Oncologie

Les souris dont la tumeur dépasse 1 500 à 2 000 mm3, se nécrose, ou qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées. 2 707 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever organes, sang et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la veine des cellules leucémiques prélevées sur des patients ou une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, puis deux prises de sang par semaine à la veine jugulaire sous anesthésie, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine. Le porteur écrit que la diminution de la tumeur chez la souris "présage" sa diminution chez l'humain lors des futurs essais cliniques.

Objectifs

Malgré les progrès permanents dans la compréhension des cancers et dans les traitements disponibles, de nombreux patients ne répondent pas aux traitements classiques ou rechutent après différentes périodes de rémission. L’objectif est de proposer de nouveaux traitements contre les cancers du poumon et les leucémies aigües myeloïdes. Le microenvironnement tumoral (MET) dans les cancers est aujourd’hui reconnu comme ayant un fort impact sur la résistance des cancers aux thérapies. Parmi les composantes cellulaires du MET, il y a les macrophages et les lymphocytes T (LT) auxquels nous nous intéressons plus particulièrement dans l’équipe. Les LT sont normalement capables d'éliminer les cellules tumorales et les macrophages associés aux tumeurs (TAM) sont capables d'aider la tumeur à grossir. Nous cherchons donc à activer les LT et désactiver les TAM au sein de la tumeur grâce à de nouvelles molécules plus efficaces et surtout plus spécifiques que celles déjà existantes. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser des traitements classiques et/ou de proposer de nouveaux traitements contre les cancers du poumon et les LAM.

Bénéfices attendus

L’inoculation des différentes molécules dans les modèles murins considérés permettra de réduire les masses tumorales et/ou d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques impliquées dans l’éradication de la tumeur. Le but est de mieux comprendre le développement tumoral, d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, ou de comprendre les mécanismes d'action de certains médicaments, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine. L'utilisation d'animaux permet d'appréhender tous ces mécanismes au niveau de la tumeur mais également au sein de son microenvironnement. A terme, la validation de certains médicaments conduiront à des essais cliniques chez l'homme. Les bénéfices attendus sont une meilleure prise en charge de l'évolution de la tumeur, donc une diminution de la tumeur sous l'effet des molécules thérapeutiques utilisées dans ce projet. La diminution de la tumeur chez la souris présage donc une diminution de la tumeur chez l'humain lorsque que ces mêmes molécules seront testées en essais cliniques.

Procédures

Afin que la souris développe une LAM (leucémie aigue myéloïde) humaine, après anesthésie, les cellules primaires de patients seront injectées très doucement par voie intraveineuse dans la veine caudale. La prise de la maladie sera suivie par 2 prélèvements sanguins par semaine à la veine jugulaire pour minimiser l'impact sur les animaux quiauront été anesthésiés au préalable. La mise en place du modèle de cancer de poumon sera faite par injection en sous-cutané dans le flan des animaux des cellules tumorales. Afin de suivre les cellules greffées nous injecterons une molécule fluorescente spécifique des cellules ciblées par voie intraveineuse dans la queue de l'anima, l'animal sera ensuite anesthésié et observé en imagerie non invasine. Afin d'éliminer de manière totale les cellules tumorales, des molécules de thérapie ciblée seront injectées par voie intraveineuse (veine caudale) ou en intrapéritonéal.Les animaux seront surveillé pour leur bien-être, la tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Les animaux ne subiront pas de chirurgie. La durée de chaque intervention (acte expérimental) est d'environ 3 minutes pour chaque souris.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales peut avoir un impact sur les animaux: une injection en sous-cutané pourra conduire à une croissance tumorale importante, à une légère perte de poids. Les animaux peuvent être stressés par le prélèvement sanguin au niveau de la veine jugulaire. L'injection de molécules en intrapéritonéal ou en intraveineux peut engendrer un léger stress (poils légèrement hérissés).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes, le sang et les tumeurs afin d'étudier l'impact du traitement appliqué.

Remplacement

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées par observation en imagerie in vivo non invasive dans la mesure du possible. Ainsi, nous remplacerons dans la mesure du possible les mesures invasives par de l'imagerie, permettant de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Le recours à l'expérimentation animale pour nos projets est essentiel car elle nous permet de prendre en compte le microenvironement tumoral de la tumeur qui intervient d'une manière très importante dans les mécanimes que nous étudions et notamment ceux reliés à l'immunothérapie qui est basée sur le système imunitaire dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d’animaux sera de 6 animaux maximum par groupe. Dans le cas d'une étude d'efficacité de thérapies anti-cancéreuses, il s'agira de distinguer les groupes d’animaux recevant la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence. Nous respecterons ainsi la règle des 3R. Le nombre de 6 animaux à été déterminé afin d'avoir des tests statistiques fiables. Afin de réduire le nombre d'animaux, les doses de molécules thérapeutiques à utiliser seront préalablement définies grâce a des expériences in vitro notamment avec des modèles 3D (sphéroides) que nous avons mis en place au laboratoire.

Raffinement

Les manipulations des animaux sont effectuées en environnement stérile. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Pour l'analyse des animaux à l'IVIS (In Vivo Imaging System), les animaux seront anesthésiés. Les animaux, quelque soit le mode d'injection, seront observés tous les jours afin d’évaluer leur état général. Tout animal présentant une souffrance ou une détresse sera euthanasié par élongation cervicale. Pour cela, le comportement général de l’animal sera observé (posture, réaction à un stimulus externe tel que le bruit, manque d’appétit, hérissement des poils) et des mesures seront réalisées (poids, taille de la tumeur). Si l’animal perd plus de 15% de poids ou si la taille de la tumeur correspond à une prise de charge tumorale supérieure à 10% (volume max: 1500-2000 mm3) ou si la tumeur est nécrosée (score 2: >-50%), l’animal sera euthanasié . Les personnes en charge du projet ont été formés aux gestes qu'ils vont mettre en oeuvre.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et sont devenus les modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’Homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisés en clinique. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes.

1 018 souris vont être utilisées, chacune recevant une greffe de cellules tumorales sous la peau puis jusqu'à dix injections de composés, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus et des organes. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. L'abdomen est irradié sous anesthésie gazeuse pendant un quart d'heure, ce qui provoque selon le porteur une toxicité et une perte de poids modérée dans les jours suivants, les tumeurs entraînant une gêne et un inconfort qualifiés de modérés. Le projet vise d'abord à installer chez la souris un modèle de chute des lymphocytes après radiothérapie, l'espoir d'un traitement pour les patients étant placé "à plus long terme" et suspendu à d'éventuels essais cliniques.

Objectifs

La radiothérapie fait partie du traitement de près de 60% des patients atteints de cancer, que ce soit dans le cadre d’un traitement ou à des fins palliatives. Un des mécanismes d’action de la radiothérapie est l’induction de dommages létaux au niveau de l’ADN des cellules, et notamment des cellules tumorales. La radiothérapie est délivrée principalement par des accélérateurs externes et les rayons, pour atteindre la tumeur, traversent également des tissus sains et touchent des vaisseaux sanguins. Les lymphocytes sont des cellules très radiosensibles. Un des effets secondaires majeurs de la radiothérapie réside dans la survenue d’une lymphopénie. Il s’agit d’une baisse drastique du taux de lymphocytes après le début du traitement par radiothérapie. La lymphopénie radio-induite (RIL) est un phénomène transitoire qui dure généralement jusqu’entre 3 et 9 mois après la fin du traitement par radiothérapie. Elle peut persister parfois pendant des années après le traitement. La sévérité comme la durée de la lymphopénie radio-induite ont été corrélées à une plus mauvaise survie globale chez les patients traités par radiothérapie. Ce phénomène est encore mal compris. Nous savons aujourd’hui que les lymphocytes sont des acteurs majeurs de la réponse anti-tumorale et cette chute du taux de lymphocytes pourrait concourir à une mauvaise réponse anti-tumorale. Notre projet vise à établir un modèle de lymphopénie radio-induite chez la souris pour avoir un modèle sur lequel tester de nouveaux composés pouvant éventuellement réduire ou abroger cette lymphopénie.

Bénéfices attendus

La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. 50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. La lymphopénie radio-induite est un effet secondaire majeur de la radiothérapie. Il est actuellement reconnu que les lymphocytes sont essentiels dans la réponse anti-tumorale. De plus, il a été montré que les patients qui subissent cet effet secondaire ont une plus faible chance de survie. Réduire la durée ou la sévérité de la lymphopénie pourrait éventuellement permettre d’améliorer l’efficacité antitumorale du traitement par radiothérapie et d’augmenter les chances de survie des patients traités par radiothérapie. La mise en place d’un modèle préclinique de lymphopénie radio-induite permettra d’obtenir des connaissances sur ce phénomène encore assez peu exploré et permettra de tester si certains composés peuvent réduire ou atténuer cette lymphopénie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender le phénomène de lymphopénie radio-induite mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de nouvelles combinaisons thérapeutiques lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Une injection de cellules tumorales en sous-cutané sera réalisée chez tous les animaux, durée 10 secondes, sous anesthésie locale. L’injection des composés se fera par injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineux (une à 10 injections selon les composés), durée 10 secondes, sous anesthésie locale. Les souris seront anesthésiées pendant l’irradiation (maximum 15 minutes), une fois. Les prélèvements de sang sur les souris seront réalisés sous anesthésie générale, n=3, durée 3 minutes..

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée de l’abdomen. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse (maximum 15 minutes). Cela peut générer du stress et de l’anxiété. Par contre, l’irradiation en elle-même est indolore. Elle peut induire de la toxicité qui va se traduire par une perte de poids modérée dans les jours suivants l’irradiation.L’administration des composés par voie intrapéritonéale ou sous-cutané ou intravein eux peut engendrer de la douleur et un stress léger et transitoire (mais les injections seront faites sous anesthésie locale). L’administration des composés per os peut engendrer du stress léger et de courte durée. Les tumeurs peuvent entraîner une gêne et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales aux fins d'analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Il a clairement été mis en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternative permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité. De même, il n'existe pas de sytème permettant de reproduire les interactions entre les éléments du sang, les cytokines, la tumeur et le sytème immunitaire dans sa globalité. La phénomène de la lymphopénie n'a pour l'instant pas pû être modélisé in vitro ou in silico.is

Réduction

Une analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives au niveau du taux de lymphocytes dans le sang au cours du temps. L’analyse des différences de taux de lymphocytes se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections un anesthésique local sera appliqué sur la peau avant chaque injection. L’irradiation sera réalisée sous anesthésie générale pour réduire le stress induit. Les prélèvements de sang seront réalisés par une personne entraînée qui effectue déjà ce geste depuis longtemps au sein du laboratoire pour réduire le temps et le stress induit, sous anesthésie locale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids. Du Diet Gel Hi Energy pourra être introduit en cas de perte de poids). De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines, jeunes adultes, ce qui correspond au meilleur âge pour les greffes et à la population de patients visées.

Greffées de deux tumeurs, injectées trois fois d'un immunomodulateur puis irradiées un quart d'heure sous contention, vigiles, 1 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever le sang et les tumeurs. Le projet cherche à savoir si cet immunomodulateur amplifie l'effet dit abscopal de la radiothérapie sur des métastases situées hors du champ d'irradiation, la retombée pour les patients étant renvoyée au long terme et à d'éventuels essais cliniques. Le porteur reconnaît que la tumeur, en grossissant ou en se nécrosant, peut faire souffrir la souris et gêner ses déplacements, et annonce des points limites "précoces" appliqués strictement, sans dire lesquels.

Objectifs

Notre projet consiste à évaluer l’impact de l’addition d’un immunomodulateur à un traitement par radiothérapie dans le cas de cancers multi-site. Cette voie de recherche est intéressante à explorer. En effet, elle peut contribuer à améliorer de façon significative l’efficacité des radiations ionisantes, sachant qu’aujourd’hui un traitement de radiothérapie est indiqué chez plus de la moitié des patients atteints d’un cancer. De plus, il a été montré que l’irradiation d’une tumeur pouvait engendrer des effets sur des métastases situées hors du champ d’irradiation. Cet effet, nommé « effet abscopal » provient du système immunitaire et serait très intéressant à amplifier grâce à des combinaisons thérapeutiques. Par ailleurs, des combinaisons thérapeutiques combinant irradiation et d’autres immunomodulateurs ont déjà montrées des effets en clinique soulignant le potentiel et l’intérêt de telles combinaison. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire de l’hôte. Suite à l’irradiation, la réponse interféron-gamma puis la sécrétion de cytokines et de médiateurs vont favoriser l’infiltration de cellules immunitaires pro tumorale ou anti tumorales par vagues successives. Certaines réactions vont promouvoir l’effet antitumoral, tandis que d’autres, comme l’infiltration intratumorale radio-induite des lymphocytes T régulateurs vont freiner l’efficacité de la radiothérapie. Ces cellules ont normalement pour rôle de réprimer les réponses immunitaires anormales ou excessives envers des antigènes du soi ou du non-soi pour maintenir l’homéostasie immunitaire. Dans les cancers, elles sont impliquées dans le développement et la progression tumorale car elles inhibent l’immunité antitumorale. Le but de notre projet est de combiner une molécule permettant d’éliminer ces cellules avec la radiothérapie et de voir si cela peut améliorer l’efficacité de la radiothérapie et/ou l’effet abscopal induit par l’irradiation. Il a également été montré que cette nouvelle molécule augmentait l’efficacité de certains traitements dans des modèles résistants . Nous testerons donc dans un second temps le triple traitement avec radiothérapie.

Bénéfices attendus

La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. 50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de miniiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostique de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet abscopal induit par l’irradiation qui est médié par le système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Deux injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, une fois, durée 1 minute, sous anesthésie locale. L’injection des médicaments durera 10 secondes, sous anesthésie locale (3 administrations au total pour chaque immunomodulateur, une injection tous les 4 jours). Les souris vigiles seront mises dans un système de contention pendant l’irradiation (maximum 15 minutes, une irradiation). Le prélèvement de sang sur les souris dédiées sera réalisé sous anesthésie générale, durée 2 minutes.

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée de tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété, légers et transitoires. Par contre, l’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée, elle induit pas une perte de poids modérée et transitoire. L’administration des immonumodulateurs par voie intrapéritonéale peut engendrer de la douleur (un spray contenant de la lidocaïne sera appliquée avant chaque injection intrapéritonéale). La tumeur quand elle grossit ou quand elle commence à nécroser peut gêner la souris (douleur, difficulté à se déplacer,…). Les souris seront sacrifiées aux points limites pour éviter cela. Pour les prélèvements, les souris seront d’abord anesthésiées pour prélever le sang ce qui peut générer du stress mais ces souris seront sacrifiées juste après le prélèvement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures.

Remplacement

Il a clairement été mise en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternatives permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité.

Réduction

Une analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour détecter des différences significatives de croissance tumorale . L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité du traitement triple combinaison radothérapie avec des immunomodulateurs par rapport aux doubles combinaisons.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections en sous-cutanée et en intrapéritonéale, un anesthésique local sur la peau avant chaque injection. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà ce geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Du Diet Gel Hi Energy pourra être introduit en cas de perte de poids). De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines, jeunes adultes, ce qui correspond au meilleur âge pour les greffes et à la population de patients visées.

Irradiées, puis greffées sous anesthésie avec des cellules souches sanguines de souris ou humaines, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour que soit quantifiée la proportion de cellules greffées dans leur moelle et leur sang, chacune ayant subi jusqu'à trois prises de sang au cours de sa vie. Le projet vise à améliorer des protocoles de thérapie génique destinés à la drépanocytose et à la bêta-thalassémie, en testant des gènes thérapeutiques, de sélection, "suicides" ou activateurs de prolifération. Le porteur écrit que l'irradiation non létale n'est pas censée provoquer de douleur, et décrit par ailleurs une irradiation létale des souris immunocompétentes dont seule la greffe assure la survie.

Objectifs

Au laboratoire nous développons de nouveaux vecteurs thérapeutiques permettant de modifier plus efficacement les cellules souches sanguines pour optimiser les conditions de culture, de modification et de sélection des cellules « corrigées » qui seront injectées, afin d’améliorer les protocoles de thérapie génique chez l’humain dans le cadre de maladies génétiques. L’objectif de ce projet consiste à étudier l’effet de gènes thérapeutiques, de gènes de sélection, de gènes « suicides » ou de gènes activateurs de la prolifération cellulaire ayant un effet sur le processus physiopathologique des maladies de l’hémoglobine telles que la béta-thalassémie et la drépanocytose. Pour cela nous devons réaliser des études précliniques de transplantation dans des modèles murins de deux maladies (la drépanocytose et la béta-thalassémie), ainsi que dans un modèle murin immunodéficient (n’ayant pas de système immunitaire) qui permet la prise de greffe de cellules souches sanguines humaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’amélioration des protocoles de correction (des cellule souches sanguines défectueuses) et de transplantation des cellules souches sanguines corrigées pour des thérapies géniques qui pourront être appliqués à l’humain dans le cadre de maladies de l’hémoglobine ou de greffes de cellules souches sanguines.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe de cellules souches hématopoïétiques/sanguines (soit 3 min environ pour les souris immunodéficientes et 2 fois 5 min environ pour les souris immunocompétentes). Les animaux seront également transplantés avec des cellules souches hématopoïétiques/sanguines murines ou humaines. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin une fois par mois et trois fois maximun durant la vie de l’animal. Ce geste ne dure que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) ont un risque de développer des infections diverses en lien avec des pathogènes (virus, bactéries). L’irradiation non létale de ces souris n’est pas censée provoquer de douleur ou d’altération majeure de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rares cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limitée au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique. L’irradiation létale des souris immunocompétentes nécessite une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour assurer leur survie. Suite à l’irradiation, une perte de poids peut être observée mais elle est transitoire (une semaine environ). Les prélèvements sanguins peuvent générer du stress dû à la contention de l’animal ainsi qu’une légère et brève douleur au niveau de l’œil.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier la proportion de cellules souches sanguines murines ou humaines présentes dans la moelle et le sang des souris et de les caractériser.

Remplacement

La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines/hématopoïétiques (CSHs) est un phénomène complexe pour lequel il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer les processus physiologiques de guidage, d’implantation, de survie et de différenciation de ces cellules. La transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs cultivées et modifiées par des vecteurs thérapeutiques à se loger au niveau de la moelle osseuse et reconstituer l’hématopoïèse (processus physiologique de production des cellules sanguines) à long terme. Par ailleurs il n’existe pas de protocole in vitro permettant de différencier les cellules érythroïdes humaines ou murines en globules rouges parfaitement matures. Les souris sont donc utilisées à la fois pour déterminer si des CSHs ont été génétiquement modifiées par les vecteurs de transfert de gènes mais également à terme, par l’étude de l’effet des vecteurs de thérapie génique sur la fonction des globules rouges.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des conditions de culture et/ou protocoles de modification des cellules dans des systèmes de culture in vitro afin de vérifier qu’ils ne génèrent pas de toxicité cellulaire. Le recours à l’animal est ensuite indispensable à l’étude de l’effet des procédures de culture sur la capacité des cellules à reconstituer le système hématopoïétique (de production de toutes les cellules sanguines). Notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines dans le modèle murin ainsi que les résultats de la littérature nous indiquent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe est de 6 animaux pour rendre des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau en bouteille du commerce et qui est stérilisée. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants aseptisées à l'alcool. Les cages des animaux disposent de cotons (enrichissement) qui ont été au préalable stérilisés. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, la greffe de cellules souches sanguines sera réalisée sous anesthésie grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Durant les 15 jours suivant la greffe cellulaire les souris seront examinées par le porteur du projet 3 fois par semaine et une grille de suivi sera remplie en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu. Des points limites ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Afin d’éviter toute infection, les souris seront traitées par antibiothérapie durant ces 30 jours. Au bout d’un mois, les souris seront observées par le porteur de projet une fois par semaine en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de cellules souches sanguines. Le projet porte sur quatre lignées murines. Deux lignées sont utilisées comme modèles de pathologies humaines du globule rouge, dans le cadre d’expériences de thérapie génique. Une lignée est utilisée comme lignée receveuse de transplantations effectuées à partir de cellules souches sanguines murines. Une autre lignée de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules souches sanguines humaines qui sont capables de reconstituer le système sanguin. Ce système de greffe permet l’étude de l’efficacité de vecteurs de thérapie géniques sur les cellules souches sanguines humaines provenant de donneurs sains ou de patients atteints de drépanocytose ou de béta-thalassémie. Dans ce projet les animaux sont utilisés à l’âge de 10-12 semaines, moment où la prise de greffe est optimale.

7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant passer jusqu'à 96 heures seule en cage à métabolisme. Après une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc ou de l'omoplate, elles reçoivent des molécules radiomarquées, avant deux prélèvements de sang derrière l'œil et une saignée terminale par ponction cardiaque. Le porteur décrit un projet répétitif, mené selon un même schéma pour les entreprises clientes, dont il retient les composés qui passeront ensuite en études d'efficacité. Le nombre d'animaux par groupe est fixé par le client, à quatre souris aux tumeurs jugées homogènes et exploitables, ce qui laisse sans explication l'effectif total de 7 200.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en oncologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapeutiques innovantes et évaluer leur efficacité. Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit dans un but diagnostic ou thérapeutique. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un isotope radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour objectif l’étude pharmacologique d'une sélection de candidats médicaments. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée, le modèle tumoral sous cutanée utilisé, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de la greffe des tumeurs sous cutanées puis par l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un isotope radioactif non toxique aux doses utilisées afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus dont le tissu tumoral et les fluides biologiques d’intérêt. Les candidats médicaments ont été testés au préalable chez nos clients et sont connus pour ne pas présenter d’effets délétères. Ce sont des protéines, des peptides et/ou des anticorps dilués dans des tampons respectant la physiologie de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la distribution tissulaire des composés thérapeutiques de nos clients dans l’organisme (tissus cibles, notamment tumeurs et organes non-cibles où ils pourraient s’accumuler de manière non désirée) et ainsi de sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) Sur animal anesthésié : Tonte de l’omoplate en vue de la greffe (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (omoplate) (1 injection, 15 s) ; Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (2 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) ; hébergement individuel en cage à métabolisme (maximum 1 fois pendant 96 heures maximum)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous cutanées ; Stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiomarquées en sous cutanée, gavage oral, voie intra péritonéale, intramusculaire ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; stress modéré lors du placement en cage à métabolisme.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur en cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal ; Fin de l’étude

Remplacement

Les canddats médicaments de nos clients ont fait l’objet d’études d’efficacité préliminaires in vitro et/ou in vivo au préalable. Néanmoins, évaluer la distribution tissulaire et l’accumulation d’un composé thérapeutique dans un organisme vivant implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité finale dépendra entre autres de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement, ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé par groupe est déterminé par le client par des méthodes classiques statistiques en fonction des résultats préalables qu'il a obtenus avec le modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs). Ce nombre est réduit au minimum afin d’avoir 4 animaux par groupe dont les tumeurs seront homogènes et exploitables. En effet, la méthode de quantification par mesure radioactive est très précise et répétable. Néanmoins, dans certains cas et lorsque c’est possible, ce nombre pourra être diminué.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 à 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser la distribution de candidats médicaments variés. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Deux chirurgies d'implantation de pastilles à diffusion lente, six prises de sang à la queue et trois épreuves de gavage au glucose suivies d'insuline : 48 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont toutes tuées à la fin, pour prélever les organes destinés aux analyses lipidiques, protéiques et d'expression génique. L'objectif déclaré est de savoir si bloquer une protéine du stress cellulaire, le translocon, limite le diabète et le foie gras associés à l'obésité. Le porteur retient la souris comme modèle intégré, seul moyen selon lui d'observer les communications entre organes, et fait débuter le régime gras à huit semaines d'âge pour écarter les effets du développement.

Objectifs

Le but de notre projet est de déterminer l’implication d’une protéine connue pour être jouer un rôle dans le stress cellulaire, le tranlocon, dans la dysfonction du tissu adipeux, un évènement se déroulant au cours de l’obésité et qui est central dans l’apparition des complications de l’obésité (diabète, maladies cardiovasculaires, foie gras). A l’aide de souries rendues obèses avec un régime gras et qui présentent une dysfonction adipocytaire, nous allons déterminer si l’inhibition du translocon avec un inhibiteur pharmacologique améliore la bonne santé du tissu adipeux et limite les complications de l’obésité (diabète et foie gras). Notre approche va nous permettre d’éclairer les mécanismes conduisant aux complications métaboliques de l’obésité et de développer des stratégies thérapeutiques afin d’en limiter les conséquences.

Bénéfices attendus

Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux complications métaboliques de l’obésité, la dysfonction adipocytaire qui est un mécanisme physiopathologique clé du développement de ces complications a été largement étudiée dans une multitude de contextes. Cependant, les mécanismes initiateurs de la dysfonction adipocytaires demeurent encore mal connus. Le rôle du translocon dans cette dysfonction n’a, a notre connaissance, jamais été étudiée à ce jour. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer. Nos résultats préliminaires obtenus dans des modèles cellulaires montrent que le translocon induit l’augmentation de marqueurs de la dysfonction adipocytaire. A court terme, ce projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeux et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler l’activité du translocon pharmacologiquement ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer les complications métaboliques chez les patients obèses.

Procédures

Dans ce projet, les animaux subissent deux procédures chirurgicales pour implanter et renouveler au bout de trois mois des pastilles permettant de délivrer l’inhibiteur pharmacologique ou le placébo. Tous les mois, à six reprises au cours de cette période, du sang sera prélevé en vigil au niveau de l’extrémité de la queue. Tous les deux mois, à trois reprises au cours de cette période et a une semaine d'intervalle, du glucose sera administré par gavage et de l'insuline en intrapéritonéale, puis du sang sera prélevé au niveau de l’extrémité de la queue, le tout sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : sédentarité due au régime obésogène, potentielle sensibilité au niveau des point de délivrance (injection intrapéritonéale, gavage oral) ou de prélèvements (sang à la veine caudale) (qui devrait être très limité au regard de la fréquence espacée dans le temps).

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'intérêt pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.

Remplacement

Le projet global dans lequel la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des adipocytes en culture. Ce modèle cellulaire permet de remplacer les modèles animaux dans l’affinage de la détermination du rôle du translocon dans la dysfonction adipocytaire. L’utilisation de modèle animal reste indispensable car il permet d’étudier une pathologie qui résulte d’une communication interorgane ne pouvant être étudié que dans un modèle intégré.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 48 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous avons précédemment défini la cinétique de la mise en place de la dysfonction adipocytaire chez les souris nourries avec un régime gras et donc de déterminer le temps traitement le plus approprié et de réduire le nombre d’animaux et le temps de l’expérimentation.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal, la définition de points limites adaptés (signes cliniques notables ou spécifiques) couplé à un examen clinique quotidien des animaux par du personnel formé permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées en prêtant une attention particulière à la délivrance de l’inhibiteur pharmacologique (utilisation de pastilles à diffusion lente pour éviter toute injection quotidienne) et à la délivrance d’anesthétiques et d’antalgiques. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et un tube tunnel en polycarbonate ) et les animaux sont hébergés en groupes sociaux.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques utilisés (obésité, diabète de type 2 et hépatopathie dysmétabolique pour ce projet) ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (conséquence systémiques d’une dysfonction adipocytaire à l’origine des complications de type diabétique et hépatique en ce qui concerne ce projet). Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiaques associées aux dérégulations métaboliques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires importants pour mieux comprendre les effets bénéfiques de l’inhibition du translocon. Pour tous les animaux débuterons l’administration de l’inhibiteur et du régime à 8 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de cette inhibition au cours du développement de l’organisme.

Anesthésiées pour une chirurgie de quarante minutes qui interrompt la circulation dans l'artère fémorale d'une patte, 1 380 souris passent ensuite par cinq à six imageries laser doppler et cinq imageries isotopiques pouvant durer deux heures, étalées sur 21 jours. Une partie reçoit en plus des injections abdominales ou des gavages, jusqu'à deux fois par jour pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur énumère les atteintes possibles : douleur, œdème douloureux du membre, infections, incapacité à se servir de la patte, irritations de l'œsophage liées au gavage. Celles qui vont au bout sont tuées pour prélever leurs tissus, et 88 souris qui n'auront pas perdu la vascularisation de leur patte pourront être réutilisées dans un autre projet.

Objectifs

La maladie artérielle périphérique (MAP) se définit comme un blocage partiel ou total d’une artère causé par une accumulation de lipides dans la paroi des vaisseaux artériels se situant en périphérie de l’aorte. Elle est généralement provoquée par un durcissement des artères (athérosclérose). La MAP représente un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Malgré les progrès réalisés dans la prévention des facteurs de risque (tabac, diabète, obésité…) et dans les techniques interventionnelles et chirurgicales (pontage, stents…) pour améliorer la perfusion des membres inférieurs, une partie importante des patients atteints sont considérés comme « non répondeurs » pour la revascularisation et ont un pronostic particulièrement défavorable avec des taux élevés de mortalité et d’amputation des membres. En conséquence, l’identification de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter cette complication invalidante est d’un intérêt critique. Le but de ce projet est d’évaluer soit de nouveaux radiotraceurs qui permettraient un meilleur suivi ou détection des processus de réperfusion (recrutement des petits vaisceaux autour ou créations de nouveaux vaisseaux permettant la revascularisation du membre inférieur), soit d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats-médicaments sur un modèle murin d’ischémie de la patte par arrêt de la circulation dans l'artère fémorale de la patte.

Bénéfices attendus

Le diagnostic et le traitement précoces, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à améliorer la qualité de vie des patients en réduisant les symptômes associés et en augmentant l’efficacité des traitements. L’utilisation de nouveaux traceurs permet de détecter le site d’ischémie et facilite la prise en charge rapide des traitements, en augmentant les chances de bon pronostic des patients. Les traceurs développés grâce à la recherche en imagerie médicale offrent une précision supérieure dans la détection du site ischémique. Cela permet aux médecins de cibler plus précisément les zones affectées, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains environnants.

Procédures

Les animaux auront : une chirurgie (1 fois, durée 40 minutes max, sous anesthésie générale), des imageries laser doppler (5 à 6 fois sur 21 jours, durée :5 min ; sous anesthésie général), des imageries isotopiques (5 fois sur 21 jours, durée maximum 2h ; sous anesthésie). Une partie des animaux auront également des injections de médicaments soit par injections abdominal soit par gavage (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours , durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min).

Impact sur les animaux

Pendant les procédures décrites dans cette saisine, les animaux sont passibles d’expérimenter ce qui suit : • Douleur et inconfort : la chirurgie pourra provoquer une douleur due au manque d'oxygène et de nutriments dans les tissus affectés. Cela peut aussi entraîner une diminution de l'appétit chez l'animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entrainer un stress dû aux contentions répétées de l’animal ainsi que des irritations de l’œsophage et des problèmes de déglutition dans les cas des gavages. Les traitements répétés par injections peuvent entrainer des petites plaies cutanées. • Problèmes circulatoires et œdème : le manque de circulation peut entraîner une accumulation de liquide dans les tissus, provoquant un gonflement douloureux et une altération de la fonction des membres affectés. • Infections : en raison de la chirurgie, les tissus ischémiques sont plus sujets aux infections en raison de la réduction de l'apport sanguin et de la réponse immunitaire locale ; ça peut entrainer aussi une dégradation de la peau et du pelage dans le cas des infections cutanées. • Difficulté de locomotion : les animaux dont la patte n'est plus correctement vascularisé peuvent présenter une difficulté ou une incapacité à utiliser leur patte. Cela peut réduire leur capacité à se déplacer librement ou à chercher de la nourriture. • Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps.

Devenir

Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort de afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations ex vivo et in vitro. Les animaux qui n'auront pas développé de perte de la vascularisation de la patte et qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisé dans un autre projet.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent l’utilisation de modèle complexe. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative in vitro ou in sillico qui permet d'avoir une vision complète des grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’Homme. L’ensemble des candidats radiotraceur et des candidats médicament, qui seront testés dans ce projet, auront été préalablement évalués pas des études in vitro pour leur ciblage spécifique et leur efficacité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé aux maximums tout en assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé les effectifs à l’aide d'un logiciel de statistique G*Power. Pour l’évaluation de nouveaux traceur radioactif, le marquage spécifique dans la patte avec le blocage artériel sera comparé avec la patte en controlatérale (saine), chaque animal sera donc son propre contrôle. Pour la partie sur le développement de nouveaux candidat médicament, nous réaliseront sur 5 groupes distincts une série de 5 mesures répétées sur les mêmes animaux grâce aux imageries in vivo permettant de visualiser les traceur radioactif et permettant de faire des études longitudinales. Nous analyserons les données à l'aide de tests statistiques multiparamétriques.

Raffinement

Les chirurgies, les injections par voie veineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et générale par injection sous cutanée de morphinique . Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post- opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Les périodes de traitements sur animaux vigiles seront précédées d’une semaine d’habituation à la contention pour diminuer le stress lors des expérimentations. Les gavages se feront avec sonde de nutrition vétérinaire adaptée aux souris. L’embout est arrondi pour ne pas endommager les parois de l’œsophage et de l’estomac et l’on attend que la souris avale le bout de la sonde (sans forcer) pour éviter les fausses routes. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement classiques ; animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12 h ; seront enrichies en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de bâtons ou boules en bois pour faire les dents, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le modèle d'ischémie des membres inférieurs chez la souris est bien documenté et a fait l'objet de plusieurs publications dans notre équipe. Notre modèle d’ischémie des membres inférieurs se fait chez le jeune adulte. Les animaux arriveront dans l’animalerie à 6 semaines (poids compris entre 25 et 35 g en fonction du sexe) et la chirurgie sera faite dans leur 8e semaine (poids compris entre 27 et 40 g). À la fin du protocole, les souris devraient peser entre 28 et 45 g.

Injectées à trois à six reprises avec de la doxorubicine ou son véhicule, puis anesthésiées pour deux échographies cardiaques de vingt minutes, 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. 1 080 d'entre elles reçoivent en plus une greffe de cellules tumorales sous la peau, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le projet cherche à savoir si des gènes de la réponse immunitaire protègent le cœur des effets de cette chimiothérapie, dont la cardiomyopathie touche 29 % des patients dans les cinq premières années. Le porteur qualifie la cardiotoxicité induite d'asymptomatique, avec des altérations transitoires, tout en décrivant des tumeurs pouvant se nécroser, s'ulcérer ou saigner et, plus rarement, une tachycardie, une fibrillation ventriculaire et une insuffisance cardiaque aiguë.

Objectifs

La doxorubicine est un médicament anti-cancer puissant et largement utilisé pour le traitement de différents types de carcinome chez l’homme. Toutefois, il est connu qu'il peut provoquer des effets secondaires graves, parmi lesquels le développement d’une cardiomyopathie. Bien que plusieurs modèles aient été proposés pour expliquer ce phénomène singulier de toxicité cardiaque, il n'a pas encore été possible d'identifier un mécanisme moléculaire spécifique afin de développer une stratégie pharmacologique cardio-protectrice. L'objectif de ce projet est d'évaluer si nos gènes d’intêret, impliqués dans la réponse immunitaire, jouent un rôle protectif au niveau cardiaque lors d’un traitement à la doxorubicine. L’étude de ces gènes dans ce contexte permettra la mise en place d’une stratégie cardio-protectrice.

Bénéfices attendus

La doxorubicine peut provoquer des effets secondaires graves. Parmi ceux-ci, le développement de la cardiomyopathie est parmi les plus courants, affectant 29 pour cent des patients au cours des cinq premières années de traitement. Ce projet vise à identifier les mécanismes impliqués dans le développement des effets cardiotoxiques observés, afin d’améliorer la prise en charge des patients traités avec la doxorubicine. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des bases pour le développement de stratégies cardioprotectrices ciblées pour les patients atteints de cancer et traités avec doxorubicine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à: (i) l'injection de traitements intrapéritonéaux par contention de l'animal vigile (un minimum de 3 fois à un maximum de 6 fois au total/animal, 2 min/animal); (ii) 2 échographies cardiaques (20 min/animal) sur l'animal anesthésié par anesthésie gazeuse. 1080 animaux seront soumis à : (i) l’injection de cellules tumorales en sous cutané (1 fois, 5 min/animal) sur l’animal anesthésié par anesthésie gazeuse ; (ii) un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine (5 min/animal). 360 animaux vigiles seront soumis à 2 prélèvements sanguins (4min/animal)

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations peuvent entrainer du stress chez l’animal. La chimiothérapie et la croissance tumorale peuvent induire une perte de poids et de la diarrhée. Les tumeurs peuvent se nécroser et/ou ulcérer et/ou saigner. Les sites d’injections ainsi que les sites des prélèvements sanguins peuvent s’infecter. La cardiotoxicité qui est induite dans ce protocole est asymptomatique avec des altérations transitoires de la fonction systolique et des arythmies. Des manifestations symptomatiques graves mais rares (moins d’un pour cent) peuvent apparaître sous la forme d'une tachycardie et fibrillation ventriculaire, et d'une insuffisance cardiaque aigüe. Les risques liés à l’anesthésie peuvent être : l’hypothermie, difficultés de réveil et respiratoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaires pour répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Nous développons un maximum d’approches in vitro (développement de tumoroides et expériences in vitro avec coltures cellulaires humaines et murines ; mesures de paramètres biochimiques sur du sang de patients, extraction de cellules mononuclées du sang périphérique pour mise en culture puis stimulation/inhibition) dans le but de répondre à l’ensemble des questions posées dans notre projet de recherche. De plus, des études retrospectives sur coohortes de patients sont en cours. Toutefois, l’étude de la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie rend l’étude in vivo indispensable, car il n’est pas possible d’étudier la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie seulement dans des systèmes in vitro ou ex vivo à cause de sa complexité.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 1440 souris transgéniques ou normales pour permettre d’étudier le rôle de nos gènes d’interet dans le cadre de la cardiotoxicité en réponse à la chimiothérapie et ce dans le respect du bien-être animal. Les modèles choisis sont très bien documentés dans la littérature et les protocoles solidement établis au sein de notre laboratoire, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur comportement et leur bien-être. Pour l’injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée et lors des échographies, les souris seront anesthésiées (anesthésie gazeuse). La mise en place d’un suivi des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par differentes raisons : - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis.