Recherche fondamentale

600 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 étant transférées vers un autre établissement et 150 reproducteurs tués pour prélèvement du cerveau. La lignée porte un phénotype décrit comme "dommageable", une paralysie progressive des membres postérieurs que les animaux développent à partir de cinq mois et demi. Le porteur précise qu'il faut maintenir ces souris en vie jusqu'à un stade avancé de paralysie, en les aidant alors à s'alimenter et à s'hydrater, car c'est à ce stade que la pathologie visée s'étend dans le cerveau. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que l'étude in vivo est "indispensable".

Objectifs

Il s’agit d’un projet d’élevage de souris transgénique avec phénotypage dommageable dans le but de générer des animaux nécessaires pour répondre à des questions scientifiques avec des enjeux de santé public majeurs. Pour mener à bien notre projet de recherche, nous aurons recours à des souris transgéniques pour la protéine Tau humaine qui présentent l’avantage d’être un modèle robuste d’induction et de propagation de la tauopathie. Les avancées de notre projet scientifiques, de par l'utilisation de ces animaux à phénotype dommageable, permettront de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie d'Alzheimer aboutissant sur des innovations thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Cet élevage a pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à nos deux projets de recherche tout en surveillant l'apparition du phénotype dommageable et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, les tauopathies sont des maladies neurodégénératives complexes pour lesquelles des spécificités semblent être impliquées et l'étude de certains de ces aspects est indispensable in vivo afin de pouvoir analyser les différences d'induction et de propagation au sein de l'organisme vivant.

Procédures

Il s'agit d'un élevage de souris à phénotype dommageable. 450 animaux produits au sein de ce projet sont destinés à être transférés dans un autre établissement utilisateur dans le cadre de projets préalablement autorisés. 150 animaux reproducteurs seront euthanasiés par CO2, leur cerveau sera prélevé, congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C afin d'être analysés pour les besoins des projets de recherche.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable attendu sera une paralysie des membres inférieurs qui sera détectable cliniquement à partir de 22 semaines d’âge (5,5 mois) chez les souris homozygotes et entre 9 et 12 mois d’âge (36-48 semaines) pour les souris hétérozygotes. Les premiers signes de développement de la paralysie observables seront une perte d’équilibre lors de la marche et un affinement progressif du bas du corps. Les animaux à ce stade peuvent encore se déplacer et se dresser sur les pattes arrières pour accéder aux croquettes et à l’eau de boisson. Il faut bien suivre le développement de la paralysie à partir de ce stade. Il va progresser vers un stade avancé en un mois pour les souris homozygotes et en 2-3 mois pour les hétérozygotes. A ce moment-là il faudra aider ces animaux à s’alimenter et à s’hydrater en leur mettant à disposition des croquettes en poudre mouillées et en ajoutant de l’eau gélifiée. Pour les besoins des différents projets nous devons garder les animaux en vie jusqu’à un stade avancé de paralysie car c’est à ce moment que la pathologie de Tau s’étend dans l’hippocampe, région de grand intérêt pour notre recherche.

Devenir

450 animaux produits au sein de ce projet sont destinés à être transférés dans un autre établissement utilisateur dans le cadre de projets préalablement autorisés. 150 animaux reproducteurs seront euthanasiés par une méthode réglementaire, leur cerveau sera prélevé, congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique l'euthanasie de ces animaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre projet les objectifs du projet. En effet, les tauopathies sont des maladies neurodégénératives complexes pour lesquelles des spécificités semblent être impliquées et l'étude de certains de ces aspects est indispensable in vivo afin de pouvoir analyser les différences d'induction et de propagation au sein de l'organisme vivant.

Réduction

Nous utiliserons 600 animaux, nombre minimal nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif afin de pouvoir aboutir à des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des travaux. Le nombre d'animaux a été établi grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées. Nous avons défini un ensemble de points limites pour la procédure d’élevage. De plus, un programme d’enrichissement sera appliqué en ajoutant dans la cage, une petite maison en carton et de matériel pour la nidification (coton compacté).

Choix des espèces

Nous aurons recours à une lignée de souris transgénique pour la protéine Tau qui représente un modèle de tauopathie robuste et fiable car la cinétique de développement de la tauopathie est prédictible. Les animaux seront utilisés à des stades adultes (à partir de 6 semaines) leur permettant de pouvoir être mis en accouplement.

126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales osseuses ou cartilagineuses, puis des séances d'échographie sous anesthésie, avant d'être tuées même si aucune tumeur ne s'est développée. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur osseuse implantée près du tibia peut être douloureuse et provoquer un boitement, et que la tumeur cartilagineuse sous-cutanée peut s'ulcérer. Il affirme qu'après des essais in vitro il est "indispensable" de tester la méthode d'imagerie chez l'animal pour l'amener en clinique.

Objectifs

Le projet a pour objectif de valider une nouvelle technique d’imagerie la spectrosocpie ultrasonore quantitative. Actuellement, la caractérisation du type et du grade d’une tumeur passe par la biopsie. Cet examen, est cependant invasif, local et une source de stress pour le patient. Il y a donc un besoin de développer de nouvelles techniques de caractérisation non-invasives, globales et rapides du cancer afin de déterminer à la fois la nature d’une tumeur et le type de cancer. Les tumeurs présentent des différences dans leurs microstructures tissulaire et vasculaire avec les tissus sains et entre elles : différences de propriétés mécaniques à l’échelle cellulaire, différences morphologiques , et structurelles (répartition plus compacte ou désordonnée des cellules) Des biomarqueurs de la microstructure tissulaire peuvent être évalués par ultrasons par la technique de spectroscopie ultrasonore quantitative. Ce projet a donc pour premier objectif d’évaluer la spectroscopie ultrasonore pour la caractérisation de tumeurs solides

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider in vivo dans des modèles mimant des évolutions cliniques de tumeurs osseuses, une méthode de détection et de suivi des tumeurs non invasive. Cette validation permettra de poursuivre le développement de cette imagerie et servira à l'amener vers les étapes de validations cliniques pour bénéficier aux patients.

Procédures

Les animaux vont tous etre soumis à une implantation de cellulles tumorales soit en position sous cutanée soit en position paratibiale. Cette implantation se fait par injection des cellules et est réalisée une fois en début de procédures, les animaux étant maintenus sous anesthésie gazeuse (5 min) et ayant reçu de la buprénorphine en préopératoire dans le cas des injections paratibiales. En fin de procédure, les animaux vont etre soumis à 2 examens d'imagerie: échographie et spectroscopie ultrasonore quantitative. Ces deux examens sont réalisés de manière consécutive les animaux étant sous anesthésie (20 et 2 min, respectivement).

Impact sur les animaux

L'ostéosarcome est une tumeur osseuse ; le modèle utilisé est implanté en position paratibiale (entre l'os et le muscle). De ce fait la croissance tumorale peut être douloureuse. Le boitement peut survenir ce qui est surveillée et est un des points limites. En cas de boitement douleureux, de la buprénorphine pourra être administrée (0,05mg/kg). A noter que nous choisissons la buprénorphine comme analgésique car le carprofène est un antiinflammatoire non stéroïdien qui peut influencer l’environnement inflammatoire des tumeurs osseuses. Le chondrosarcome est une tumeur cartilagineuse ; le modèle utilisé est implanté en position sous cutanée. C’est une tumeur de progression lente qui du fait de sa position d’implantation pourrait ulcérer. Ce point est particulièrement surveillé et est d’ailleurs un point limite.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux, même ceux n'ayant pas développé de tumeur à J25 ou atteints de point limite, seront mis à mort.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées sur des culots cellulaires et des sphéroides et ont montré l’intérêt de la spectroscopie ultrasonore quantitative pour détecter les différences dans les structures cellulaires (zones de nécrose par exemple). Cette approche in vitro a permis de remplacer des études in vivo. Maintenant afin de pouvoir valider la spectroscpie ultrasonore quantitative et de l’emmener en clinique il est indispensable de tester cette méthode d’imagerie dans des modèles animaux mimant la clinique humaine.

Réduction

Des études in vitro préliminaires ont été réalisés et ont déjà permis de repousser le passage chez l’animal et de réduire le nombre d’animaux à inclure. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum mais dans des mesures satisfaisantes pour pouvoir conclure sur l’efficacité de la spectroscopie ultrasonore quantitative pour détecter, caractériser les tumeurs musculosquelettiques et leurs changements en réponse à des thérapies.

Raffinement

Tout au court de ce projet, les précautions seront prises pour ne pas stresser l’animal. En cas de douleurs, les médicaments contre la douleur seront administrés par la voie intra-péritonéale ou intra-veineuse. L'administration des médicaments et de l'anesthésie pendant l'epxérimentation est effectuée seulement par un personnel formé à ces actes. A note que ce cas de figure ne s'est jamais présenté dans nos précédentes expérimentations. De l'enrichissement est ajouté dans les cages (nids, croquettes déposée dans la cage en cas de difficulté d'accès à la grille de croquettes).

Choix des espèces

Parmis les modèles d'ostéosarcome, le plus représentatif est un modèle murin obtenu par greffe de cellules aussi murines chez des souris immunocompétentes. L’évolution de ce modèle et sa réponse à des thérapies conventionnelles sont bien connues au niveau macroscopique et histologique. Ce modèle a déjà servi dans des études d’évaluation de thérapies et d’imageries. De part toutes ces caractéristiques et connaissances, il se prête donc parfaitement à une validation de technique d’imagerie nouvelle. Quant au chondrosarcome, peu de modèles sont disponibles. Pour des études d’imagerie, le modèle obtenu par greffe sous cutanée de cellules humaines sur des souris immunodéprimées est bien caractérisé et permettra d’avoir un accès facile à la tumeur pour assurer son suivi et réaliser la prouve de concept de l’utilisation de la spectroscopie ultrasonore quantitative. Cette technique serait utilisée pour le suivi de ces tumeurs cartilagineuses pour lesquelles aucune méthode d’imagerie ne permet à l’heure actuelle un suivi optimal.

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois chirurgies puis une dizaine de séances où il porte un microscope miniature fixé sur la tête pendant qu'il se déplace, avant d'être tué par perfusion intracardiaque pour analyse du cerveau. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des lésions osseuses et tissulaires pouvant s'accompagner de douleur, de perte de poids et d'immobilité, et que le port du dispositif peut d'abord induire un stress. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible" car il s'agit d'un système intégré "non modélisable".

Objectifs

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles cérébrales qui permettent à l'animal de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. À cette fin, nous utiliserons des microscopes miniatures pour visualiser l'activité neuronale d'animaux au comportement libre. (1) Notre objectif est de comprendre la structure dynamique du réseau de neurones d'orientation spatiale et comment il est influencé par les stimuli visuels. L'activité des populations de cellules sera enregistrée pendant que les animaux marchent librement dans une arène ronde avec des repères visuels proéminents. Pour examiner comment l'entrée visuelle régit le circuit neuronal de direction de la tête, nous allons faire varier l'entrée sensorielle de l'animal en enregistrant en présence de repères visuels proéminents, puis en éteignant la lumière et en la rallumant. (2) Notre deuxième objectif est d'étudier le rôle des neurones du cervelet lors de la locomotion libre. Le cervelet est l'une des régions clés du cerveau impliquées dans la coordination motrice. On sait que le microcircuit cérébelleux traite les informations sensori-motrices et réalise des modifications immédiates des pattes correspondant au mouvement en cours. Les bases cellulaires d'une telle intégration demeurent largement inconnues. Le but de ce projet est d'examiner le rôle des neurones du cervelet dans la coordination des mouvements. Nous proposons d'étudier le rôle du réseau chez la souris éveillée en mouvement libre en utilisant l'imagerie calcique nous informant sur l'activité neuronale sous-jacente. La tâche pour cette étude consiste pour les animaux à traverser librement une échelle horizontale - avec des barreaux - reliant deux plateformes. Une telle tâche nécessite une intégration sensorimotrice qui implique le cervelet.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles cérébrales qui permettent à l'animal de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement de des pathologies neurologiques liées.

Procédures

Les souris de cette étude subiront 2 procédures : Procédure n°1: Rôle des neurones du cervelet lors de la locomotion libre (6-8 semaines au total) et Procédure n°2: Dynamique du réseau neuronal d'orientation spatiale dans le présubiculum (6-8 semaines au total). Les animaux de la procédure n°1 (100 souris en total) subiront 3 chirurgies dont 1 peu invasive et environ 10 séances de comportement couplé à des enregistrements de mouvement et d'imagerie calcique. Les animaux de la procédure n°2 (230 souris en total) subiront 3 chirurgies dont 1 peu invasive et environ 10 séances de comportement couplé à des enregistrements de mouvement et d'imagerie calcique. Les deux procédures se terminent par la mise à mort des animaux par perfusion intra-cardiaque.

Impact sur les animaux

Les chirurgies invasives prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 à 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. Le fait de porter le microscope miniature sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement anormal indésirable. Avant d'imager l'activité neuronale à l'aide du miniscope, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer à porter l'appareil d'imagerie.

Devenir

Tous les animaux suivant les procédures 1 et 2 sont sacrifiés comme indiqué à l'étape E. Ils sont mise à mort par perfusion intra-cardique avec dosage des anesthésiques pour prélèvement d'organes et analyses histologiques. L'étude histologique post-mortem nous permet d'identifier la localisation et l'identité des neurones enregistrés.

Remplacement

L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant en libre movement afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. Le remplacement n'est pas possible car il s'agit d'une étude d'un système intégré, non modélisable

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants permanents. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de plusieurs sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement et à réduire le nombre d’animaux. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible

Raffinement

Tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance quotidienne de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.

Choix des espèces

La souris a été choisie car en combinant souris transgénique et injections virale de GCaMP nous serons en mesure de mesurer l’activité calcique dans des populations neurales spécifiques pendant le mouvement libre. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures..

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages de tamoxifène pour inactiver un gène, subissent plusieurs tests métaboliques avec injections répétées de glucose et d'insuline, une partie étant soumise à un régime riche en graisses, avant une anesthésie sublétale suivie d'exsanguination. Une perte de poids progressive est attendue du fait de la destruction des cellules intestinales visées. Le porteur affirme que ces processus "n'existent que dans l'organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris génétiquement modifiée.

Objectifs

La digestion, la glycémie, et l’appétit sont régulés par différentes hormones (telles que l'insuline pancréatique), produites par les cellules endocrines présentes dans le pancréas et l’intestin. Des pathologies sévères telles que diabète, obésité et malabsorption intestinale sont associées à des altérations des cellules endocrines. Notre laboratoire s’intéresse aux mécanismes responsables du développement des cellules endocrines pancréatiques et intestinales, afin de comprendre comment ces cellules très hétérogènes sont produites, en particulier dans l’intestin (où elles sont appelées cellules entéroendocrines (CEE)), et comment elles sont capables d’assurer leurs fonctions tout au long de la vie. Malgré leur grande diversité, les cellules endocrines sont toutes issues de cellules dites progénitrices qui expriment un gène spécifique commun. L’absence d’expression de ce gène dans l’intestin au cours du développement entraine une perte de l’ensemble des CEE et par conséquent de toutes les hormones qu’elles produisent, provoquant une malabsorption intestinale et des diarrhées chroniques. Ces altérations engendrent des atteintes très sévères chez l’Homme et entrainent une létalité périnatale dans des modèles murins, empêchant l’étude à des stades tardifs, lorsque l’intestin est pleinement fonctionnel. Les cellules de l'épithélium intestinal, y compris les CEE, sont continuellement renouvelées (tous les 3-4 jours chez l'Homme) durant toute la vie. Afin d'étudier le rôle des CEE et des hormones intestinales dans l’intestin mature au cours de ces processus et d'éviter la létalité périnatale, nous avons développé un modèle de souris où l’on peut induire, suite à l’administration d’une drogue (le tamoxifène), l’inactivation du gène responsable de la formation des CEE dans l’intestin. Dans ce projet, nous souhaitons induire l’inactivation de ce gène chez l’adulte afin de définir l’impact de la perte des CEE sur le métabolisme énergétique (en particulier la régulation de la glycémie) et l’absorption des nutriments, et de suivre les éventuelles conséquences sur la flore intestinale. Nous souhaitons également évaluer le rôle de l’alimentation sur le développement des CEE. Dans ce but, l’ensemble des analyses (métabolisme, flore intestinale) sera réalisé à la fois en présence d’une alimentation standard et d’une alimentation riche en graisses.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des CEE chez l'adulte, notamment dans le contrôle de la digestion, de l'homéostasie intestinale, du métabolisme glucidique et du microbiote intestinal. A long terme, ces données pourraient permettre d'améliorer la prise en charge des patients souffrant d'anendocrinose entérique, qui est une pathologie caractérisée par l'absence de CEE.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à : - 3 gavages de drogue (tamoxifène) par animal sur 5 jours (1 par jour à J0, J2, J4) (1min/gavage) - 1 gavage de glucose par animal (1min/gavage) avec suivi de la glycémie (à 0, 5, 15, 30, 60, 120min) et de l'insulinémie (à 0, 15 et 30min) par prélèvement sanguin au niveau de la queue (qlq secondes) - 1 injection intrapéritonéale de glucose (1min) par animal avec suivi de la glycémie (à 0, 5, 15, 30, 60, 120min) et de l'insulinémie (à 0, 15 et 30min) par prélèvement sanguin au niveau de la queue (quelques secondes) - 1 injection intrapéritonéale d'insuline par animal (1min) avec suivi de la glycémie (à 0, 15, 30, 60, 120min) (quelques secondes) - 2 injections intrapéritonéales de molécules (1min / injection, 22h entre les deux injections) permettant l'évaluation de la division des cellules de l'épithélium intestinal - 1 injection intrapéritonéale (1min) de produits anesthésiants.

Impact sur les animaux

Une perte de poids progressive est attendue suite à la perte des cellules entéroendocrines. Des procédures sont réalisées successivement sur les animaux : 3 gavages de tamoxifène (1/jour à J0, J2, J4), 1 gavage de glucose, 1 injection intrapéritonéale de glucose, 1 injection intrapéritonéale d'insuline, 2 injections intrapéritonéales de marqueurs de prolifération cellulaire (à 22h d'intervalle) et 1 injection intrapéritonéale d'anesthésiants. En plus de ces procédures, le groupe B est soumis à un régime riche en graisses depuis le sevrage. Outre le stress causé par les procédures, nous n'attendons pas d'effets indésirables particuliers.

Devenir

- Groupes A et B : A l'issue de la PE1 : les animaux seront réutilisés pour les PE 2 à 6 succesivement. La PE6 (anesthésie sublétale) est suivie d'un prélèvement sanguin intracardiaque (exsanguination) et d'un prélèvement d'organes (intestins, pancréas, foie). Les tissus prélevés seront utilisés pour des analyses histologiques et de biologie moléculaire. Le sang prélevé en intracardiaques sera utilisés pour réalisés des analyses biochimiques (glucose, cholestérol, ...). - Groupe B : A l'issue de la PE7 (groupes B) : les animaux seront réutilisés pour les PE 1 à 6 successivement et mis à mort lors de la PE6. Pour plus de détails voir point mentionnée ci-dessus. - Groupe C : Tous les animaux sont mis à mort (inhalation de CO2 ou dislocation cervicale) après la PE1 pour dissection.

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer comment les cellules endocrines intestinales, sécrétrices d'hormones, sont générées dans l'intestin adulte et comment ces cellules sont capables de contrôler le métabolisme énergétique, l'absorption intestinale et la flore intetsinale. L'ensemble de ces processus nécessite non seulement des régulations au sein du tissu mais également des communications inter-organes et avec l'environnement, qui n'existent que dans l'organisme entier. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt uniquement dans les cellules étudiées. Par ailleurs, des études antérieures ont révélé que les mutations du gène d'intérêt (Ngn3) chez la souris entrainent des pathologies très proches de celles observées chez l'Homme.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans cette étude a été calculé en tenant compte notamment de la variabilité inter- individus (élevée dans le cas de tests métaboliques) mais également pour l’application de tests statistiques adéquats (tels que le t-test ou le test non paramétrique de Mann Whitney). La répétition des études sera jugée nécessaire uniquement si les résultats d'une expérience ne peuvent être correctement interprétés (nombre de points mesurés trop faible).

Raffinement

Les procédures expérimentales seront réalisées par un personnel compétent effectuant couramment les différentes procédures et respectant l’ensemble des règles relatives au bien-être animal, limitant ainsi au maximum le stress de l’animal. Par ailleurs, les animaux seront maintenus dans des cages incluant litière et enrichissement. En outre, des phases de repos de 15 jours seront respectées entre les différents tests métaboliques. Les procédures mises en oeuvre impliquent un suivi régulier, notamment une pesée hebdomadaire; en cas de souffrance d'un animal, l'avis du vétérinaire sera demandé.

Choix des espèces

La souris (Mus Musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son temps de génération permet de réaliser des études relativement rapides et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. La nécessité d’utiliser des souris génétiquement manipulées est liée à l’absence de toute mutation spontanée dans cette ou d’autres espèces de mammifères qui correspondrait à la maladie humaine. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt uniquement dans les cellules étudiées. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 8 et 30 semaines), l'invalidation du gène d'intérêt, Ngn3, dans l'intestin au cours du développement étant létale dans la période périnatale. Le modèle murin utilisé permet de contrôler l'invalidation du gène d'intérêt, qui ne se produit qu'après traitement au tamoxifène.

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent dès le quatorzième jour de vie l'injection d'un carcinogène chimique, puis subissent un régime induisant une forte prise de poids, des prélèvements sanguins réguliers et un développement tumoral du foie pouvant provoquer amaigrissement et altération de l'état général. Les retombées annoncées pour les patients, de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" car il constitue selon lui le "seul modèle préclinique" permettant de modifier l'expression des gènes de façon ciblée.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour élucider la pathogénie sous-jacente de la maladie. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations génétiques, métaboliques et inflammatoires favorisant un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte, cellule majoritaire du foie. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique.

Bénéfices attendus

Les résultats de notre projet permettront de déterminer les mécanismes par lesquels l’hépatocyte assure le maintien de l'intégrité du génome, et en particulier lors des maladies métaboliques et inflammatoires du foie conduisant au développement d’un cancer du foie. Les retombées de nos travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié. Une injection intra-péritonéale de tamoxifène sera réalisée (une fois, à 6 ou 7 semaines de vie suivant le lot expérimental, durée 30 secondes) sur animal vigile. Un prélèvement sanguin au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière bi-mensuelle (16 répétitions, entre le 4ème et 12ème mois de régime, durée 30 secondes-1 minute). Une injection intra-péritonéale de Diethyl-nitrosamine (carcinogène chimique) sera réalisée (une fois, à 14 jours de vie, durée 30 secondes) sur animal vigile. Une injection intra-veineuse (veine de la queue) sera réalisée (une fois, à 6 semaines de vie, durée 5-7 secondes) sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Du par le régime alimentaire auquel seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Du fait de l’injection IV par la veine caudale, une douleur transitoire dans cette région pourra être ressentie. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général (asthénie, perte de poids...).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux (2240).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les processus de carcinogenèse du foie.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet, 2240 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection intra-orbitaire) sera précédée d’une courte anesthésie générale (mélange gazeux d'O2-Isofluorane [0.5-2.5%]). La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées dans ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.

180 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus transgéniques pour exprimer deux gènes de canard, ils sont infectés par le virus de la grippe aviaire H7N1, subissent jusqu'à neuf prises de sang et de nombreux écouvillons, puis sont euthanasiés pour prélever leurs organes. Les animaux infectés peuvent développer détresse respiratoire, prostration et immobilité, l'euthanasie étant déclenchée quand au moins trois signes cliniques sur six apparaissent. Le porteur affirme que l'étude de la réponse immunitaire adaptative "n'est possible que par des études in vivo" et présente ces poulets comme un "modèle unique".

Objectifs

Les virus de la grippe aviaire (AIV) représentent une menace majeure pour la santé humaine et animale. Les AIV, sont susceptibles d'acquérir des mutations dans les protéines virales, ce qui augmente le risque de transmission de l'oiseau à l'homme. Les oiseaux aquatiques sauvages, dont les canards, représentent le réservoir naturel des AIV. Il a été suggéré que les caractéristiques génomiques de ces espèces aviaires étaient associées à une résistance virale naturelle contre les maladies induites par le virus AIV. Chez le canard, le RIG-I (retinoic acid inducible gene 1) est considéré comme un gène de résistance naturelle contre la grippe aviaire. RIG-I est impliqué dans le déclenchement de la réponse antivirale caractérisée par une production des interférons (IFN) de type I et de type III, suivie de la production de gènes stimulés par l'IFN. Alors que les poulets sont très sensibles à l'infection grippale et présentent des symptômes cliniques, les canards ne développent pas de symptômes cliniques lors de l'infection par plusieurs sous-types de virus de la grippe aviaire, ce qui est peut-être dû à la présence de RIG-I, mais pourrait aussi être lié à la protéine 135 du doigt d'encoche (RNF-135). RIG-I et RNF-135 sont absents du génome du poulet, ce qui pourrait être à l'origine d'une plus grande sensibilité à certaines infections virales. Ce projet permettra d'expliquer pour la première fois le rôle des gènes de canards capables de maitriser les AIV en utilisant des poulets transgéniques. Les objectifs du projet sont de répondre à deux questions principales : 1) Les poulets transgéniques qui expriment le RIG-I et le RNF-135 de canard sont-ils protégés contre l'infection par des virus virulents de la grippe aviaire? 2) Quel est le rôle de RIG-I et RNF-135 de canard dans les réponses immunitaires adaptatives aux virus de la grippe aviaire ? Le nombre total d’animaux est de 180.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de répondre à des questions relatives à l'aviculture, à l'immunologie et à la virologie qui n'ont pu être résolues jusqu'à présent en raison de l'absence de poulets transgéniques. Nous obtiendrons de nouvelles informations sur le rôle des gènes du canard chez la volaille. Cela permettra de mieux contrôler le virus de la grippe aviaire chez les volailles en développant de nouvelles thérapies qui conduisent à l'activation de certaines voies immunitaires. En outre, les résultats de ce projet contribueront à la compréhension de l'oiseau aquatique en tant que réservoir du virus et expliqueront le rôle exact de RIG-I ainsi que de RNF-135 du canard. De plus, nous espérons fournir une compréhension approfondie des interactions virus-hôte d'une importante infection potentiellement zoonotique, ce qui bénéficiera à la santé des humains et des animaux.

Procédures

- Inoculation par voie intra-trachéale et intra-choanale de 100 µL virus (144 animaux) ou de 100 µL de PBS (36 animaux) : vigile, soit 180 animaux, à raison d’une administration pour 150 animaux (120 animaux avec le virus et 30 animaux avec le PBS) et 2 administrations pour les 30 autres (24 infectés et 6 témoins). Les inoculations durent moins de 30 sec en moyenne par animal. - Prélèvements de sang au sinus occipital : vigile, quelques µL à 100 µL à naissance, jour 1, 3, 7, 11, 14, 18 et 22 post-inoculation) soit 9 prises de sang par animal pour ceux euthanasiés à J22 (60 animaux), 5 prises de sang pour ceux euthanasiés à J7 (60 animaux) et 3 prises de sang pour ceux euthanasiés à J1 (60 animaux). - Ecouvillons oropharyngés et cloanaux : vigile, sur tous les animaux, un écouvillon de chaque à raison de 8 fois par animal (à 1, 3, 7, 11, 14, 18 et 22dpi) pour ceux euthanasiés à J22 (60 animaux), 4 écouvillons de chaque pour ceux euthanasiés à J7 (60 animaux) et 2 écouvillons pour ceux euthanasiés à J1 (60 animaux). Le prélèvement ne dure que quelques sec.

Impact sur les animaux

Les poulets transgéniques non infectés n'ont présenté aucun phénotype anormal. Au cours de l’infection, certains animaux qui ne sont pas génétiquement modifiés peuvent presenter dès 24h des signes cliniques modérés qui sont liés à la réponse de l’organisme à l’infection virale, mais ne présagent pas toujours d’une issue fatale. Il n’existe pas actuellement de grilles de scores cliniques adaptées à l’influenza aviaire expérimental. Cependant, en nous inspirant des études de bien-être du Welfare Quality® chez le poulet, nous mettrons en place le système d’évaluation de l’état clinique de l’animal suivant: Les animaux seront observés deux fois par jour par un animalier expérimenté, connaissant parfaitement les signes cliniques de l’influenza aviaire. Les animaux qui présenteront au moins 3 des 6 paramètres suivants seront euthanasiés par injection létale de barbiturique: - difficulté respiratoire visible - fermeture anormale de l'oeil (mi-fermé, fermé) - position anormale de la tête et de la queue - posture anormale des ailes (écartées, tombantes) - plumage ébouriffé - Absence de réponse à la stimulation (immobilité). Ce modèle d’infection de grippe (souche H7N1) chez les vollailes de type PA12 de statut EOPS ou axéniques est bien connu et maitrisé au sein de nos équipes. Les signes cliniques sont bien connus du personnel technique.

Devenir

Le projet est de réaliser un challenge infectieux (inoculation de la grippe) avec un suivi clinique de la maladie sur des prises de sang et écouvillons. Les animaux à la fin du projet (procédure) seront tous euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes afin de quantifier le virus. Les animaux infectieux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés sur le plan sanitaire pour l’environnement, pour la santé animale et publique. Pour les animaux témoins, ils seront également euthanasiés afin de réaliser les prélèvements d’organes, ils serviront de témoins dans les dosages de cytokines et l’identification des cellules immunitaires.

Remplacement

L'étude du rôle du RIG-I et du RNF-135 du canard dans la protection contre le virus de la grippe aviaire ainsi que dans la réponse immunitaire adaptée n'est possible que par des études in vivo. Nous utilisons des poulets transgéniques qui représentent un modèle unique pour de telles études.

Réduction

Le nombre d'animaux sélectionnés répartis sur deux expériences pour répondre à deux questions spécifiques concernant la susceptibilité des animaux à l'infection virale ainsi que le rôle de la réponse immunitaire adaptative dans la prévention des réinfections. Statistiques : Si p est inférieur à 0,05, l'hypothèse nulle est rejetée et l'hypothèse alternative est acceptée. Le nombre d'animaux requis a été calculé à l'aide du logiciel G*Power 3.1. La base de calcul de la taille des groupes est le nombre d'animaux par groupe qui est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement évaluables lors de l'autopsie et des tests de laboratoire ultérieurs (Tests F – ANOVA). Avant la production des poulets transgéniques, notre collaborateur en Allemagne a mené plusieurs expériences in vitro sur des fibroblastes et des cellules germinales de poulet qui nous ont permis de comprendre la fonction des gènes RIG-I et RNF-135. Toutes les expériences préliminaires ont éliminé la nécessité d'utiliser des animaux vivants pour comprendre le rôle du RIG-I dans la réponse immunitaire innée. Les données préliminaires in vitro nous ont permis de formuler des hypothèses spécifiques et de poser de nouvelles questions scientifiques qui ne peuvent être abordées que par des études in vivo, telles que le rôle de l'immunité adaptative et l'effet physiologique de l'expression de RIG-I sur l'animal pendant l'infection.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe dans des isolateurs adaptés en nombre et en taille, dans des conditions environnementales contrôlées (température, hygrométrie, éclairage), avec nourriture et boisson à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement social (élevés en groupe) et du milieu avec des jouets à picorer et des petits perchoirs. Les surfaces d’hébergement seront respectées. Le nombre d’isolateurs sera adapté (surface de 0,84 m²/isolateur). Une surveillance clinique quotidienne des animaux sera réalisée avec des observations physiologiques et comportementales pour ne pas dépasser le point limite. Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié. Pour les points limites, il n’existe pas actuellement de grilles de scores cliniques adaptées à l’influenza aviaire expérimental. Cependant, en nous inspirant des études de bien-être du Welfare Quality® chez le poulet, nous mettrons en place le système d’évaluation de l’état clinique de l’animal suivant : Les animaux seront observés deux fois par jour par un animalier expérimenté, connaissant parfaitement les signes cliniques de l’influenza aviaire. Les animaux qui présenteront au moins 3 des 6 paramètres suivants seront euthanasiés par injection létale de barbiturique: - difficulté respiratoire visible - fermeture anormale de l'oeil (mi-fermé, fermé) - position anormale de la tête et de la queue - posture anormale des ailes (écartées, tombantes) - plumage ébouriffé - Absence de réponse à la stimulation (immobilité). Ce modèle d’infection de grippe chez les vollailes de type PA12 de statut EOPS ou axéniques est bien connu et maitrisé au sein de nos équipes. Les signes cliniques sont bien connus du personnel technique.

Choix des espèces

L’espèce cible de la maladie est le poulet. Les questions abordées dans ce projet nécessitent l'utilisation de poulets transgéniques pour deux raisons principales : la première, il n'existe pas de poulets qui expriment les gènes du canard. Nous supposons que le poulet a perdu les gènes étudiés à un moment donné au cours de l'évolution et que la seule façon possible de ré-exprimer ces gènes dans le poulet est d'utiliser la transgénèse. Deuxièmement, notre objectif est d'étudier en détail la réponse immunitaire adaptative, ce qui n'est pas possible en utilisant des modèles in vitro qui ne permettent pas d'étudier les réponses immunitaires cellulaires telles que les lymphocytes T. Sur la base d'études antérieures ayant utilisé le même virus H7N1, les animaux seront utilisés à l'âge de trois semaines et conservés pendant 22 jours supplémentaires après l'infection initiale. Les œufs reçus de notre partenaire (environ 200 par expérience) seront incubés et éclos dans nos installations, les poussins seront élevés dans les isolateurs de 0 à 3 semaines. Ce seront les mêmes isolateurs que ceux de l’expérimentation.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunisées avec un allergène, une partie recevant ensuite des injections de toxine diphtérique destinées à détruire un type de cellules immunitaires, avant d'être euthanasiées au dixième jour pour prélever la rate et les ganglions. L'objectif est de valider une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées, un outil qui sera ensuite mis à disposition d'autres équipes. Le porteur affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend l'expérimentation in vivo "nécessaire" et écarte les méthodes sans animaux.

Objectifs

Les cellules Tfh (lymphocytes T folliculaires helper) sont des cellules immunitaires impliquées dans différentes réponses immunitaires. En effet, elles aident à la mise en place des réponses immunitaires impliquant la production d'anticorps, ce qui en fait des cellules clés de la défense immunitaire. Elles sont par exemple impliquées dans la réponse immunitaire suite à une vaccination mais aussi suite à une infection comme dans la réponse anti-VIH. Cependant, si ces cellules sont dérégulées, ceci peut conduire à différentes maladies comme des maladies auto-immunes (lupus érythémateux disséminé, la polyarthrite rhumatoïde) ou encore les allergies. Ces exemples permettent de comprendre l'intérêt pour ces cellules dans l'étude des pathologies actuelles. Comprendre leur fonctionnement pourrait permettre de renforcer l'efficacité des vaccinations ou de prévenir ou soigner ces maladies. Toutefois, les outils classiques de biologie ou modèles de souris actuels ne permettent pas de visualiser ces cellules in vivo ou de les éliminer sans impacter d'autres cellules, ce qui rend leur étude difficile actuellement. C'est pourquoi notre équipe a développé un nouveau modèle de souris permettant de visualiser les cellules Tfh et de les éliminer. En effet, au sein de ces souris, les cellules Tfh produiront une molécule fluorescente, ce qui permettra de suivre ces cellules. De plus, ce modèle permettra aussi d'éliminer les cellules Tfh grâce à une technique communément utilisée en biologie. En effet, les cellules Tfh seront modifiées génétiquement pour produire le récepteur de la toxine diphtérique (DTR) à leur surface. Par conséquent, l'injection de toxine diphtérique induira uniquement l'élimination des cellules Tfh. Cette toxine n'induit pas de réponse néfaste chez la souris comme chez l'homme car les autres cellules de la souris ne produisent pas le DTR. Cet outil pourra être utilisé par différentes équipes pour étudier le rôle des Tfh dans différentes pathologies, soit en suivant les cellules Tfh, soit en les éliminant spécifiquement. Néanmoins, l'utilisation de ce nouveau modèle est soumise à validation de celui-ci. Pour ce faire, il nous faut montrer que les cellules Tfh de cette lignée produisent bel et bien la molécule fluorescente. Dans un second temps, il nous faut démontrer l'élimination des cellules Tfh suite à l'injection de toxine diphtérique. Nous étudierons ceci en conditions inflammatoire (suite à une immunisation avec un allergène et un adjuvant) ou non.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider un nouveau modèle murin permettant de suivre les cellules Tfh avec une molécule rapportrice, la BFP, ou permettant la déplétion de ces cellules suite au croisement avec des souris exprimant Cre et à l'injection de toxine diphtérique. Ce modèle sera mis à disposition et pourra permettre l'étude des cellules Tfh dans différents contextes, comme les allergies, l'auto-immunité, les infections ou la vaccination, pour contrer les pathologies ou améliorer la vaccination.

Procédures

Tous les animaux (270) seront anesthésiés puis immunisés avec deux injections de CFA/OVA ou de PBS au jour 0 (durée de la procédure : 5 minutes). Parmi les 270 animaux, 198 animaux seront également injectés au jour 8 et jour 9 (durée de la procédure : 10 secondes par injection, soit 20 secondes au total sur deux jours) avec de la toxine diphtérique pour induire l'élimination des cellules Tfh. A jour 10, les 270 animaux seront euthanasiés par exposition à une dose croissante de CO2 pour pouvoir prélever la rate et les ganglions dans le but de voir le nombre de cellules Tfh dans nos différents groupes d'animaux pour valider notre modèle.

Impact sur les animaux

Les animaux devraient initier une réponse immunitaire dans les ganglions iliaques et la rate contre l'allergène utilisé suite à l'immunisation. L'injection étant locale, nous n'attendons pas d'effet indésirables autre qu'une inflammation locale, cependant si certains devaient survenir, ils seront traités selon les points limites établis pour limiter la souffrance de l'animal. Ayant déjà pratiqué les injections de toxine diphtérique dans d'autres modèles de souris et n'ayant observé aucune souffrance ou changement de comportement, nous n'attendons pas d'effet indésirable.

Devenir

Après injection de CFA/OVA, les animaux non concernés par la procédure expérimentale "Injection de toxine diphtérique" seront euthanasiés selon la procédure autorisée pour prélèvement et analyses des ganglions et de la rate, soit 72 souris. Tous les animaux concernés par la procédure expérimentale "Injection de toxine diphtérique" seront euthanasiés après celle-ci selon la procédure autorisée pour prélèvement et analyses des ganglions et de la rate, soit 198 souris

Remplacement

L'étude de la réponse immunitaire, et en particulier au cours de l'allergie, met en jeu différents organes et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse immunitaire et le rôle de chaque cellule impliquée.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 270 souris, permettant de caractériser les cellules exprimant la molécule rapportrice, ainsi que la déplétion des cellules Tfh. L'effectif par groupe est de 11 souris, ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales, avec un nid comme enrichissement. L'injection pour l'immunisation est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter la souffrance / stress des animaux. Après ce traitement, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Tout au long du protocol, les animaux seront surveillés de manière visuelle avec un suivi de l'aspect général des animaux, de leur posture et de leur comportement et déplacement. Une grille évaluant la douleur sera utilisée. Si celle ci est importante, ils seront retirés de l'étude et bénéficieront de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La lignée à caractériser est une lignée de souris. La souris a été choisie comme modèle car cette lignée sera ensuite utilisée dans l'étude du système immunitaire et en particulier de l'allergie. Le système immunitaire murin est proche de celui de l'homme avec une immunité innée mais également une immunité adaptative, ce qui permet l'étude spécifique de l'antigène et de la réponse mémoire. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.

424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées avec de la peau humaine et injectées de cellules immunitaires humaines, elles reçoivent un traitement quotidien pour tester une combinaison de molécules contre le rejet de greffe. Le porteur indique que l'injection de cellules humaines déclenche une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et mise à mort au-delà de 20 % du poids initial. Il présente ces souris humanisées comme une alternative à l'usage de primates non-humains.

Objectifs

En transplantation d’organes solides, les inhibiteurs de la calcineurine permettent de prévenir efficacement le risque de rejet aigu précoce. Néanmoins après quelques années survient une dysfonction chronique du greffon due d’une part à la néphrotoxicité des inhibiteurs de la calcineurine et d’autre part à un mauvais contrôle de la réponse allo-immune (humorale avec l’apparition d’anticorps anti-donneur et cellulaire matérialisé par l'apparition de plage de fibrose). Ainsi l’amélioration de la survie des greffons nécessite le développement de nouvelles stratégies immunosuppressives contrôlant mieux la réponse allo-immune et la progression de la fibrose. Dans cette optique les inhibiteurs de MEK sont une piste encourageante. La voie MAPK classique étant située en aval du TCR, les inhibiteurs de MEK ont un effet immunosuppresseur. Dans le cadre de la transplantation, cet effet a été rapporté dans un modèle murin de Graft versus Host Disease (GVHD), dans un modèle murin de greffe cardiaque et dans un modèle de transplantation pulmonaire chez le rat. Dans ces différents modèles les inhibiteurs de MEK bloquent l’activation des CD8 et favorisent l’épuisement des lymphocytes CD4 allo-réactifs. Par ailleurs les inhibiteurs de MEK favorisent l’essor des lymphocytes T régulateurs. Enfin il a été montré dans des modèles murins que les anti-MEK permettent de prévenir la fibrose rénale. Nous avons montré que les inhibiteur de MEK permettent de prolonger la survie des greffes de peau humaine allogéniques de façon significative comparativement aux contrôles non traités dans un modèle de peau greffée chez la souris NSG humanisée mais les inhibiteurs de MEK n’empêchent pas un rejet à long terme. Notre objectif est maintenant d’évaluer l’inhibition de la voie MEK en combinaison avec un traitement d’induction avec un inhibiteur de la calcineurine. Les inhibiteur de MEK, avec un bon profil de tolérance, pourraient être une alternative aux immunosuppresseurs classiques une fois la phase de rejet aigu maîtrisé avec un inhibiteur de la calcineurine.

Bénéfices attendus

Les inhibiteurs de MEK ont montré une bonne efficacité pour prévenir le rejet de greffe et un effet anti-fibrotique dans des modèles murins. Cependant, ces modèles ne peuvent valider l’efficacité d’une molécule sur les cellules du système immunitaire humain. Nous avons montré dans le modèle de greffe de peau allogénique humaine chez la souris NSG humanisée que l’inhibition de la voie MEK permet d’augmenter de façon significative la survie des greffons mais ne permet pas d’éviter le rejet. Les inhibiteurs de la calcineurine sont efficaces pour prévenir le rejet aigu mais leur utilisation au long cours n’empêche pas le rejet chronique et est associé à de nombreux effets indésirables. Cette étude vise à évaluer l’efficacité des anti-MEK combiné à un inhibiteur de la calcineurine pour prévenir le rejet de greffe d’organe dans le modèle bien validé de greffe de peau humaine chez la souris NSG humanisée par injection de PBMCs humain. En cas de résultats encourageants, cette combinaison de molécules pourrait être évaluée dans un modèle pré-clinique encore plus relevant (primates non humains par exemple). A plus long terme, cela pourrait aboutir à une diminution de l’utilisation des inhibiteurs de la calcineurine, dont la toxicité est reconnue, dans le traitement des patients transplantés

Procédures

Une greffe de peau sous anesthésie générale, durée de l’opération 1 heure. Une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, 5 min. Administration quotidienne du traitement par voie orale et/ou administration intrapéritonéale, 5 min. Prélèvement de sang , 1 fois par semaine.Jusqu'à J56 puis une fois par mois. 5 min.

Impact sur les animaux

La greffe de peau humaine chez la souris NSG n’entraîne pas de signe clinique chez la souris. L'humanisation des souris avec des cellules hPBMC entrainera des signes cliniques liés à l’apparition d’une xéno-GVHD (graft versus host disease) lorsque la quantité de cellules humaines sera suffisamment importante, notamment des lymphocytes T. Les souris seront surveillées quotidiennement au niveau comportemental et pesées 3 fois/semaine puis tous les jours lorsque les premiers signes cliniques apparaîtront ; chute de poids notamment. L'animal sera euthanasié si le poids atteint une perte de poids de 20% du poids initial. Le comportement général de la souris sera observé et l’animal sera euthanasié si un comportement anormal est constaté (par exemple, animal isolée du reste de ses congénères, dos vouté, poils hérissés).

Devenir

Toutes les souris de la procédure 1 seront utilisées pour la procédure 2. A l’issue de la procédure 2, les souris seront euthanasiées.

Remplacement

La molécule que nous souhaitons tester chez la souris NSG humanisée a déjà été étudiée in vitro et in vivo dans des modèles murins. Le passage dans un modèle in vivo mimant la situation complexe que constitue le système immunitaire humain apportera des arguments supplémentaires quant à son efficacité pour prévenir le rejet de greffe chez l’homme.

Réduction

Les données issues de ce projet devront donc être suffisamment robustes (c'est-à-dire validées avec tests statistiques). Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques (Test de Mann- Whitney) car nous ne pourrons pas nous assurer d’une distribution normale (n < 30. Nombre total d’animaux 424). Chaque groupe sera constitué de 5 souris .

Raffinement

Lors des manipulations pouvant générer une douleur, les animaux bénéficieront en amont d’une analgésie. Les souris seront hébergées sur des portoirs ventilés avec un accès libre à la nourriture et à l’eau de boisson, un cycle jour/nuit au niveau de la lumière et un enrichissement adapté. Les animaux seront suivis quotidiennement lorsque les cellules humaines seront injectées et les signes cliniques notables et sévères décrits dans le tableau en annexe de cette saisine seront notés. Lorsque 3 signes cliniques notables ou un seul signe clinique sévère seront notés alors les animaux seront sortis du protocole et euthanasiés. Tous les animaux seront analysés post-mortem avec des prélèvements d'organes en vue d'études immunohistochimiques ou histologiques permettant de caractériser au mieux l’effet des molécules testées.

Choix des espèces

Les souris immunodéficiences NSG sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre. Il est possible de reconstituer un système immunitaire humain dans ces souris par injection de PBMC humains. Ces souris ainsi humanisées offrent une alternative à l'utilisation de primates en recherche clinique. Cependant, si nous constatons que la fenêtre de lecture expérimentale n’est pas suffisamment longue avant la survenue de la GvHD nous changerons de souche de souris et prendrons des NSG déficientes pour les molécules de CMH de classe I et II. En effet, ces souris montrent une GvHD nettement retardée voire inexistante. Les cellules immunitaires humaines injectées dans ces souris survivent et prolifèrent. Ce modèle pourra donc servir d’alternative. Lors des greffes de peau les souris NSG seront adultes (âgées de 6 à 8 semaines). Au moment de l’humanisation avec des hPBMC elles seront agées de 11 à 13 semaines pour permettre à ces cellules humaines de se développer .

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie provoquant un traumatisme crânien, puis sont tuées pour que leurs cerveaux servent à préparer des débris de myéline destinés à des cultures cellulaires. Le porteur indique que le traumatisme peut réduire la prise de nourriture et d'eau, et prévoit une analgésie et des points limites. Il affirme que ce projet, visant à produire ces débris à partir de cerveaux de souris, ne peut être remplacé par des modèles in vitro.

Objectifs

Le traumatisme crânien est un problème majeur de santé publique lourd de conséquences neurologiques et lésionnelles à court comme à long terme pour lequel il n’existe aujourd’hui aucun traitement. Ces conséquences tardives sont en grande partie reliées à des lésions jusqu’ici largement sous-estimées et méconnues : les lésions de la substance blanche. Cette dernière contient essentiellement des cellules nerveuses entourées d'une gaine particulière, la myéline, permettant la transmission des informations dans le cerveau. L'espoir d'améliorer le pronostic du traumatisme crânien repose sur la découverte des mécanismes impliqués dans les lésions de la substance blanche et les désordres neurocomportementaux conséquents. Parmi ces mécanismes, des études suggèrent le rôle de la neuro-inflammation dans les lésions de la substance blanche après un traumatisme crânien. La microglie est une cellule immunitaire du cerveau qui joue un rôle majeur dans la neuro-inflammation. Des études suggèrent que les débris de myéline induits par le traumatisme crânien pourraient activer à leur tour la microglie. Une fois activée, la microglie peut adopter 2 phénotypes distincts, c'est-à-dire qu'elle peut exercer des effets délétères, mais elle peut aussi exercer des effets bénéfiques, et ceci, selon son environnement. Ainsi, des études ont rapporté aussi bien des effets pro- ou anti-inflammatoires des débris de myéline, mais à ce jour, aucun lien entre débris de myéline et activation microgliale n’a pu être mis en évidence dans le traumatisme crânien. L'objectif de ce projet est donc de préparer des débris de myéline à partir de cerveaux de souris mâles Swiss ayant subi un traumatisme crânien, afin (1) d'étudier leurs effets (bénéfiques ou délétères) sur le phénotype microglial, et (2) d'identifier les mécanismes mis en jeu, et ceci sur des cultures de microglies de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra d'identifier des cibles moléculaires permettant de moduler la neuro-inflammation d'origine microgliale induite par les débris de myéline suite à un traumatisme crânien.

Procédures

Une procédure chirurgicale permettant d'induire un traumatisme crânien sera réalisé chez les souris. L’ensemble de cette procédure dure 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'induction du traumatisme crânien peut entraîner une diminution de la prise alimentaire et d'eau.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour préparer les débris de myéline.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant de préparer des débris de myéline à partir de cerveaux de souris mâles Swiss ayant subi un traumatisme crânien pour en étudier les effets sur des cultures de microglies, il ne peut donc être remplacé par des modèles in vitro ou autres.

Réduction

Le faible taux d'échec (10%) des gestes pour réaliser le traumatisme crânien, ainsi que la bonne connaissance de la temporalité des mécanismes induits par le traumatisme crânien (activation microgliale, démyélinisation, détection des débris de myéline, déficits comportementaux, lésions de la substance blanche) permettront de réduire le nombre d'animaux au minimum

Raffinement

L'eau et la nourriture seront fournies à volonté et le milieu sera enrichi par des cotons compactés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Afin de s'assurer du bien-être animal, l'intervention chirurgicale permettant de réaliser le traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera donné en pré- et post-opératoire, afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de points limites et l'observation du comportement des animaux permettront d'identifier toute souffrance et douleur, et d'entraîner une mise à mort anticipée, si nécessaire.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de traumatisme crânien. Le traumatisme crânien sera réalisé chez des souris jeunes adultes (6-8 semaines), puisque c'est un évènement fréquent dans cette tranche d'âge chez l'Homme.