Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
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- Système urogénital
Utilisation de faibles doses d’IL2 dans un modèle murin d’autisme médié par une MIA
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
275 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit jusqu'à cinq injections sous-cutanées, un prélèvement sanguin et des tests comportementaux nommés, mesure des vocalisations, test d'enfouissement et test des trois chambres, dans un modèle d'autisme induit par activation immunitaire de la mère pendant la gestation. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélever le sang et les organes. Le porteur juge "nécessaire" d'étudier le comportement sur l'animal, les modèles cellulaires ne venant selon lui qu'après la caractérisation comportementale.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neuro-développemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre clinique large et hétérogène. Récemment, la piste d’une activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse (MIA) a été suspectée par des études épidémiologiques puis confirmée par des modèles animaux. Grâce à une collaboration étroite entre psychiatres et immunologistes, des données cliniques combinées avec des modèles animaux, nous permettrons de mieux comprendre les toubles autistiques des patients. En effet, dans notre projet, nous allons développer des modèles murins d’autisme liés à une MIA afin de mieux comprendre et de caractériser expérimentalement les conséquences de ces modifications neuro-immunologiques in vitro et in vivo. Nous examinerons également le comportement de ces modèles animaux. Nous explorerons donc, sous des angles très divers, les relations entre immunologie et susceptibilité aux troubles du spectre autistique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples: 1- Permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques en lien avec l'immunité dans le champ de l'autisme 2- Identifier des sous-groupes homogènes de patients à l'aide de biomarqueurs diagnostiques 3- Développer une prise en charge thérapeutique spécifique pour ces patients
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1- des analyses comportementales (vocalisation (5 minutes), test d'enfouissement (20 minutes), test des 3 chambres (20 minutes). Chaque animal ne sera soumis à chaque test qu'une seule fois. 2- une injection sous-cutanée de produits pharmaceutiques non iatrogènes, répétée au maximum 5 fois et un prélèvement sanguin qui ne sera réalisé qu'une seule fois.
Impact sur les animaux
Dans notre projet, les animaux subissent soit des injections sous-cutanées et un prélévement sanguin, soit des tests comportementaux. Dans le cas des injections sous-cutanées et du prélévement sanguin, une attention particulière sera portée à la surveillance des potentielles infections et/ou signes d'inflammation au niveau des sites d'injection. Par expérience, nous savons que les produits utilisés dans notre projet sur les groupes d'animaux ne présentent aucun effet dommageable sur les souris. Pour réduire au maximum les effets indésirables de nos procédures sur les animaux, les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté et compétent. Cela permettra de diminuer la douleur mais aussi le stress généré aux animaux. Enfin un suivi quotidien des animaux sera réalisé afin de veiller au bon état de santé de ces derniers. L'application de la surveillance des points limites décrits dans chaque procédure sera utilisée pour détecter au plus vite le moindre problème chez les animaux.
Devenir
Euthanasie par dislocation cervicale afin de récuperer le sang et les organes et de réaliser des analyses immunologiques.
Remplacement
Les marqueurs de l’autisme sont comportementaux (anomalies de la communication sociale et comportements stéréotypés). Il est donc nécessaire d’étudier le comportement des modèles afin d’identifier clairement les mécanismes liés aux MIA (activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse). Les modèles cellulaires ne pourront être utilisés qu’une fois que les anomalies comportementales auront été caractérisées chez les modèles murins. Par ailleurs, aucun modèle alternatif et aucune approche in vitro satisfaisante n’existe et ne peut être utilisé pour répondre aux questions posées. Seul le modèle animal permet d’évaluer l’efficacité́ des approches thérapeutiques. Nous avons choisi d’utiliser un modèle murin, qui permet de répondre aux questions scientifiques posées et pour lequel nous avons toute l’expertise et les outils nécessaires.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons calculé le nombre nécessaire en fonction de la puissance nécessaire. Afin de palier à la variabilité inhérente aux tests comportementaux (vocalisation, test d'enfouissement, 3 chambres), il est nécessaire de tester 15 souris par groupe pour obtenir des résulats robustes, dans le respect de la règle des 3R. Pour comparer les différents groupes et utilisant 15 souris par groupes, nous utiliserons donc des tests statistiques adaptés limitant le nombre d'individus.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et accès illimté à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie seront controlées et stables. Le cycle d'éclairage sera de 12h/jour. Les animaux seront hebergés ensemble et l'isolement sera limité aux conditions expérimentales décrites. Dans le cas d'isolement, un enrichissement avec du coton et un maison en carton sera apporté et le temps d'isolement sera limité au maximum. Les animaux seront surveillés quotidiennement et un soin particulier sera apporté à la surveillance des points limites des souris isolées (comportements répétitifs, automutilation, perturbation de l'activité motrice).
Choix des espèces
La souris est un modèle important en immunologie et particulièrement dans les modèles de pathologies psychiatriques tels que l'autisme. En effet, la souris est un animal spontannément social et ses comportements normaux commencent à être de mieux en mieux connus, La souris a donc été choisie car elle permet d'analyser les symptômes cores de l'autisme c'est-à-dire (i) les anomalies précoces de la communication par l’évaluation des vocalisations ultrasoniques dès 7 jours de vie, (ii) les comportements répétitifs par le test d'enfouissement et (iii) la perte d'appétence sociale par le tests des 3 chambres. Ces deux dernières évaluations seront réalisées sur des souris adultes entre 7 et 9 semaines de vie.
Etude de la cryoconservation des spermatozoïdes aviaires pour la gestion de la biodiversité
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Autres oiseaux : 138
346 oiseaux, 208 poules et 138 cailles, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les interventions se limitent à des collectes de semence et des inséminations, mais les mâles sont maintenus en cage individuelle en raison de leur agressivité, pour une étude sur la cryoconservation du sperme aviaire au service de la filière volaille et de la biodiversité. Le porteur indique que les animaux sont gardés vivants puis proposés à d'autres expérimentations à la fin du projet. Il affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe pour produire des spermatozoïdes fécondants chez ces espèces.
Objectifs
A l’échelle mondiale, le maintien de la diversité génétique des espèces animales est un enjeu majeur, notamment pour les espèces de rente comme les volailles représentant la première source de protéines animales pour l’alimentation humaine. Actuellement, la sélection des races basées sur des critères de croissance s’accompagne d’une réduction majeure de la diversité génétique. La conservation des ressources génétiques est donc cruciale pour protéger la biodiversité, restaurer des espèces ou races menacées et contrer les épidémies ou les accidents de reproduction. De nos jours, la cryoconservation des spermatozoïdes est l'approche la plus répandue car elle se base sur la collecte de grandes quantités de cellules, le respect du bien-être animal (prélèvement non-invasif) et la possibilité d’un stockage long. Cependant chez les espèces aviaires, ces protocoles sont longs et fastidieux, dépendants de la fertilité des animaux, ainsi que des espèces et races considérées. De plus, les taux de fertilité après décongélation sont plus faibles que ceux obtenus avec de la semence fraiche. Des optimisations sont donc encore nécessaires afin de tendre vers un protocole applicable à toutes les espèces et races aviaires, notamment celles présentant une faible fertilité des mâles. L’amélioration de ces protocoles passe nécessairement par la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les capacités fécondantes des spermazotoïdes. Ces mécanismes connus, il est alors possible d’identifier des leviers d’amélioration de la conservation de la semence aviaire. Ainsi, les objectifs de ce projet sont multiples. Tout d’abord, nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la fécondance d’un spermatozoïde, dans deux espèces aviaires d’interêts agronomique et scientifique, la caille et la poule, en comparant de façon individuelle la qualité des spermatozoïdes d'animaux de haute fertilité à ceux d'animaux de basse fertilité. Ces données nous permettrons dans un second temps d'améliorer les protocoles déjà existants de cryoconservation de la semence pour les espèces et races domestiques françaises. Ce projet, finance par le CRB anim (ANR-11-INBS-0003), a débuté en 2016 et se finit fin juin 2022, sous la DAP APAFIS#4026-2016021015509521 qui se termine en février 2022. La présente DAP a pour objet de poursuivre les expérimentations déjà débutées (animaux déjà présents) sur la période de février à juin 2022.
Bénéfices attendus
Les protocoles de cryoconservation de la semence aviaire actuellement disponibles présentent certaines failles. En effet, seuls les individus ayant une bonne fertilité au départ présentent une bonne capacité de cryoconservation avec une bonne fertilité observable après décongélation. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la fécondance du spermatozoïde aviaire, en comparant des animaux présentant un haut et un faible taux de fertilité, pour identifier des leviers d'amélioration de la cryoconservation de la semence aviaire. De plus, le protocole actuellement le plus répandu utilise comme cryoprotectant (agent de protection des cellules contre les dommages de la congélation), le glycérol. Or cette substance est associée à une forte réduction de la fertilité des animaux lorsqu'elle subsiste dans les échantillons de semence inséminés. Aujourd’hui, il est donc nécessaire de supprimer le glycérol par des moyens longs et complexes. Nous avons pour objetif de développer de nouvelles approches pour retirer cette substance, reposant notamment sur un gel colloïdal. Enfin, sur la base de nos données obtenues chez la poule, nous travaillons également à l’élaboration d’un protocole de cryoconservation de la semence de caille, procédure jusqu’à présent non décrite.
Procédures
Les seules interventions prévues sont la collecte de semence chez les mâles et les inséminations des femelles. Ces deux interventions sont non invasives et couramment menées en élevage. La seule procédure est l'hébergement des mâles en cage individuelle (entre 30 et 60 semaines d'âge) car les mâles sexuellement matures sont agressifs les uns envers les autres et il est impossible de les mettre avec les femelles pour éviter les inséminations non contrôlées. L’hergement en cage individuelle est donc la seule solution pour éviter les accidents d’élevage (agressivité) et certifier la justesse des données (insémination des femelles non contrôlées).
Impact sur les animaux
Le prélèvement de semence est un acte non invasif chez les espèces caille et poule. Cependant, afin de limiter le stress lié à la manipulation, seuls trois prélèvements seront effectués par semaine. Les inséminations artificielles sont des procédures classiquement développées en élevage sans stress pour les animaux. Nous limitons cependant le nombre d’insémination à cinq par mois afin de limiter tout stress lié à la manipulation excessive des individus. L’hébergement des mâles en cage individuelle (nécessaire car les mâles sexuellement matures sont agressifs les uns envers les autres) mais également la présence de différents individus dans les cages des femelles (mise en place de hiérarchie) peuvent être source d’inconfort et de stress. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.
Devenir
Les animaux sont maintenus en vie tout au long du projet. Les animaux seront proposés pour d'autres expérimentations à la fin du projet auprès de l'unité expérimentale.
Remplacement
Ce projet concerne la reproduction d’espèces aviaires. A l’heure actuelle, aucune alternative in vitro n’existe pour la production de spermatozïdes fécondants ou de fécondation in vitro chez ces espèces.
Réduction
Nous travaillons actuellement sur 48 coqs et 66 cailles mâles. D’après notre expérience, ces chiffres nous permettent de constituer des groupes de mâles de faible fertilité entre 5 et 10 individus, permettant des analyses statistiques concluantes sur les taux de fertilité (évalués sur les nombres d’œufs fertilisés par chi2). Pour déterminer précisement la fertilité d’un mâle, l’insémination de 8 ou de 4 femelles par mâle pour respectivement les espèces poule et caille est généralement préconisée. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous n’étudions pas la fertilité de tous les mâles en même temps. En effet, nous effectuons plusieurs campagnes d'analyse de la fertilité (4 pour les cailles et 3 pour les poules) durant lesquelles la fertilité individuelle de maximum 18 mâles cailles et 20 coqs est étudiée sur respectivement 72 et de 160 femelles. La fertilité des individus se maintenant généralement dans le temps, les groupes ainsi identifiés de bons et mauvais reproducteurs peuvent ainsi être constitués pour l’ensemble du protocole. Ainsi, ce projet concerne 48 coqs et 160 poules (soit 208 poules) mais également 66 cailles mâles et 72 cailles femelles (soit 138 cailles), soit 346 animaux au total. L'analyse de la fertilité des mâles actuellement en expérimentation (APAFIS#4026-2016021015509521 ) est aujourd'hui en cours.
Raffinement
Aucune douleur particulière n'est attentue avec ce protocole. De plus, les mâles sont entrainés au moins deux fois par semaine au prélèvement de semence par massage dorsal depuis l’âge de 30 semaines afin de limiter tout stress lié à la manipulation. Cependant, tout signe de stress accru notamment lié aux manipulations répétitives est fortement surveillé. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.
Choix des espèces
La caille et la poule sont deux espèces à fort interêt agronomique mais également des espèces modèles pour les autres espèces aviaires. En effet, la cryoconservation de la semence de ces deux espèces est un enjeu important pour la filière volaille (maintien des lignées/races à fort potentiel) mais les protocoles développés pour ces deux espèces serviront également de base pour la cryoconservation de la semence d'autres espèces aviaires. Les animaux doivent être matures sexuellement afin d’étudier leur reproduction, soit entre 30 et 60 semaines d’âge.
Rôle d’un récepteur aux signaux de danger dans le développement des mélanomes chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à trois injections et une greffe de cellules tumorales pour induire un mélanome, la plupart des injections étant faites sans anesthésie, que le porteur juge plus traumatisante que l'acte lui-même. Il décrit comme principal risque l'ulcération de la tumeur, et toutes les souris sont mises à mort en fin d'étude pour des analyses post-mortem. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'existe et que ces expériences sont "indispensables" car les interactions in situ ne peuvent être modélisées in vitro.
Objectifs
Notre projet vise à déterminer le rôle précis d’un récepteur de signal de danger dans les réponses immunitaires anti-tumorales dans un modèle de mélanome chez la souris. Pour cela nous utiliserons des modèles de souris conditionnellement déficientes pour ce récepteur et nous leur injecterons des cellules tumorales suivi ou non de transfert adoptif de lymphocytes T protégeant ou attaquant la tumeur et nous étudierons la pousse tumorale, le phénotype des cellules immunitaires recrutées au sein de la tumeur et des ganglions drainants. Enfin nous évaluerons l’influence de traitements immunothérapeutiques dans ces modèles de souris.
Bénéfices attendus
Le cancer est un problème de santé publique majeur, et la 2ème cause de mortalité dans le monde. Récemment, des traitements développés chez la souris visant à lever les phénomènes de tolérance immunitaire contre le cancer ont prouvés leur efficacité chez l’Homme et redonnés un espoir de réduire la mortalité liée à cette maladie. Ces traitements n’ont néanmoins pas encore permis d’éradiquer la maladie. Ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer les immunothérapies visant à inhiber la tolérance immunitaire aux tumeurs et augmenter l’efficacité des vaccins contre le cancer.
Procédures
Les animaux seront soumis à des Injections sous cutanées, intra péritonéales, intraveineuses. Chaque animal recevra entre 1 et 3 injections selon la procédure: procédure 1 : 1 seule injection sous-cutanée; procédure 2: une injection sous-cutanée et une injection intraveineuse (sur animal anesthésié) 1 à 3 jours plus tard; procédure 3: 1 injection sous-cutanée et 2 injections intrapéritonéales, chacune à 7 jours d'intervalle. Sauf cas indiqué, les procédures ne justifient pas l’utilisation d’anesthésiques. Une procédure de sédation rendrait en effet l’ensemble de la procédure plus traumatisante pour l'animal que la procédure expérimentale elle-même.
Impact sur les animaux
Les procédures de notre projet sont bien établies et réalisées par du personnel expérimenté pour leur réalisation. Les nuisances et effets indésirables possibles ont donc peu de chance de se produire. Etant donné les précautions prises dans l’exécution du projet, les risques comportent principalement l’ulcération de la tumeur chez les animaux porteurs de tumeurs et les éventuelles réactions secondaires (irritations cutanées, diarrhées, poil hirsute, perte de poids) aux traitements immunothérapeutiques. Pour éviter leur apparition, le comportement des animaux sera contrôlé régulièrement (tous les jours par le zootechnicien et 3 fois par semaine par l’expérimentateur). Nous serons vigilants aux changements de comportement et d’aspect des souris et les évalueront au moins 3 fois par semaine à l’aide d’un système de scoring détaillé. L’apparition de nuisance ou d’effet indésirables donnera lieu à une réponse graduée en fonction du score. Parmi les actions à prendre, figurent le traitement des animaux par des analgésiques ou la mise à mort des animaux qui atteidraient un point limite.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique que l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’étude de façon éthique par des personnes expérimentées.
Remplacement
En termes de remplacement, aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'étant disponible pour cette recherche, ces expériences chez la souris sont indispensables car les interactions complexes se déroulant in situ ne peuvent être modélisées in vitro. Mais pour les tests fonctionnels nous remplacerons chaque fois que possible l’utilisation des animaux par des tests in vitro. Il est à noter que parmi les 10 molécules les plus efficaces en cancérologie développées depuis 20 ans, toutes ont été découvertes grâce aux modèles murins. En particulier les découvertes de James Allison et de Tasuku Honjo leur ont valu le Prix Nobel en 2018, signe que l’immunothérapie est un espoir contre le cancer et que les avancées majeures passent par l’étude de modèles animaux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons établi des procédures expérimentales tenant compte de l'effectif minimal pour atteindre une puissance statistique suffisante. L’utilisation de techniques modernes de phénotypage et les tests in vitro développés par notre équipe permettra également de réduire le nombre de souris utilisées. Des études exploratoires sur un petit nombre de souris seront réalisées pour sélectionner les meilleures stratégies avant d’évaluer leur impact sur un nombre plus important d’animaux. Pour mener à bien le projet sur l'ensemble des lignées, 2860 souris seront étudiées.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, nous avons mis en place des points limites précis et un système de score afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par du personnel formé et compétent afin de détecter les changements de poids d’aspect et l’apparition de comportements associés à la douleur. En cas de signes précoces d’ulcération tumorale ou de souffrance, les animaux recevront des antidouleurs, et s’ils présentent de l’hypothermie ou des difficultés à se nourrir, ils seront placés dans des cages chauffées ou en présence de nourriture humidifiée respectivement. Ils seront mis à mort si le diamètre tumoral dépasse une valeur seuil ou s’ils perdent une valeur seuil de leur poids. Les souris âgées de 7 à 15 semaines seront hébergées en groupe en accord avec la législation en vigueur avec un nombre maximum de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (lanières de papier permettant la nidification) avec un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson au sein d’une animalerie A2 avec surveillance informatique du respect des paramètres environnementaux (température, hygrométrie). Les animaux seront anesthésiés pour la réalisation des procédures les plus stressantes pour l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle valide en immunologie, en immunologie des tumeurs et particulièrement dans les études visant à mieux décrire une voie de signalisation. L’homme et la souris ont un système immunitaire proche et partagent les mêmes sous-populations de cellules immunitaires. Les modèles mimant le développement tumoral existent et sont très bien caractérisés. Nous pourrons facilement implémenter ces modèles et ainsi minimiser le nombre de souris nécessaires pour notre étude. Par ailleurs, le modèle souris offre l’avantage de pouvoir utiliser des outils immunologiques puissants permettant de suivre les cellules spécifiques d’antigène. Du fait de l’utilisation de ces modèles très spécifiques, le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Nous utiliserons des souris adultes de 7 à 15 semaines d’âge, conditions favorables permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total.
Etude du rôle de la métalloprotéase matricielle-11 dans la fonction musculaire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Chaque animal subit jusqu'à six interventions, dont une injection intramusculaire de cardiotoxine, une toxine tirée de venin de serpent qui provoque une nécrose du muscle, pour étudier le rôle de la métalloprotéase MMP11 dans la régénération musculaire. Vingt souris sont tuées dès l'étape de présélection après biopsie de la queue, les quatre-vingts autres dix-sept jours après l'injection, pour prélever le muscle. Le porteur affirme que travailler sur "l'organisme entier" est "nécessaire" car le système immunitaire ne peut pas être reproduit in vitro.
Objectifs
Dans ce projet, nous allons étudier le rôle de la métalloprotéase matricielle-11 (MMP11) dans l’homéostasie et la régénération musculaire ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avons récemment identifié un rôle important de cette enzyme dans la régulation du métabolisme énergétique de l’organisme. Dans des modèles de souris génétiquement modifiées, nous avons montré que l’expression de la MMP11 dans le tissu adipeux est importante puisque son absence se traduit par un surpoids des souris avec une augmentation significative de la taille des adipocytes et une altération du métabolisme du glucose et des lipides conduisant à un diabète de type 2. Des résultats miroirs ont été obtenus lorsque la MMP11 est surexprimée. Des données préliminaires ont montré que les souris invalidées pour le gène de la MMP11 ont une taille de fibres musculaires significativement inférieure à celle des souris sauvages. Des résultats miroirs ont été obtenus lorsque la MMP11 est surexprimée. Nous avons démontré que la diminution du diamètre des fibres était liée à une augmentation de l’expression de la protéine atrogine-1, un marqueur de l’atrophie musculaire. De plus, il existe une augmentation du stress oxydant dans le muscle squelettique des souris qui surexpriment la MMP11. Cette augmentation a déjà été observée dans le tissu adipeux brun de ces souris avec une altération d’une partie des mitochondries. Les muscles squelettiques sont naturellement dotés de défenses antioxydantes qui neutralisent les espèces réactives de l’oxygène (ROS) mais influencent la régénération musculaire à différents niveaux (viabilité et prolifération des cellules satellites, stimulation de l'angiogenèse, etc.).
Bénéfices attendus
Le corps humain est composé de 639 muscles dont 570 striés (autres que les muscles lisses et le muscle cardiaque) qui ont tous des fonctions bien définies dans l'organisme. Ils permettent notamment la posture, la mobilité, la mastication, et la respiration (muscle du diaphragme) entre autres fonctions. Les muscles squelettiques sont dotés d'une capacité de régénération remarquable après une lésion (déchirure, morsure, cytolyse musculaire due à une toxine, etc...). Les mécanismes de cette régénération commencent à être relativement bien élucidés même si beaucoup de travail reste à faire pour arriver à soigner des maladies dégénératives génétiques qui peuvent atteindre nos muscles comme les myopathies (ex. Myopathie de Duchenne). Pour faire avancer les recherches, nous nous intéressons donc à la fonction du gène de la MMP11 dont le rôle dans le muscle n'est pas bien connu. Des données préliminaires ont montré l'impact de la MMP11 sur la fonction musculaire et sur la croissance des fibres musculaires. Par conséquent, nous avons établi un projet de recherche fondamental dont le but est d'étudier également la fonction potentielle de ce gène dans la régénération musculaire. Selon notre hypothèse, les animaux surexprimant la MMP11 présenteront une régénération musculaire plus rapide que les souris contrôles après lésion musculaire alors que les souris MMP11KO auront une régénération musculaire plus lente.
Procédures
Lors de ce projet, les souris seront soumises à un total de 6 interventions réalisées par le manipulateur. 1. Une biopsie de la queue sera réalisée sur les 40 souris K14-MMP11Tg (durée : 5 secondes par souris) pour déterminer par qpcr le niveau d'expression de la MMP11 et ainsi sélectionner les 20 souris avec une expression de la MMP11 qui est la plus forte et surtout la plus homogène possible entre les souris. 2. Le protocole d'administration de cardiotoxine nécessitera d'endormir dans un premier temps les souris grâce à un mélange d'isolflurane et d'oxygène dans une boîte à induction en plexiglas (durée : 1 minute 30 à 2 minutes selon la souris) puis de maintenir cette anesthésie à l'aide d'un masque à anesthésie gazeuse durant la procédure expérimentale (durée : 2 minutes maximum par souris). Ensuite, les souris recevront une injection d'analgésique, le metacam, par voie sous-cutanée pour limiter la douleur liée à l'injection de cardiotoxine (durée : 5 secondes par souris). 3. Les souris seront également rasées au niveau du muscle tibial antérieur sur une surface de 1cm² (durée : environ 15 secondes par patte). 4. Après désinfection du site d'injection, 50µL d'une solution de cardiotoxine à 10µM sera injectée dans le muscle tibial antérieur d'une des deux pattes, et le muscle tibial antérieur controlatéral sera injecté avec le même volume de PBS (durée : environ 10 secondes par patte) . 5. Après le réveil des souris et dans les jours qui suivront, une seconde dose d'analgésique pourra être injectée aux souris en cas d'observation de signes de douleur (durée : 5 secondes). 6. Pour finir, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale par une personne habilitée (durée : 5 secondes) ou par inhalation de CO2 (durée : 5 minutes), afin de prélever le muscle tibial antérieur.
Impact sur les animaux
La cardiotoxine est une toxine cytolytique obtenue à partir du venin de serpent et qui lorsqu’injectée dans le muscle produit une dépolarisation suivie d’une nécrose myofibrillaire aboutissant à une dégénérescence musculaire suivie d’une régénération au bout de 15 jours après lésion. Un défaut de régénération du muscle est caractérisée par l’accumulation anormale de cellules mononuclées dans l’espace interstitiel qui persiste au-delà de 15 jours après induction de la lésion. Suite au traitement à la cardiotoxine, une attention particulière sera donc accordée à la démarche de la souris afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, inactivité…). La zone d'injection de la cardiotoxine sera également analysée pour éliminer tout risque d'infection (pas d'inflammation, pas de pus).
Devenir
Lors de l'étape de présélection des souris, après avoir vérifié le niveau d'expression de la MMP11 dans 40 souris K14-MMP11Tg par qpcr, les 20 souris qui ont l'expression de la MMP11 la plus faible et la plus hétérogène par rapport aux autres souris seront sacrifiées. Les 80 animaux utilisées pour la partie expérimentale seront ensuite sacrifiés au terme des 17 jours suivant l'injection de cardiotoxine, afin de prélever et d'étudier le muscle tibial antérieur. Aucun animal sera donc maintenu en vie au terme de ce projet.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux est nécessaire pour mimer le plus fidèlement possible la dégénérescence et/ou la régénération fibrillaire, et observer les effets sur l'organisme entier, notamment du fait de la présence du système immunitaire qu'il est impossible de récapituler in vitro. C'est pourquoi nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'Homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. De plus, les modèles de souris génétiquement modifiées dont nous avons besoin ont été utilisés pour d'autres études et sont donc déjà disponibles au laboratoire.
Réduction
Des données préliminaires ont déjà montré que la MMP11 avait un impact sur le diamètre des fibres musculaires, cela permet donc la réduction du nombre d’animaux utilisés au strict minimum, afin d'étudier l’impact de la MMP11 dans la régénération musculaire après une atteinte musculaire induite par la cardiotoxine. De plus, d'après l'expérience d'une équipe de notre institut (étude de la régénération musculaire après injection de cardiotoxine dans le muscle TA), il a été déterminé que 10 souris par paramètre à analyser était un nombre optimal pour assurer la puissance statistique tout en réduisant le nombre d'animaux au strict minimum. Ce nombre est d'autant plus optimisé, que le facteur de variabilité est retiré avant le début du protocole. En effet, les souris qui surexpriment la MMP11 (K14-MMP11Tg) présentent une hétérogénéité d'expression de la MMP11, ce qui constitue un facteur de variabilité impactant les résultats obtenus. Ainsi, une biopsie (queue) sera réalisée sur 40 souris K14-MMP11Tg pour déterminer par qpcr le niveau d'expression de la MMP11 et ainsi sélectionner les 20 souris avec une expression de la MMP11 qui est la plus forte et surtout la plus homogène possible entre les souris. Pour chaque souris, une patte est injectée avec le composé induisant un dommage musculaire et la patte controlatérale est systématiquement injectée avec le même volume de PBS (véhicule) pour servir de contrôle. Au lieu d'injecter un lot de souris avec le composé induisant un dommage musculaire et un autre lot témoin avec du PBS, l'utilisation systématique de la patte controlatérale en tant que contrôle permet ainsi de réduire de moitié le nombre d'animaux requis. En revanche, la blessure induite par la cardiotoxine étant très localisée, chaque souris ne sera utilisée que pour un type d'analyse (ARN ou histologie). Vu que nous travaillons avec des lots de 10 souris seulement par paramètre à analyser, nous utilisons soit un test paramétrique (test de student) ou un test non paramétrique (Mann-Whitney) de comparaison entre deux groupes (souris contrôles et mutantes) avec le logiciel PRISM qui s'appliquent aux petits échantillons (n
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages leur assurant un bien-être avec de la sciure de bois comme litière. Celle-ci est remplacée de manière hebdomadaire pour une hygiène optimale. Le stress est diminué au maximum en hébergeant les souris dans des cages transparentes permettant la visualisation des autres souris et en les habituant à la vue de l'opérateur expérimental qualifié pour les procédures liées à l'expérimentation animale. L'utilisation d'analgésique permettra de limiter la douleur de la lésion musculaire déclenchée par l’injection de cardiotoxine. La taille de l'aiguille permettant l'injection du produit sera adaptée au poids de l'animal afin de réduire le risque de lésion induite par l'aiguille. Les souris seront placées sur un support chauffant afin d’éviter toute déperdition de chaleur causée par l’anesthésie. Elles seront ensuite suivies dans les heures suivant l'injection. Des visites quotidiennes seront effectuées afin de vérifier le niveau d'inconfort et les signes de douleur des animaux dans la cage (diminution des comportements d'exploration, diminution de la prise de boisson et/ou de nourriture, perte de poids, posture voutée, etc...). Ainsi, l'occurence de blessure éventuelle et le risque d'infection au niveau de la zone d'administration du composé induisant un dommage musculaire seront pris en considération. Etant donné que le projet cible les muscles squelettiques, la démarche de la souris sera examinée afin de s'assurer qu'elle ne présente pas de difficultés à se déplacer. En cas de souffrance visible ou de douleur apparente des animaux, un avis vétérinaire sera sollicité pour décider de la continuité ou de l'arrêt de l'expérience.
Choix des espèces
Le modèle de souris a été retenu car c'est le seul pour lequel il est possible de manipuler le niveau d’expression de la MMP11 en employant des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 de manière tissu-spécifique. Ces modèles permettent de répondre directement à notre objectif. A notre connaissance, il n’existe pas un autre modèle animal plus simple permettant de répondre à la problématique inhérente à ce projet. Les souris utilisées pour ce projet seront âgées de 10 semaines au moment de l’expérimentation de manière à étudier la régénération musculaire sur un organe différencié et fonctionnel.
Microdialyse intracérébrale chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un trou est foré dans le crâne de chaque animal sous anesthésie et une sonde y est scellée au ciment dentaire et à trois vis, avant des recueils de liquide céphalorachidien pouvant durer neuf heures, pour mesurer l'effet de molécules à tester sur les neurotransmetteurs. Le porteur signale des nuisances liées à l'opération et à l'hébergement individuel, et les rats sont ensuite tués au CO2 pour prélever le cerveau et vérifier la position de la sonde. Il justifie le recours au rat par la "nécessité" de tester les molécules sur un système nerveux "intègre".
Objectifs
La technique de microdialyse va permettre de vérifier l'activité sur différents systèmes neurochimiques centraux d'une molécule à tester. Ceci permettra de comprendre son mode d'action mais également de vérifier son innocuité, son absence d'effets indésirables sur certaines zones du cerveau. On pourra ainsi confirmer des effets comportementaux observés, cibler certaines pathologies ou alors s'assurer par exemple que les nouvelles molécules testées n'interagissent pas avec les circuits de la récompense et n'aient pas de propriétés addictives.
Bénéfices attendus
La mise en place de ce projet va permettre de comprendre les mécanismes fins d'action de nos nouvelles molécules au niveau synaptique, d'établir des corrélations avec des observations comportementales. Ce projet permettra de cibler certaines pathologies présentant des altérations neurochimiques bien déterminées (Alzheimer, Parkinson, schizophrénie...) ou alors s'assurer par exemple que les nouvelles molécules testées n'interagissent pas avec les circuits de la récompense et n'aient pas de propriétés addictives.
Procédures
La technique de microdialyse se décompose en 2 phases: - implantation d'un guide canule au niveau du cerveau : l'animal est anesthésié (kétamine/xylazine), un trou est foré au niveau du crâne et la sonde est positionnée et scellé avec du ciment dentaire et 3 vis. L'ensemble de la procédure dure maximum 45 minutes. - recueil des dialysats : l'animal est placé dans une enceinte, une sonde est insérée dans le guide canule et du liquide céphalo-rachidien artificiel mis à circuler à un débit déterminé (0.5 à 2 µl/min). Un échantillon de liquide céphalo-rachidien est collecté toutes les 20 à 30 minutes sur une durée de 9h maximum.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux peuvent avoir plusieurs origines : - nuisances liées aux suites de l'opération d'implantation (mauvaise récupération post anesthésie, plaie sur le crâne mal cicatrisée) - Hébergement individualisé - Lors du recueil, problème de tolérance au nouveau produit à tester.
Devenir
Les animaux issus des sessions de recueils sont sacrifiés à l'aide d'une concentration croissante de CO2, les cerveaux sont prélevés afin de vérifier la bonne implantation des sondes.
Remplacement
L’utilisation de rats en microdialyse est justifiée par la nécessité de pouvoir tester sur un système nerveux intègre l'effet de nouvelles molécules. En effet, l'objectif de la microdialyse est de mesurer l'évolution au cours du temps de la quantité de différents neurotransmetteurs au niveau de la fente synaptique. Cette libération de neurotransmetteurs peut être influencée par les nombreuses interactions des systèmes neurochimiques situés dans d'autres structures que celle recevant la sonde de microdialyse.
Réduction
L'intérêt de la microdialyse est qu'elle permet notamment d'observer les effets d'un traitement sur un animal vigile avec plusieurs observations au cours du temps, cet animal étant son propre témoin. Cette technique permet ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Un effort important a été réalisé afin d'optimiser l'anesthésie des animaux au moment de l'implantation du guide canule. L'association kétamine / xylazine permet une sédation et une analgésie correcte et couvrant largement le temps de l'opération. Jusqu’à 3 jours après l’implantation, si l’animal présente des signes de mal être (poils hérissé, yeux mi-clos, prostration) alors il reçoit une administration de carprofène (une administration s.c. par jour maximum, 5 mg/kg, 1ml/kg, Carprofelican, Dechra, 50 mg/mL, dilué 10 fois). Si après 3 jours, nous ne constatons pas d’évolution de l’état du rat alors il est euthanasié. Si nous constatons dans les 3 jours que la plaie ne cicatrise pas (présence de saignements / croutes, boursouflures) l’animal peut être à nouveau réanesthésié (isoflurane) afin de refaire des points de sutures. Si 5 jours après le réveil de l’anesthésie, un animal n’a pas repris de poids, alors il est euthanasié. Pour compenser l'hébergement individualisé des animaux, un enrichissement du milieu (balles, blocs de bois, lambeaux de papier) est ajouté dans la cage. Les cages d'hébergement en polycarbonate transparent sont placées côte à côte afin de favoriser le contact visuel entre animaux.
Choix des espèces
- La taille adéquat de l’animal : ni trop petit pour des microdissections de structures déterminées du cerveau, ni trop gros pour des problèmes de gestion et d’organisation d’un laboratoire. - Le rat est déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et il a un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée chez le rat et il existe de très bons atlas stéréotaxiques permettant des implantations précises (par ex : Paxinos et Watson, 1996). Les animaux sont utilisés à l'âge adulte. En effet, les coordonnées stéréotaxiques des structures d'intérêt sont obtenues à partir d'atlas stéréotaxiques déterminés pour des animaux adultes.
Caractérisation d’un nouveau modèle de l’Ataxie de Friedreich et mise en application d’une approche de thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hors animaux reproducteurs et de maintien de la lignée. Porteuses d'une mutation reproduisant l'ataxie de Friedreich, les homozygotes développent une ataxie vers trois mois et sont suivies par des tests comportementaux réguliers et des électromyogrammes, avant l'injection d'un vecteur de thérapie génique et une mise à mort à neuf mois pour analyses. Le porteur qualifie ces tests de comportement d'"indolores et sans stress" pour l'animal. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer cette approche et qu'une validation in vivo est "indispensable".
Objectifs
L’ataxie de Freidreich (AF) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une maladie neurologique avec une dégradation progressive des fonctions motrices et sensorielles qui conduit à une perte des mouvements volontaires. La maladie est dû a une perte de frataxine, une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Les approches thérapeutiques pharmacologiques développées ciblant principalement les effets secondaires sont à ce jour faiblement efficaces et l’AF reste une maladie incurable. Une approche de thérapie génique permettant de restaurer les taux physiologiques de frataxine est en cours de développement. Un nouveau modèle murin avec une mutation ponctuelle dans la frataxine a été généré, afin de mimer les effets d’une mutation ponctuelle identifiée chez certains patients. Ce modèle est en cours de caractérisation, mais nous savons que ce modèle développe un phénotype neurologique progressif entre 3 et 9 mois, similaire à la maladie humaine. Ce modèle murin nous permettra donc de comprendre les états précoces de la maladie, et de développer une approche préclinique de thérapie génique. Le projet a 2 axes : 1) caractériser le phénotype neurologique du modèle au cours du temps, notamment au cours des trois premiers mois et 2) appliquer et optimiser un protocole de thérapie génique avec un vecteur permettant d’exprimer la frataxine à des niveaux proches de l’endogène.
Bénéfices attendus
Il y a plusieurs bénéfices attendus de ce projet. Le premier sera de valider ce nouveau modèle qui présente des faibles taux de frataxine de façon ubiquitaire et une mutation retrouvée chez l’Homme. Ce modèle pourra être utiliser pour continuer à comprendre la pathophysiologie de la maladie afin de développer des nouvelles approches thérapeutiques. Le deuxième bénéfice sera de continuer à développer au niveau préclinique une approche de thérapie génique.
Procédures
A partir de la naissance les animaux seront observés 2x /semaine (pour surveiller leur poids et taille). Des tests de comportement indolores et sans stress pour l’animal, effectués par le même expérimentateur, nous permettront d’identifier avec précision les défauts locomoteurs et de suivre l’évolution du phénotype. Les tests seront utilisés en conformité avec la littérature et les procédures établies au laboratoire. Ces tests seront effectués tous les 15 jours jusqu’à 12 semaines, et ensuite 1 fois par mois jusqu’à l’âge de 9 mois. Des mesures d’électrophysiologie par électromyogramme (EMG) seront effectués afin de mesurer la réponse proprioceptive des animaux et de corréler ses résultats aux données comportementales à 2 et 3 mois, puis 1 fois tous les 2 mois. A 9 mois, les souris seront mises à mort et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques et histopathologiques. (Procédure 1) Une deuxième cohorte de souris sera générée pour le prélèvement de tissus pour une caractérisation biochimique et histopathologique, à différents temps (naissance, 7 jours, 3 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois), ce qui correspond à différentes phases clés dans la progression de la maladie. Le point de 9 mois sera obtenu à partir de la cohorte de la procédure 1. (Procédure 2) Enfin deux autres cohortes seront générées pour évaluer une approche de thérapie génique, d’abord en pré-symptomatique puis en postsymptomatique. Après injection intraveineuse du vecteur médicament (vecteur exprimant la frataxine) soit avant symptômes (Procédures 3) ou après l’apparition des symptômes (Procédure 4), des tests de comportements ainsi que des mesures d’électrophysiologie seront effectués comme en procédure 1 pour évaluer l’effet thérapeutique. A 9 mois, les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus pour des analyses.
Impact sur les animaux
Les lignées utilisées pour l'élevage sont maintenues à l’état hétérozygote, portant un seul allèle muté et un allèle sauvage. Elles n'ont pas de phénotype dommageable et ne nécessitent donc pas de surveillance particulière. Seuls les animaux homozygotes pour la mutation du gène de la frataxine issues des croisements entre deux souris hétérozygotes ont une réduction de la taille globale et développent des symptômes d’ataxie vers le 3ème mois, aspect qui nécessite d’être affiné. De la nourriture gélifiée sera proposée aux animaux dès l’apparition des signes de la maladie, détectés par les tests de comportement que nous effectuerons.
Devenir
Pour des analyses biochimiques et histologiques une mise à mort est nécessaire en fin de procédure en respectant les points limites et la progression de la maladie.
Remplacement
Ce projet vise à optimiser une approche de thérapie génique pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et de ralentir la progression de la maladie, voire la stopper de façon pérenne sans induire des effets secondaires invalidants. Tous les outils moléculaires utilisés ont été testés dans des cellules en culture mais il est indispensable de réaliser une validation in vivo sur un modèle murin de la maladie. Ce modèle est le premier modèle qui reproduit génétiquement une mutation ponctuelle retrouvée chez l’homme.
Réduction
Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans un maximum de 720 animaux hors animaux reproducteurs et maintien de la lignée. Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant en compte du nombre minimum nécessaire pour pouvoir appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires de nos collaborateurs nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (20 souris par condition pour les tests de comportement et 10 souris par condition pour les analyses biochimiques et histologiques). Autant que possible, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Si aucun phénotype moléculaire/histologique n'est observé à 6 semaines, les cohortes prévues pour les points plus précoces ne seront pas générés. En l’absence de différence entre les mâles et les femelles, les données seront combinées afin de diminuer de moitié l’effectif.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et leur poids et taille seront mesurés 2x / semaine. Dès les premiers signes cliniques (défauts à la locomotion ou perte de poids), de la nourriture gélifiée sera mise à leur disposition dans la cage. Des points limites prédictifs sont déjà établies et validés par la communauté scientifique avec un « scoring » adapté aux modèles d’ataxie.
Choix des espèces
Il n’existe à ce jour pas de méthodes alternatives pour évaluer la pertinence d’une approche de thérapie génique pour le traitement de l'Ataxie de Friedreich, notamment de la composante neurologique de la maladie. Il est alors nécessaire d’utiliser un modèle animal pour comprendre et proposer des approches thérapeutiques de la pathologie. La frataxine humaine sauvage est capable de compenser l’absence de frataxine murine endogène dans des modèles cellulaires et murins. Malgré l’existence de modèles cellulaires, une étude chez l’animal est indispensable pour déterminer la pertinence de cette approche de thérapie génique et afin d’établir une preuve de concept et l’innocuité de cette stratégie. Cette étape préliminaire est cruciale avant de pouvoir considérer une application chez l’Homme. Les études aux stades post-nataux débuteront à la naissance et se termineront à 9 mois au plus tard, et avant d’atteindre les points limites fixés dans cette étude. Nos collaborateurs ont déjà établi que les animaux avaient un phénotype à 3 mois, mais n’ont pas testé les stades avant.
Effet d’une thérapie ciblée dans des modèles murins de sarcomes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéficientes greffées de tumeurs humaines de sarcome, elles reçoivent deux injections par semaine d'anticorps ciblés et de chimiothérapie pendant tout le suivi tumoral, avec des nécroses de tumeur en surface et une cachexie possible menant à la mise à mort. Le porteur affirme que la diversité cellulaire des sarcomes ne se retrouve pas en culture mais seulement dans les greffes chez la souris. Il écarte d'autres modèles comme le poisson zèbre au motif que les schémas d'administration y sont moins standardisés.
Objectifs
Les sarcomes constituent une maladie rare qui touche environ 1000 personnes par an en France. Ils affectent majoritairement les sujets jeunes et présentent un profil métastatique et un taux de récurrence élevé, conduisant à un pronostic réservé . Actuellement les patients sont traités par amputation additionnée de chimiothérapie et/ou radiothérapie. Il convient donc de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques. L'objectif principal de ce projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie sur le développement de certaines formes de sarcomes dans des modèles humains greffés chez la souris. Les expérimentateurs en charge des animaux sont expérimentés dans la mise en œuvre des modèles animaux présents dans les 3 différentes procédures.
Bénéfices attendus
L'hypothèse de ce travail est que la cible thérapeutique étudiée joue un rôle dans le développement des sarcomes. Ceci est basé sur l'évaluation de l'expression de la protéine ciblée dans les tumeurs de patients atteints de cette maladie. Dans le cadre de cette étude, l’effet anti-tumoral d’une thérapie ciblée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie sera évalué dans des modèles murins. Un projet d’essai clinique portant sur le traitement de ces sarcomes avec la thérapie ciblée est actuellement à l’étude. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement du candidat médicament et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.
Procédures
Injections sous-cutannées de lignées cellulaires (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL ou 200µL. Injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral) et/ou chimiothérapies (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral).
Impact sur les animaux
Dans les trois procédures il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les individus concernés seront mis à mort.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Les animaux ne présentant pas de prise tumorale seront mis à mort 2 mois après la greffe.
Remplacement
Les sarcomes nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension des mécanismes d’action de notre thérapie ciblée. Les modèles retrouvés dans la littérature montrent que cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires mais uniquement dans les greffes chez la souris.
Réduction
Procédure 1) Un nombre de 5 souris par condition, selon 3 différentes conditions de greffe, est suffisant pour évaluer la prise de greffe des différentes lignées cellulaires. Les souris seront greffées dans chaque flanc pour réduire le nombre d’individus nécessaires. Ces expérimentations seront réalisées sur les six lignées cellulaires. Procédure 2) Les lignées ne montrant pas de prise tumorale en procédure 1 ne seront pas utilisées en procédure 2 et 3 conduisant à une réduction. D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 10 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales combinés au fait que nous ne connaissons pas encore l'efficacité de prise de ces modèles, nous envisageons des lots de 45 souris par expérience de manière à pouvoir répartir au moins 10 souris par groupe de traitement (retrait des 5 tumeurs n’ayant pas pris et/ou de trop grosses tumeurs à l’inclusion). Procédure 3) Une fois l’efficacité anti-tumorale déterminée, nous nous intéresserons aux mécanismes d’action de notre thérapie dans les temps précoces du traitement. La procédure 2 sera donc répétée pour les lignées montrant une efficacité anti-tumorale mais avec une mise à mort plus précoce (environ 500mm3) des animaux pour réaliser des analyses biologiques. Des expériences in vitro seront menées sur les lignées pour déterminer leur sensibilité aux agents de chimio thérapie. Ces résultats conditionneront le maintien ou non des conditions de traitement avec ces agents dans les procédures 2 et 3, pouvant ainsi conduire à une réduction. Les traitements seuls ou associés ne montrant pas d’efficacité anti-tumorale dans la procédure 2 ne seront pas utilisés en procédure 3, conduisant également à une réduction. Des statistiques adaptées seront utilisées.
Raffinement
Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans toutes les procédures le volume tumoral sera évalué 2 à 3 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, cachexie, isolement social) seront surveillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 à 3 fois par semaine.
Choix des espèces
La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l'activité anti-tumorale de la thérapie ciblée étudiée. La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu humain pour éviter les rejets tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps et chimiothérapies sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. La cible thérapeutique étudiée n'est pas exprimée dans certaines espèce. On retrouve une forte homologie entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, les outils destinés à l'analyse des tissus post mortem n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi.
Étude des interactions entre un exercice physique pré- administration de l’immuno-chimiothérapie sur la croissance tumorale et le muscle squelettique dans un modèle pré- clinique de cancer colorectal chez la souris. EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, puis un gavage cinq jours sur sept et des injections d'immuno-chimiothérapie, tout en étant contraintes de courir sur un tapis, pour tester si l'exercice améliore l'effet des traitements. Le porteur reconnaît que le gavage répété est stressant et que des ulcérations ou une tumeur trop grosse conduisent à la mise à mort. Il affirme n'avoir aucune autre possibilité que d'utiliser un "organisme entier".
Objectifs
Nous savons que réaliser de l’activité physique (AP) diminue la mortalité induite par différents types de cancer chez l’Homme. Cela a été montre dans des études chez l’humain et chez l’animal. Cependant, nous ne comprenons pas vraiment comment l’exercice agit pour diminuer la croissance de la tumeur. Notre projet chez la souris est associé à notre projet chez l’homme ou nous souhaitons voir si un exercice physique juste avant la prise des traitements anti-cancéreux améliorerait l’efficacité de ces traitements. Chez l’homme, nous ne pouvons pas souvent récupérer les tumeurs chez des patients en stade avances car il y a trop de risques pour les patients. Nous avons donc besoin de développer d’autres modèles pour étudier les effets sur la tumeur elle-même. L’exercice physique pourrait modifier la réaction du système immunitaire ou le nombre de vaisseaux sanguins sur la tumeur (vascularisation) et ainsi rendre la tumeur plus sensible aux traitements. Secondairement, nous savons que le cancer ainsi que les traitements contre cette maladie peuvent engendrer des effets secondaires. En particulier, il existe une fonte musculaire et une altération de leur fonctionnement. Cela diminue la qualité de vie des patients et serait synonyme d’un moins bon pronostic. Ainsi faire réaliser des exercices physiques aux patients permettraient de maintenir leur masse musculaire et améliorer les effets des traitements. Notre projet vise donc à étudier les effets d’un exercice physique aigu pré- traitements sur 1) le développement de la tumeur dans un modèle de cancer chez la souris ; 2) la fonte musculaire induite dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Le développement de la recherche dans le domaine de l'exercice appliqué à l’oncologie a permis de constituer une base de données importante sur le rôle de l’exercice physique dans la prévention et la gestion des effets indésirables du cancer. Néanmoins, il est essentiel de comprendre comment l'exercice diminue la progression tumorale. Sur le plan scientifique, ce projet permettra donc d’apporter des nouvelles données scientifiques sur les interactions entre l’exercice physique et les traitements anticancéreux des patients ainsi que les mécanismes potentiels par lesquels l’exercice physique pré-administration de l’immunochimiothérapie pourrait potentialiser l’efficacité des traitements. Aujourd’hui pour des questions de réduction de technique invasive chez les patients, de moins en moins de biopsie de la tumeur sont réalisées ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle murin à visée scientifique pour comprendre l’interaction biologique et moléculaire entre un exercice physique réalisé juste avant l’injection des traitements et le microenvironnement tumoral. Ce modèle nous permet donc d’accéder aux tumeurs et d’évaluer l’effet de l’exercice sur la taille de tumeur, les mécanismes immunitaire et vasculaire sous-jacent ainsi que le muscle squelettique. Grâce à cette étude nous pourrons rapidement apporter de précieuses données sur les interactions entre exercice et cancer. Sur le plan clinique, les mécanismes mis en évidence au cours de cette étude permettront d’envisager des essais cliniques futurs grandes ampleurs étudiant plus spécifiquement les effets de ce type d’intervention combiné sur le développement tumoral et la cachexie musculaire associée au cancer, deux paramètres majeurs dans la survie des patients. Ces résultats permettront ensuite de concevoir des essais cliniques plus poussées afin de déterminer et affiner la prescription de la dose d’exercice (durée, intensité, modalités) à utiliser en combinaison à un traitement anti-cancéreux. Ces différentes études permettront d’améliorer la prise en charge des patients et l’efficacité de la thérapie.
Procédures
Les animaux utilises dans ce projet seront tout d’abord soumis à une seule injection sous la peau au niveau du flan gauche de cellules capables de former une tumeur. Après avoir attendu quelques jours pour que la tumeur se forme, les animaux commenceront leurs traitements bases sur une immuno et chimiothérapie. Certains des animaux ne seront pas injectes avec des cellules tumorales et ne développeront pas de tumeurs. Ceux-ci correspondront aux groupes Non-Tumoraux (NT). Pour cela, les animaux recevront une fois par semaine une injection au niveau du ventre pour atteindre les organes (intrapéritonéale) ainsi qu’un gavage (insertion d’une sonde dans l’œsophage) quatre jours sur cinq pour recevoir la totalité des traitements. Une partie des animaux eux ne recevront pas le traitement mais un placebo. Au moment du début des traitements, les animaux commenceront de réaliser de l’exercice physique. Le premier exercice sera réalisé avant même l’injection des tumeurs pour établir le niveau de d’endurance physique des animaux grâce a un test de vitesse maximal de course (VMC) qui permettra d’adapter les exercices suivants. Ces derniers seront réalisés juste avant les traitements anti-cancéreux quatre jours sur cinq et dureront 50 minutes à une vitesse correspondant a 60% de la VMC. Ensuite une partie des animaux, seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs après quatre jours de traitement et/ou d’exercice. L’autre partie des animaux poursuivra le protocole (traitement + exercice) jusqu’à 30 jours. A la fin du protocole, une partie des animaux sera utilise pour évaluer si l’exercice a modifie la vascularisation des tumeurs, c’est-à-dire savoir si l’exercice a permis que la tumeur soit plus perfusée et reçoive plus de traitement. Pour cela, les animaux recevront une molécule capable de visualiser les zones qui ont une diminution de leur taux d’oxygène (hypoxie) qui est une caractéristique des tumeurs agressives. Après cette injection, soient les animaux resteront au repos soient ils seront mis à l’exercice, puis mis à mort pour récupérer les tumeurs. Une autre partie des animaux, sera utilise pour voir si la croissance tumorale et les traitements ont un impact négatif sur les muscles et étudier les mécanismes mis en jeu. Pour cela, nous testerons la capacite des souris à réaliser une contraction musculaire. Puis, les animaux seront mis a mort et les muscles récupérés pour être étudiés.
Impact sur les animaux
Le modèle de tumeur sous la peau ne présente pas de métastases ni d’atteintes musculaires trop importantes. De plus, la localisation sous-cutanée de l’implantation de la tumeur permet de minimiser les douleurs associées à la croissance tumorale de par l’espace disponible et l’élasticité de la peau. La douleur ou gêne occasionnée lors de celle-ci sera néanmoins surveillée, en particulier si les animaux en évaluant une possible gêne à se mouvoir ou a se nourrir. Il est possible que les animaux présentent une plaie au niveau de la tumeur et dans ce cas les animaux touches seront mis à mort dans les plus brefs délais pour arrêter leur souffrance. De même si la croissance tumorale est trop importante et que la tumeur atteint une taille trop importante, les animaux seront sacrifiés. Les intensités d’exercice sont modérées et se rapprochent des intensités utilisées chez des patients atteints de pathologies chroniques. Elles sont donc connues pour induire des adaptations physiologiques bénéfiques sans effets négatifs chez l’homme comme chez la souris. Les différents traitements utilisés au cours de ce protocole ont déjà été validés au cours d’études précédentes et permettent une réduction du volume tumoral tout en minimisant la toxicité liée au traitement. Les traitements sont administrés par gavage ou injection dans le ventre. Les animaux seront donc exposés au stress induit par la contention et à la douleur de la manipulation. Ces gestes seront de très courte durée pour minimiser l’impact négatif sur les animaux. Ces procédures ont été choisies car utilisées dans le modèle tumoral utilise et déjà valide et n’ont pas été modifié pour ne pas changer l’efficacité des traitements. Le gavage 5 jours sur 7 est reconnu comme stressant. L’injection IP altère les tissus autour de la zone d’injection mais celle-ci n’ayant lieu qu’une fois par semaine, cela limitera les effets délétères de ce geste. La mesure de la force chez l’animal est réalisée sous anesthésie générale afin de ne pas induire de stress chez l’animal. Les contractions des muscles induites lors du test n’entraînent pas d’altérations de la fonction et de l’intégrité du muscle squelettique (i.e. crampe et/ou déchirement musculaire).
Devenir
Les animaux seront mis à mort après l’expérimentation car l’utilisation des muscles et de la tumeur sont nécessaires pour répondre aux questions émises dans le projet.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier les interactions complexes des traitements combinés immuno/chimiothérapie et de l’exercice physique au sein de la tumeur et le rôle joue par le système immunitaire. De plus le second objectif est d’évaluer l’altération des muscles induits par ces différentes interventions. Nous n’avons donc aucune autre possibilité que d’utiliser un organisme entier. Toutes les découvertes faites lors de ce projet feront ensuite l’objet d’approfondissement dans des modèles de cellules n’utilisant pas d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de nos expériences passées pour mettre en évidence des différences en utilisant le minimum d’animaux. Dès lors que nous obtiendrons des différences entre nos conditions, nous arrêterons les expérimentations chez l’animal afin de maintenir le nombre d’animaux utilises au strict minimum.
Raffinement
Nous veillerons à améliorer au mieux les conditions d’hébergement des animaux en leur donnant accès a des zones cachées pour s’isoler, des jeux et en favorisant les interactions entre les animaux. Si leur condition physique rend difficile leur accès a la nourriture ou à l’eau en hauteur, nous adapterons leur environnement en leur mettant a disposition eau et nourriture au sol. Pour être sûr que la croissance tumorale reste acceptable pour l’animal, nous surveilleront le développement de la tumeur et mettrons a mort les animaux si la tumeur devient trop grosse. Nous surveillerons aussi le poids des animaux pour veiller à ce qu’ils ne subissent pas une perte de poids trop importante et synonyme de leur souffrance. Dans le cas d’une trop forte perte de poids, les animaux concernes seront mis à mort. Le protocole d’exercice physique est d’intensité modérée (60% des capacités maximales). A la suite du test de vitesse maximale de course, la récupération des souris sera vérifiée par observation de leur capacite à bouger le jour de l’intervention et le suivant avec un intervalles de 2h entre deux observations. Les différentes procédures peuvent induire du stress et nous veillerons donc à adapter au mieux nos manipulations pour limiter les actes stressants. Par exemple, nous limiterons le nombre de fois où nous toucherons les animaux en réalisant au même moment la mesure de la taille de la tumeur et les injections des traitements anti-cancéreux ; ou lors du transfert des cages au tapis de course et inversement ou nous pouvons les transférer sans les toucher avec l’aide d’une petite boite. Normalement le modèle ne devrait pas induire de douleur particulière sauf lors de l’atteinte d’un point limite (ulcération ou taille tumorale trop importante) menant à la mise à mort des animaux. Cependant, dans le cas où il semble que les animaux souffrent, nous prendrons contact avec le vétérinaire réfèrent pour évaluer les possibilités d’utiliser des médicaments pour réduire la douleur.
Choix des espèces
Le modèle de cancer sous la peau et les traitements anti-cancéreux que nous utilisons ont été valides préalablement sur les souris. Ces animaux sont très souvent utilisés dans les études en cancérologie ou dans les études portant sur l’exercice physique. Ce modèle permet donc d’obtenir des résultats nouveaux sans avoir à répéter des expériences déjà réalisées avant (nous limitons donc le nombre d’animaux ainsi que les procédures subites par ces animaux). De plus, les outils techniques dont nous avons besoin pour répondre aux questions ont bien été valides chez l’animal augmentant la probabilité d’obtenir de nombreux résultats en utilisant un minimum d’animaux. L’âge des animaux a été déterminé par des études précédentes qui ont valide le modèle que nous utilisons. Nous savons qu’a cet âge, nous obtiendrons un développement de la tumeur suffisant pour répondre à notre question. A cet âge, les animaux ont une fonction musculaire bonne qui permet de diminuer le nombre d’animaux ne voulant pas courir (pourcentage augmentant avec l’âge). Ainsi, a ce stade nous pouvons répondre aux différents questionnements du projet.
Evaluation in-vivo des effets hémodynamiques et ECG d’entités pharmacologiques testées chez le lapin anesthésié
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 900 opérés sous anesthésie sans reprise de conscience et 400 soumis à des gestes de niveau modéré. Ils subissent une trachéotomie, un cathétérisme et des prélèvements cardiaques sous anesthésie, une partie étant d'abord sensibilisée à un allergène pour déclencher un choc anaphylactique, pour comparer les effets cardiovasculaires de médicaments selon la voie d'administration. Le porteur reconnaît des risques de nécroses cutanées aux sites d'injection de l'adjuvant chez les animaux sensibilisés. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif et présente ce projet comme préparatoire à des expériences ultérieures chez le chien.
Objectifs
Nous souhaitons explorer, par différentes voies d'administration, les effets d'entités pharmacologiques sur la sphère cardio-vasculaire, sur aninal normotendu ou soumis à un choc anaphylactique. Dans ce dernier cas, l'effet recherché sur une amélioration de la fonction cardio-vasculaire après induction d'un choc anaphylactique sur animal sensibilisé. Dans tous les cas, les investigations se feront sur animal anesthésié.
Bénéfices attendus
Démontrer par des données pré-cliniques que l'efficacité d'un nouveau traitement peut être obtenue par une autre voie d'administration et être potentiellement augmentée dans le cadre du choc anaphylactique et ce en comparaison d'un traitement de référence.
Procédures
Les animaux conscients subiront des gestes invasifs modérés (administration sous cutanée pour prémédication ou sensibilisation à l'ovalbumine ; intraveineuse ou intramusculaire pour induction de l'anesthésie au mélange kétamine/xylazine). Tous les autres gestes chirurgicaux (trachéotomie, cathétérisme, prélèvements sanguins ou cardiaques) se feront sous anesthésie générale (anesthésie gazeuse à l'isoflurane). La durée maximale sous anesthésie sera de 2h30 avant euthanasie.
Impact sur les animaux
A l'exception de la phase de sensibilisation à un allergène conduite sur animaux conscients, le projet est essentiellement conduit sur des animaux anesthésiés et les principales nuisances vont donc être relatives aux gestes invasifs pratiqués pour l'induction (sous cutanée et intraveineuse) et le maintien (trachéotomie pour une ventilation assistée) d'une bonne anesthésie générale sous isoflurane. Pour les animaux sensibilisés, les risques de souffrance concernent le développement de nécroses et lésions cutanées survenant au niveau des sites d'injection de l'adjuvant.
Devenir
La mise à mort par surdosage à l'Exagon est systématique à l'issue de la procédure expérimentale.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle alternatif pour appréhender sur la fonction cardio-vasculaire les effets comparés d'un même traitement, selon différentes voies d'administration, chez des animaux normotendus ou soumis à un choc anaphylactique.
Réduction
Pour éviter de trop fortes fluctuations chez un animal vigile, nous avons fait le choix du lapin anesthésié et déjà montré que ce modèle était approprié pour réduire la variabilité des mesures recueillies. Toutefois, la phase de sédation est primordiale et doit être conduite avec une attention particulière, dans le calme, en évitant au maximum les désagréments auprès de l’animal (gestes brutaux, contrainte physique). L’injection du sédatif doit être réalisée de façon lente pour éviter la survenue d’apnées fatales, en favorisant un produit qui n’induise pas de douleur à l’injection. Selon l'amplitude des réponses obtenues sur le(s) paramètre(s) d'intérêt, nous avons constaté qu’un effectif compris entre 6 à 15 lapins par groupe expérimental est raisonnable et généralement suffisant pour effectuer une approche statistique des données. Les analyses statistiques sont de deux types : soit en comparant les données de cinétiques aux données mesurées en conditions basales (within group analysis), soit en comparant les données sous traitement à celles recueillies aux mêmes temps dans le groupe contrôle (between group analysis). Le plus souvent, sont rapportées des analyses de variance, suivies d'un test post-hoc approprié lorsque des différences significatives (dès p
Raffinement
Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour expérimental (qui survient en général dans la semaine qui suit). Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une plateforme surélevée, une balle en plastique, une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Sans traitement particulier, les animaux ne doivent pas présenter de signes de douleur à ce stade expérimental. Toutefois, le personnel zootechnicien est sensibilisé pour communiquer directement à l’expérimentateur tout comportement « suspect » d’un animal anxieux, soit observé durant la période d’acclimatation (un animal qui tape systématiquement fortement du pied lors d’une entrée dans la pièce ou lorsque l’on s’approche près de sa cage), soit le jour même de l’expérimentation au moment de sa manipulation pour sa sortie (comportement excessif de fuite, vocalisation…). L’animal est disposé dans un SAS de transfert avec son étiquette d’identification sur laquelle sont annotées son poids et ces remarques éventuelles, il n’y reste que quelques minutes avant que l’expérimentateur ne vienne le chercher. Si l’animal n’a toujours pas retrouvé un certain calme au moment de l’induction de l’anesthésie, il est préférable que l’expérimentateur soit assisté d’un collègue au moment de réaliser son geste invasif (injection intraveineuse), celui-ci pourra par exemple continuer de gratter le dos de l’animal ou la base du cou pour le déstresser momentanément. En cours d'expérimentation, la perte des réflexes aux stimulis externes (cornée, pincement oreille ou extrémité d’une patte postérieure) est contrôlée de façon régulière ; la concentration d’isoflurane dispensé est augmentée si nécessaire.
Choix des espèces
Du fait de sa très grande sensibilité sur la sphère cardio-vasculaire, le lapin a été couramment utilisé au laboratoire pour évaluer les risques de cardio-toxicité pro-arythmique de candidats médicaments. Dans la littérature, il a été montré chez le lapin que la sensibilité des barorécepteurs sous isoflurane était préservée. Les animaux utilisés seront choisis à l'âge de jeunes adultes, en lien avec la visée thérapeutique humaine (adultes)
Evaluation préclinique de l’Accident de Décompression : injection post-plongée de nanocaspules contenant de la perfluorodecaline.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque rat reçoit un cathéter dans la veine jugulaire, puis subit une plongée hyperbare simulée reproduisant un accident de décompression, suivie d'une heure d'observation des symptômes pouvant aller jusqu'à la paralysie ou la convulsion, seule cette dernière déclenchant un arrêt anticipé. Les survivants sont ensuite mis à mort pour analyses. Le porteur affirme que les expérimentations induisant un accident de décompression ne sont envisageables que chez l'animal et que le remplacement n'est pas possible.
Objectifs
L’accident de décompression (ADD) représente le risque le plus grave chez les plongeurs subaquatiques professionnels et de loisir, mais concerne aussi toutes les personnes soumises à des modifications de la pression ambiante (patients et personnels des chambres hyperbares, pilotes, astronautes, ouvriers tunneliers…). Ses manifestations vont de la simple démangeaison jusqu’à la paralysie définitive ou, à l’extrême, au décès. Or, environ un tiers des personnes accidentées conserve des séquelles invalidantes malgré les traitements actuels. Il est donc nécessaire d’améliorer l’efficacité du traitement de cette pathologie. L’administration intraveineuse de solutions de perfluorocarbone (PFC) a montré son efficacité chez des modèles animaux (rongeurs et miniporcs). Ce transporteur d’oxygène est potentiellement efficace dans le traitement de nombreuses pathologies dont l’ADD. L’encapsulation du PFC dans des nanocapsules d’albumine offre des perspectives prometteuses. Ces préparations présentent une faible toxicité autorisant des applications thérapeutiques ; de plus, l’enveloppe d’albumine, soluble à la fois dans l’eau et les lipides, ne provoque pas de réaction immunitaire ; Enfin, ces capsules sont stables en solution et peuvent être administrées par voie intraveineuse. Un travail récent a permis de montrer l’intérêt de ces nanocapsules en prévention primaire sur un modèle murin d’ADD mais son administration en préventif n’est pas envisageable chez le plongeur. Il serait plutôt destiné à être administré immédiatement et uniquement en cas d’apparition de symptômes d’ADD, soit après la plongée. Pour nous rapprocher des conditions d’administration réalistes des nanocapsules, la pose chronique d’une voie d’injection par la veine jugulaire avec un suivi post-opératoire des animaux pendant un mois et administration juste après une plongée simulée ont été validés. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité des nanocapsules dans la prévention secondaire de l’accident de décompression chez un modèle murin d’ADD.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur l’étude de l’efficacité des nanocapsules d’albumine contenant de la perfluorodecaline en traitement secondaire de l’ADD. Nous allons pouvoir confirmer ou infirmer ce que nous avions déjà observé en comparant les différents groupes. A moyen terme, si les résultats sont confirmés positivement, nous pourrons envisager une étude clinique pour le traitement secondaire de l’ADD chez l’homme. A long terme, les bénéficiaires seront tous les personnels susceptibles d’être atteints d’ADD.
Procédures
Tous les animaux (n=60) sont soumis à deux actes pendant la procédure : - En condition d’asepsie stricte, un cathéter veineux est implanté dans la veine jugulaire externe droite. En pré-opératoire, les rats sont soumis à une injection de buprénorphine (0.05mg/kg en sous-cutanée, aiguille 25G) 30 minutes avant la chirurgie. Cette chirurgie est réalisée sous anesthésie générale (injection intrapéritonéale de kétamine 1000 à 100mg/kg associée à de la xylazine à 10mg/kg). Nous réinjectons des demies doses si nous observons une réaction lors du pincement de la patte arrière du rat. En phase post-opératoire, un antalgique est injecté en sous-cutané (minimum 3 jours en fonction de l’état de l’animal) ainsi qu’un antibiotique. La récupération des animaux est surveillée quotidiennement pendant un mois. Puis : - si l’animal est en bonne santé, il rentrera dans le protocole de plongée hyperbare, après administration d’un antalgique, qui est une procédure sévère. Les animaux qui sortent vivants de la plongée reçoivent immédiatement, via le cathéter veineux, une injection dont le contenu est différent entre les groupes que nous avons constitués. Une observation stricte de l’évolution des symptômes à l’aide de la table de suivi de soin sera réalisée pendant une heure. Les animaux vivants seront mis à mort (cf item 3.3.3.) à l’issue de la période d’observation de 60 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances /effets indésirables attendus sont : - la douleur après la chirurgie : intensité de modérée à faible et durée 5 jours après la chirurgie. - l’isolement des animaux en cage individuelle le temps que la cicatrisation soit effective après la chirurgie. Durée une semaine maximum. - la vérification de la perméabilisation des cathéters par injection de 100 microlitres de NaCl hépariné stérile à usage vétérinaire 3 fois par semaine en moyenne après la chirurgie. Intensité de l’acte : légère. - Une possible infection bactérienne après la chirurgie : au maximum 5 jours post-opératoire. - l’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules : intensité légère et durée maximale de 2 minutes. - la douleur et l’angoisse lors de la plongée simulée et lors de la période d’observation de l’apparition des symptômes sur une heure post-plongée. Intensité sévère, durée maximale une heure.
Devenir
A l’issue de la période d’observation de la plongée simulée, tous les animaux survivants seront mis à mort. Nous prélèverons sang, tissus, organe pour des analyses multiples (Histologie des tissus prélevés, dosages biochimiques des paramètres inflammatoires, détermination des activités enzymatiques (LDH, CK, AST, ALT, creatinine)... afin de déterminer si notre traitement est efficace.
Remplacement
Les expérimentations cliniques induisant des accidents de décompression ne sont envisageables que chez l’animal. Chez l’Homme, le risque d’ADD est quantifié à partir de la quantité de bulles veineuses circulantes, or les données récentes montrent clairement que cette mesure est très insuffisante. Par ailleurs, en l’absence de marqueur biologique validé de l’ADD, les approches in vitro ne peuvent être mises en œuvre que sur des échantillons de tissus prélevés sur des animaux préalablement soumis à des décompressions génératrices d’accidents de décompression. De même, les modèles cellulaires, par ailleurs utilisés au laboratoire, permettent d’étudier les effets de la pression ambiante, mais ne sont pas applicables à l’étude de l’ADD. Le remplacement n’est donc pas possible dans cette étude.
Réduction
Plusieurs variables sont analysées : - La proportion d’animaux souffrant d’un accident de décompression, en relation avec le traitement pharmacologique. - La gravité de l’ADD et son évolution en relation avec le traitement pharmacologique - les paramètres biologiques d’intérêt, déterminés à partir de dosages biologiques dans les tissus prélevés. Des tests statistiques appropriés permettront de comparer l’effet de nos traitements (3 groupes de 15 animaux) à notre groupe témoin (1 groupe de 15 animaux). Le nombre d’animaux dans chaque groupe correspond à l'effectif minimal pour assurer une puissance statistique de 0,8 au risque de 0,05.
Raffinement
Tout au long de la procédure, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et ils sont suivis quotidiennement (tables de suivi de soin fournies en annexe). Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire. La chirurgie aseptique est réalisée sous anesthésie gazeuse avec injection d’antalgique en pré-opératoire et en post-opératoire minimum 3 jours en fonction de la gravité des critères comportementaux observés. Un antibiotique sera aussi injecté en post-opératoire. Son utilisation est préventive (au maximum 5 jours post-opératoire) pour enrayer immédiatement la contamination bactérienne si elle a lieu. La vérification de la perméabilisation des cathéters (injection de 100µL de NaCl stérile hépariné à usage vétérinaire, 3 fois par semaine) est un acte léger qui relève de la contention des animaux par les mêmes personnels durant toute la procédure. Nous administrerons un traitement antalgique avant l’entrée des animaux dans le caisson hyperbare afin de diminuer la douleur pendant les injections des nanocapsules et la période d’observation sans modifier l’évolution des symptômes. L’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules est légère et ne dure que 2 minutes après la sortie du caisson hyperbare, cela relève davantage de la contention à laquelle les rats sont déjà habitués pendant la période post-chirurgie. L’appréciation de la survenue d’un ADD à l’issue du protocole hyperbare ne peut se faire que sur des animaux vigiles dont le comportement n’est pas modifié par d’autres facteurs que la présence d’ADD. C’est un accident grave mais certains animaux survivent et ne présentent aucun symptôme. La grille que nous utilisons pour évaluer la gravité de l’ADD est un outil robuste avec des critères fiables. Dans cette étude l’évolution de l’ADD sera appréhendée en fonction de sa gravité sur 60 minutes. C’est le temps nécessaire pour observer et s’assurer que les traitements sont efficaces ou pas. Puis les animaux seront mis à mort (item 3.3.3). Le point limite est la convulsion, seul critère qui conduira systématiquement à l’arrêt de la procédure avant les 60 minutes d’observation.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans ce projet sont des rats Wistar. Chez ce modèle expérimental, nous possédons à la fois de nombreuses données biologiques concernant les effets d’expositions hyperbares et une bonne connaissance des symptômes d’ADD. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Afin d’être certain d’avoir atteint le stade de «jeunes adultes», matures sexuellement, au moment de la plongée simulée dans le caisson hyperbare, tous les animaux sont âgés de 12 pour qu’ils atteignent la masse corporelle de 450g environ (c’est ce paramètre le plus important dans notre projet). Les rats seront cathétérisés un mois avant soit à l’âge de 8 semaines.
Mise en place d’un modèle de souris à auto anticorps anti tPA
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales et subissent deux tests de saignement passant par une section de l'extrémité de la queue, pour créer un modèle d'auto-anticorps dirigés contre une protéine de la coagulation. La mise à mort sert à récupérer la totalité du sang et les organes pour doser ces anticorps. Le porteur affirme que ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris et qu'aucun modèle fiable n'existe chez des espèces jugées moins sensibles.
Objectifs
La présence d’auto-anticorps dirigé contre l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) a était historiquement décrit dans les lupus Erythematosus. Même si dans ces études il a était démontré que ces anticorps étaient dirigés contre le domaine catalytique, les techniques de l’époque n’ont pas permis de mettre en évidence un impact des anticorps sur les fonctions du tPA. D’autres études ont aussi montré la présence de ces autoanticorps dans le syndrome des antiphospholipides, une étude en particulier suggère que ces anticorps pourraient éventuellement inhiber l’activité du tPA et augmenterait ainsi le risque de thrombose. De façons plus intéressante, les travaux de Massimo Cugno et collaborateurs en 2010 ont montré que la thrombolyse de patients atteints d’infarctus du myocarde induit une réaction immunitaire qui amène à la production importante d’anticorps anti tPA. Les auteurs proposent ici que ces anticorps diminueraient les fonctions du tPA endogène à moyen terme. Dans ce contexte, au sein de notre laboratoire, nous avons développé un outil original permettant d’évaluer la quantité d’anticorps anti tPA circulant. Nous avons ainsi mis en évidence la présence de ces anticorps dans le plasma de 80 individus ayant donné leurs sangs à l’établissement français du sang. Ces résultats montrent des niveaux très hétérogènes et démontrent que certains individus présentent des taux très supérieurs. Nous avons aussi démontré un impact de ces auto anticorps sur certaines fonctions du tPA. Afin de mieux comprendre le rôle de ces auto anticorps nous avons aujourd’hui besoin de mettre en place un modèle chez la souris. Ce modèle reposerait sur l’immunisation active de souris c57b6 et de souris c57b6 tPA ko (souris tPA NULL).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la création d'un modèle original permettant de comprendre les fonctions de ces auto anticorps et de leur impact sur l’hémostase.
Procédures
- quatre injections intrapéritoneales (duree 5 min chacune) - deux tests de saignement (30 min chacun)
Impact sur les animaux
Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite des injections. Nous pouvons néanmoins nous attendre à du stresse lors de la manipulation de la contention, d’où l’importance de réaliser une habituation préalablement. Une réponse à l'immunisation est attendu avec une augmentation modérée de la température de l'animal. Par ailleurs dans nos expérimentations précédentes, les animaux ayant subi une section de l'extrémité de la queue n'ont pas présenté de signe de douleur ni de souffrance.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin d'évaluer la présence des auto anticorps dans le sang et dans les différents organes. Par ailleurs les études sur l'activité et la quantité de tPA circulant nécessite la totalité du sang de l'animal.
Remplacement
Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 56 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques c57b6 WT et c57b6 tPA Null. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme. Les souris tPA WT et tPA Null utilisées dans cette étude seront commandées à l'age de 8 semaines, à la fin de l'expérimentation les animaux seront âgés donc de 16 semaines correspondant à un stade jeune adulte (4 mois). Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation.
Étude de la réponse immunitaire à l’infection, au cancer et aux immunothérapies dans les voies urinaires à l’aide de modèles de souris 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système urogénital
4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. La description des procédures reste très générale et le porteur reconnaît des douleurs d'infection et un risque d'obstruction urétérale par les tumeurs. Il justifie ce nombre élevé par la nécessité d'organes intacts et affirme n'avoir "aucune autre alternative pertinente".
Objectifs
Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.
Bénéfices attendus
Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.
Procédures
les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.
Impact sur les animaux
Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).
Réduction
Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.
Raffinement
Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).
Choix des espèces
Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles