Recherche fondamentale

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à une alcoolisation forcée par un régime liquide pendant dix-sept jours et gavées d'oméprazole ou de benzopyrène, un polluant, cinq jours sur sept, avant mise à mort pour analyses. Le porteur reconnaît que certaines souris peuvent mourir d'un coma éthylique en quelques heures de façon imprévisible, et demande une dérogation à l'anesthésie locale pour limiter le stress des contentions. Il affirme que seul l'animal permet d'intégrer les interactions entre alcool, microbiote, intestin et foie.

Objectifs

La consommation d’alcool induit une maladie alcoolique du foie (MAF). Cependant tous les individus consommateurs ne développent pas de formes sévères de MAF. Il existe un risque de développer des lésions du foie dès une consommation équivalente à 5 verres de vin chez l’homme et 3 verres de vin (ou 2 bières à 6° d’alcool) chez la femme. Il a été démontré que les bactéries intestinales qui constituent le microbiote intestinal (MI) ont un rôle dans ce risque individuel, et que moduler ce MI permet de réduire voire d’empêcher les lésions du foie. Des études ont montré que la pectine, une fibre soluble que l’on retrouve dans les végétaux dont la pomme ou les agrumes a un effet protecteur sur les lésions de MAF. En effet, la pectine va favoriser la croissance de certaines bactéries intestinales et favoriser la production de produits bactériens, les indoles, qui vont être protecteurs et diminuer l’apparition des lésions du foie. Ces indoles exercent leurs effets bénéfiques par le biais d’un récepteur, le AhR (récepteur aux hydrocarbures aromatiques). Ce récepteur interagit également avec d’autres molécules, en particulier les médicaments et les polluants, permettant notamment de les éliminer de l’organisme. L’oméprazole est un médicament largement prescrit aux patients ayant une MAF pour traiter l’acidité gastrique. Le Benzoapyrène (BaP) est un hydrocarbure présent notamment dans notre alimentation. Comme les indoles, ces deux xénobiotiques auquels nous sommes couramment exposés interagissent avec le récepteur AhR. Dans ce contexte, notre projet vise donc à évaluer les effets croisés d’une stimulation physiologique bénéfique du AhR par la pectine, et donc les indoles issus du MI dans des situations où il existe une co-exposition de l’individu soit à l’oméprazole, soit à des polluants tels que le BaP. L’approche in vivo nous permettra d’évaluer les effets croisés des indoles et des médicaments/polluants en prenant en compte les interactions entre l’intestin, l’immunité digestive, le microbiote intestinal, et le foie.

Bénéfices attendus

Il n’existe pas de traitement pour prévenir et encore moins améliorer les lésions du foie au cours de la maladie alcoolique du foie. Il a été démontré que les bactéries du tube digestif appelées le microbiote intestinal (MI) joue un rôle dans la MAF. Ces bactéries agissent sur notre organisme en produisant des métabolites qui peuvent s’avérer bénéfiques. Nous avons montré que dans la MAF, l’ajout de pectine, une fibre alimentaire, au régime quotidien permet de favoriser la croissance de certaines bactéries qui produisent des métabolites, les indoles, protecteurs des lésions du foie. Ces indoles agissent par le biais de voies métaboliques également utilisées pour détoxifier l’organisme des polluants et des médicaments. Dans un contexte où un individu est traité avec ces indoles pour améliorer les lésions de MAF, il s’agit de voir si la co-exposition aux médicaments et aux polluants n’affecte pas le traitement. Cela permettra également de vérifier si le traitement n’impacte pas l’élimination des polluants/medicaments. L’absence d’effets croisés permettrai d’envisager la voie des indoles comme traitement dans la MAF.

Procédures

- Les souris de toutes les procédures sont alcoolisées avec un régime semi-liquide contenant l’alcool et +/- de la pectine. 168 souris pendant 17 jours - les souris reçoivent le traitement à l’oméprazole (médicament) ou le placebo par gavage 5 fois/semaine durant toute la phase d’alcoolisation : 48 souris pendant 11 jours (procédure 1). - Les souris recevront le benzoapyrène en gavage 3 fois/semaine : 72 souris pendant 4 semaines (procédures 2 et 3). - 24 souris recevront le benzoapyrène en injection intra-peritonéale 3 fois par semaine : 24 souris pendant 4 semaines -Un seul prélèvement de sang est effectué, le jour du sacrifice chez toutes les souris anesthesiées : 168 souris, 1 seul prélèvement.

Impact sur les animaux

- Nous soumettons les souris à une alcoolisation forcée avec des doses élevées d’alcool. La quantité d’alcool dans le régime peut engendrer une réaction forte chez la souris en peu de temps. Des souris peuvent décéder d’un coma éthylique en quelques heures sans pouvoir le prévoir, alors que certaines souris récupèrent très bien. - L’exposition au polluant ou la prise de l’oméprazole nécessite de gaver régulièrement les animaux. Ce geste répété induit un stress de l’animal dès la contention. Cependant, les canules de gavage et la compétence de l’assistant ingénieur formé à ce geste permettra de réduire au maximum le temps de la contention. - Une exposition au BaP via une injection intra-péritonéale est également prévue. La contention à chaque injection induit un stress chez l’animal en plus de l’injection intrapéritonéale.

Devenir

Mise à mort pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les complications qui vont être observées au cours de la maladie alcoolique du foie mettent en jeu des interactions entre les différents organes qu’il est encore actuellement impossible de reproduire in vitro. Notre projet vise en effet à étudier l’effet curatif des indoles bactériens produits par le microbiote intestinal dans un contexte d’exposition à des xénobiotiques, l’oméprazole un médicament diminuant la production d’acide gastrique et un hydrocarbure aromatique polycyclique, le benzoapyrène (BaP) présent dans notre alimentation quotidienne. Si nous réalisons un certain nombre d’expériences in vitro sur des lignées hépatocytaires et entérocytaires différenciées afin d’approcher les effets à l’échelle d’un organe spécifique. Nous devons également considérer l’effet sur les bactéries intestinales présentes dans le tube digestif, sur les cellules immunitaires de l’intestin et leur impact sur la barrière intestinale puis sur le foie. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours est donc l’animal permettant d’intégrer les interactions entre alcool, xénobiotiques/ bactéries du tube digestif / altération du tube digestif y compris au niveau immunitaire et lésions du foie.

Réduction

Notre critère de jugement principal est la modulation des transaminases. Pour mettre en évidence des différences de transaminases entre les groupes qui puissent etre validés statistiquement, nous allons avoir besoin de 12 souris par groupe.

Raffinement

Les souris seront par 2 pour avoir accès au régime en quantité suffisante. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique et la quantité de sciure augmentée pour favoriser l’enfouissement. La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux si nécessaires. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Néanmoins, le gavage administré aux souris nécessitera leur manipulation très régulière. Cela sera réalisé par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole. Lors de l’injection intrapéritonéale du benzapyrène, nous demandons une dérogation à l’anesthesie locale à la lidocaïne afin de limiter le stress de 2 contentions successives et sachant que le diluant , de l’huile isio 4, n’a pas de toxicité avérée. Le jour du sacrifice, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. L’option du gavage pour le benzoapyrène plutot que l’ajout au régime a été choisi pour contrôler parfaitement la dose de xénobiotiques par poids de souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie de la maladie alcoolique du foie sont proches de ceux observés chez l’Homme bien que l’évolution des lésions du foie reste plus modérée que celles observées chez l’homme. Le modèle d’alcoolisation chez la souris est bien décrit dans la littérature, et c’est un modèle largement utilisé et validé par la communauté scientifique.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont cousues deux par deux par chirurgie pour relier leurs circulations sanguines, puis leur poumon est irradié, afin de déterminer l'origine des macrophages impliqués dans la fibrose. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire et une mobilité modifiée par la suture, mais s'appuie sur une publication rapportant l'absence d'effet de la parabiose sur le sommeil et le toilettage. Il affirme qu'il n'existe aucune alternative et que la souris est un "modèle incontournable" pour ces tests.

Objectifs

Chaque année en France, 30 000 nouveaux cas de cancers pulmonaires sont diagnostiqués. Dans 25% des cas, le diagnostic est précoce et la prise en charge thérapeutique est chirurgicale avec de bons résultats. Néanmoins, environ 40% des patients sont considérés comme inopérables et depuis 10 ans, la radiothérapie stéréotaxique (permettant de cibler précisément la zone à traiter) leur est proposée. Elle nécessite des appareils permettant de délivrer avec une grande précision de fortes doses en quelques fractions, sur un très petit volume. Globalement, la toxicité majeure associée à la radiothérapie stéréotaxique, est la pneumopathie radique pouvant évoluer vers une fibrose radique. Vu son efficacité sur le contrôle tumoral, des questionnements sont en cours sur une possible utilisation de la radiothérapie stéréotaxique en première intention chez les patients opérables mais également sur la possibilité d’utiliser des champs plus larges pour traiter des tumeurs plus grosses, permettant une utilisation plus large. Les connaissances sur ces doses ablatives (très fortes doses par fraction) ne sont que parcellaires. L’acquisition d’un appareil permettant ce type d’irradiation chez le petit animal a permis la conduite d’études (thèses et publications). Un recul important sur le modèle d’irradiation stéréotaxique pulmonaire chez la souris a été acquis, avec des données anatomopathologiques précises jusqu’à 12 mois après irradiation en dose unique ou fractionnée. L’objectif de ce projet est de déterminer si les macrophages sont issus du tissu lui-même ou s’ils sont recrutés depuis la circulation sanguine. Pour cela, l’objectif est de pouvoir faire circuler dans le sang des souris avant irradiation des cellules colorées, que nous pourrons rechercher ensuite dans le tissu (seules les cellules sanguines circulantes sont colorées, les cellules du tissu restent normales). Pour cela, le projet utilisera le modèle de parabiose chez la souris permettant de créer une connexion des systèmes sanguins de deux souris. Les souris GFP sont des souris dont toutes les cellules expriment une protéine fluorescente verte, la GFP : toutes leurs cellules sanguines sont donc vertes. Une fois la parabiose établie entre une souris normale et une souris GFP, la souris normale se retrouve donc avec des cellules vertes circulantes. Nous allons rechercher ces cellules chez la souris normale après irradiation localisée du poumon.

Bénéfices attendus

La fibrose est une cicatrisation exagérée aboutissant à un dépôt excessif de collagène au sein des tissus et organes. Les macrophages, cellules immunitaires jouant un rôle également dans la cicatrisation, ont été démontrés comme impliqués dans le développement de la fibrose pulmonaire, que l’on peut observer chez certains patients traités par radiothérapie au niveau du thorax (cancers pulmonaires, cancers du sein, lymphomes). Les techniques de radiothérapie ont beaucoup évolué ces dernières années, avec en particulier l’irradiation de très petits volumes pulmonaires avec des doses quotidiennes beaucoup plus fortes que lors des protocoles classiques. Si on sait aujourd’hui que les macrophages jouent un rôle dans le développement de la fibrose pulmonaire lors des protocoles « classiques » de radiothérapie, très peu de choses sont connues sur la fibrose induite par l’irradiation de petits volumes pulmonaires. La possibilité récente de modéliser ces petits volumes irradiés chez la souris permet de mieux connaître les processus responsables du développement fibreux dans ce contexte, et en particulier le rôle des macrophages. Le but de ce projet est savoir si les macrophages sont issus des macrophages présents au sein du tissu (prolifération in situ) ou issu d’un recrutement depuis la circulation sanguine. La réponse à cette question est déterminante pour la suite des projets de recherche. En effet, dans une perspective thérapeutique, les stratégies pouvant être mises en place pourront être très différentes en fonction de l’origine des macrophages. Par exemple et de manière simplifiée, si la stratégie thérapeutique mise en place vise à bloquer le recrutement des macrophages depuis la circulation sanguine alors qu’en réalité ils prolifèrent in situ au sein du tissu, la stratégie est vouée à l’échec.

Procédures

• Chirurgie de mise en place de la parabiose, anesthésie générale : durée 1 heure • Prélèvement au sinus rétro-orbital, animal vigile, 1 prélèvement par animal 2 semaines après la chirurgie • Irradiation sous anesthésie : durée maximale 35 min • Durée totale d’une étude : 8 semaines

Impact sur les animaux

Le modèle de parabiose implique une douleur post-opératoire, prise en charge par injection de buprénorphine. Une perte de poids est observée de l’ordre de 10%, avec récupération du poids initial dans les 8 jours suivant la chirurgie. Les souris étant suturées l’une à l’autre, ceci implique forcément une modification de mobilité, sans réduction. Lorsque la parabiose est équilibrée (souris habituées l’une à l’autre, poids identiques, pas de dominance), le comportement des souris n’est pas affecté. Une publication ne rapporte aucun effet de la parabiose sur les différentes phases de sommeil ni sur les activités de toilettage.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements sous anesthésie terminale

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à ce jour concernant l’étude du recrutement macrophagique depuis la circulation sanguine vers le tissu pulmonaire irradié. L’utilisation des animaux vivants est indispensable à l’étude de ce processus.

Réduction

Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques paramétriques (Anova, T-test), il est donc en général nécessaire d’avoir un minimum de 5 animaux pour chaque groupe et condition étudiée. Nous prévoyons donc 5 couples en parabiose pour les analyses en cytométrie en flux. En revanche, étant donné le recul acquis au laboratoire sur les lésions tissulaires et leur étude en histologie et immunohistologie, nous jugeons suffisant de réaliser 3 couples en parabiose pour les analyses histologiques. Nous prévoyons également 6 couples contrôles (parabiose mais non irradiés), 3 pour la cytométrie en flux, 3 pour l’histologie. Enfin, le risque chirurgical impose de réaliser quelques couples supplémentaires, nous avons choisi de réaliser 6 couples supplémentaires afin de garantir la taille des groupes d’étude.

Raffinement

Pour la chirurgie et l’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Des traitements associés à la chirurgie seront mis en place : analgésie per et post-opératoire, anti-inflammatoires et antibiotiques. Un seul couple de parabiose sera hébergé par cage. Des dômes jetables seront disposés dans les cages afin de fournir un abri rassurant. La taille de l’ouverture sera adaptée pour que le couple de parabiose puisse y avoir accès. Les souris sont suivies régulièrement (2 fois par jour/1 fois par jour le week-end les 2 premières semaines puis 1 fois par jour) et tout signe de détresse sévère et de prostration d’un animal entrainera l’euthanasie anticipée des deux souris impliquées dans la parabiose (immobilité, perte de poids, anémie, déshydration sévère, signes de détresse respiratoire, conflit entre les deux membres de la parabiose).

Choix des espèces

Le développement fibreux est un processus évolutif s’étendant sur une période longue. Le rongeur est utilisé pour plusieurs raisons : - durée de vie courte (la fibrose peut s’installer en 8 semaines) - facilité de manipulation - modèles incontournables pour réaliser des tests thérapeutiques préventifs ou curatifs La souris est utilisée pour ses variantes génétiques et la grande quantité d’outils moléculaires disponibles sur le marché. Les animaux seront commandés âgés de 10 semaines et utilisés après 1 semaine d’habituation à l’animalerie.

485 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales pulmonaires par chirurgie du thorax, puis des injections répétées et un suivi de la tumeur par imagerie, pour tester des molécules censées restaurer la reconnaissance des tumeurs par le système immunitaire. Le porteur reconnaît des alternatives sur cellules mais affirme que seul un "animal vivant, entier" permet d'étudier l'effet anti-tumoral. Les effets attendus incluent une gêne respiratoire liée à la greffe et une toxicité possible du traitement.

Objectifs

Le cancer est un groupe de maladie touchant une grande partie des organes, il se caractérise par la multiplication anarchique de cellules. Ces cellules, dites « tumorales », ont subi plusieurs mutations qui leur ont permis d’acquérir de nouvelles propriétés telles que l’immortalité. Aujourd’hui, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, en particulier en France où il est devenu la première cause de décès. De plus, avec 30 991 morts répertoriés en 2017, le cancer du poumon est la première cause de mortalité par cancer en France. Celui-ci est divisé en deux catégories en fonction des cellules à partir duquel il se développe : les cancers non à petites cellules (NSCLC) et les cancers à petites cellules (SCLC). Les NSCLC représentent 85% des cas, contre 15% pour les SCLC. Cette distinction est importante car la prise en charge des patients est différente. Le choix de traitement d’un patient dépend du type de tumeur, mais aussi de son stade de développement. Parmi ce choix thérapeutique, il existe la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie. Cette dernière se définie par l’administration de molécules stimulant le système immunitaire afin de lutter contre le cancer. En autres, les anticorps anti-PD1 (Nivolumab© ou Pembrolizumab©) sont indiqués pour le traitement de certains cancers avancés, tels que les mélanomes, les NSCLC, etc. Cependant chez les patients atteints de NSCLC, seuls 20-30% d’entre eux répondent positivement à l’immunothérapie anti-PD1. Cette résistance peut être expliquée par plusieurs paramètres intrinsèque à la tumeur du patient, par exemple le faible taux d’expression d’antigène à la surface de la tumeur. A savoir, ces antigènes sont des protéines qui sont présentes seulement à la surface des cellules cancéreuses. La présentation de ceux-ci permette au système immunitaire du patient de différencier les cellules tumorales des cellules saines. Ainsi, le système immunitaire est capable de protéger quotidiennement notre organisme en surveillant, puis en éradiquant les cellules non-saines. Le faible taux d’antigènes sur les NSCLC met donc en péril la reconnaissance des cellules tumorales par le système immunitaire. Notre étude donc sur la restauration de l’expression d’antigènes sur les NSCLC grâce à de petites molécules. Cette restauration permettrait donc au système immunitaire du patient de lutter contre les cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Notre stratégie thérapeutique est de favoriser l’expression d’antigènes au sein de la tumeur NSCLC lors de son développement facilitant sa reconnaissance par le système immunitaire et donc, sa régression et/ou son élimination. Cette réactivation du système immunitaire à l’aide de ces molécules pourrait aussi être combinée avec des immunothérapies déjà approuvées chez les patients, telles que anti-PD1, afin de lever la résistance chez les patients concernés.

Procédures

Greffe orthotopique pulmonaire chirurgicale avec incision au niveau du thorax et injection sous anesthésie de moyenne durée (quelques minutes). Après l'inoculation des cellules, les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales (anesthésie locale) pour la voie d'administation du traitement (1, 2 ou 3 fois par semaine pendant 2 semaines) et pour le suivi de la croissance tumorale par bioimagerie (2 injections de luciferine par semaine pendant 2 semaines, puis 1 injection par semaine si l'animal ne présente plus de signe de tumeur). Du sang pourra être prélevé au niveau sub-mandibulaire après anesthésie sous anesthésie gazeuse (isoflurane) (1 fois par semaine durant la durée du traitement). Après euthanasie des animaux, certains organes seront prélevés afin d’étudier l’impact des traitement sur le système immunitaire et les cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient présenter des signes moteurs anormaux et des changements sensoriels au réveil après anesthésie, ils seronts donc oberservés de façon accentuée les 24 heures suivant l'opération. De plus, pour favoriser une récupération rapide, les souris seront nourries avec du DietGel Recovery. Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés à la greffe intrapulmonaire et une toxicité éventuelle du au traitement par les petites molécules.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes (poumons, rate, ganglions drainants) et d'étudier au mieux la réponse anti-tumorale mise en place après traitement de nos deux molécules.

Remplacement

Concernant cette étude, il existe des alternatives non-animales comme des tests de toxicité sur cellulles, test d'inhibition du splicésome sur cellules à l'aide plasmide. Cependant ces alternatives nous permettent seulement de décrire les caractéristiques de nos molécules et non leur activité anti-tumorale sur les NSCLC. L'utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité et l’effet anti-tumoral des thérapies sur le modèle TC-1 en orthotopique. En effet, les relations entre les cellules cancéreuses pulmonaires et les cellules immunitaires s’effectuent via différents organes, nécessitant toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

D'après nos études antérieures, on observe une différence significative de surface tumorale entre deux groupes lorsque la différence entre les moyennes est supérieure à 28%, avec une variabilité d’environ 22%. Après calcul de puissance, avec un risque alpha à 0.05 et beta de 0.20, on obtient 12 animaux par groupe. Nous ferons un suivi longitudinal de la croissance tumorale. Nous vérifierons si les valeurs suivent une loi normale. En fonction, nous utiliserons soit un Mann Withney ou un t test lorsqu’il n'y a que deux groupes à comparer, ou un 2-way ANOVA avec un post test Kruskal Wallis ou Bonnferoni lorsqu'il y a plus de deux groupes. Nous pourrons ainsi également comparer les groupes entre eux à un temps T défini (par exemple à J7 afin de voir si le lot de souris développant la tumeur avant traitement est homogène, ou bien à des temps plus avancés afin d’apprécier la différence de croissance entre 2 ou plusieurs groupes). Afin de répondre aux obejectifs scientifiques de cette étude, nous avons calculé que 4 groupes suivants 4 conditions de traitement différents (procédure 1) serait suffisant.

Raffinement

Afin de réduire la douleur chez l’animal les injections intrapéritonéales seront effectuées après anesthésie locale (lidocaïne); les injections intra-pulmonaires seront faites sous anesthésie isoflurane . Le milieu est enrichi afin de réduire le stress des animaux. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi à l’aide de nestlets et maisons en cartons afin de réduire le stress des animaux.Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux adultes à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, car ce cancer se développe chez les adultes.

26 rats immunodéprimés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est implantée, puis une canule est fixée dans le crâne pour des séances de microdialyse pouvant durer cinq heures par jour, l'hébergement se faisant en cage individuelle pour éviter que les animaux ne rongent le dispositif. Le porteur classe l'implantation de la canule comme sévère et indique des points limites liés au volume tumoral et à l'état de l'animal, tous les rats étant tués au plus tard cinq jours après la pose. Il affirme que le remplacement n'est "clairement pas possible" car le développement d'une tumeur cérébrale dépend de phénomènes biologiques complexes.

Objectifs

Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. Le traitement de référence consiste, lorsque cela est possible, à retirer chirurgicalement la tumeur, puis à traiter par radiothérapie (traitement par les rayons X) et chimiothérapie. La radiothérapie occupe une place incontestée après la chirurgie. Malgré un traitement bien conduit, de nombreux patients développent une récidive tumorale locale. La Nanomédecine offre de remarquables perspectives de développement et d'innovation en matière de radiothérapie. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nanoparticule innovante (en cours de développement clinique), la compréhension approfondie des effets de ce traitement sur la réponse immunitaire et inflammatoire est une étape cruciale qui permettra de maitriser et potentialiser les effets du traitement. Pour cela, il est important de mettre en place une technique d’approche permettant de suivre en direct les marqueurs participant à la réponse immunitaire et inflammatoire. L’identification des marqueurs de l’inflammation se fait traditionnellement par technique d’immunohistochimie (méthode de localisation de marqueurs dans des coupes de tissu, par la détection d'antigènes au moyen d'anticorps) mais cette technique reste invasive puisqu’elle ne se fait que sous une approche « ex vivo » nécessitant la mise à mort de l’animal. Il est donc nécessaire d’utiliser une technique plus pertinente permettant de réduire le nombre d’animaux en effectuant un suivi longitudinal des marqueurs de l’inflammation « in vivo » sans avoir à mettre à mort l’animal. a microdialyse intracérébrale constitue une technique adaptée puisqu’elle permet d’assurer un échantillonnage sur animal vivant. Elle nécessite l’introduction dans le cerveau d’une sonde (passant à travers un guide ou canule) contenant une membrane semi-perméable à l’eau et aux petites molécules. L'atout principal associé à cette technique est qu'elle permet la mesure répétée de molécules dnas l'environnement du cerveau et de la tumeur sans nécessité de biopsie.

Bénéfices attendus

La microdialyse est une technique largement employée en clinique, permettant la surveillance du métabolisme cérébral. Elle permet, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le cerveau, d' obtenir des échantillons du liquide prése,t dans le cerveau. La maitrise de cette technique d’échantillonnage permettra de mieux appréhender les mécanismes liés au développement de la tumeur et permettra par la suite de pouvoir caractériser les mécanismes d’action des différentes stratégies thérapeutiques menées au sein du laboratoire, notamment au niveau de la réaction inflammatoire. Dans le cas précis du projet européen, la mise en place de ce modèle permettra à terme d’apporter une compréhension approfondie des effets sur la réponse immunitaire qui constitue une étape cruciale pour maitriser et potentialiser les effets thérapeutique d’une nanoparticule innovante pour le traitement du glioblastome.

Procédures

- Implantation de la canule intra-cérébrale (suite à la réalisation de la procédure 1) : présence d'une canule (guide) qui émerge au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal pour une durée de 5 jours maximum. La chirurgie en elle-même est quant à elle estimée à 1h - Microdialyse intracérébrale (procédure 2) consiste en l'infusion d'un perfusat à travers des tubulures et à travers la sonde dans le but d'én récupérer un dialysat. Cette technique nécessite une équilibration préalable de la sonde antérieure à la récupération du diaysat. Pour la série 1, 5 microdialyses sont prévue de Jn+1 à Jn+5 avec 3h d'équilibration de la sonde au préalable et 2h de collecte des dialysats, ce qui correspond à une durée de 5h/jour soit 25h au total. Pour la série 2, 3 microdialyses sont prévues à J11, J13 et J15 avec de la même façon 3h d'équilibration de la sonde au préalable et 2h de collecte des dialysats correspondant à une durée de 5h/jour soit 15h au total.

Impact sur les animaux

Implantation de la canule : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux (cf procédure 1). Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la canule (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements spéciales (30 cm *30 cm) et système de contention nécessaire à la protection des 2 tubulures (infusion du perfusat et récupération du dialysat)

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de chaque procédure sauf si un des points limites détaillés précédemment est atteint, conduisant alors à la mise à mort de l'animal. Pour réaliser un suivi longitudinal des marqueurs de l’inflammation, les animaux sont gardés en vie après chaque séance de micro-dialyse(procédure 2), sauf atteinte d’un des points limites (volume tumoral, dysfonctionnement moteur, modification comportementale, altération de l’état physiologique de l’animal) ou critère de perte de poids décrit comme précédemment. Cependant, comme mentionné précédemment, tous les rats seront mis à mort maximum 5 jours après la pose de la canule suite à la dernière session de micro-dialyse (soit Jn+5) pour a série 1 ou de la même façon à J15 post-implantation tumorale pour la série 2. Une mise à mort plus précoce sera préconisée dans le cas de problèmes techniques liés à la micro-dialyse (interruption de l’infusion, sonde mal positionnée par rapport à la tumeur)

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (influence du microenvironnement tumoral, activation des cellules immunitaires, envahissement du tissu cérébral, processus inflammatoires...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules des caisseuw sanguins, tissu cérébral,...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Cependant une expérience préliminaire « in vitro » sera menée pour dans un premier temps estimer les rendements de micro-dialyse ainsi que les temps d’équilibration de la sonde.

Réduction

La technique de micro-dialyse intra-cérébrale est une méthode d’échantillonnage permettant le recueil de molécules produites par l'organisme sans avoir à mettre à mort les animaux pour récupérer l’organe d’étude afin d’en extraire les molécules à doser. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements de dialysats peuvent être réitérés au cours du temps : chaque animal sera donc utilisé à plusieurs temps cinétiques, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la canule (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment de la micro-dialyse, en effet les animaux connectés aux tubulures seront régulièrement observés, d’une part pour vérifier que le prélèvement se déroule correctement mais aussi pour s’assurer que le comportement des animaux n’est pas trop altéré par la contrainte des tubulures. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie (5 min de trajet à pieds), notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie sous gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la nécessité d’obtention de volumes de dialysats suffisamment importants pour les dosages ultérieurs mais aussi par les limitations de résolution offertes par l’imagerie anatomique. Les rats immunodéprimés sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car du fait leur immunodéficience, il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Des rats âgés de 6 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.

360 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées puis reçoivent par voie intraveineuse des cellules sanguines humaines déclenchant une maladie du greffon contre l'hôte, avec des injections répétées et des gavages d'antibiotiques sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les animaux développent une perte de poids et une atteinte cutanée avec perte de poils, et qualifie de "non douloureux" les injections et les prélèvements. Il affirme que l'accès aux organes cibles est très limité chez les patients et qu'il est "indispensable" de recourir à un modèle animal.

Objectifs

La greffe de cellules souches hématopoïétiques (= cellules permettant la production de toutes les cellules sanguines) est l'une des approches thérapeutiques dans le traitement de cancer du sang après une chimiothérapie. Dans le cas d'une allogreffe (les cellules souches hématopoïétiques d'un donneur compatible), une complication majeure peut apparaître: la maladie du greffon contre l’hôte (GVH). Cette maladie est due à la réaction des cellules du donneur contre les cellules du receveur, entrainant leur destruction, les organes cibles étant essentiellement, la peau, le tube digestif et le foie. Les avancées technologiques récentes ouvrent de nouvelles perspectives pour la compréhension du rôle du système immunitaire (système de défense contre les infections) dans le développement de la GVH humaine. Ce projet a pour but de caractériser le rôle d’une population particulière de cellules du système immunitaire en étudiant leur action régulatrice potentielle sur la survenue de la GVH.

Bénéfices attendus

La détermination du rôle régulateur potentiel de cette population de cellules d'intérêt contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes pouvant freiner le développement de la GVH humaine. Les approches thérapeutiques actuelles pour prévenir la survenue d’une GVH demeurant limitées par leurs effets indésirables, nos résultats permettront d’élargir le champ thérapeutique de cette maladie.

Procédures

Afin de comprendre comment la population de cellules particulière agit sur le développement de la GVH, nous allons utiliser un modèle parfaitement décrit dans la littérature scientifique du domaine. Des souris immunodéficientes (dépourvues de système immunitaire) seront soumises à une irradiation, étape d'une durée de 5 minutes non douloureuse permettant de "faire de la place" avant l'injection des cellules sanguines humaines qui seront à l'origine du développement de la GVH. En effet, un jour après l'irradiation, les souris recevront par voie intra-veineuse (injection non douloureuse dans la veine de la queue réalisée sur souris éveillées, durant moins d'une minute par souris) les cellules sanguines humaines avec ou sans notre population cellulaire d'intérêt. Pour identifier les mécanismes par lesquels notre population cellulaire d'intérêt agit sur le contrôle de l'apparition de la GVH, nous administrerons (par injection dans l'abdomen de souris éveillées, durant moins d'une minute par souris) une molécule connue pour bloquer l'action de nos cellules d'intérêt. Cette injection non douloureuse sera répétée trois fois par semaine pendant 21 jours. Des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux réalisé sur souris éveillées durant une minute par souris) seront effectués chaque semaine sur toute la durée (35 jours) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition hebdomadaire. Nous évaluerons également le rôle de la flore intestinale sur l'activation de notre population d'intérêt et donc sur son rôle protecteur de la GVH. Pour cela, nous administrerons soit dans l'eau de boisson, soit par gavage (une fois par jour pendant 3 semaines, intervention durant une minute par souris) à l'aide d'une sonde adaptée, un mélange d'antibiotiques. Nous suivrons le développement de la GVH par l'apparition des signes cliniques mais également grâce à des prélèvements sanguins hebdomadaires.

Impact sur les animaux

Les souris développant une GVH vont présenter une perte de poids dans les 30 jours après le début de la procédure. Une atteinte cutanée sera également observable (poils hérissé puis perte de poils). La mise en place du modèle implique une étape d'irradiation à une dose qui ne devrait pas avoir d’effet néfaste sur le bien-être de l’animal. Nous y serons tout particulièrement vigilants avec une surveillance accrue de l’aspect des souris au courant de la première semaine. Les administrations répétées (dans l'abdomen ou gavage) pourront également avoir un impact sur le bien-être de l’animal, auquel nous serons tout particulièrement attentifs. De plus lors de l’administration (dans l’eau de boisson) d’antibiotiques, nous nous assurerons que les souris s’hydratent correctement.

Devenir

Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire ou connus pour être des organes cibles de la GVH seront prélevés pour analyse.

Remplacement

L’accessibilité aux principaux organes cibles de la GVH demeure très limitée chez les patients. L’étude des mécanismes de développement de la maladie ainsi que les évènements pouvant la réguler est très difficile chez l’homme et requiert donc l’utilisation d’un modèle animal. Nous avons néanmoins réalisé au préalable le maximum d’expériences in vitro pour démontrer qu'une population de cellules du système immunitaire très particulière est capable de réguler la prolifération et la fonction des cellules responsables de la GVH. A ce stade du projet, il est indispensable d'utiliser un modèle animal pour caractériser leur mécanisme d'action en vue d'une utilisation possible dans des essais thérapeutiques.

Réduction

Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.)

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir d'une fiche d'évaluation des signes cliniques indique des signes de souffrance.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinant, car un modèle reproduisant de nombreux signes de la GVH humaine est parfaitement décrit dans la littérature. De plus nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement et rapidement. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris immunodéficientes (dépourvues de système immunitaires) adultes conformément aux modalités de mise en place de ce modèle expérimental.