de cancer du pancréas. Des biodistributions ex vivo de ces agents de contraste sont réalisées. L'objectif à long terme de ce projet sera de fournir un diagnostic précoce aux populations à haut risque afin d'accroître leur taux de survie et d'améliorer le suivi des patients après traitement.

Procédures

270 souris auront des greffes orthotopiques au niveau du pancréas (procédures 1, 2, 3) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirugie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 75 souris vigiles (dont 60 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 2 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue (à un temps précoce J7 et à un temps tardif J21 ou J35) (procédure 2) et 180 souris vigiles (dont 120 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 1 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue. 180 souris vigiles portant une tumeur du pancréas recevront une IP de 50μL de glucose 40% (modèle insulinome dans les procédures 1, 2 et 3). 180 souris ((dont 120 avec des tumeurs du pancréas) anesthésiées à l'isoflurane (2% dans l'air) subiront un prélevement sanguin de 400μL en intracardiaque qui sera immédiatement suivi par la mise à mort sans réveil intermédiaire. (procédure 3)

Impact sur les animaux

Les dommages attendus lors de ce projet sont dûs au développement tumoral pancréatique. Pour suivre cela, nous mettons en oeuvre une grille de scoring qui permettra de prendre les mesures nécessaires afin d'éviter toute souffrance chez l'animal. En pratique, une perte de poids et une modification du comportement pourront être observés (diminution de la locomotion, prostration, amaigrissement, aspect du pelage).

Devenir

Procédure 1: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever les foies et les pancréas post mortem pour le dosage du Zinc présent. Procédure 2: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les souris ayant des tumeurs pancréatiques et ayant été injectées avec des agents de contraste radiomarquées ne peuvent être réutilisées. Procédure 3: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort, afin de pouvoir prélever différents organes (pancréas, rate, foie, coeur, poumons, reins, cerveau, intestins, muscles) post mortem afin de quantifier précisément des molécules marquées à l'111In ou à l’165Er préalablement administrées.

Remplacement

Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisqu'à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs pancréatiques et la distribution des agents de contraste à tester in vitro ; cette étude ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.

Raffinement

Les animaux seront suivis par observation individuelle chaque jour de la semaine pour anticiper, le cas échéant, le développement de douleurs ou de souffrances. Les animaux seront également suivis individuellement par pesée 1 fois par semaine. Si une perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, cela entraînera la mise à mort de l’animal (points limites). Par ailleurs, l’absence de socialisation des animaux, le changement d’aspect de la peau (reflet de la qualité du toilettage de l’animal) et l’absence de toilettage seront évalués quotidiennement pour anticiper la souffrance des animaux. Les modèles de tumeur pancréatique peuvent se dérouler sur une période maximale de 35 jours postinjection des cellules. De par notre expérience, à J35, les tumeurs auront une taille inférieure ou égale à 100mm3. Si toutefois un animal venait à présenter des signes de souffrance, il serait mis à mort avant. Une grille de scoring sera utilisée pour le suivi clinique des animaux :ASPECT GENERAL, COMPORTEMENT/ LOCOMOTION, PHYSIOLOGIE CLINIQUE Chaque animal sera mis à mort dès que le score d’un paramètre sera égal à 2, ou dès que le total des scores sera strictement supérieur à 3. De plus, l’imagerie TEMP est une approche non invasive pratiquée sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle d’adénocarcinome chez la souris a été décrit et mis en oeuvre par notre équipe depuis plusieurs années. La lignée immunodéprimée Swiss nude est la lignée qui répond le mieux à l’induction de l’adénocarcinome. Les niveaux de zinc changeant avec la lignée et le sexe des souris, cette même lignée sera utilisée comme témoin et pour l’induction des insulinomes. Des souris femelles âgées adultes de 6-8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur ce modèle.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales du foie, par chirurgie dans l'organe ou par injection sous la peau, puis des traitements par voie intrapéritonéale ou par plasma froid et un suivi par imagerie sous anesthésie, pour évaluer de nouvelles thérapies des cancers hépatiques. Le porteur indique que la contrainte principale tient au développement tumoral et prévoit des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.

10 924 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une dose d'irradiation aux rayons X puis une transplantation de cellules de mélanome, avec un suivi sous anesthésie pouvant durer six mois, pour identifier des gènes régulant les métastases. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer troubles de la nage, œdèmes et léthargie, et prévoit une mise à mort quand ces signes n'évoluent pas sous douze heures. Il affirme que la culture cellulaire, y compris en 3D, ne reproduit pas la complexité d'un "organisme vivant".

Objectifs

La formation de métastases est la première cause de mortalité chez les patients atteints de cancers solides. La compréhension du processus menant à la dissémination des cellules tumorales représente donc un enjeu majeur de santé publique. Si ces mécanismes commencent à être caractérisés dans les tumeurs épithéliales telles que le poumon ou le sein, ils demeurent mal connus dans les tumeurs non-épithéliales comme le mélanome. En particulier, le rôle d’interactions potentielles entre signaux extérieurs et adhérence des cellules tumorales dans la dissémination du mélanome n’a pas été élucidé. L’objectif de ce projet est de découvrir de nouvelles molécules exprimées à la surface des cellules de mélanome et qui régulent la formation de métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de découvrir de nouveaux gènes régulateurs de la capacité de dissémination des cellules de mélanome. La compréhension du mécanisme d’action de ces gènes pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques contre les cancers métastatiques.

Procédures

A partir de l’apparition de la première tumeur, les poissons sujets au développement de tumeurs seront soumis à une observation hebdomadaire et individuelle. Le suivi sera réalisé sur une durée de 6 mois, après quoi tous les poissons seront mis à mort, qu’ils aient ou non développé une tumeur. Des poissons adultes de la lignée casper recevront une dose sub-létale d’irradiation aux rayons X de l’ordre de 30 Gy (déterminée par la procédure 1) répartie sur deux jours (15 Gy par exposition). Ils seront ensuite transplantés avec des cellules de mélanome 24 heures après la seconde irradiation. Pour suivre l’évolution des tumeurs, une documentation photographique sera réalisée sous anesthésie une fois par semaine. Ce suivi sera réalisé sur une durée maximale de 6 semaines après transplantation, après quoi tous les poissons seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent présenter des signes de stress ou de maladie dus au développement de tumeurs primaires. Les signes les plus précoces et les plus légers comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 12h. En absence d’amélioration des signes de stress ou de maladie listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. Le hérissement des écailles, la présence d’œdèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites plus rarement observés et plus graves nécessitant une mise à mort immédiate.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, les animaux susceptibles de développer des tumeurs ne peuvent être replacés ou adoptés.

Remplacement

Les modèles de migration et d’invasion cellulaires seront utilisés à chaque fois que cela est possible, notamment pour les analyses mécanistiques du rôle des gènes impliqués dans la formation de métastases et identifiés au cours de ce projet. Cependant, les lignées cellulaires de cancers humains rendent mal compte de la complexité des comportements des cellules dans leur milieu naturel, notamment dans un cadre de migration, et souffrent de limites importantes pour la modélisation des étapes de progression métastatique puisque la plupart des lignées cellulaires de mélanome humain proviennent de métastases et se sont adaptées à leurs conditions de culture in vitro. Les méthodes alternatives telles que la culture en 3D seront aussi envisagées mais ne peuvent à l’heure actuelle reproduire la complexité chimique, biologique et physique d’un organisme vivant pour étudier le comportement des cellules dans un environnement physiologique.

Réduction

Le recours à des expériences pilotes permettront d’optimiser les protocoles sur un petit nombre de poissons adultes. De plus, une stratégie visant à tester tous les gènes candidats en même temps réduira considérablement le nombre total d’animaux utilisés par rapport à une stratégie qui s’intéresserait à chaque gène candidat séparément. Enfin, des analyses statistiques a priori basées sur notre expérience du type de manipulations proposées ont permis d’établir les tailles d’échantillons nécessaires pour observer des différences significatives, réduisant ainsi au minimum le nombre d’animaux utilisés pour ce projet.

Raffinement

Le développement de tumeurs présente un risque de souffrance animale modérée. Cependant, cette souffrance éventuelle peut être prévenue par une surveillance attentive des animaux et l’application de critères d’arrêt définis. Afin de réduire le stress des animaux et de prévenir toute souffrance, les poissons sujets au développement de tumeurs seront observés au moins deux fois par semaine à la recherche de signes ou de changements de comportement précoces et prédictifs de la maladie. Ceux-ci comprendront principalement (par ordre de fréquence) des modifications de la nage, une respiration accélérée prolongée, une léthargie (immobilité prolongée au fond de l’aquarium) ou une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau. Des cas plus rares peuvent présenter un hérissement des écailles, la présence d’œdèmes ou une incapacité à se nourrir. Les poissons malades seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 12h. En absence d’amélioration des signes de stress ou de maladie listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. Dans un souci de raffinement, les poissons seront maintenus à une densité optimale de 5-8 poissons par litre d’eau pour favoriser leurs interactions sociales, en accord avec les recommandations de l’AAALAC. Les poissons seront également nourris une fois par jour avec des artémias pour préserver leurs instincts prédateurs et enrichir leur milieu.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un organisme modèle particulièrement adapté à l'étude de la fonction de gènes d’intérêt dans le cancer. Des modèles très fiables de mélanome ont été établis et des outils performants sont disponibles pour modifier des gènes spécifiquement dans ces tumeurs afin d’en examiner le rôle, en particulier sur le comportement des cellules cancéreuses. De plus, l’environnement des cellules est très bien conservé entre l’homme et le poisson puisque la plupart des organes ont des programmes de développement et des structures semblables. D'autres espèces pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique. Les microinjections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade une-cellule, ce qui permet l’intégration dans le génome et la production d’animaux transgéniques mosaïques. Les tumeurs primaires surviennent au stade adulte entre 8 et 30 semaines après fécondation. Les transplantations sous-cutanées nécessitent l’utilisation de poissons adultes âgés de 12 à 26 semaines car les poissons âgés de moins de 3 mois sont trop petits pour permettre l’observation de la migration spatiale des cellules tumorales et les poissons âgés de plus de 6 mois présentent une variabilité plus importante de la réponse à l’irradiation.