Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Modèle d’allergie alimentaire au beurre de cacahuète et activités thérapeutiques de candidats médicaments.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
10 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère, sur cinq ans et 330 études précliniques. Elles reçoivent des injections répétées et des gavages, puis sont "challengées" par des extraits d'arachide destinés à déclencher une réaction anaphylactique, avec candidats médicaments et prélèvements de sang. Le porteur indique que ce choc peut provoquer hypothermie, gonflements et difficultés respiratoires, et classe pourtant l'ensemble en gravité légère. Il affirme que la souris à système immunitaire humanisé est un modèle "indispensable" faute de reproduire le système immunitaire humain in vitro.
Objectifs
L’allergie alimentaire est un problème de santé publique croissant avec très peu d’options de traitement. A titre d'exemple, l’allergie au beurre de cacahuète touche 6 millions de personnes en Europe et aux Etats-Unis. La menace d’exposition accidentelle à des produits contenant ce type d’arachides engendre un haut degré de stress chez les personnes touchées et affecte leur qualité de vie par crainte d'un choc anaphylactique sévère pouvant conduire à la mort. L’objectif de ce projet est de créer un modèle d’allergie alimentaire sur souris au système immunitaire humanisé, plus précisément une allergie au beurre de cacahuète, et de l’utiliser pour étudier les effets potentiels de traitements prophylactiques ou thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Pour ce projet, nous souhaitons développer un modèle d’étude de l’allergie alimentaire, en particulier chez des souris ayant un système immunitaire humanisé. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires de la réaction allergique et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de specificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.
Procédures
Pour le développement de la maladie : injection intrapéritonéale 1 injection ou plusieurs injections pendant 4 semaines (fréquence définitive à déterminer). Gavage ; une fois par semaine pendant 8 semaines. Ces procédures durent chacune 10-15 secondes. Injection hydrodynamique par voie intraveineuse : 2 fois, maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Après l’installation d’une réponse allergique, les souris seront challengées, c'est-à-dire qu'elles recevront par gavage ou bien par injection intrapéritonéale des extraits de protéines allergènes permettant d'induire une réaction anaphylactique. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation) ou parentérale (veineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire) pour évaluer leurs activités thérapeutiques, en particulier sur le système immunitaire humanisé. La fréquence et les volumes d'administration autorisés seront déterminés par le vétérinaire d'établissement et validés par le comité de bien-être. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées au niveau du sinus retro-orbital, de la veine saphène ou dans la veine caudale. Les prélèvements au sinus retro-orbital seront réalisés sous anesthésie générale. La fréquence et les volumes de prélèvements autorisés seront déterminés par le vétérinaire d'établissement et validés par le comité de bien-être. A titre d'exemple, 200 µL de sang pourront être collectés sur une période de deux semaines pour une souris de 25 gr.
Impact sur les animaux
De la douleur peut être induite par : l'administration de composés de recherche et leurs effets potentiellement toxiques dans un contexte préclinique. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer. Le challenge est également susceptible d'induire une réaction allergique ou un choc anaphylactique pouvant se manifester, notamment, par une hypothermie, la présence de démangeaisons, de gonflements, de problèmes respiratoires et un impact sur l'activité de la souris.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront subit deux procédures légères à modérées. Une réutilisation n'est donc pas envisagée.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer, in vitro, un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer les réactions physiologiques humaines responsables de la mise en place d’une allergie, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants.
Réduction
Un total de 10000 souris adultes seront utilisées, couvrant une période de 5 ans, permettant de réaliser 330 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe, avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques reposant sur les effets attendus de la série.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un morceau de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. Les souris recevront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant l’entrée en projet, et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence.
Choix des espèces
Nous maîtrisons l’humanisation du système immunitaire sur plusieurs souches de souris. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront inclus aux études à l’âge de 16-18 semaines.
Étude des défauts hypothalamiques dans des modèles murins de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations mimant la sclérose latérale amyotrophique et subissent des chirurgies cérébrales, implantation de pompes, pose d'électrodes sous-durales et injection intracérébrale, puis des tests glycémiques, métaboliques et des tests comportementaux non détaillés sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des douleurs atténuées par des analgésiques et prévoit de retirer un animal dont l'état ne s'améliore pas sous 48 heures. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal dont l'hypothalamus est bien caractérisé et conclut que la souris ne "saurait être remplacée".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), la plus fréquente des maladies du système moteur adulte (2 à 3 nouveaux cas pour 100 000 habitants), reste une pathologie incurable et présente un pronostic extrêmement sévère, conduisant au décès, 2 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA présente des formes sporadiques (90%) et familiales (10%). Diverses lignées de souris transgéniques ont été mises au point, récapitulant les symptômes de la maladie : une dégénérescence des neurones moteurs cortico-spinaux et des motoneurones spinaux, une dénervation des muscles striés squelettiques accompagnée d’une atrophie musculaire et d’une paralysie progressive se finissant par la mort. Ces lignées transgéniques sont à la base des recherches expérimentales dans le domaine de la SLA. Outre les symptômes moteurs, la SLA est aussi accompagné par une perte de poids très importante (chez l’homme et modèles murins) due à une diminution de la prise alimentaire, associée à un changement de la dépense énergétique. Il a été observé récemment que les modèles transgéniques ont aussi des dysfonctionnements du sommeil et du métabolisme. Ces altérations à l’origine de ces symptômes n'ont pas encore été demontrees. Chez la souris, l’hypothèse expliquant les bases cellulaires de ces dysfonctionnements sont un défaut fonctionnel des neurones hypothalamiques impliquées dans la régulation de la balance énergétique, la prise alimentaire et le sommeil. Ceci suggère l’existence d’un défaut hypothalamique touchant le contrôle de la prise alimentaire et la qualité/quantité de sommeil aussi chez le patient SLA. De plus d'un point de vue moléculaire, il a été montré que l'une des molécules impliquées dans la maladie, est un élément central de l’horloge interne. Ce dernier gène particulièrement contrôle de façon remarquable le rythme de prise alimentaire et le sommeil. Ceci faisant le lien entre la pathologie étudiée et les problèmes de l'horloge interne. Nous investiguerons donc, dans cette etude, le sommeil et le metabolisme de ces lignees transgeniques mimant la SLA.
Bénéfices attendus
Ces expériences nous permettront de déterminer si les défauts fonctionnels de l’hypothalamus peuvent être reversés et ainsi ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour la SLA. Au-delà de la SLA, ce projet est destiné à contribuer à l’effort commun de recherche sur l’étiologie des maladies neurodégénératives du système moteur.
Procédures
Les animaux subiront des procédures chirurgicales (implantation de pompes iPRECIO durée 2h, implantation d’électrodes subdurales durée 3h, injection intracérébrale durée 2h) en plus de test glycémique (durée 2h), comportementaux et métaboliques. Ces expériences dureront maximum 35 jours et prennent en compte le développement de la pathologie dans les 2 lignées transgéniques. Les prélèvements ne seront fait qu’en phase terminale d’une procédure.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à des douleurs causées par les procédures chirurgicales qui seront atténuées par des antalgiques et analgésiques avant, pendant et après la chirurgie ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant la période de récupération des souris. Nous préviendrons toutes infections par l’apport d’antibiotique a la fin des procédures chirurgicales. Enfin, nous ne laisserons aucune souris dans la souffrance en nous référant à la feuille en Annexe 1. Il sera pris la décision de sortir une souris de l’étude si les conditions de la souris ne montrent pas d'amélioration sous 48 heures.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour des analyses biochimiques et immunologiques, après avoir collecté sang, tissus et organes.
Remplacement
La SLA est une maladie d’origine multifactorielle et multicellulaire. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré de cette pathologie. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent, en outre, une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études fonctionnelles. Le nombre de souris incluses dans ce projet a été précisément calculé à partir des observations faites dans le laboratoire lors d’études préliminaires ce qui a permis de calculer la puissance statistique et d’éviter les biais de taille d’effet (nombre suffisant permettant l’exploitation statistique). Le logiciel GPower nous a permis de calculer le nombre minimum nécessaire par groupe à 24. Secondairement lorsque les données seront récoltées nous utiliserons une analyse statistique ANOVA à un facteur avec une analyse post-hoc pour analyser les résultats.
Raffinement
Les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions d’hébergement conformes à la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des animaux (coton compressé pour faire des nids, maisons en plastique rouge), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s’assurer de leurs bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites (perte de poids, difficultés métaboliques, etc.) permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établi. De plus, nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de pré-anesthésie, d’anesthésie et de prise en charge analgésique en cas de procédure.
Choix des espèces
La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la SLA. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Les animaux seront utilisés à partir de 30 jours, au moment du sevrage, car l’injection de DREADDS nécessite d’être faite sur des souris âgées de 30 jours car le DREADDS est laissé 15 jours avant de pouvoir conduire un quelconque effet. Pour les pompes iPRECIO et l’EEG des animaux de 65 jours seront utilisés pour pouvoir observer les effets au stade présymptomatique.
Caractérisation de l’univers relationnel de velles élevées sous nourrices et suivi de leur bien-être/santé.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
50 bovins, 30 velles et 20 vaches nourrices, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrés au troupeau d'élevage classique de l'établissement. Chaque animal subit des prélèvements répétés de sang, de fèces par fouille rectale, de poils au rasoir et de lait, ainsi que des tests comportementaux nommés, trois tests de choix et six tests à l'homme, pour étudier le lien entre veaux et nourrices et un protocole d'apprivoisement après sevrage. Le porteur décrit un projet portant sur le "bien-être des animaux non-humains" tout en le conduisant dans le cadre d'une pratique d'élevage laitier. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'est possible puisqu'il faut des "animaux entiers".
Objectifs
Ce projet a pour but de (1) étudier le développement d'un lien entre les veaux femelles et leur nourrice; (2) tester un protocole d'apprivoisement directement après sevrage compatible avec les pratiques d'élevage; (3) suivre le bien-être et la santé d'une troupeau de vaches nourrices et de leurs veaux.
Bénéfices attendus
Le projet porte sur une technique d'élevage innovante, qui permet aux jeunes veaux d'être en contact avec des vaches adultes et ainsi de bénéficier de maternage. le projet vise à mieux évaluer l'impact de cette pratique sur la santé et le bien-être des animaux, et à ajuster les modalités d'apprivoisement des veaux après le sevrage, garantissant un stress minimal pour l'animal et une bonne relation entre l'animal et l'homme.
Procédures
Au total sur l'ensemble des la durée du projet, l'ensemble des animaux seront soumis à 7 prélèvements de sang (10 mL par prise de sang) , 5 prélèvements de matières fécales (30 mL, par fouille rectale)et pour les prélèvements de poils (30 x 20 cm sur l’épaule, prélevés via un rasoir électrique), il y en aura 3 sur les veaux et 4 sur les vaches. Les vaches seront soumises à 5 prélèvements de lait (15mL par prélèvement). Concernant les tests comportementaux, l'ensemble des animaux seront soumuis à 3 tests de choix et 6 tests à l'homme.
Impact sur les animaux
Les tests réalisés peuvent engendrer un stress pour l'animal testé. différentes dispositions seront prises pour limiter ce stress: limiter au maximum le temps de séparation des veaux avec leur nourrice, et avec leurs congénères, habituer préalablement au test les animaux à l'arène de test, surveiller minutieusement les animaux pendant le test et éventuellement arrêter celui-ci si la situation le nécessite (trop forte agitation de l'animal).
Devenir
A l'issue des procédures expérimentales, les animaux rejoindront le troupeau principal pour y être élevés selon l'élevage classique de l'établissement. Les procédures ne doivent pas engendrer de traumatismes ou de blessures sur les animaux.
Remplacement
Aucune alternative à l'utilisation des animaux vivants n'est possible, puisqu'il s'agit d'étudier l'impact d'une pratique d'élevage sur la santé et le bien-être d'animaux d'élevage, ce qui implique le recours à des animaux entiers.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit à l'effectif minimum permettant de mettre en évidence des différents significatives au cours d'une étude longitudinale et entre les lots par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Un ensemble de mesures veille au raffinement de l'expérimentation. En effet, le projet est mené par du personnel compétent et l'ensemble des animaux sera élevé selon leur mode d'élevage habituel au pâturage avant sevrage puis en bâtiment durant l'hiver sur paille et au printemps suivant à nouveau au pâturage. Le pâturage se fait dans des prairies ayant des espaces ombragés pour le confort des animaux durant les périodes de fortes chaleurs. Les tests de choix et à l'homme qui seront réalisés en bâtiment se feront dans une arène à laquelle els animaux auront été habitués pour limiter leur angoisse. Les veaux y seront menés par un personnel compétent. La présence de signes cliniques sera prise en compte dans la décision de l'application des critères d'arrêt mis en place pour l'expérimentation. Il en va de même lors des tests et des prélèvements : une surveillance minutieuse des animaux sera réalisée et permettra l'arrêt à tout instant du test si la situation le nécessite. En cas de risque de blessure lors d'un test ou d'un prélèvement, ce dernier sera immédiatement arrêté et l'animal recevra sans attendre les premiers soins si blessure il y a, et un vétérinaire pourra être sollicité suivant la gravité établie de la blessure.
Choix des espèces
Le projet porte sur une nouvelle pratique d'élevage des veaux femelles en élevage laitier, en vue de mesurer la santé, le bien-être et l'évolution du comportement des animaux impliqués dans ce type d'élevage. Il est donc pertinent de mobiliser des bovins de race laitière. Les mresueres se feront principalement via des méthodes d'observation comportemental, ce qui nécessite l'utilisation d'animaux dans leur intégralité Nous utilisons 30 veaux femelles depuis l'âge de quelques jours jusqu'à leur première traite (enrte 24 et 26 mois d'âge, en fonction des résultats de reproduction), ainsi que 20 vaches nourrices ce qui nous permettra de répondre à notre objectif de détemriner la santé et le bien-être à court et long terme de veaux et de leurs nourrices et l'impact pour les veaux d'un apprivoisement sur ces variables.
Évaluation du rôle de l’auto-anticorps anti-TRPV2 dans le syndrome de mort subite du nourrisson chez la souris Balb/c
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
60 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil pour prélèvement du coeur. Des mères sont immunisées pour produire un auto-anticorps censé traverser le placenta, et le porteur attend une mort subite des souriceaux par bloc cardiaque, sans signe avant-coureur, en analogie avec la mort subite du nourrisson. Les femelles et les nouveau-nés sont euthanasiés après enregistrement d'un électrocardiogramme. Le porteur affirme que l'usage de modèles in vitro "n'est pas envisageable", rendant selon lui l'animal "indispensable".
Objectifs
Le syndrome de mort subite du nourrisson (SMSN) correspond à la mort subite et inattendue d’un nourrisson apparemment en bonne santé âgé de moins d’un an. La plupart du temps, la mort survient pendant le sommeil, sans raison apparente. Plusieurs facteurs de risque de SMSN (y compris la position de sommeil et l’environnement) ont été identifiés. Cependant malgré les mesures préventives, le SMSN demeure la principale cause de décès chez les nourrissons. Les chercheurs continuent de s’interroger quant aux raisons pour lesquelles les nourrissons peuvent mourir sans cause apparente. À la recherche d’une réponse, les investigations se sont principalement concentrées sur les gènes, mais les mutations ne sont une cause sous-jacente que dans la minorité des cas. Lors d’une étude clinique récente, nous avons identifié un auto-anticorps dirigé contre le canal TRPV2 (une séquence spécifique et extracellulaire) du cœur en lien avec le SMSN. Une cause auto-immune du SMSN n’a pas encore été étudiée à ce jour et constitue l’objectif du présent projet
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont que les auto-anticorps dirigés contre le TRPV2 chez les souris mères traversent la barrière placentaire pour atteindre et interagir avec le cœur de leur progéniture. En vue du rôle majeur des canaux TRPV2 dans le nœud auriculo-ventriculaire du cœur, il est attendu à ce que les auto-anticorps provoquent un bloc auriculo-ventriculaire, identifiable sur un ECG. Par ailleurs, en analogie à la SMSN humaine, il sera possible d’observer une mort subite de souris nouveau-nées. Par conséquent, nous accorderons notre attention sur le taux de survie/mortalité des souriceaux pour ainsi déceler une éventuelle corrélation entre la mort subite et la présence d’auto-anticorps anti-TRPV2. Une telle découverte serait une avancée majeure dans le domaine clinique : non seulement elle nous permettrait pour la première fois de disposer d’un marqueur prédictif pour la SMSN, mais elle permettrait également un changement de paradigme en prévention et thérapie de la SMSN.
Procédures
Enregistrement d'un électrocardiogramme sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L’enregistrement des ECGs sera effectué sous anesthésie générale et durera au maximum 15 minutes par animal. Il est attendu d’observer des morts subites chez les souris nouveau-nées, dans la mesure où il s’agit d’un modèle SMSN. Aucun phénotypage dommageable n'est attendu chez les femelles immunisées.
Devenir
A la fin de la procédure sans réveil, toutes les souris femelles et les souriceaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser un prélèvement sanguin par ponction cardiaque et le prélèvement du coeur pour des études histologiques.
Remplacement
Le SMSN est la cause la plus fréquente de décès de nourrissons âgés de moins d’un an (35-55%). Afin d’étudier les mécanismes sous-jacents du SMSN, l’usage de modèles in vitro n’est pas envisageable, rendant l’utilisation d’animaux indispensable pour comprendre le lien entre SMSN et l’auto-anticorps anti-TRPV2.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. La taille des lots a été déterminée à l'aide du logiciel G power (voir paragraphe 3.4.10). Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Une analyse statistique sera réalisée à l'issue de l'étude : les paramètres quantitatifs seront évalués par analyse de variance associée à un test de comparaisons multiples, alors que l'incidence des morts subites chez les nouveau-nés sera évaluée avec un test de Khi carré. Enfin, les souris mâles utilisées pour l'obtention des portées étudiées seront proposées aux utilisateurs de l'UTE IRS-UN pour une réutilisation dans d'autres études.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler et/ou de papier pour fabriquer des nids. Lors de l’enregistrement de l’ECG ainsi que lors l'euthanasie, les animaux seront sous anesthésie et sous surveillance constante des manipulateurs. Les souris adultes immunisées ne devraient pas présenter de phénotype dommageable. Toutefois, en cas d'apparition d'un signe clinique sévère ou de trois signes cliniques notables selon le tableau fourni en annexe, malgré un traitement analgésique, l'animal serait euthanasié par dislocation cervicale sous anesthésie à l'isoflurane. Il existe un risque de mort subite par bloc auriculoventriculaire complet chez les souriceaux immunisés par leur mère. Dans ce cas, il n'existe pas de signe avant-coureur, le bloc conduisant à une mort très rapide. Dans le cas improbable où un souriceau présenterait un autre phénotype dommageable détectable par l'apparition d'un signe clinique sévère ou de trois signes cliniques notables selon le tableau fourni en annexe, celui-ci serait anesthésié et un ECG serait enregistré avant euthanasie selon la procédure 2.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus utilisée en recherche, notamment dans le cadre d’un modèle d’auto-immunité expérimentale. De plus, notre équipe possède une expertise sur l’ensemble des procédures associées, notamment l’enregistrement d’ECG sur les souris nouveau-nées. Les souris seront âgées de 1-4 semaines lors des enregistrements d’ECG, à un âge équivalent à la première année de vie chez l’humain. Le SMSN faisant l’objectif de notre étude, nous enregistrerons les ECG à l’âge de 1 à 4 semaines, période équivalente à la première année d’une vie humaine. Un ECG sera également enregistré sur les souris femelles adultes.
Développement de radiotraceur pour l’imagerie de la mutations mIDH1 dans le chondrosarcome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales en sous-cutané ou près du tibia, puis l'injection de traceurs radioactifs pour l'imagerie, avant d'être tuées pour analyser la distribution des molécules. Le porteur reconnaît que la greffe près du tibia peut être douloureuse et gêner le déplacement une fois la tumeur développée. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" pour valider ces traceurs.
Objectifs
Les mutations des gènes de l’Isocitrate Déshydrogénase (mIDH) favorisent la progression tumorale. Ces mutations sont fréquemment identifiées dans des cancers comme le gliome ou le chondrosarcome (CHS), tumeurs solides infiltrantes et invasives, limitant une résection complète et provoquant souvent des récidives ainsi qu’une incapacité progressive des patients. De nouveaux inhibiteurs ciblant mIDH pourraient représenter de nouveaux espoirs de thérapie, mais leur succès repose sur une évaluation préalable de l’expression de mIDH dans ces tumeurs. Cependant, contrairement aux alternatives invasives comme la biopsie, les modalités d’imagerie non invasives pour la quantification de l’expression de mIDH n’ont été que peu étudiées pour ces tumeurs. Ce projet consiste en une approche translationnelle et multimodale de développement de méthodes d’imagerie, via des radiotraceurs marqués au fluor-18 pour l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP). Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.
Bénéfices attendus
Si les résultats de biodistribution sont favorables au transfert et à évaluation clinique de radiotraceurs, la quantification de l’expression de mIDH sera évaluée par autoradiographie sur tissus de tumeurs cérébrales et de CHS issus de patients, afin de conduire pour la première fois à des données quantitatives concernant l’expression de mIDH sur des tumeurs humaines. Si ces résultats sont favorable, cette mutation et son impact métabolique seront également étudiés en clinique par spectroscopies per-opératives de résonance magnétique chez des patients atteints de gliome ou de CHS afin d’évaluer leur intérêt pour estimer plus précisément l’étendue de la résection à réaliser, paramètre impactant fortement le taux de survie. A plus long terme, Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra une injection sous cutanée ou paratibiale sous anesthésie gazeuse (durée 5min). Pour les animaux des lots 2 à 4, ils recevront également une injection intraveineuse (moins de 1min) en vigile entre 15 jours et 6 semaines après l’injection sous cutanée ou paratibiale.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules en paratibiale pourrait entrainer une douleur poste injection (douleur anticiper par l’administration préventive d’antalgique (Rimadyl, 20mg/kg ou Méloxicam 5 mg/kg) en pré et post implantation. Une gêne au déplacement pourra aussi être observé une fois la tumeur ayant atteint un certain stade de développement.
Devenir
Procédure 1 et 2 : Mise à mort Lot 1 pour l’analyse protéique, génomique et histologique des tumeurs Procédure 3 : Mise à mort Lot 2 détermination de la distribution des radiotraceur dans les organes des animaux à différent temps Mise à mort Lot 3 analyses de spécificité de fixation par prélèvement Mise à mort du lot 4 analyses des métabolites sang et urine et tumeur
Remplacement
Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouveaux radiotraceurs requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude pilote (étude 1) et les examens d’imagerie (étude 3) permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 488 souris maximum sur une période de 5 ans.
Raffinement
Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection…). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, l’étude pilote ainsi que l’étude impliquant des examens d’imagerie permettent de raffiner cette étude en termes de caractérisation du modèle et d’examen non invasif.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptés pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèle.
Etude in vivo de l’impact de la colonisation des bactéries filamentaires segmentées sur l’activation immunitaire et sur la flore intestinale de l’hôte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent gavages, injections répétées, greffes de moelle osseuse et prélèvements de sang et de fèces, une partie recevant du busulfan qui supprime l'immunité et peut provoquer des hémorragies sévères. Le porteur mène une recherche fondamentale sur des bactéries intestinales et écrit ne prévoir "aucune perte" et juger "négligeable" l'effet de l'hébergement en cage. Il conclut à la nécessité de la souris pour reproduire ces interactions entre hôte et bactéries.
Objectifs
Les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries naturellement présentes dans la flore intestinale de nombreuses espèces dont l’Homme. Ces bactéries sont attachées à la paroi intestinale de manière spécifique à l’espèce hôte. Ces bactéries peuvent entrainer une réponse immunitaire au niveau de l’intestin de leur hôte. Chez la souris, la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées protège l’hôte de certaines bactéries infectieuses. Cette colonisation peut également accentuer la gravité de certaines maladies ayant pour cause un dysfonctionnement du système immunitaire de l’hôte. Pour ces raisons les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries clés à la fois dans l’évolution de la santé et de la maladie. Cependant de nombreux impacts de la colonisation d’un hôte par les bactéries filamentaires segmentées restent à définir. Au cours de notre projet nous tenterons de définir les impacts de la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées sur l’activation de la réponse immunitaire. Nous étudierons également les mécanismes de détection des bactéries filamentaires segmentées par le système immunitaire de l’hôte. Nous évaluerons ensuite l’impact de la colonisation de l’hôte par les bactéries filamentaires segmentées sur l’évolution de la flore intestinale, mais également lors d’infection par des entéropathogènes.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est une meilleure compréhension des premiers évènements survenant pendant la colonisation des bactéries filamentaires segmentées chez l’hôte. De plus, nous comprendrons mieux comment la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées a un impact sur l’évolution de la flore intestinales et la résistance aux infections bactériennes intestinales. Ces connaissances fondamentales constitueront la base d’une application des bactéries filamentaires segmentées dans l’amélioration de la santé intestinale dans le futur.
Procédures
Au cours de notre projet les animaux subiront différentes interventions en fonctions des procédures expérimentales. En ce qui concerne la colonisation et l’inoculation de bactéries, un gavage ponctuel sera réalisé sur 3456 animaux éveillés, 2 gavages ponctuels et distant de 21 jours seront réalisés sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne les traitements par injection, sur une période de 6 jours, 2 injections ponctuelles distantes de 5 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 7 jours, 3 injections ponctuelles distantes de 3 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, 1 injection ponctuelle par jour sera réalisé sur 288 animaux éveillés. Sur une période de 5 jours, 1 injection ponctuelle par jours sera réalisé sur 1728 animaux éveillés. En ce qui concerne la greffe de moelle osseuse, 1 injection ponctuelle sera réalisée sur 1728 animaux sous anesthésie générale. En ce qui concerne le traitement administré par l’eau de boisson, sur une période de 4 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de fèces, sur une période de 5 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les jours sur 1728 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les 2 jours sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de sang, 2 prélèvements sanguin distant de 60 jours seront réalisés par ponction sur 1728 animaux éveillés.
Impact sur les animaux
Durant notre projet certaines procédures entraineront des nuisances et effets secondaires sur les animaux. La procédure de gavage bien que non douloureuse pour l’animal entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation de l’animal. L’inoculation de bactérie aura pour effets indésirables des troubles gastriques sans gravités dus au changement de la flore intestinale. L’injection entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation. Toutes les substances injectées ou administrées à l’animal à l’exception du busulfan n’auront pas d’effets indésirables sur les animaux. Le traitement au busulfan aura comme effets indésirables attendus une suppression des cellules responsables de l’immunité. Nous pourrons observer également comme effets secondaires, des troubles de la nutrition, diarrhée, inflammation au niveau du site d’injection, ainsi que de manière exceptionnelle des hémorragies sévères dues à une diminution du nombre de plaquettes. En ce qui concerne les prélèvements effectués chez l’animal, seul le prélèvement sanguin entrainera une nuisance après le prélèvement. Cette nuisance se caractérisera par une fatigue transitoire après le prélèvement.
Devenir
A la fin de chaque procédure expérimentale la totalité des animaux sera mise à mort par dislocation cervicale ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par la nécessité à la fin de chaque procédure de procéder au prélèvement d’organe tel que la rate, le foie, le ccum, le colon ainsi que les ganglions lymphatiques. Ces organes sont des organes vitaux ce qui exclut pour des raisons éthiques leur prélèvement sur animaux éveillés. Les animaux qui ne seront pas prélevés en raison de leur exclusion d’un lot expérimentale afin de ne pas compromettre les résultats d’une expérience seront également mis à mort par dislocation cervical ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par l’impossibilité de réutiliser, replacer ou adopter ces animaux à la fin de nos procédures expérimentales.
Remplacement
La culture en laboratoire des bactéries filamentaires segmentées reste très difficile et limitée dans le temps. Ceci limite l'utilisation de système artificiel. Les systèmes artificiels seuls ne nous permettrons pas d'atteindre les différents objectifs de recherche décris dans ce projet. Afin de caractériser en détail les interactions complexes entre bactéries filamentaires segmentées et son hôte, nous devons avoir recours à un modèle animal pouvant reproduire ces types d'interactions en laboratoire et ce dans différentes conditions avec des paramètres contrôlés. La souris est la solution que nous avons retenue pour atteindre nos objectifs. La grande variété de modèle disponible pour cet animal et ça similarité anatomique et physiologique avec l'humain en font un modèle adapté pour atteindre les objectifs de notre projet.
Réduction
Dans un principe de réduction nous avons conçu nos expérimentations en réduisant au minimum le nombre de procédure expérimentale. Ainsi chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre spécifiquement un des objectifs précédemment décrits. Nous nous sommes assurés d’exclure toute répétition et de garantir l’obtention de résultats originaux. Pour l’ensemble de nos procédures et afin d’obtenir des résultats significatifs nous avons fixé un niveau de risque suffisamment faible et une puissance élevée afin d’obtenir avec un minimum d’animaux des résultats expérimentaux incontestables. Les animaux seront hébergés en groupe de 5. Nous ne prenons pas en compte l’effet lié à l’hébergement en cage que nous jugeons négligeable durant nos expériences. Lors de la réalisation de nos expérimentations nous ne prévoyons aucune perte. Nous décidons d’utiliser 12 animaux par groupe. Ce nombre nous permettra d’obtenir lors de nos analyses statistiques des résultats significatifs. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu et indépendante de nos protocoles expérimentaux.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les animaux seront hébergés en groupe. Le nombre d’animaux par cage ne pourra être supérieur à 5. En conditions d’hébergement sans microorganisme les animaux seront hébergés dans les mêmes conditions. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par un personnel correctement formé et limité au maximum dans le temps. Afin de diminuer les désagréments et les douleurs lors de certaines expérimentations les animaux seront anesthésiés. Toutes les expérimentations incluant un traitement avec une substance chimique pouvant potentiellement induire des effets secondaires, ont été conçues afin de réduire au maximum la posologie du traitement tout en garantissant l’induction des effets souhaités chez l’animal. Des points limites généraux et spécifiques à chaque procédure, suffisamment prédictifs ont été mis en place. Si aucun moyen efficace n’est disponible afin de supprimer la souffrance, la douleur et l’angoisse de l’animal sans compromettre les résultats de nos expériences, l’animal sera mis à mort. Le bien-être animal sera une priorité lors de notre projet de recherche et ce dernier sera régulièrement évalué et optimisé au cours de notre projet.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser cette espèce car elle présente de nombreux avantages pour notre projet d'étude. Cette espèce peut nous fournir un grand nombre de modèle génétique et d'individu dépourvus de flore bactérienne nécessaires pour notre projet. Cette espèce possède également une grande similarité anatomique de son système digestif avec l'Homme. Il en est de même du point de vu immunitaire. Cette espèce est également facile à manipuler en laboratoire ce qui participera de limiter les risques liés aux manipulations expérimentales. L’hébergement séparé des mâles et des femelles est également possible. Des souris mâles et femelles de chaque espèce, âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisées. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris adultes dont le système immunitaire et la flore intestinale sont pleinement développés. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage et l'injection sont plus faciles à réaliser chez les souris adultes, ce qui minimise les douleurs inutiles dues aux manipulations.
Approche régénérative pour restaurer les fonctions après une lésion traumatique du système nerveux : de l’étude fondamentale à l’étude translationnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1170
1 104 souris et 1 170 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, en majorité dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit de une à quatre chirurgies, dont des sections ou contusions de la moelle épinière entraînant une paralysie des pattes postérieures, ou des lésions du nerf sciatique, avant d'être euthanasié pour analyses post-mortem. Le porteur souligne que cette paralysie est chez le rongeur partiellement réversible, à la différence de l'humain. Il affirme que les études sans animaux ne permettent pas d'étudier le contrôle moteur et conclut que trouver une solution thérapeutique est "indispensable".
Objectifs
Les lésions traumatiques (médullaires et crâniennes) et neurodégénératives du cerveau et de la moelle épinière chez l’homme induisent en général un handicap sévère et qui peut être permanent. Par leur importante prévalence, ces pathologies ont un fort impact sociétal et économique. Analyser l’évolution de la lésion du système nerveux central et, en parallèle, élucider comment le neurone répond à ces changements constitue un grand défi pour concevoir des stratégies thérapeutiques visant à stimuler la régénération et la réparation du réseau neuronal affecté. Cela s’applique également aux lésions sévères des nerfs périphériques où la régénération axonale est limitée pour atteindre les cibles périphériques appropriées. Le projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dégénérescence versus la régénération des fibres nerveuses, avec l'objectif de contribuer à l'élaboration de stratégies de réparation, basée sur l’ingénierie tissulaire. L’utilisation des rongeurs, rat et souris, constitue le modèle animal adapté pour ce projet. Ces modèles inclus les lésions médulaires : la transection bilatérale dorsale ou la contusion, au niveau thoracique qui entraine une paralysie des pattes postérieures, mais qui est suivie d’une récupération partielle. De même, la lésion du nerf sciatique est le modèle de lésion périphérique couramment utilisé. Enfin pour obtenir une preuve de concept de notre stratégie d’ingénierie tissulaire du trauma au niveau du cerveau, le modèle de contusion corticale contrôlée sera adapté. La règle des 3R a été́ considérée tout au long de l'élaboration de ce projet et sera appliquée au quotidien.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est de déterminer quand et comment, après la lésion de la moelle épinière, la combinaison de l'implantation du biomatériau avec les traitements cités montrerait une efficacité. Par ailleurs, nous poursuivrons notre processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens vers une perspective clinique, pour aboutir à des solutions transposables, réalisables et convaincantes pour leur application en clinique. Grâce aux preuves de concept obtenues au préalable, notre projet de recherche préclinique démontre qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Les animaux sont soumis à 1 à 4 procédures chirurgicales, de durées inférieures à 30 min chacune pour les souris et inférieures à 45 min pour les rats. La durée entre 2 chirurgies soumises à un animal s’étale entre 24h et 8 semaines. Toute procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et analgésie. Aucun prélèvement n’est effectué sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Nos procédures sont, pour la plupart, classées sévères. Cependant chez le rongeur, les modèles expérimentaux utilisés, entrainent une paralysie (paraplégie) qui, à la différence de l’homme, est réversible partiellement. Les traitements utilisés ne sont pas nocifs, au contraire, ils améliorent la récupération fonctionnelle. Ils sont biocompatibles et résorbables. Ils pourront aussi être envisager dans le cas de trauma ou dommages du système nerveux des animaux domestiques comme le chien ou le chat. Enfin, la réglementation est strictement respectée et appliquée.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue de leur procédure, afin de réaliser des études histologiques et biochimiques sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tel que le contrôle moteur latéralisé. D’autre part, le système nerveux traumatique est complexe et évolutif ; l’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études ni de développer des stratégies à visées thérapeutiques pour obtenir des preuves de concepts pour une application translationnelle. Néanmoins, dans notre projet, des études in vitro sont menées en parallèle pour des questions fondamentales de mécanistiques à l’échelle moléculaire ainsi que des tests de criblage sont développés en amont de l’expérimentation animale.
Réduction
Les expériences antérieures nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. Ainsi, les analyses comportementales et biochimiques ou anatomiques sont réalisées sur les mêmes animaux, pour des raisons de rigueur d’analyse et pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. A cette fin, les groupes d’animaux sont créés au fur et à mesure, avec les contrôles à l’intérieur de chaque groupe. 2274 animaux seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. outes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie (isofluorane au masque) et analgésique. Les animaux sont regroupés dès le lendemain après chirurgie pour limiter la période d’isolement et un enrichissement adapté pour chaque espèce de rongeur (briques en bois pour les rats et nid végétal pour les souris) est placé dans la cage. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Ces contrôles, enregistrés et validés par le SBEA local, permettent de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une surdose d’euthanasiant. (ces injections sont réalisées après une brève anesthésie ; induction à l’isoflurane). Par ailleurs, nous continuons à poursuivre des formations de mise à jour pour appliquer au mieux la réglementation et d’avoir l’opportunité d’introduire des améliorations pout le meilleur raffinement possible en le validant en amont par notre SBEA et en interagissant avec le vétérinaire référant.
Choix des espèces
Rat et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptés. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du trauma est très reproductible et standardisée chez le rat et de nombreux tests sensori-moteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion. Malgré l’absence de formation de cavités chez la souris (présente chez l’homme et le rat), elle permet de démontrer la fonction d’un gène spécifique grâce à la transgénèse et les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles post-traumatiques y sont comparables. Chez le mammifère l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi la majorité de nos expériences seront réalisées chez la souris et le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit 30g et 250g respectivement. A noter que les lésions arrivent en grande majorité sur des jeunes adultes. Par ailleurs, dans le cadre du développement d’une stratégie thérapeutique après traumatisme, nous projetons de combiner l’implantation de biomatériaux biocompatibles et biodégradable avec une greffe de cellules : des neurones issus d’embryons à E12-14 de rongeurs et des cellules de Schwann issues de rat adulte. Cette greffe homotypique sera réalisée uniquement chez le rat.
Comparaison de la resistance osseuse de bars alimentés avec 3 régimes alimentaires différents
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
290 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons nagent quatre jours contre un courant destiné à provoquer des déformations de la colonne vertébrale, puis sont euthanasiés pour analyser leur squelette. L'objectif est de tester un aliment enrichi censé renforcer l'ossature et réduire les pertes économiques de la pisciculture. Le porteur affirme que ces déformations sont "légères car réversibles" et que la lordose "ne semble pas indiquer de présence de douleur" puisque le poisson continue de nager, sans qu'un test spécifique de la douleur soit précisé.
Objectifs
Dans les piscicultures marines, une très forte proportion de poissons a des malformations de la colonne vertébrale, ce qui constitue une perte économique pour l’aquaculteur. L’origine de ces malformations est en partie due aux forts courants appliqués dans les structures d’élevage pour y maintenir une bonne oxygénation. L’objectif de ce projet est de déterminer si différentes teneurs en peptides dans l’aliment peuvent avoir une incidence sur la robustesse de l’ossature des juvéniles de bar. La réponse à cette incidence est évaluée par la formation ou non de déformation du squelette lors d’un test à l’effort modéré continu (nage pendant 4 jours). Le but à long terme est de développer un nouvel aliment pour l’aquaculture, qui permettra au poisson d’avoir une ossature solide afin d’éviter les malformations, d’améliorer le bien-être animal et la qualité du produit final.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu du projet est le développement d'un aliment enrichi en peptide permettant d'induire une meilleure robustesse squelettique des poissons d'élevage. Une nouvelle formulation des aliments destinés à l’aquaculture pourra alors être envisagée par la filière. Ce nouvel aliment permettrait de maintenir la qualité optimale du produit et d’améliorer le bien-être animal. D'un point de vue purement zootechnique, ce projet est le premier à mettre en œuvre ce type de test de nage pour appréhender la robustesse squelettique chez un poisson d'intérêt aquacole. Il nous permet de créer et d’optimiser nos protocoles de nage.
Procédures
290 poissons participeront à un test d'effort modéré continu (4 jours). La procédure intitulée "Validation du protocole du test de nage "permettra de valider ou diminuer la vitesse du courant choisie (4 tailles du poisson/sec). Nous utiliserons dans la seconde procédure, intitulée "Test de nage modéré et continu ", 270 poissons à la vitesse du courant validée dans la procédure test. Ce courant est susceptible de générer de légères malformations squelettiques (qualifiées de légères car réversibles). A l'issue de ces procédures, les poissons seront euthanasiés après sédation.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont modérées. La vitesse du courant pendant le test de nage va induire des déformations squelettiques légères (lordoses) c’est-à-dire une légère cambrure de la colonne vertébrale. Cette déformation est très répandue en aquaculture. Elle ne semble pas indiquer de présence de douleur chez le poisson car celui-ci continue de nager, de s’alimenter et d’avoir un comportement normal. Le personnel en charge de cette expérience a réalisé le même protocole sur le poisson zèbre. Nous nous appuyons sur son expérience pour transposer ce protocole au bar. Pour rappel, cette expérience est une première et il n’existe pas d’autres références sur lesquelles nous pouvons nous appuyer. Chez le poisson-zèbre, 40 à 60 % des poissons (en fonction des conditions expérimentales) présentent des lordoses après ce type de challenge. Mais ces malformations sont légères car réversibles puisque chez le poisson zèbre 100% des poissons retrouvent un aspect normal après une semaine passée en eau calme. Le postulat de la transposition de la procédure expérimentale sera vérifié au cours de la procédure test sur 20 poissons. Ce test nous permettra d'affiner si nécessaire la vitesse du courant.
Devenir
Tous les poissons seront euthanasiés à l'issue du test de nage afin de procéder à des analyses histologiques permettant d'identifier et de quantifier le nombre de poissons malformés dans chaque groupe.
Remplacement
Dans le cadre d'une étude destinée à évaluer la résistance squelettique d'un poisson, il n'est pas possible de faire appel à des modèles de remplacement tels que les cultures cellulaires osseuses ou musculaires ; En effet, l'effet des peptides alimentaires sur la robustesse des tissus soutenants le squelette passe par des processus complexes, dont notamment la fonction digestive. Il n'y a pas d'alternative possible à l'utilisation des animaux dans cette étude.
Réduction
Le nombre de poisson a été réduit au minimum et défini au seuil de pertinence scientifique et statistique compte tenue de la variabilité inter-individuelle observée dans d'autres études chez le poisson zèbre. Le nombre de poisson utilisé tient également compte de la densité minimale d’animaux nécessaires lors de l'élevage.
Raffinement
Les poissons sont pêchés délicatement à l’aide d’une épuisette de façon aléatoire dans leur bac d’élevage, puis placé dans un sceau avec une sédation (50mg/L) afin de limiter le stress. Ils sont amenés au tunnel de nage à pied (20m entre le bac d’élevage et le tunnel). Le tunnel est situé dans une pièce isolée sans passage de personnes afin de limiter tout stress pendant le test. Les poissons sont ensuite placés délicatement à l’aide d’une épuisette dans le tunnel de nage. Les paramètres physico-chimiques de l’eau du tunnel sont les mêmes que leur bac d’élevage. L 'élevage du bar est maitrisé au laboratoire et les poissons sont élevés dans les conditions optimales. Ces paramètres seront vérifiés quotidiennement (température, oxygène, pH, ammoniac, nitrites, nitrates). Après une acclimatation de 2h dans le tunnel de nage, la vitesse du courant augmentera progressivement jusqu’à la vitesse maximale de 4 tailles du poisson/sec. Les poissons sont surveillés quotidiennement, par du personnel compétent. Il s’agit d’un test de nage modéré pendant 4 jours, nous ne nous attendons pas à atteindre de point limite. Néanmoins, la procédure 1 va nous permettre d’ajuster les modalités du test à l’espèce bar pour ne pas imposer une procédure sévère comme pour le poisson zèbre. Nous avons ainsi rédigé une feuille de suivi du comportement (annexe).
Choix des espèces
Le Bar Européen est un poisson d'élevage dont la zootechnie est maitrisée. Les malformations ou déformations squelettiques sont toutefois encore rencontrées dans les élevages. De nombreuses études scientifiques sont en cours afin d'optimiser les conditions d'élevage et notamment leur alimentation aux jeunes stades. Les poissons seront au stade juvénile (centaine de jours post éclosion) ; ils feront 35mm de longueur et auront une masse d'0,5g en moyenne. Le stade utilisé est justifié pour trois raisons : 1) Il correspond au même stade de développement squelettique que celui du poisson-zèbre utilisé dans une étude récemment publiée 2) Ce stade de développement relativement jeune est propice à l'apparition de malformations en pisciculture 3) Le stade est suffisamment avancé pour que les poissons soient manipulables (transfert entre leur bassin d'élevage et l'arène de nage) sans induire de malformation.
Etude par télémétrie des adaptations musculaires chez un modèle animal de simulation de la microgravité
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées comme impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie un capteur enregistrant l'activité musculaire, puis sont maintenues trente jours dans un dispositif simulant l'absence de gravité par suspension, avant d'être tuées par injection létale. Le porteur présente ce modèle comme "indispensable" pour préparer les vols spatiaux vers Mars et le décrit comme maîtrisé depuis vingt-cinq ans. Il minimise les atteintes, évoquant une perte de poids inférieure à 15 % et une "angoisse modérée de courte durée", alors que la procédure est elle-même déclarée sévère.
Objectifs
L'envoi d'animaux dans les véhicules spatiaux est indispensable pour mieux comprendre les effets de l'absence de gravité sur l'organisme. Cette connaissance est le préalable obligatoire à un voyage de plusieurs années sur Mars. Afin de bien préparer ces vols spatiaux, nous utilisons un modèle animal mimant les effets de l'absence de gravité (Hypodynamie-hypokinésie ou HH).
Bénéfices attendus
Le projet s’inscrit dans le cadre de l’étude du système musculaire squelettique et ses altérations lors de situations de dysfonctionnement ou de non-utilisation. Parmi les critères permettant de déceler les altérations musculaires, l’étude de l’activité électromyographique (EMG) peut fournir des indications précieuses sur le bon fonctionnement ou non du muscle squelettique. Notre projet consiste à affiner une technique d’enregistrement de l’EMG par télémétrie chez la souris en condition de non-utilisation (HH) .
Procédures
Les animaux seront équipés par voie chirurgicale d'un capteur télémétrique permettant d'enregistrer l'électromyogramme, caractéristique de l'activité électrique musculaire. La méthode télémétrique permettra d’enregistrer en continu (pendant 30 jours) à la fois l'électromyogramme et la température chez un animal vigile, non contraint et dans son environnement habituel. Après l’implantation des capteurs (opération d’1h maximum, anesthésie comprise) et le suivi post-opératoire (d'une durée de 24h), les animaux ne sont plus soumis à aucune manœuvre susceptible d’induire de la souffrance ou de la douleur.
Impact sur les animaux
Seule la procédure de simulation de microgravité peut engendrer quelques nuisances. Cette procédure est appliquée depuis 25 ans dans notre laboratoire et elle est bien maîtrisée. Nous surveillons chaque jour la prise alimentaire et la prise de boisson pendant les 30 jours de la procédure. Les souris sont pesées tous les 2 jours en début de procédure puis tous les 3 jours pendant la suite de restriction sensorimotrice. On observe une perte de poids les 2-3 premiers jours du fait d’une angoisse modérée de courte durée, mais elle est
Devenir
Les animaux du lot "contrôles" et HH seront euthanasiés en fin de protocole (après 40 jours d'enregistrement) par injection létale de produit anesthésiant (doléthal, ip, 180 mg.kg-1) par voie intrapéritonéale.
Remplacement
il s'agit d'un projet portant sur l'inactivté physique et ses effets sur les propriétés éléctriques musculaires. Un tel projet ne peut etre mené avec des méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
l'ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l'accomplissement de ces études requiert un nombre total de 80 souris. Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention derésultats satisfaisants (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles).
Raffinement
dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales seront réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites.
Choix des espèces
Ces travaux viennent en prolongement d’études réalisées depuis plusieurs années au laboratoire. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les études antérieures, il est important de conserver la même espèce animale, à savoir la souris. La souche mutante choisie, la C57BL/6J, est un modèle polyvalent utilisé dans de nombreux domaines d’application. Les fournisseurs standardisent l’élevage de cette souche en conformité avec les procédures d’élevage et le programme de qualité génétique de The Jackson Laboratory, ce qui nous permet de travailler avec les mêmes animaux que nos collègues russes qui organisent le vol spatial. Arrivée des animaux à l’animalerie à 8 semaines. Après 1 semaine d’acclimatation, les implantations auront lieu à 9 semaines d’âge, ce qui constitue un état stable mature de développement (âge adulte).
VaccinoLIV : Étude de l’immunogénicité et de l’efficacité chez la souris de candidats vaccins recombinants
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Toutes tuées à la fin de chaque procédure, 3 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer des candidats vaccins et des virus de la rougeole modifiés contre le cancer. Une partie est infectée par des virus humains ou par le parasite du paludisme des rongeurs Plasmodium berghei, une infection qui peut entraîner selon le porteur fièvre, prostration, perte de poids et paralysie, avec une mise à mort dès le score 2 de sa grille de douleur. D'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, avec des tumeurs qui peuvent s'infecter ou s'ulcérer, et des injections de vaccins une à deux fois par semaine pendant dix semaines au plus. Pour la virothérapie des cancers, le porteur invoque un "besoin médical" et un "marché" qu'il dit "également immenses".
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés au laboratoire. Les capacités anticancéreuses de virus de la rougeole modifiés seront aussi évaluées dans des modèles de greffes de tumeurs syngéniques. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves, ainsi qu’un possible traitement contre certains cancers, deux domaines d’impact majeur en santé publique.
Bénéfices attendus
Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves pour lesquelles le besoin médical est immense, ainsi qu’un traitement viro-thérapeutique contre certains cancers pour lesquels le besoin médical et le marché sont également immenses.
Procédures
Les animaux sont immunisés par voie intrapéritonéale, intramusculaire, intradermique, intraveineuse ou orale selon l'agent pathogène ciblé (quelques secondes par animal). Les prélèvements sanguins à la veine rétro-mandibulaire sont effectués à J0 - J7 - J28 - J60 après la vaccination (quelques secondes par animal). Pour évaluer l'efficacité des vaccins, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses (quelques secondes par animal) par des virus humains pathogènes ou non-pathogènes chez les souris contrôles ou par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, pathogène. Le suivi du challenge est effectué sur une goutte de sang récupérée à la queue de chaque animal à J1, J2, J3, J5, J7, J10 (quelques secondes par animal). Pour évaluer les propriétés immuno-oncolytiques des vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales (quelques minutes par animal). Le traitement des tumeurs est effectué par des injections intratumorales, intrapéritonéales, intramusculaires, intradermiques ou intraveineuses de vaccins recombinants contre la rougeole (quelques secondes par animal). Les vaccins candidats sont inoculés (quelques secondes par animal) une ou deux fois par semaine pendant un maximum de 10 semaines.
Impact sur les animaux
Pour évaluer l'efficacité des vaccins recombinants, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses par des virus humains pathogènes ou non chez les souris contrôles, ainsi que par le parasite du paludisme murin Plasmodium berghei, également pathogène. Selon l'agent testé, l'infection peut entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précédera la mort de l'animal. Pour évaluer les propriétés anticancéreuses des candidats vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales syngéniques qui peuvent entrainer des effets indésirables. En effet, la croissance des tumeurs chez la souris peut provoquer une gêne ou affecter le comportement ou la locomotion. La tumeur peut s'infecter ou s'ulcérer.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins recombinants. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris IFNAR ou hCD46/IFNAR permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.
Réduction
Pour appliquer le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous composons les groupes d’animaux « contrôles » de 4 souris et les groupes « test » de 6 souris. Ainsi deux souris sont épargnées à chaque test. Par la suite nous pourrons diminuer le nombre d’animaux à 4 dans les groupes « contrôle négatif » car, d’une expérience à l’autre, ces animaux contrôles reçoivent systématiquement le vaccin rougeole standard Schwarz et que la réponse des souris à l’immunisation est relativement homogène d’un animal à l’autre. Les groupes « test » sont composés de 6 souris, le nombre minimal d’animaux pour que les résultats soient statistiquement significatifs, comme validés par un bioinformaticien en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe représente la moitié des normes utilisées dans l’industrie du vaccin. Nous pouvons appliquer cette réduction car nous observons des effets forts : réponses immunitaires présentes ou absentes ; protection d’épreuves infectieuses efficace ou non. Ces observations sont basées sur notre longue expérience (67 publications dans ce domaine).
Raffinement
Les animaux soumis à des procédures qui produisent une douleur ou une détresse minimale/transitoire seront suivis par une observation quotidienne. Lorsque les animaux subiront des épreuves infectieuses, ils seront également contrôlés quotidiennement. En effet, selon le pathogène utilisé, l’infection pourra entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précèdera la mort de l’animal. La mort des animaux comme point limite est strictement évitée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille évaluation douleur stress inconfort sera utilisée pour noter la douleur et la détresse qui peuvent survenir chez les animaux exposés à des agents pathogènes connus pour provoquer des effets graves. Nous suivrons : 1) L'apparence générale (poil luisant/terne, hérissé, état d'embonpoint, perte de poids, rétrécissement des orbites oculaires, renflement du nez, changement de position des vibrisses. 2) Signes cliniques : respiration, posture, activité, fèces, pli cutané. 3) Comportement : comportement normal/agitation, mobilité, mâchonnement des barres, déplacement en cercle, saut arrière. Pour éviter au maximum la douleur et la détresse nous suivrons les recommandations suivantes : mise à mort en cas de score 2 et observation quotidienne si score >0. Un aliment enrichi sera ajouté et l'enrichissement de l’environnement sera amélioré dès le début des procédures des épreuves infectieuses.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins. Nous utilisons ces souris depuis de nombreuses années et avons publié un grand nombre d’articles décrivant leurs propriétés et leurs qualités dans ce contexte. Pour étudier les propriétés immuno-oncolytiques du virus de la rougeole, des modèles de greffe de tumeurs sont utilisés. Age moyen des animaux : 11 semaines +/- 4 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique. Par ailleurs les jeunes individus répondent mieux que les plus vieux. Enfin, il est inutile de laisser vieillir les animaux avant utilisation.
Rôle de DYRK1A dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour préciser le lien entre la protéine DYRK1A et les lésions de la maladie d'Alzheimer, 240 souris issues de croisements entre des lignées qui développent des lésions amyloïdes ou tau et des lignées portant une ou trois copies du gène Dyrk1a vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sans anesthésie cinq prises de sang à la veine sous la mâchoire, de 2 à 6 mois, puis un labyrinthe en Y, un test de reconnaissance d'un nouvel objet et la piscine de Morris, où elle doit retrouver à la nage une plateforme immergée. Toutes sont tuées à 6 mois, 128 pour l'extraction du cerveau et 112 par perfusion cardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie. Le porteur affirme que la souris est tenue pendant la prise de sang "sans que l'animal n'exprime ou montre des signes de détresse", et cite un risque d'hémorragie dans la bouche et d'hématome au visage.
Objectifs
Les personnes atteintes du syndrome de Down présentent des niveaux accrus de DYRK1A dans le tissu cérébral et de plasma. Une expression accrue des transcrits DYRK1A a été signalée dans des échantillons d'hippocampe provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, bien que les niveaux de protéine DYRK1A dans des homogénats de cortex frontal se soient avérés similaires entre les patients atteints de la maladie d'Alzheimer et les témoins. Récemment, il a été demontré que les personnes âgées souffrant de troubles de la mémoire et présentant une imagerie amyloïde positive présentaient des taux plasmatiques de DYRK1A plus faibles que celles présentant une imagerie amyloïde négative. En outre, il a éte également observé que les adultes âgés cognitivement normaux et sans dépôts amyloïdes présentaient des niveaux plasmatiques de DYRK1A plus élevés que les individus plus jeunes, ce qui pourrait suggérer que l'augmentation de DYRK1A associée à l’âge protègerait de la maladie d'Alzheimer. Dans cette étude, nous cherchons à préciser le lien entre les niveaux cérébraux et plasmatiques de DYRK1A et les deux neuropathologies de la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à mieux comprendre le rôle de la surexpression/downregulation de DYRK1A dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer, en particulier les pathologies amyloïdes et tau. Ce projet contribuera également à une meilleure compréhension de l'apparition précoce de la neuropathologie de la maladie d'Alzheimer chez les personnes atteintes du syndrome de Down, étant donné que le gène codant pour la DYRK1A est situé sur le chromosome 21 et qu'il est donc surexprimé dans cette population. L'étude de biomarqueurs plasmatiques capables d'identifier les individus à haut risque pour la maladie d'Alzheimer de manière rapide et efficace permettrait d'initier un traitement pré-symptomatique de cette maladie, en particulier dans les populations à haut risque. Enfin, les efforts visant à élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies amyloïdes et tau pourraient également ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques visant à modifier le développement de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront effectué at 2, 3, 4, 5, 6 mois sur chacune des 240 souris (5 échantillons/animal; 1 échantillon/mois; durée de la procédure: 2 à 3 minutes). Nous prélèverons le sang dans la veine submandibulaire, un procédé rapide, simple et reconnu, qui permet aux chercheurs de prélever rapidement 0,2 à 0,3 ml de sang sans recourir à l'anesthésie. Ensuite, les souris effectueront des tests comportementaux: Y maze, reconnaissance de nouvel objet et piscine aquatique de Morris. Le labyrinthe Y est basé sur une session de 8 minutes. La reconnaissance d'objets nouveaux est basée sur quatre sessions : deux sessions d'habituation, une session de familiarisation et une session de test. Chaque session a une durée de 10 minutes. Le test du labyrinthe aquatique de Morris est basé sur des épreuves d'apprentissage qui se dérouleront sur 5 jours, à raison de 4 épreuves par jour (intervalle inter-épreuves : 60 min), et d'un "test de sonde" le 7ème jour (48 h après le dernier jour d'entraînement). Pendant les essais d'apprentissage, l'animal doit localiser une plate-forme cachée immergée sous la surface de l'eau en 90 secondes. Pendant le “probe test”, les souris sont autorisées à nager librement pendant 60 secondes. Les souris auront une semaine de repos entre les tests afin de réduire les effets de transfert des tests précédents. Chaque souris sera testée pour tous les paradigmes comportementaux, et l'ordre des tests sera le même pour chaque souris. Chaque souris effectuera chaque test une fois. A l'issue de ces tests, 128 souris seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin d'extraire les cerveaux pour les analyses biochimiques (durée de la procédure: 3 à 5 minutes pour chaque souris). Les 112 souris restantes recevront une perfusion cardiaque de parafolmaldéhyde afin d'éliminer le sang du cerveau pour les études immunohistochimiques (durée de la procédure: 10 à 15 minutes pour chaque souris).
Impact sur les animaux
Pendant le prélèvement de l’échantillon de sang (étape 1), l'animal est retenu avec précaution par la peau du cou et du dos afin d'immobiliser la tête, sans que l'animal n’exprime ou montre des signes de détresse. Les personnes effectuant les prélèvements de sang sont familiarisées avec la technique de prélèvement. Le sang s'écoule rapidement après la ponction, et une fois la contention de la souris relâchée, le saignement s'arrête rapidement. Une ponction trop profonde peut entraîner la pénétration du sang dans la cavité buccale et un risque d'hémorragie. Un hématome sur le côté du visage peut se produire occasionnellement. Les souris seront observées pendant 30 minutes après le prélèvement de sang pour vérifier leur comportement normal et leur hémostase. Les tests comportementaux (étape 2) sont basés sur les comportements spontanés de l’animal avec une procédure graduelle d’habituation-familiarisation aux dispositifs de test. Pour limiter le stress durant les tests, les souris seront habituées à l’expérimentateur/la manipulation et seront transférées de leur cage à la salle de comportement au moins une heure avant le test. En général, les tests comportementaux utilisés dans ce projet peuvent causer un stress léger. Pour tous les tests, on prendra soin de placer et de retirer délicatement l'animal de l'appareil de test et, entre les animaux, l'appareil sera nettoyé des débris. Pour les tests dans l'eau (Labyrinthe aquatique de Morris), les souris sont surveillées en permanence pendant qu'elles sont dans l'eau, et à la fin du test, les souris sont essayer avec un torchon et placé dans une cage avec un autre torchon avant de les remettre dans leur cage d'origine. Enfin, le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation (perte de poids, pelade, agressivité, prostration, agitation, les petits yeux, les oreilles en arrière, etc). La perfusion transcardiaque (étape 3) de souris est une procédure définitive. Cette procédure se déroule avec un animal complètement anesthésié (vérifier l’absence de réflexe de retrait et palpébral). Si l'animal réagit à la coupe pendant la procédure chirurgicale, un anesthésique supplémentaire sera administré immédiatement.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées (euthanasie réglementaire ou perfusion transcardiaque de souris) pour prélever le cerveau afin d’étudier les lésions de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau).
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de maladie d'Alzheimer et aux croisements avec des souris surexprimant ou sous exprimant DYRK1A, pour atteindre les objectifs du projet: analyses de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau) ainsi que des déficits d'apprentissage et de mémoire.
Réduction
Réduction: le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées, notamment des études du laboratoire. Des groupes de 10 à 12 souris seront nécessaires afin d’atteindre un poiuvoir statistique suffisant permettant de détecter des variations significatives dans les données comportementales. Nous utiliserons sur 3 ans un total de 240 souris.
Raffinement
Raffinement: les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec le comité de bien-être animal.
Choix des espèces
Les souris APP23 sont un modèle de maladie d'Alzheimer développant une pathologie amyloïde étendue. Les souris PS19 sont un modèle de tauopathie, qui développent des enchevêtrements neurofibrillaires, une perte neuronale et une atrophie cérébrale caractéristiques de la pathologie tau retrouvée dans la maladie d'Alzheimer. Ces deux modèles murins de la maladie d'Alzheimer présentent des déficits cognitifs. Le modèle de souris mBACtgDyrk1a porte trois copies du gène Dyrk1a de la souris comme dans la trisomie 21, alors que les souris DYRK1A+/- KO portent une seule copie de ce gène. Dans ce projet, nous analyserons les effets de la surexpression du gène Dyrk1a, ainsi que sa sous-expression sur les pathologies amyloïde et tau en croisant ces différentes lignées de souris. Des échantillons de sang seront prélevés sur des souris adultes âgées de 2 à 6 mois afin de détecter différents biomarqueurs. Les performances cognitives seront évaluées à l'âge de 4 mois, et des tissus cérébraux seront prélevés sur les souris à l'âge de 6 mois.
Potentiel vaccinal de souches de virus du Nil Occidental atténuées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections de virus, une souche atténuée candidate au vaccin puis la souche pathogène, et subit jusqu'à sept prises de sang. Le porteur indique que l'infection par le virus du Nil occidental peut provoquer paralysie, prostration, dos voûté et perte de poids d'au moins 20 %, l'animal étant tué dès l'apparition d'un signe sévère. Il affirme que l'étude d'une réponse protectrice "ne peut être effectuée qu'in vivo".
Objectifs
Le virus du Nil Occidental (West Nile Virus) est un flavivirus pouvant conduire à des cas sévères d’encéphalite virale (dans 1 infection sur 150 environ chez l’homme). Cela pouvant conduire à la mort de la personne infectée. Il n’existe à ce jour que des traitements symptomatiques et il n’existe aucun vaccin efficace chez l’homme. La mise en place d’un vaccin atténué contre le WNV est donc d’intérêt clinique. Nous avons décrit dans les dernières années différentes mutations permettant d’atténuer le virus WNV. Ainsi des mutations dans la protéine de membrane réduisent significativement la production virale par rétention réticulaire. De plus une mutation dans la protéine d’enveloppe abrogeant la glycosylation de la protéine E conduit également à une souche atténuée. Cependant ces virus ne sont pas complètement atténués, et la probabilité de réversion est théoriquement importante. Notre objectif est de générer un virus vivant atténué comportant simultanément plusieurs des mutations décrites, et tester la capacité de ce virus à répliquer, et à éliciter une réponse immunitaire protectrice contre une infection d’épreuve. En un premier temps, nous testerons l’atténuation du virus in-vivo, i.e. l’absence de symptômes sévères et l’absence de mortalité. Nous confirmerons que chez l’animal aucun virus révertant n’émerge (i.e. les mutations sont maintenues). Enfin nous testerons l’efficacité de ce virus à induire une protection contre une infection secondaire par le virus WNV sauvage (challenge).
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier un triple mutant du virus WNV (1 mutations dans la protéine E, deux mutations dans la protéine M) qui pourrait constituer un virus atténué, sûr et au potentiel vaccinal. Les 3 mutations étudiées dans ce projet ont déjà été décrites indépendamment dans la littérature mais mis en évidence une atténuation partielle ou pourraient muter et redevenir pathogène.
Procédures
Chaque animal sera soumis à deux injections de virus (souche vaccinale puis souche pathogène ; quelques minutes par injections), et à 7 prises de sang au maximum (alternance veine caudale et rétro-mandibulaire ; quelques minutes par prise de sans).
Impact sur les animaux
Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort.
Devenir
Les souris ont reçu du virus et un traitement potentiellement vaccinal, elles ne peuvent donc ni être réutilisées ni replacées ni adoptées, et sont donc mises à mort.
Remplacement
L’étude de la capacité d’un virus atténué à induire une réponse protectrice ne peut être effectuée qu’in vivo. Nous aurons au préalable confirmé que le virus est capable de réplication efficace et incapable de réverter in vitro. Le modèle souris (Balb/c) est un modèle précédemment utilisé pour les essais vaccinaux précliniques contre les infections à WNV.
Réduction
Nous commencerons par une expérience préliminaire sur 18 souris femelles, qui permettra de valider le nombre d’animaux à utiliser dans les expériences suivantes pour atteindre la significativité. Les groupes contrôles pour lesquels on connait bien la mortalité en réponse au virus WT, est nécessaire pour tester l’inoculum viral ; nous aurons dans ce groupe 3 animaux. Les expériences ne seront réalisées sur les mâles que si les résultats sont concluants chez les femelles. Nous commencerons par travailler chez les femelles car elles sont plus faciles à gérer. Bien que des différentes immunologiques entre mâles et femelles peuvent être décrits dans certains, cas, il n’y a eu aucune différence observée au cours les études antérieures.
Raffinement
Les souris seront suivies 3 fois par semaine (quotidiennement à partir de J7 post challenge). Pour réduire les risques de souffrance inutile, les animaux seront mis à mort selon les critères de suivi. Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort. En cas de problèmes de motricité, la nourriture et du gel d’hydratation seront déposés directement dans cage. En cas de symptômes légers, davantage de coton dentaire sera ajouté.
Choix des espèces
La souris Balb/c est un modèle à la fois simple et bien décrit de mammifère pour évaluer la capacité vaccinale de virus atténués WNV. S’ils sont positifs, les résultats chez la souris constitueront une première preuve de l‘efficacité vaccinale de ce virus atténué, permettant alors d’envisager la conduite d'autres essais précliniques. En règle générale, les jeunes animaux sont plus sensibles aux Flavivirus neurotropes et sont donc préférentiellement utilisés. Nous utiliserons dans cette étude des animaux âgés de 3 à 4 semaines, afin que les souris soient âgées de 8 à 9 semaines au moment de l’épreuve.