Recherche fondamentale
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- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
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- Organes sensoriels
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Développement et caractérisation de modèles de poisson zèbre pour étudier les processus pathologiques impliqués dans des syndromes malformatifs chez l’homme
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- Système musculosquelettique
3 880 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés pour porter des mutations liées à des malformations humaines du visage et du cœur, ils subissent un prélèvement d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et le porteur indique que les lignées peuvent présenter des malformations du squelette et de la tête. Des tests comportementaux de nage en réponse à des stimuli sonores et lumineux sont réalisés sur les larves. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" car les études in vitro ne rendent pas compte du développement en trois dimensions du cœur ou des mâchoires.
Objectifs
Les malformations congénitales, diagnostiquées dans 2-3% des naissances sont un enjeu majeur de Santé Publique. Les malformations du visage et du cœur sont une composante fréquente des syndromes de malformations congénitales humaines et sont donc d'une importance clinique majeure. Les deux impliquent généralement une lourde charge médicale et chirurgicale. De plus, parmi les malformations congénitales humaines, les malformations affectant la forme du visage sont peut-être les plus frappantes en raison des attentes culturelles et des conséquences psychologiques. La majorité des alterations du visage et du coeur sont la conséquence d’un défaut de développement de l’embryon qui est provoqué par la mutation d’un gène. L’objectif de ce projet est d'élucider les mécanismes moléculaires et développementaux qui causent des malformations grâce à l’analyse de poissons zèbres qui portent des mutations dans certains gènes.
Bénéfices attendus
L'étude des poissons zèbres qui portent des mutations dans des gènes récemment identifiés dans des pathologies humaines devrait fournir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires responsables de ces maladies rares et sur le développement normal du visage, du cœur et du cerveau.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour l’analyse de l’ADN. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte jusqu’à absence de réflexe au toucher (environ 3 minutes) puis un segment de 3mm de la nageoire caudale est coupé. Le poisson est ensuite placé à nouveau dans l’eau et il se réveille au bout de 1-2 minutes. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Cette procédure sera nécessaire pour chaque animal génétiquement modifié et sera effectuée une seule fois au cours de la vie de l'animal.
Impact sur les animaux
Les lignées génétiquement modifiées pourront présenter des malformations du squelette, de la tête (diminution de la taille de la mâchoire, aplatissement de la face) ou des altérations des paramètres de la nage témoignant de problèmes moteurs ou de nutrition (amaigrissement).
Devenir
Procédure 1 : Tous les poissons génétiquement modifiés et âgés entre 20-24 mois (âge à partir duquel ils n’arrivent plus à se reproduire) ou toujours en vie à la fin du projet, seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 2 : À la fin de la procédure qui a pour but l'étude post-mortem de l’ensemble des caractères visibles de poissons mutants, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 3 : À la fin de la procédure, qui a pour but l'observation, sur une brève période, du comportement de nage des larves en réponse à des stimuli sonores et lumineux, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique.
Remplacement
Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires et développementaux qui sous-tendent certaines malformations du visage et du cœur et la déficience intellectuel. Le recours à des modèles animaux est indispensable pour réaliser ces études car les études in vitro ne peuvent pas complètement rendre compte de la complexité des processus mis en jeu, par exemple, le développement complexe en 3 dimensions du coeur ou les interactions entre des populations de cellules qui donneront lieu aux mâchoires.
Réduction
Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Nous générerons uniquement le nombre d’animaux nécessaires à nos projets. La fécondité élevée chez cette espèce est un avantage, car elle permet d’obtenir beaucoup d’embryons, à partir d’une population restreinte de reproducteurs adultes.
Raffinement
Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance journalière, avec un dénombrement des poissons affectés par symptôme. Compte-tenu des gènes impliqués, des malformations du squelette de la tête ou de la capacité de nager sont attendues parmi les phénotypes spécifiques. De ce fait, ces altérations ne seront pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion) ou comportementaux (fort amaigrissement, immobilité) seront suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis seront euthanasiés. La procédure de prélèvement d’un fragment de la nageoire caudale (pour l’analyse de l’ADN) sera réalisée sous anesthésie générale. De plus, un enrichissement du milieu sera effectué par la constitution de groupes sociaux, la mise en reproduction régulière et l’ajout de nourriture vivante.
Choix des espèces
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette de la tête et de la mise en place de l’orientation du cœur car ces processus chez le poisson zèbre sont similaires à ceux des mammifères. Le poisson permet du fait de la transparence des embryons et des larves, une observation non invasive des organes et cellules in vivo. Il permet d’établir des lignées génétiquement modifiées. -Pour la sélection des nouvelles lignées, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale pour l’analyse d’ADN sera réalisé sur poisson adulte, car prélever ce tissu aux stades plus jeunes serait trop endommageant. -L'analyse d'orientation du cœur sera réalisée sur des embryons âgés de moins de 5 jours post fertilisation, car l'orientation du cœur est déjà établie avant ce stade. -Les analyses du développement du squelette seront réalisées à trois stades clefs du développement : formation du squelette de la mâchoire à 5-7 jours post fertilisation ; début de la formation du crâne à 4 semaines post fertilisation ; squelette entièrement formé à 3 mois de vie. -L’observation de la taille sera réalisée sur des poissons à trois stades clefs de la croissance du poisson : à 18 jours post fertilisation, un stade larvaire ; à 28 jours post fertilisation, un stade juvénile, lorsque la plupart des caractéristiques adultes ont été acquises, sans maturité sexuelle ; à 11 semaines post fertilisation, un stade adulte. -Les tests comportementaux seront réalisés sur des poissons âgés de 10 jours post fertilisation, une étape à laquelle le développement neurologique est suffisamment mature pour pouvoir tester le comportement en réponse à des stimuli.
Etudes par électrophysiologie, imagerie ultrasonore fonctionnelle et reflexes oculomoteurs chez le macaque éveillé ou anesthésié pour la compréhension du traitement de l’information visuelle et le développement d’implants rétiniens
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Macaques rhésus : 7
14 macaques, à longue queue et rhésus, vont être utilisés dans des procédures allant jusqu'à un niveau de souffrance sévère, quatre d'entre eux étant réutilisés dans d'autres projets et les autres tués. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'un plot de fixation et d'une chambre d'enregistrement de quatre à six heures, puis des séances tête fixe devant un écran, jusqu'à cinq par semaine, pour obtenir une récompense. Le porteur décrit une phase terminale sous anesthésie de huit heures pour recueillir un maximum de données et indique reconduire l'animal en cage s'il refuse de travailler. Il affirme que l'étude d'un système visuel intégré rend impossible tout remplacement par des explants ou des modèles, et relie le projet au développement d'un implant rétinien.
Objectifs
L’étude du comportement anatomo-fonctionnelle de la chaîne visuelle a principalement été étudiée en IRM, modalité d’imagerie qui reste limitée en résolution spatiale et temporelle lorsqu’il s’agit de faire de l’imagerie fonctionnelle.
Bénéfices attendus
L’objectif général du projet est d’apporter une meilleure compréhension anatomo-fonctionnelle du traitement neuronal de l’information visuelle de l’oeil jusqu’au cerveau. Grâce à des techniques d’imageries ultrasonores innovantes, il sera possible d’imager l’activité de la rétine, du cortex visuel ainsi que du thalamus et du LGN suite à une stimulation visuelle donnée. Décrire avec précision le fonctionnement de la chaîne visuelle chez le primate non humain permettra d’obtenir des informations cruciales pour un meilleur diagnostic des pathologies visuelles chez l’Homme. Ces connaissances du traitement neuronal pourront être extrapolées à de nombreux processus cognitifs. Ce projet a également pour but de prouver l’efficacité d’une méthode de restauration visuelle développée au sein de notre institut : l’implant rétinien. Comparer les réponses cognitives obtenues pourra également permettre la compréhension et l’amélioration de cette approche innovante.
Procédures
Pour la globalité du projet 18 primates non humains seront nécessaires (4 primates supplémentaires en remplacement peuvent être ajoutés si les premiers ne permettent pas d’obtenir des résultats exploitables) et ce, tout en optimisant les méthodologies utilisées afin d’assurer le bien-être des animaux ainsi que la pérennité du projet (réduire, raffiner et remplacer). De plus, les développements et améliorations des outils d’imagerie et de restauration visuelle utilisés au cours de cette étude, permettront d’effectuer des tests cliniques chez l’Homme et pourront à terme bénéficier à de nombreux patients. Parmi les 18 primates utilisés, 10 proviennent de la fin de divers projets et sont destinés à être euthanasiés. Sur les lots 1 et 2, nous ferons les procedures chirurgicales: l'implantation du poste de fixation et de la chambre d'enregistrement. Chaque chirurgie dure en moyenne 4-6 heures. Si jamais l'animal perd son implant de fixation, une seconde chrirugie de reimplantation sera programmée apres que l'animal soit totalement rétabli en accord avec le veterianire. Une seul chambre d'enregistrement sera implantée par animal. Les seances de comportement se feront au minimum 8 semaines apres l'implantation de la casquette de fixation pour permettre une bonne consolidation a raison de 5 seances par semaine. Les seances de coomportement ou d'acquisition de données physiologiques durent en moyenne 1-2 h. Une limite d’entrainement de 12 semaines sera appliquée à chaque étape (transport, d’acclimatation, et d’entrainement à la tâche visuelle), au-delà de laquelle l’animal sera sorti des procédures. Une séance d’acquisition de données neurophysiologiques chez l’animal anesthésié lors de la phase terminale dure en moyenne 8h afin de recueillir le maximum de données (n=18 animaux).
Impact sur les animaux
Pour toute intervention chirurgicale, le singe est tranquillisé dans sa cage. L’animal est ensuite profondément anesthésié (respiration assistée). Un analgésique est systématiquement administré si la procédure peut induire une douleur transitoire chez l'animal. Les techniques permettant de déterminer une activité cérébrale (IRMf, ultrasons fonctionnels ultrarapides et les mesures d’électrophysiologie) ont été développées afin de pouvoir être utilisées chez chacun des primates (avec un minimum de chirurgies requises), et ainsi réduire le nombre nécessaire d’animaux, tout en limitant le nombre de phases critiques.Les seances d'entrainements et d'acquisitions de données physiologiques sur animal éveillé peuvent durer plusieurs heures (en moyenne 1-2h, 4-5h max) durant lesquelles l'animal est maintenu tête fixe devant un écran pour effectuer un tache visuelle pour etre récompensé. Une attention particuliere sera portée sur la position de l'animal dans la chaise afin qu'elle soit la plus confortable possible. Des pauses régulières pendant la séance seront effectuées au cours desquelles l'animal sera recompensé de fruits secs ou autres. Enfin, si l'animal ne coopère pas (refus de travailler, longues pauses ou agitation), il sera reconduit dans sa cage et la séance d'entrainement ou d'acquistions de données physiologiques sera stoppée.
Devenir
Les animaux du lot 2 qui ont implantés avec un implant rétinien pourront être réutilisés dans des projets sur l'étude du cortex visuel et du comportement des primates non-humains
Remplacement
L’étude portant sur un système intégré dans sa globalité (de l’œil jusqu’au cortex), il est impossible de remplacer les animaux par tout type d’explants, de modèles ou stimulations. Des tests concluants de transfections ont cependant déjà été réalisés sur des explants.
Réduction
L'expérience dans ce domaine de notre laboratoire mais également d'autres laboratoires dans des tâches comportementales similaires ainsi que les normes de publication indiquent que les données doivent être reproduites pour au minimum 2 animaux (souvent 3, parfois 4) afin d'obtenir des données fiables et interprétables. Les animaux participeront à plusieurs tâches comportementales et/ou de perturbations d'activité cérébrale cela afin de limiter le nombre d'animaux dans chacun des groupes.
Raffinement
Tout acte chrirugical se fera sous anesthesie générale soit gazeuse ou en IV. La douleur post-opératoire est gérée par l'administration d'analgésiques opioïdes et une observation régulière des animaux par différents acteurs. Nous utiliserons aussi des images d’IRM anatomiques pour positionner correctement les chambres d’enregistrements pour les primates. Les primates sont hébergés dans des cages individuelles connectées. L’appariement entre individus est privilégié. Les primates reçoivent un programme d'enrichissement varié : les jouets à manipuler sont changés par semaine, des éléments structurels (de type échelle, pneus ...) sont installés en permanence dans leurs cages, les primates participent aux protocoles de recherche avec des sorties en chaise de transport, de l'entrainement cognitif.
Choix des espèces
Les fonctions cérébrales et l’anatomie de l’oeil chez le Macaca fascicularis et le Macaca mulatta (primate non humain) se rapprochent fortement de celles de l’Homme, en plus des similitudes cognitives. Ce modèle animal est le plus pertinent pour notre étude car : - notre objectif est d’imager l’activité de la rétine et du cortex visuel en vue d’un transfert clinique des améliorations des outils d’imagerie - nous acquierons les connaissances biologiques pour améliorer le diagnostic des pathologies de l’oeil chez l’Homme, - nous testerons des thérapies envisagées (implant rétinien), Nous n'utiliserons que des animaux adultes ou jeunes adultes (>3ans) car leur système nerveux central est mature
Exploration par échographie de contraste de la vascularisation cérébrale dans un modèle rongeur de Trouble de Déficit d’Attention avec ou sans hyperactivité.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures classées sans réveil. Issus d'un modèle de trouble du déficit de l'attention, ils subissent une échographie cérébrale avec injection d'un agent de contraste, avec une craniotomie partielle si l'os atténue trop les ultrasons. Le porteur consacre très peu de lignes aux impacts, se bornant à indiquer que la procédure est sans réveil et que tous les animaux seront tués. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative permettant de modéliser ce trouble, sans autre justification.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la vascularisation cérébrale par échographie de contraste dans un modèle animal de Trouble de Déficit d’Attention avec ou sans Hyperactivité (TDAH). Le TDAH est une maladie caractérisée par des problèmes d’attention, d’impulsitivité et d’hyperactivité chez l’enfant qui persistent dans 2/3 des cas chez l’adulte. De nombreuses études montrent que les patients TDAH adultes ont un risque accru de développer une addiction, notamment à la nourriture. L’objectif de ce projet est de comprendre à l’aide d’un modèle animal de TDAH les modifications cérébrales qui pourraient être à l’origine de cette association. Les modifications d’activité métabolique étant couplées avec des modifications de flux sanguin cérébral, l’objectif de cette partie du projet est d’étudier les modifications de flux sanguin cérébral à l’origine de l’association entre TDAH et addiction à la nourriture.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons ainsi améliorer la compréhension des mécanismes neurobiologiques associés aux modifications de vascularisation cérébrale qui sous tendent les addicitons chez les patients TDAH.
Procédures
Cette procédure durera environ 30 min, elle sera réalisée une seule fois sur des animaux sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à une échographie cérébrale avec injection d’un agent de contraste par voie intraveineuse. Si l’os cranien atténue de façon excessive les ultrasons il sera nécessaire de réaliser une craniotomie partielle circulaire puis les animaux seront sacrifiés.
Impact sur les animaux
C'est une procédure sans réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives permettant de modeliser le TDAH.
Réduction
Les animaux sont issus d'un projet antérieur de l'unité validé. Un nombre de 20 animaux par groupe est nécessaire avec dans les 2 groupes 10 animaux soumis au protocole d'addiction au sucre et 10 sans addiction.
Raffinement
Les rats seront hébergés par groupe social, 2 par cage, en présence d'enrichissement comprenant un tunnel et/ou une cabane en carton ainsi qu'un bâton à ronger, ainsi que du Sizzle Nest et/ou papier absorbant. Toutes les stratégies d'analgésie et d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle. Les animaux seront observés deux fois par jour afin d’évaluer leur stress/leur douleur après les différentes procédures réalisées sous anesthésie.
Choix des espèces
Le rat est l'espèce la plus adapté pour cette étude, notamment pour l'imagerie échographique. Adultes, afin que le modèle de prise alimentaire en escalade ait eu le temps d’avoir été mis en place.
Klebsiella et translocation intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des gavages et des prélèvements de selles quotidiens pour étudier la translocation intestinale de la bactérie Klebsiella, un mélange d'antibiotiques leur étant administré. Le porteur indique un point limite fixé à 20 % de perte de poids, au-delà duquel les animaux sont tués, et décrit un suivi des signes de douleur avec administration de paracétamol si besoin. Il affirme que l'analyse in vitro reste insuffisante et qu'il est impossible de reproduire in vitro le microbiote complexe et l'inflammation de l'hôte.
Objectifs
L’objectif principal est de caractériser le processus physiopathologique des infections à Klebsiella chez des patients de réanimation impliquant potentiellement leur translocation de l’intestin vers la circulation sanguine et les poumons. Ces mécanismes peuvent être multifactoriels et peuvent impliquer des facteurs de risques des patients (notamment une inflammation intestinale bas bruit et la prise d’antibiotiques). L’utilisation de modèles murins et la seule approche permettant de comprendre au mieux cette physiopathologie afin de penser de futures stratégies prophylactiques des infections.
Bénéfices attendus
L’analyse comparative des souches isolées dans les différents sites cliniques d’un même patient à partir d’hémocultures et la détermination de leurs capacités à moduler les jonctions serrées in vitro, permettront de mieux comprendre le processus physiopathologique des infections à Klebsiella spp. en lien avec le réservoir intestinal de ce genre bactérien. Les modèles in vitro puis in vivo* proposés apporteront des réponses sur le comportement de cette bactérie au contact de cellules eucaryotes et permettront de répondre clairement à des questions souvent évoquées dans la littérature : Des souches de Klebsiella spp. sont-elles capables d’emprunter une voie endogène pour générer une infection et quels sont les mécanismes mis en jeu au niveau de l’épithélium intestinal ou respiratoire ? Ce projet transversal vise à fournir des réponses fondamentales et des pistes de réflexion face au problème des infections liées à Klebsiella spp. Les résultats obtenus permettront d’orienter des mesures pour prévenir ces infections. Ce travail servira de preuve de concept afin d’initier un projet sur un modèle animal pour confirmer ces résultats. Cette étape est nécessaire avant d’envisager une modulation du microbiote intestinale pour prévenir la translocation intestinale à Klebsiella spp.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à des prélèvements de selles quotidiens et des gavages (2 par animal).
Impact sur les animaux
Quotidiennement, les animaux seront pesés pour détecter une possible perte de poids, et observés (comportement général de l’animal, apparence) pour repérer les signes de stress et de douleur (activité, locomotion, prise d’eau et de nourriture, état du poil, prostration, vocalise,…). L’animalier ou l’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau et de nourriture pour chaque cage. Toute observation anormale sera transmise à l’expérimentateur. Si des signes de douleur sont observés, du paracétamol sera administré par voie orale à l’animal concerné (2 gavages quotidiens, 200mg/kg). Les animaux présentant des signes de déshydratation seront réhydratés par injection sous-cutanée de sérum physiologique. Ces animaux seront surveillés 3 fois par jour mais resteront cependant avec leurs congénères car un l’isolement serait un facteur de stress pouvant impacter fortement les résultats. Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% seront euthanasiés immédiatement. Pour ce projet, plusieurs critères ont été définis sur la base de l’évaluation des points limites proposés par Morton et Griffiths (1985). Ces critères sont les suivants : -Poids : perte de poids supérieure à 20%, depuis le début de l’expérience (J0). -Activité : diminution marquée de la motricité spontanée, diminution des activités de toilettage ou motrice après stimulation. -Apparence physique externe : poils hérissés, couleurs du pelage terne, posture voutée, vocalisation -Fèces : Présence de sang dans les fèces pendant plus d’une semaine.
Devenir
Les animaux de la procèdure 1 seront inclus dans la 2 puis dans la 3. En fin d'expérimentation, tous les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Notre approche expérimentale inclut une analyse in vitro mimant les épithélia, mais elle reste insuffisante pour analyser le pouvoir pathogène de Klebsiella lors des étapes initiales de colonisation de niches écologiques et de translocation intestinale. Il est impossible de reproduire in vitro les paramètres inflammatoires de l’hôte ainsi que la présence d’un microbiote complexe.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Les animaux seront exploités au maximum : prélèvement d’un maximum d’organes, réalisation de lavages broncho-alvéolaires,… Le nombre d’animaux utilisés est défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. L’analyse statistique se fera par les tests habituels de comparaison de médianes (Mann-Whitney, Wilcoxon, Kruskall-Wallis, Friedmann suivant le nombre de groupe à comparer et l’appariement ou non des données).
Raffinement
Quotidiennement, les animaux seront pesés et observés pour repérer les signes de stress et de douleur (perte de poids, activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise,…). La présence d’eau et de nourriture pour chaque cage seront contrôlées quotidiennement. Toute observation anormale sera notée et transmise à l’expérimentateur. Un enrichissement est apporté à tous les animaux dans les cages (refuges rouges pour souris).
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris C57BL/6. Le choix de cette lignée est lié à plusieurs paramètres essentiels : - des publications internationales montrent que cette lignée est parfaitement adaptée pour étudier la virulence de Klebsiella. - le fond génétique C57BL/6 est préférable pour l’étude de l’immunité régulant l’infection. - des outils moléculaires sont disponibles pour cette espèce. Les expériences seront débutées sur des souris âgées de 6 semaines et qui pèseront environ 20g. Les expériences prendront 14 jours maximum après le début de l’expérience, avant euthanasie des animaux. L’utilisation de jeunes adultes permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Mécanismes de l’effet anti-allodynique d’un nouvel inhibiteur de la p38 mitogen-activating kinase
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
242 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et, pour une partie, menées sous anesthésie sans réveil. Une inflammation ou une lésion douloureuse leur est provoquée par injections de CFA ou de capsaïcine et par chirurgie, afin de tester un inhibiteur de la kinase p38 sur l'allodynie mécanique. Le porteur décrit une gêne due à l'irritation et indique que les tissus nerveux sont prélevés après mise à mort, les enregistrements électrophysiologiques terminaux étant réalisés sans réveil. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole car l'intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux.
Objectifs
Aigue, la douleur est physiologique, nécessaire à notre survie. Chronique ou persistante, par suite d’une inflammation (douleur inflammatoire) ou d’une lésion nerveuse (douleur neuropathique), la douleur n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire détresse et souffrance. Les traitements ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s’accompagner d’effets secondaires importants. Il faut donc découvrir de nouveaux antalgiques. Etonnamment, si notre connaissance des mécanismes de la douleur s’est considérablement accrue, cette avancée ne s’est accompagnée d’aucun progrès thérapeutique majeur. Une des raisons à cet échec est qu’il n’existe pas un mais des symptômes douloureux. En effet, inflammatoire ou neuropathique, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes douloureux : douleurs spontanées et/ou provoquées, par une stimulation normalement douloureuse (exacerbation de la douleur ou hyperalgésie) ou non (allodynie).Parmi une série de composés chimiques synthétisés par un institut de Chimie, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Ce composé se révèle être un inhibiteur sélectif de la kinase p38alpha. Ces résultats prometteurs nous amènent à poursuivre l’étude de l’effet anti-allodynique de ce composé pour en faire un candidat médicament anti-allodynique. Ce projet vise à répondre à plusieurs questions. Ce composé a-t-il un effet : -sur les douleurs spontanées comme sur l’hypersensibilité mécanique ? -sur toutes formes d’allodynies mécaniques inflammatoires ? -suite à une administration chez des animaux naïfs : afin d’investiguer de potentiels effets secondaires-par voie systémique comme par voie locale utilisée lors du ‘screening’?.Ces tests seront suivis d’analyses par quantification protéique et analyse immunohistochimique des tissus prélevés sur les animaux mise à mort à l’issue des tests comportementaux. Ces tests comportementaux seront complétés d’analyses électrophysiologie in vivo.
Bénéfices attendus
Nosu aimerions prouver l’effet anti-allodynique de ce composé pour en faire un candidat médicament anti-allodynique. L’allodynie mécanique est un symptôme très fréquent, observé chez 20-50% des patients neuropathiques et 60-80% des migraineux chroniques. On sait maintenant que son apparition est liée à l’activation d’un circuit neuronal local–dans la corne dorsale (CD) de la moelle épinière ou le sous-noyau caudal du Trijumeau (Sp5C)– transmettant l’information tactile aux voies de la douleur. Or, bien qu’anatomiquement toujours présent, ce circuit ne devient fonctionnel qu’en conditions pathologiques. Ce processus nécessite l’activation d’enzymes dans la CD/Sp5C dont la p38 mitogen-activating kinase (p38). La p38 semble donc une cible pertinente pour le développement de nouveaux médicaments anti-allodyniques. L’inhibition de cette kinase diminue bien le comportement douloureux spontané et l’allodynie mécanique chez l’animal en conditions inflammatoires et neuropathiques.
Procédures
Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie générale: - injection locale 1*4min puis injection sous cutanée de CFA 1*1min ou injection systémique 1*3min puis injection de CFA1*1min - injection locale 1*4min puis injection sous cutanée de capsaicine 1*1min ou injection systémique 1*3min puis injection de CFA1*1min - chirurgie 1*1h puis injection sous cutanée de CFA 1*1min puis contrôles 3*5min puis tests 12*5min (procédure sans réveil)
Impact sur les animaux
Dans le cas des expérimentations comportementales, la douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » et les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer ses gestes habituels. Les effects indésirables prévus seraient une gêne dûe à l'irritation.
Devenir
A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique. A l 'issue des enregistrements électrophysiologiques (procédure sans réveil), les tissus ne peuvent pas être prélevés et les animaux seront euthanasiés par injection systémique d’une dose létale d'anesthésique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.
Réduction
Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Pour les enregistrements électrophysiologiques un nombre de 10 à 15 animaux par groupe est nécessaire. Les données sont traitées selon les données de la littérature et sont analysées à l’aide d’une ANOVA à une voie suivie d’un test post-hoc de Newman-Keuls.
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, systémiques, locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.
Elongation des acides gras et cancer colique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
98 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses coliques leur sont transplantées, les animaux sont maintenus vingt-cinq jours puis tués pour prélever la tumeur, un régime riche en lipides étant testé pour son effet sur la tumorigenèse. Le porteur indique que du sang dans les fèces ou tout autre effet indésirable entraînera la mise à mort de l'animal, et précise que les souris sont maintenues sans traitement antalgique pour ne pas modifier la réponse inflammatoire. Il affirme que l'effet d'un régime alimentaire ne peut être caractérisé in vitro et que la proximité physiologique avec l'humain justifie le recours à la souris.
Objectifs
L’enzyme Elovl5 catalyse l’élongation des acides gras et son expression est augmentée dans les tissus coliques tumoraux comparés aux tissus sains chez l’Homme. De plus, nos résultats in vitro montrent que l’inhibition de cette voie métabolique réduit la prolifération des cellules cancéreuses du côlon. Notre projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme elovl5 dans le développement du cancer du côlon et à évaluer l’importance d’un régime riche en lipides dans ce contexte. En effet, un régime riche en lipides augmenterait la tumorigenèse colique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à démontrer l’importance de Elovl5 dans le développement de cancer colique dans un contexte nutritionnel riche en lipides. Nous attendons une effet protecteur de l’absence d’expression Elovl5 validant cette enzyme comme cible thérapeutique. L’utilisation des modèles CT-26 et MC-38 permet de comparer le comportement de deux lignées cancéreuses coliques murines avec des profils mutationnels différents.
Procédures
Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée pour transplantation des cellules cancéreuses.
Impact sur les animaux
Les modèles utilisés de transplantation de cellules cancéreuses en sous-cutanée et de cancer colique induit par AOM et HFD peuvent induire des nuisances concernant le stress lié à la contention de l’animal au moment des différentes injections. Dans le modèle de cancer colique, du sang dans les fèces pourrait apparaître et occasionnerait la mise à mort de l’animal. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.
Devenir
Après transfert des cellules cancéreuses, les souris seront maintenues 25 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elle seront ensuite mises à mort pour le prélèvement de la tumeur.
Remplacement
L'utilisation de ces modèles murins de cancer sont nécessaires pour évaluer la progression tumorale et métastatique dépendante d’acteurs cellulaires différents (système immunitaire notamment). L’effet d’un régime alimentaire ne peut être caractérisé dans un modèle in vitro. Par ailleurs, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.
Raffinement
Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 178 souris mâles sur un fonds génétique C57Bl6 seront utilisées.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée.Des souris mâles âgées d’au moins 6 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses. Les souris wt et Elovl5 ko seront mises sous régime spécifique également dès 6 semaines pour prise de poids rapide.
Évaluation d’un nouveau modèle animal, le rat Zucker Obèse, pour l’étude de la dysfonction coronarienne microvasculaire
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
12 rats Zucker obèses vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont suivis jusqu'à vingt semaines par échocardiographie hebdomadaire sous anesthésie et par imagerie nucléaire, avec des prélèvements sanguins, avant une ponction cardiaque terminale et la mise à mort. Le porteur affirme que ces procédures d'imagerie n'entraînent ni douleur ni angoisse et présente cette étude pilote comme visant à valider le modèle du rat obèse pour de futurs travaux. Il indique qu'aucune méthode alternative n'est disponible et qualifie les expériences d'"absolument indispensables".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont responsables d’un tiers des décès dans le monde. La maladie ischémique, définie par un apport sanguin insuffisant au muscle cardiaque, représente la moitié des décès d’origine cardiovasculaire. Elle peut être d’origine macrovasculaire et impacter les gros vaisseaux via le développement de plaques d’athérome. De récentes avancées ont mis en évidence qu’une dysfonction coronarienne microvasculaire (DCM), à savoir une dysfonction des petits vaisseaux composant le système vasculaire cardiaque [pré-artérioles (500-100 μm), artérioles (
Bénéfices attendus
Cette étude pilote permettra de valider le modèle de rat Zucker obèse pour l’étude de la dysfonction coronarienne microvasculaire dans le contexte du laboratoire.
Procédures
Les animaux seront tous soumis à la procédure 1 (Imagerie échographique cardiaque chez le petit animal) une fois par semaine jusqu'à 20 semaines maximum, afin d’évaluer les changements morphologiques et fonctionnels cardiovasculaires liés au développement de la maladie métabolique. Cette procédure dure moins de 45 min. Une fois toutes les deux semaines jusqu' à 20 semaines maximum, leur glycémie sera mesurée à jeun. Une fois après la période de stabulation et une fois avant euthanasie, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin pour mesure de l’insulinémie. Dès qu’une différence significative sera observée entre les groupes en termes de changement morphologique et/ou fonctionnel lors de la procédure 1 d’échocardiographie, les animaux seront soumis à la procédure 2 (imagerie TEMP pour la mesure de la réserve coronaire). Cette procédure sans réveil dure moins de 45 min. En ce qui concerne la mesure de la réserve coronaire lors des procédures 1 et 2, les animaux seront soumis à une injection d'agent pharmacologique permettant de mimer une situation d'effort. A l'issue de la session d'imagerie (procédure 2), les animaux seront profondément anesthésiés sous anesthésie volatile et subiront une ponction intracardiaque dans le but de mesurer leur insulinémie et seront ensuite euthanasiés par surdose létale d'un anesthésique liquide.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’imagerie qui seront mis en œuvre dans cette étude n’entraîneront pas de douleur, souffrance ou angoisse. Ils impliqueront une anesthésie générale et une injection intrapéritonéale (procédure expérimentale #1) avant réveil ou une anesthésie générale volatile rapidement réversible, une cathétérisation veineuse et une ponction cardiaque sous anesthésie profonde avant mise à mort (procédure expérimentale #2). Ils ne sont pas susceptibles de générer des effets indésirables. De plus, aucune drogue ou médicament ne sera utilisé dans cette étude, exception faite de l'agent pharmacologique permettant de mimer une situation d'effort pour la mesure de la réserve coronaire, qui a un effet transitoire. Enfin, une prise de poids est attendue chez les animaux Zucker, mais elle ne constitue pas non plus un effet indésirable.
Devenir
Les animaux (n=6 OZR et n=6 ZL) seront gardés vivants pour un suivi temporel de leurs fonctions et morphologies cardiovasculaire sur 20 semaines maximum. Suite à la procédure 1 et à la fin de la procédure 2 (imagerie TEMP) les animaux seront euthanasiés pour des analyses ex vivo (réactivité vasculaire et immunohistochimie) afin d’évaluer les différences de densité capillaire et de réactivité vasculaire entre les deux groupes.
Remplacement
Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 12 rats seront utilisés. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. Tout au long des études in vivo, nous respecterons la règle des 3R en tenant compte du fait qu’aucune méthode alternative n’est disponible pour le remplacement. Les animaux seront hébergés par groupe de deux ou trois selon leur poids, en cages avec enrichissement du milieu de vie. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être.
Réduction
Cette étude pilote permet dans un premier temps d'utiliser un nombre minimum d'animaux afin que ceux qui seront éventuellement commandés plus tard pour une étude complémentaire soient utilisés à bon escient. Au total 12 rats seront utilisés ici. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de deux ou trois selon leur poids et disposeront d’enrichissement de milieu de vie (bâton en bois, tunnels, etc…) Les expérimentations prévues lors de cette étude sont des procédures non invasives (imagerie échocardiographie et imagerie nucléaire TEMP). Lors de ces procédures, les animaux sont sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane. Aucun test douloureux causant une souffrance animale n’a été prévu. Il n’y a donc pas de nécessité de point limite spécifique. En revanche, des critères classiques d’observation (apparence physique et comportement) seront utilisés pendant le temps d’hébergement et entre deux procédures. Des scores seront calculés selon une grille d’évaluation (voir ci-dessous). Aucune anomalie cardiaque n’a été jusqu’ici observée et l’effet de la Dobutamine est transitoire, mais une grille de surveillance sera toutefois ajoutée pour la surveillance respiratoire des rats. Un score total supérieur ou égal à 3 sera considéré comme un point limite et l’animal sera euthanasié. I. Apparence physique Normale : 0 Manque de toilettage, poil ébouriffé : 1 Poil très ébouriffé, posture anormale : 2 II. Comportement Normal : 0 Changements mineurs : 1 Anormal, mobilité et activité réduites : 2 Animal très agité ou immobile, isolé, agressif : 3 III. Respiration Normal : 0 Essoufflement : 1 Hyperventilation : 2 Anormale, tremblement : 3 Les animaux seront euthanasiés selon une méthode appropriée, à savoir après injection intraveineuse d’exagon (60mg/kg) Les résultats expérimentaux seront analysés en utilisant des tests statistiques pour valeurs non appariés (tests Wilcoxon) pour comparer les valeurs obtenues entre les deux groupes.
Choix des espèces
L’évaluation expérimentale in vivo du développement d’une pathologie telle que l’atteinte microvasculaire coronarienne est indispensable à la compréhension de la pathologie clinique. Les atteintes microvasculaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent donc l’utilisation d’un modèle animal. Le rat Zucker imite le syndrome métabolique humain (insulinorésistant, hypertendu, hyperlipidémique, obésité) et représente un outil important pour la compréhension de la physiopathologie des complications cardiovasculaires. De plus, la caméra TEMP utilisée ainsi que les sondes d’échographie étant destinées au petit animal, le choix d’un modèle chez le rat est particulièrement adapté aux caractéristiques techniques du matériel. Les animaux seront accueillis à l’âge de 10 semaines et hébergés dans des conditions standards pendant deux semaines avant inclusion dans le protocole. Cet âge correspond, d’après la littérature, au stade initial du syndrome métabolique (obésité, insulinorésistance, hyperlipidémie) développé par ces animaux.
Evaluation d’une nouvelle stratégie anti-tumorale visant la synthèse des protéines chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer du sein triple négatif leur sont injectées sous la peau, la tumeur est suivie au pied à coulisse et des composés sont administrés par voie orale ou intrapéritonéale plusieurs fois par semaine. Le porteur indique que la littérature ne prévoit pas d'effet secondaire notable de ces composés et que les animaux ne développant pas de tumeur seront tués huit semaines après la greffe. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution du composé et l'organisation d'une tumeur, et conclut à la nécessité d'un recours aux animaux.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent en France et représente la première cause de décès par cancer chez la femme. (Source : Santé publique France). Il existe plusieurs types de cancer du sein dont un appelé triple négatif. Peu de solutions efficaces sont disponibles pour le traitement du cancer du sein triple négatif, aussi le but de ce projet est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour se développer les cellules cancéreuses ont besoin de ressources importantes et notamment de protéines. Récemment, plusieurs facteurs nécessaires à la synthèse des protéines ont été identifiés, et vis-à-vis desquels les cellules cancéreuses sont dépendantes. L'inactivation de ces facteurs bloque les propriétés tumorales des cellules cancéreuses et induit leur mort. Les cellules saines ne sont pas affectées par l'inhibition de ces facteurs. Ceci a été montré in vitro pour plusieurs cancers dont la prostate, le colon ou le mélanome. Un travail préliminaire a été mené qui étend cette approche au cancer du sein de type triple négatif en utilisant une dizaine de modèles cellulaires, par des approches in vitro de culture de cellules en 2 dimensions et en 3 dimensions. En particulier in vitro deux approches ont été validées, l'une par inhibition de l'expression de ces facteurs par des outils génétiques, l'autre par inactivation de ces facteurs à l'aide de composés chimiques, qui sont des candidat médicaments en cours d'évaluation clinique dans d'autres pathologies. Il est maintenant nécessaire de vérifier si un effet anti-tumoral est obtenu lorsque les cellules sont organisées en tumeur. Le modèle de choix utilisé est la greffe de tumeurs sous-cutanée de cellules tumorales humaines chez la souris immunodéprimée. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps, puis les tumeurs seront collectées et analysées par histologie afin de déterminer l'impact des composés sur la prolifération et la mort des cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anticancer en santé humaine. En effet, altérer la synthèse des protéines des cellules cancéreuses est une nouvelle approche thérapeutique anticancer qui semble très prometteuse selon les premiers essais cliniques. Afin d'évaluer le véritable potentiel thérapeutique de cette approche, la communauté scientifique fait face à deux enjeux : premièrement, déterminer les cancers qui bénéficieraient de cette nouvelle approche ; deuxièmement, identifier de nouveaux médicaments. Ainsi les bénéfices de ce projet seront précisément de : 1- Apporter des données in vivo pour finaliser une étude in vitro en cours sur le cancer du sein de sous-type triple négatif. 2- Démontrer que les composés utilisés n'ont pas d'effets secondaires notables chez la souris. 3- Disposer de résultats obtenus dans des modèles animaux qui seront nécessaires avant d'initier des études cliniques chez l'Homme.
Procédures
Des cellules humaines de cancer du sein seront injectées sous la peau des souris. Pour cela l’animal est maintenu environ 15 secondes sans stress. Une seule injection de 0,1 mL est réalisée par animal. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans les 2 à 3 semaines qui suivent. Le développement tumoral sera suivi par simples mesures au pied à coulisse (3x/semaines), sur animal vigile maintenu immobile environ 20 secondes. Les composés seront administrés soit par voie orale (2x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaines ; 10 secondes).
Impact sur les animaux
Implantation des tumeurs : Les cellules seront injectées sur animal vigile, pour cela l’animal est tenu en contention sans stress. Le volume d’injection est faible (0,1 mL). Une seule injection par animal, durée 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans un délai de 2 à 3 semaines, sans géner la mobilité des animaux. Suivi des greffes de tumeurs : Le développement tumoral sera suivi par mesures au pied à coulisse, sur animal vigile tenu en contention. Fréquence : 3x/semaine, 20 secondes. Traitements : Les souris seront traitées par voie orale (3x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaine ; 10 secondes). La littérature indique que ces composés n'induisent pas d'effet secondaire chez les souris. Un des objectifs du projet étant de confirmer ces données, les animaux bénéficieront d'une vigilance toute particulière dans la détection de signes de souffrance. Un des traitement sera administré dans l’eau de boisson. Celui-ci a un goût amer, donc pour que les souris s’hydratent correctement, 3% de sucre sont ajoutés dans l’eau de boisson.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux, ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. Les animaux ont subi une injection de cellules tumorales, ils ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
L'efficacité des composés a été validée in vitro, sur des cellules en culture, par plusieurs approches complémentaires. Néanmoins, l'efficacité d'un composé médicament dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de la tumeur et de son environnement. Aujourd'hui, il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution et l'élimination du composé dans un organisme, ni de reproduire à l'identique l'organisation d'une tumeur (par exemple la vascularisation ou la surveillance anti-tumorale). Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux pour valider l'efficacité in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour ces expériences. Une étude préliminaire de validation sera effectuée sur un petit nombre d'animaux (40 souris) avant d'engager l'étude principale. Les protocoles utilisés permettent d'effectuer l'ensemble des analyses sur une seule tumeur pour éviter de dupliquer les expériences et donc le nombre d'animaux. La procédure prévoit la collecte post-mortem de l'ensemble des tumeurs et des organes de plusieurs animaux afin qu'ils soient stockés et disponibles pour des analyses complémentaires qui pourraient être nécessaires (par exemple lors de l'expertise externe des résultats), et ce sans l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le nombre d'animaux a été fixé à 10 par groupe, en prenant en compte les éléments suivants : - Les contraintes statistiques. - Disposer d'un nombre minimum de 8 animaux par groupe, prenant en compte que la greffe ne prendra pas chez 10% des animaux et le risque qu'un animal meurt dans chaque groupe au cours de l'expérience. - La croissance de tumeur présente une variabilité de 30% - Observer un écart d'au moins 30% de baisse de croissance entre les moyennes des deux groupes
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 5 individus. Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. Sur la base de données disponibles, deux des trois composés seront administrés par voie orale. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris sera suivi par pesée des animaux et par une analyse histologique de plusieurs organes sur quelques animaux traités. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.
Choix des espèces
La souris immunodéprimée est le modèle de choix pour l'analyse de greffes de tumeurs humaines en oncologie. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles immunodéprimées de 6 à 8 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène. De plus, les femelles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de la constitution de groupes d'animaux.
Conséquences de micro-biopsies musculaires répétées sur la nage des poissons
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
60 poissons rouges vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Ils subissent deux micro-biopsies musculaires sous anesthésie à quinze jours d'intervalle, alors que le projet vise précisément à valider une méthode d'échantillonnage sans mise à mort. Le porteur décrit des risques d'infection des plaies et de stress, et indique que tous les poissons seront finalement tués pour caractériser les conséquences des biopsies et le fonctionnement mitochondrial. Il présente ce projet comme relevant des 3R et affirme que seule l'expérimentation sur animaux permet une étude intégrative de "l'ensemble de l'organisme".
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les conséquences de micro-biopsies musculaires répétées chez le poisson. Le développement de ces méthodes moins invasives pour obtenir des échantillons utilisables à des fins expérimentales apparait comme nécessaire et indispensable. En effet, une fois validées, ces méthodes s’avèreront précieuses dans un contexte éco-physiologique, car elles permettront à terme, de réaliser 1) des protocoles expérimentaux longitudinaux, c’est-à-dire utiliser le même individu pour étudier les conséquences physiologiques de stresseurs environnementaux (par exemple), ayant pour finalité une réduction drastique du nombre d’individus expérimentés et 2)
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but principal de valider la méthode de punch biopsie chez les poissons pour réaliser des protocoles de bioénergétique musculaire, sans mise à mort des individus, ce qui permet de réfléchir à de nouveaux protocoles avec suivis longitudinaux sur les mêmes individus, ou sur de nouveaux modèles moins classiques (espèces sauvages). Les bénéfices attendus à court terme seront donc la validation cette méthode, tant au niveau de la fonctionnalité des échantillons biopsiés, qu’au niveau de la récupération des poissons ayant subi les biopsies. De plus, comme ce projet s’inscrit directement dans le contexte de la règle des 3 R, les bénéfices attendus se trouvent à différents niveaux : - Réduction du nombre d’individus : au niveau statistique, l’analyse par mesures répétées, où l’individu est son propre contrôle, permet d’augmenter la puissance des tests permettant ainsi de diminuer le nombre d’individus expérimentés, et de fait, cette méthodologie est tout à fait en accord avec le « Reduce » des 3 R en éthique animale (Sneddon et al., 2017). - Utilisation d’organismes non modèles : en évitant d’euthanasier les poissons, cela permettrait d’établir des protocoles portant sur la bioénergétique cellulaire sur des espèces sauvages ou avec des restrictions d’utilisation liées à un statut particulier. Cela permettra d’étudier les mécanismes cellulaires chez des organismes non issus d’élevage, et donc parfois plus pertinents pour répondre à des problématiques d’écophysiologie ou de conservation. - Suivi longitudinal des mesures de la bioénergétique cellulaire sur des espèces non-modèles : la combinaison des deux protocoles permettrait d’étudier plus finement la mise en place des variations métaboliques des poissons en réponse à des contraintes environnementales. - Raffinement de la méthode d’anesthésie : en évaluant les effets potentiellement positifs de la lidocaïne couplée à une anesthésie classique au MS222, ce projet pourrait grandement participer à améliorer la récupération post-chirurgie des poissons.
Procédures
Les poissons seront soumis à 2 micro biopsies musculaires sous anesthésie, réalisées à 15 jours d’intervalle.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de ces protocoles pourraient être l’apparition d’infections chez les poissons au niveau des plaies chirurgicales, une augmentation du stress entrainant une atteinte au niveau comportemental (diminution de l’activité, diminution de la prise alimentaire).
Devenir
Tous les poissons seront mis à mort, afin de caractériser les conséquences morphologiques de la biopsie (hématomes ?) et le fonctionnement mitochondrial final.
Remplacement
A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. Il faut souligner le fait que cette étude a pour but, notamment de diminuer le nombre d’individus expérimentés. En effet, la validation de la méthode des micro-biopsies répétées permettra un suivi temporel du fonctionnement mitochondrial, où chaque individu deviendra son propre témoin et de fait la variation interindividuelle sera directement prise en compte au niveau statistique.
Raffinement
Les différentes phases du protocole (Anesthésies, et biopsies puis métabolisme in-vivo, performances de nage et bioénergétique cellulaire) sont bien établies chez les poissons et maitrisées au laboratoire. Lors des procédures de biopsie, les poissons seront anesthésiés soit au MS222 (selon les recommandations en vigueur), soit au MS222 + Lidocaïne hydrochloride (utilisé ici comme analgésique). Afin de favoriser une récupération rapide de la biopsie, une incision de la peau permettra au punch à biopsie d’attendre le muscle rouge sans enlever de peau au poisson. un pansement en poudre de type Orahésive sera appliqué sur l’incision ce qui favorisera une cicatrisation cutanée. De même, lors des protocoles non invasifs in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux) un des principaux objectifs est de limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux. Chaque geste contraignant (mesure et placement des poissons dans les tunnels de nage) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h. Les poissons seront à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Cela permet d’obtenir des mesures physiologiques valides et fiables, qui ne sont pas influencées par un état de souffrance, stress ou agitation de l’animal. Au niveau des expériences de bioénergétique, les individus seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur avant de prélever des échantillons tissulaires. Tout au long de l’étude, les poissons seront surveillés quotidiennement et dès l’apparition de signes de mal-être, les individus seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage.
Choix des espèces
Le poisson rouge est un modèle pertinent pour cette étude expérimentale car il présente des avantages importants : - 1) facilité d’acquisition par un établissement éleveur et de stabulation en animalerie agréée. Cette espèce est déjà communément utilisée au laboratoire - 2) population homogène en termes de taille et d’âge permettant d’avoir des paramètres morphologiques également homogènes. Il permet d’utiliser différents outils expérimentaux, afin de caractériser les paramètres in vivo et d’avoir à disposition suffisamment de matériel biologique pour les études au niveau in vitro. - 3) modèle biologique couramment utilisé en recherche, d’où une ressource bibliographique très bien fournie. Les poissons utilisés seront de jeunes adultes, dont la taille sera adaptée à l’utilisation des tunnels de nage à disposition au laboratoire.
Régulation pharmacologique des canaux ioniques et conséquences sur le métabolisme et le vieillissement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un phénotype migraineux leur est induit par injections répétées d'un donneur de NO, à 3 puis 12 mois, et le porteur précise que cette douleur ne pourra être soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées. La sensibilité douloureuse est mesurée par les tests de von Frey et de Hargreaves, complétés de tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Il affirme que le suivi du vieillissement "requiert un système biologique intégré" et ne peut être modélisé in vitro, les bénéfices thérapeutiques restant présentés comme des perspectives.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'ncidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.
Bénéfices attendus
La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.
Procédures
Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (6 tests dans la vie de l'animal) et thermique (6 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (6 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 6 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés 1) à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons, 2) par les injections intrapéritonéales des molécules régulatrices des canaux ioniques, du glucose (test GTT) ou de l'insuline (test ITT), et 3) par les tests de comportement (mesure de reflexes volontaires). Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures. La mise à mort sera effectuée pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt et le profil pharmacologique des régulateurs de K2P en termes de spécificité de cible et de concentration active. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.
Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.
Raffinement
Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable (Royal et al, 2019 ; Avalos-Prado et al, 2021). Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, poil non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur qui constituera notre base de travail.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles de régulation des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.
Etude de l’implication du canal potassique ABCC9/Kir6.1 dans l’établissement et le développement de l’hypertension artérielle pulmonaire induit par hypoxie chronique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Ils sont exposés à une hypoxie chronique pendant trois semaines pour développer une hypertension artérielle pulmonaire, avec des injections quotidiennes, des échocardiographies sous anesthésie et un bilan hémodynamique terminal. Le porteur indique que l'hypoxie provoque fatigue et essoufflement à l'effort et une moindre prise de poids, et que les animaux sont tués pour prélever le bloc cœur-poumon. Il affirme que le recours aux animaux est "indispensable" et qu'il est impossible de simuler ex vivo la mise en place de cette pathologie.
Objectifs
La pathogenèse de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est complexe, et implique des facteurs hémodynamiques et environnementaux, une dysfonction vasculaire, ainsi que des prédispositions individuelles. Cependant, actuellement aucun traitement curatif n’existe, c’est pourquoi il crucial de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques. Nos résultats préliminaires suggèrent que le canal ABCC9/Kir6.1 pourrait jouer un rôle dans le développement de l’HTAP. Dans un premier temps nous étudierons le rôle de ce canal ABCC9/Kir6.1 dans le développement et l’apparition de l’hypertension artérielle pulmonaire chez le rat. Puis, nous déterminerons si ABCC9/Kir6.1 constitue une nouvelle cible thérapeutique pour lutter contrôle l’hypertension artérielle pulmonaire. Pour cela au cours de cette étude nous utiliserons différentes approches techniques et expérimentales pour répondre à ces deux questions.
Bénéfices attendus
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est complexe touchant environ 50 personnes par million par an. Actuellement aucun traitement curatif n’existe, et le seulement « traitement » consiste en la transplantation pulmonaire pour seulement les patients éligibles. Il est donc essentiel d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la survie des patients atteints d’hypertension artérielle pulmonaire. La réalisation de ce projet permettra de comprendre l'implication du canal ABCC9/Kir6.1 dans le développement de l’hypertension artérielle pulmonaire, et permettra de déterminer si ce canal ABCC9/Kir6.1 peut être envisagé comme une nouvelle cible thérapeutique dans le développement de cette pathologie.
Procédures
120 animaux seront exposés pendant 3 semaines en continue à l’hypoxie chronique (10% O2). Pour la procédure 1, des injections en intrapéritonéal seront réalisées (1 min par animal) tous les jours durant ces trois semaines chez 60 animaux. Pour la procédure 2, des injections en intrapéritonéal seront réalisées (1 min par animal) tous les jours durant la dernière semaine en hypoxie chronique chez 60 animaux. Des échocardiographies (10-15 min par animal) seront réalisées sous anesthésie à l'isoflurane chez tous les animaux tous les 2 jours durant la dernière semaine de développement de l’HTAP. Un prélèvement sanguin sera réalisé (2-3 min par animal) chez tous les animaux (150 animaux) au dernier jour des protocoles expérimentaux sous anesthésie gazeuse (isoflurane 5% pour l’induction puis 3% pour l’entretien). Le bilan hémodynamique (20-30 min par animal) de tous les animaux (150 animaux) sera réalisé chez tous les animaux au dernier jour des protocoles expérimentaux sous anesthésie à l'isoflurane et sera sans réveil.
Impact sur les animaux
L'exposition des animaux à l'hypoxie chronique pendant 3 semaines conduira au développement d'une hypertension artérielle pulmonaire chez tous les animaux exposés qui se caractérisera principalement par fatigue à l’effort, un essoufflement à l’effort, une prise de poids moindre. Les effets secondaires importants et les atteintes pulmonaires aigües induites par l’hypoxie chronique seront combattus dans les groupes traités avec le Pinacidil.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour prélever le bloc cœur-poumon afin de réaliser une analyse histologique pulmonaire et cardiaque, des expériences de biochimieee t des immunomarquages.
Remplacement
L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre le rôle du canal ABCC9/Kir6.1 dans le développement de l'hypertension artèrielle pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'hypertension pulmonaire qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives (écocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque, et les tissus prélevés sont partagés afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés. Le nombre total de rats utilisés sera de 150 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le test statistique adéquat permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant des rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Jeune adulte (4-5 semaines, 100g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire est plus rapide et plus sévère.
Cellules souches et réparation osseuse – 4
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Une blessure osseuse leur est infligée sous anesthésie, avec analgésie, puis certains lots reçoivent des molécules inhibitrices pendant deux à quatre semaines pour étudier la régénération osseuse. Le porteur décrit une guérison en trois semaines et affirme que les animaux ne présentent pas de signes visibles de souffrance après la fracture. Sur le remplacement, il affirme que la complexité de l'environnement osseux ne peut être reproduite in vitro et conclut à la nécessité de recourir à la souris, les retombées thérapeutiques restant annoncées comme des perspectives.
Objectifs
Les maladies du système musculosquelettique touchent une large proportion de la population, que ce soient des maladies génétiques affectant le développement et la croissance osseuse, les cancers, les maladies dégénératives liées au vieillissement telles que l’ostéoporose et l’arthrose ou encore les défauts de régénération suite à un traumatisme. Ce projet vise à mieux comprendre le processus de régénération osseuse afin de mettre au point de nouvelles applications thérapeutiques cellulaires et pharmacologiques. Ce projet a 2 objectifs principaux: - développer des stratégies thérapeutiques pour les défauts de régénération osseuse liés à des pathologies génétiques ou à un traumatisme musculosquelettique. Pour cela, les souris présentant un défaut de réparation osseuse sont traitées avec différents inhibiteurs spécifiques de voie de signalisation impliquées dans ces défauts de réparation et l’impact de ces traitements sur la régénération osseuse est évalué. - identifier l’implication de nouvelles voies de signalisation dans les défauts de régénération osseuse. Pour cela, les gènes spécifiques de ces voies de signalisation sont invalidés dans les cellules souches osseuses et l’impact de ces mutations sur le phénotype de réparation osseuse est évalué.
Bénéfices attendus
Les fractures représentent les blessures les plus fréquentes du système musculosquelettique. Bien que la réparation osseuse soit un processus très efficace, environ 20% des fractures présentent un retard ou absence de réparation. Le traitement de ces défauts de réparation est compliqué, nécessitant généralement une prise en charge chirurgicale. Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la régénération osseuse en condition physiologique et pathologique. D’un point de vue fondamental, il permettra une meilleure compréhension du rôle de différentes voies de signalisation dans la régénération osseuse physiologique et pathologique. Il s’agit également d’un projet permettant l’étude de nouveaux traitements sur les défauts de régénération osseuse. Les potentielles applications cliniques sont concrètes et ouvrivont la voie à l’utilisation de ces traitements chez les patients.
Procédures
Afin de répondre aux questions du projet, nous utilisons des modèles murins transgéniques, permettant l’inactivation des gènes d’intéret. Une blessure osseuse est induite sous anesthésie générale avec une analgésie péri- et post-opératoire (durée de la procédure entre 30 et 45 min). . Afin de tester des approches thérapeutiques, certains lots de souris sont traités avec des molécules inhibitrices pour déterminer l’effet des traitements sur les atteintes osseuses (durée du traitement entre 2 et 4 semaines).
Impact sur les animaux
Le processus de régénération osseuse est spontané. Le cal est formé en une semaine stabilisant la fracture et les animaux sont guéris après 3 semaines lorsque le cal est entièrement ossifié. Ils ne présentent pas de signes visibles de souffrance 24h après la fracture. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et ne présentent pas de signes visibles de souffrances (apparence physique externe normale, pas de signes de détresse).
Devenir
Les animaux sont sacrifiés à la fin de l’ensemble des procédures afin de permettre l’analyse tissulaire et cellulaire des tissus osseux.
Remplacement
Le processus de régénération osseuse est complexe et implique de multiples types cellulaires, dont l’activité coordonnée et les interactions sont indispensable. Ces évènements ont lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant des interactions entre l’os, les vaisseaux, le système immunitaire, le système nerveux et les muscles. Expérimentalement, il n'est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro, et il est nécessaire de recourir à l’utilisation de modèles murins. Toutefois, nous combinons les études in vivo avec des analyses cellulaires in vitro lorsque que nous cherchons à identifier des défiences au niveau d’un type cellulaire particulier.
Réduction
Dans notre expérience et grâce à des analyses statistiques, nous avons déterminé un nombre réduit de temps à analyser et une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe pour fournir des résultats statistiques valables. Avec une taille d'échantillon de 10 dans chaque groupe de comparaison, la probabilité de détecter une différence est supérieure à 80
Raffinement
Le processus de régénération osseuse est spontané et est complet en moins de 3 semaines. Les animaux sont suivis de façon régulière. Ils ne présentent pas de signes visibles de souffrance 24h après la fracture. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et ne présentent pas de signes visibles de souffrances (apparence physique externe normale, pas de signes de détresse). Nos expérimentations sont accompagnées d’une analgésie en péri- et post-opératoire. Des points limites ont été définis et permettent un suivi efficace des animaux et la mise en place de réponses adaptées le cas échéant. Pour le bien-être animal, des enrichissements (coton, maisonnette, papier) sont placés dans les cages. Ces éléments sont adaptés aux procédures proposées.
Choix des espèces
Mus musculus est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de la réparation osseuse, car les étapes de réparation ressemblent aux étapes observées chez l’homme. Mus musculus permet d’analyser les bases génétiques de la réparation osseuse normale ou pathologique grâce aux nombreux outils cellulaires et moléculaires à notre disposition. La réparation osseuse est un processus physiologique très efficace en particulier chez Mus musculus permettant de controler et traiter la douleur et ne conduisant pas à des dommages durables. L’ensemble des procédures sont réalisées sur des animaux adultes, entre 2 et 6 mois pour les expériences de régénération osseuse et entre 6 et 16 mois pour le suivi de la physiologie osseuse.