Oncologie

Des composants de paroi bactérienne administrés dans les voies aériennes provoquent chez les souris un bronchospasme et une chute de température pendant cinq à huit heures. 880 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par exsanguination intracardiaque sous anesthésie, plus de 60 % du volume sanguin étant prélevé. Elles reçoivent les candidats médicaments une à deux fois par jour pendant un à trois jours et subissent jusqu'à cinq prélèvements de sang à la queue. Le chiffre de 880 correspond à 20 candidats médicaments évalués sur cinq ans "selon l'hypothèse la plus défavorable", sans que le RNT précise de quelles molécules ni de quel commanditaire il s'agit.

Objectifs

Les lésions pulmonaires aigues surviennent chez les patients atteint d’une pneumonie et est l’une des causes de décès les plus fréquentes au monde. Une inflammation excessive en réponse à l’infection provoque une atteinte sévère des poumons (lésions vasculaires et bronchiques), qui peut se manifester sous forme d’un syndrome de détresse respiratoire identifié comme une dyspnée, habituellement accompagnée d’une respiration accélérée et superficielle. Des traitements préventifs et curatifs contre les origines des pneumonies (bactérienne, virale, fongiques…) sont disponibles, de même que des soins palliatifs (ventilation mécanique, oxygène) mais il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement permettant de promouvoir une résolution efficace et rapide de l’inflammation dans le but de limiter les atteintes et le remodelage du tissu pulmonaire. Les anti-inflammatoires disponibles actuellement ont pour la plupart des effets immunosuppresseurs qui présentent un danger pour le traitement de l’infection. Il apparaît donc nécessaire de mettre au point des traitements capables de maintenir une immunité spécifique active tout en favorisant un contrôle local et une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires. Notre objectif est d’évaluer l’activité de produits pharmacologiques en cours de développement, candidats-médicaments, dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë induit par l’administration dans les voies aériennes de composants de la paroi bactérienne (lipopolysaccharides) chez la souris.

Bénéfices attendus

La mesure de l'activité de composé pharmacologique dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë (ALI) permettra de sélectionner les plus efficaces, capables de contrôler l’inflammation locale et promouvoir une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires sans perturber l’immunité spécifique. Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients atteint de pneumonie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour d'administrer les candidat-médicaments étudiés. Ces composés pourront être administrées sur animaux vigiles ou sur animaux anesthésiés (anesthésie de quelques minutes). Les candidats-médicaments pourront être administré de 1 à 3 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour. Les traitements 2x/jour et/ou de longue durée ne seront effectués qu’avec des voies d’administration qui le permettent. Afin de suivre les paramètres inflammatoires (cellules, cytokines…) au cours du temps, un maximum de 5 micro-prélèvements de sang (35µl, sur animaux vigiles et non contraints), sur une durée minimum de 48h, seront réalisés à l’extrémité de la queue. A la fin de l’expérience, lorsque des prélèvements doivent être effectués, les animaux seront mis à mort par exsanguination par le prélèvement du sang par voie intracardiaque transthoracique (>60% du volume circulant) sous anesthésie. La combinaison entre la forte surdose d’anesthésique et la chute de la pression sanguine et l'hypovolémie extrême résultant du prélèvement précipite la mort de l'animal dans les secondes qui suivent le prélèvement.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. L’administration dans les voies aériennes de composants de la paroi bactérienne (LPS, lipopolysaccharides) induit une baisse de l’activité de l’animal au réveil de l’anesthésie et est accompagnée d’un bronchospasme (ayant pour effet une baisse visible de la fréquence respiratoire) et une baisse de la température dans les 5 à 8 premières heures.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…) et pharmacocinétiques. Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans la distribution et l’activité des médicaments ou la complexité des réponses inflammatoires. De plus, les affections pulmonaires sont également fortement influencées par la respiration (mécanique) et les échanges gazeux qui impactent fortement les réponses cellulaires mais aussi l’organisme dans son entier. Une dysfonction de la respiration entraine irrémédiablement une atteinte de tous les organes et fonctions biologiques, elles-mêmes impliquées dans la réponse immunitaire et l’ADME d’un médicament. Pour ces raisons, une approche chez l’animale, reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez la souris, car cette espèce est la mieux caractérisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et permet le recourt à de très nombreux outils (animaux GM, pléthysmographie, produits et tests biologiques…) permettant de valider leur activité.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 (groupes contrôles) à 6 animaux par groupe. Ce nombre d'animaux permet une analyse statistique efficace des résultats pour la mise en évidence d'un effet anti-inflammatoire ≥30% avec une incertitude inférieure à 5%. Pour les études qui requiert la mesure du bronchospasme et/ou le suivi des populations leucocytaires dans le sang, 6 à 8 animaux pour chaque groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des variations généralement plus faible. D’après notre expérience, nous estimons que 20 candidats-médicaments seront évalués sur une période de 5 ans, soit un maximum de 880 souris selon l’hypothèse la plus défavorable.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les animaux seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’une maisonnette, d’une roue d'activité (Fast-trac), d’une balançoire, d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur a compter de la récéption des animaux puis plusieurs fois par jour après le début de la procédure expérimentale. Les souris seront anesthésiées pour permettre les administrations intranasales et intratrachéales. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie et jusqu’au réveil complet des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Malgré les précautions prises en amont des expérimentations et la séléction des candidats-médicaments ayant le meilleur rapport benefice/risque, les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue. Tout signes de douleur ne pourra être suivi de mesure corrective et les animaux seront mis à mort dès l’atteinte de l’un des points limites. Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour l’étude des réactions inflammatoires, avec de multiple modèles expérimentaux disponibles. De plus, de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires et respiratoires sont disponibles pour cette espèce. Les souris seront âgées d’au minimum 7 semaines afin que le système immunitaire des animaux soit mature.

3200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau du flanc droit une injection de cellules cancéreuses puis, dans l'abdomen, une injection d'immunothérapies, et développe une tumeur qui peut gêner ses mouvements. Le porteur écrit que les effets secondaires sont rares et que le suivi est assuré au minimum trois fois par semaine, quotidiennement si l'état se dégrade. Il annonce un "réel espoir" contre le cancer en précisant que le traitement testé sert déjà chez l'humain contre le rejet de greffe du rein et a déjà fait l'objet d'un essai clinique en cancérologie.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des freins appelés point de contrôle (PD1, PDL-1) qui vont permettre d’inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale. Des immunothérapies ont été développées pour bloquer ces freins et rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements et certains cancers restent largement réfractaires à ces thérapies. Notre projet de recherche fondamentale a pour but de lever la résistance aux immunothérapies ciblant le point de contrôle PD1. En effet, nous espérons identifier et réveiller une sous population de lymphocytes T freinés par les points de contrôle de la tumeur afin de rétablir une réponse immunitaire anti-tumorale efficace et donc de lever la résistance aux immunothérapies. Pour évaluer la réponse à notre traitement, nous mesurerons la croissance tumorale au cours du temps pour les différents groupes étudiés (traités ou non traités) et réaliserons une analyse des différents composants cellulaires de la tumeur après mise à mort des animaux qui ont reçu ou non les traitements.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses immunitaires anti-tumorales grâce aux immunothérapies a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré. Nous espérons améliorer la réponse immunitaire contre le cancer en réveillant une population cellulaire essentielle dans la réponse immunitaire. Il est important de mieux comprendre le fonctionnement des immunothérapies pour les combiner et améliorer la réponse contre le cancer. Ce projet représente un énorme intérêt en immunothérapie du cancer chez l'homme puisque notre traitement est déjà utilisé dans le cadre du rejet de greffe du rein et dans le traitement des maladies auto-immunes. De plus, une étude clinique a déjà été réalisée dans le cadre du cancer chez des patients atteints de tumeurs. Notre traitement est donc facilement applicable chez l'homme et constitue donc un réel espoir dans le traitement du cancer.

Procédures

Injection par voie sous-cutanée de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes Traitements par immunothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal quelques soit le nombre d’immunothérapies qu’il reçoit. Les différentes immunothérapies seront mélangées pour ne faire qu'une seule injection - Durée : 1 minute

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage. D’éventuels effets secondaires des traitements sont rares : les immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études et quotidiennement si dégradation. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Capturées dans une lagune au verveux ou à la pêche électrique, qui les paralyse quelques secondes, 1600 anguilles européennes sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe par un bac obscur, un bain anesthésiant de cinq à quinze minutes, une injection analgésique, puis l'ouverture de l'abdomen pour y implanter un transpondeur RFID, refermée par un pansement. Toutes sont remises à l'eau après un réveil surveillé, ce que le porteur juge "primordial" pour l'objectif de l'étude, savoir par où et quand les anguilles argentées repartent vers la mer. Sur le remplacement, il écrit seulement que l'étude portant sur le comportement en milieu naturel, elle ne peut pas "s'affranchir de l'emploi de poissons sauvages", l'espèce étant classée en danger critique d'extinction.

Objectifs

L’anguille européenne est classée « critiquement menacée d’extinction » depuis 2008 par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN) et est inscrite depuis 2009 à l'annexe II de la convention sur le commerce international des espèces de faune et flore sauvages menacées d'extinction (CITES). Des plans de gestion au niveau national et par bassin hydrographique fixent des objectifs pour évaluer le nombre d'individus qui colonisent (recrutement des civelles - juvéniles qui arrivent de la mer) et le nombre d'individus qui s'échappent (dévalaison des anguilles argentées - adultes qui repartent en mer pour aller se reproduire). Ce projet de suivi télémétrique a pour objectifs d'améliorer la connaissance relative aux déplacements de l'anguille à l'intérieur d'un système lagunaire et notamment de mieux caractériser sa migration de dévalaison : par où et quand l'anguille argentée cherchent-elles à repartir en mer ? Ces résultats permettront d'identifier des mesures de gestion pour faciliter son retour en mer.

Bénéfices attendus

L'utilisation de la télémétrie RFID (Radio-frequency identification) permet d'enregistrer in situ le passage d'individus identifiés avec une puce de marquage à des points clés du système étudié. Les résultats permettront de connaître les périodes auxquelles les anguilles argentées cherchent à repartir en mer, les voies empruntées, les éventuels obstacles à la migration et l'identification des facteurs environnementaux d'influence. Les résultats de cette étude permettront de plus d'évaluer l'efficacité d'un projet de restauration de continuité écologique. À terme ces résultats permettront d'affiner la gestion des ouvrages de connexion entre les marais et les étangs, et de faire des recommandations pour d'éventuels projets altérant les continuités hydroécologiques.

Procédures

Capture dans un verveux (nasse) : relève toutes les 24h approximativement, ou capture par pêche électrique : paralysé quelques secondes. Facultatif : Si trop de captures, mise en couve jusqu'à 3 jours maximum. Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h Bain anesthésiant: 5 à 15min Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide d'un pansement hydrofuge : 2 à 5 min Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min Stabulation avant relâcher : de 5 min à 2h

Impact sur les animaux

La capture par pêche, leur stabulation dans des bacs, leur anesthésie, la réalisation des mesures biométriques, le marquage par laparotomie, la phase de réveil et de stabulation avant remise à l'eau sont autant d'étapes sources de stress pour les animaux. Une mise en couve des individus (10 par couve) dans leur milieu naturel jusqu'à 3 jours maximum pourra être éventuellement pratiquée, si les captures sont trop nombreuses, ne permettant pas de traiter tout le même jour. Un individu traité sera gardé dans des bacs obscurs avec aération jusqu'à maximum 8h avant d'être relâché dans son milieu d'origine.

Devenir

L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre à l’objectif de l’étude.

Remplacement

L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.

Réduction

L’enjeu de l’étude est de comprendre les déplacements des anguilles supérieurs à 30 cm en fonction de la variation des conditions environnementales, de pouvoir prédire les pics de migration (nombre élevé d'anguilles argentées qui dévalent à la même date) et d'identifier d'éventuels obstacles à la migration. De plus, le marquage des individus permet de récolter des données de capture-marquage-recapture (CMR), des données indispensables pour évaluer les paramètres de dynamique de population (par exemple taux de survie et indice d'abondance). Pour que les modèles de CMR soient robustes et représentatifs de la réalité, il est nécessaire de maintenir un effort de marquage significatif à un pas de temps constant dans le temps sur une période qui couvre le temps de croissance de plusieurs générations. Ainsi, les conclusions attendues par ce présent projet, sur l’étude comportementale de l’anguille, ne peuvent pas s’affranchir de l’emploi des poissons. Au maximum, ce seront 1600 individus au total qui seront marqués sur les 2 années du projet.

Raffinement

Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie (benzocaïne) et analgésie (lidocaïne). Pour limiter la surinfection postopératoire, le marquage sera procédé lorsque les températures de l’eau n’excèdent pas 16°C, soit sur la période d'octobre à avril. Les bacs de stabulation seront noirs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil). La densité des individus par bac sera limitée à 0.17kg/L (soit 7kg pour 40L). Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu à divers points de passage grâce à des stations d'écoute installée dans le milieu naturel. Le suivi télémétrique constitue un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce migratrice amphihaline catadrome qui présente un cycle de vie unique, et qui est actuellement menacée d'extinction. Afin de mieux comprendre ses déplacements au sein de système, la dynamique de sa phase de dévalaison, et mettre en place des dispositions pour favoriser sa migration retour en mer, il est indispensable d’étudier des individus de cette espèce. Les anguilles supérieures à 30 cm et ayant un poids suffisamment important (>40g) pour supporter l’implantation d’un transpondeur de 23 mm sans affecter leurs constantes vitales seront utilisées. Il s’agit de stades jaune ou argenté de l’anguille. Les individus de 30 cm qui pèsent au minimum 40 g sont marqués avec des transpondeurs de 23 mm qui ont une masse de 0.6 g. L’impact du transpondeur est négligeable lorsque sa masse est inférieure à 2.5% de celle du poisson, ce qui se vérifie ici.

90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales prostatiques humaines, passent un scanner puis une séance de radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant que la tumeur grossit, ce qui peut selon le porteur atteindre leur mobilité et les fatiguer. Les bénéfices annoncés restent en amont de la clinique : établir si les vaisseaux tumoraux répondent à cette radiothérapie ultra-rapide comme à la radiothérapie conventionnelle, et apporter des connaissances utiles à la communauté scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme que "tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait" et que l'oxygénation d'un tissu ne s'étudie que dans un organisme perfusé.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans difféerents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en terme d'oxygénation du tissu tumoral. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.

Bénéfices attendus

La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.

Devenir

Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.

Remplacement

Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.

Réduction

La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).

Vingt et un gavages pour 360 souris, sept injections pour 240 autres, 1 200 prélèvements de selles, un rasage du dos et une ponction de la veine submandibulaire : 600 souris sont soumises à ces actes, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage à la canule et un risque d'infection cutanée lié au rasage. Il s'agit d'explorer le rôle de bactéries intestinales et de produits bactériens sur le comportement, chez des souris dont la réponse immunitaire a été altérée par délétion génique. Chaque souris passe une fois chaque test comportemental, pour 145 minutes cumulées d'épreuves sur trois semaines, sans que ces tests soient nommés.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elles sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies manifestées par des symptômes neuro-psychiatriques (Parkinson, dépression, sclérose en plaque). Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans les manifestations comportementales de l’hôte. Des travaux suggèrent que certaines bactéries et des produits bactériens sont responsables de l’apparition de troubles du fonctionnement du système nerveux central . L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes et d’identifier le rôle des bactéries et des produits bactériens dans la régulation du comportement dans un modèle de souris présentant une réponse immunitaire altérée.

Bénéfices attendus

Validation d’un modèle de souris présentant des modifications spécifiques des cellules neuronales sur des récepteurs de l’immunité innée pour l’étude de manifestations neuro-comportementales. Amélioration de la compréhension de l’influence du microbiote sur le comportement de l’hôte sur le comportement. Amélioration de la compréhension de l’impact des voies immunologiques dans les manifestations comportementales.

Procédures

Gavages : 360 souris seront soumises à 21 gavages (quelques secondes) et 240 à 7 injections (quelques secondes) ou au total, correspondant à une intervention par jour selon le protocole. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes par un expérimentateur qualifié. Prélèvement de selles : 2 prélèvements de selles correspondant à un placement dans un pot de récolte pendant 5 minutes maximum pour les 600 animaux, soit 1200 prélèvements. Rasage : les animaux subiront 1 rasage d’identification d’une durée de 10 secondes soit 360 actes de rasages de 10 secondes. Tests de comportement : tous les animaux subiront 1 fois chaque test comportemental dont la durée maximum est de 30 minutes. La durée cumulée d’épreuves comportementale sera de 145 min sur 3 semaines par animal. Prise de sang, durée inférieure à 15 secondes, 1 fois pour chaque animal.

Impact sur les animaux

stress léger induit par le placement dans un pot de récolte pour les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et la pesées des animaux (une fois par semaine). Douleur liée à la piqure et l’injection d’anesthésique et antalgique et des métabolites de l’étude.. Risque de traumatisme de l’œsophage induit par la manipulation de gavage oral à la canule souple pour administration des bactéries de l’étude. stress induit par la mise en conditions expérimentales des tests comportementaux douleurs et stress induit par la contention manuelle et la piqure effectuée par la lancette lors des prélèvements sanguins par ponction de la veine sub mandibulaire : risque de complication cutanée par infection induit par rasage à la tondeuse d’une zone du dos pour l’identification temporaire nécesaire à l’identification pendant l’enregistrement des vidéos.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre de récupérer le sang et les organes à des fins d'analyse scientifique

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant d'évaluer le lien entre l'étât physiologique du microbiote et les processsus cérébraux complexes comme les comportements Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries intestinales, la composition et l’abondance du microbiote intestinal, et des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et comportementales.

Réduction

Nous avons choisi d’utiliser des groupes de 12 animaux en se basant sur les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres comportementaux.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes permettant des interactions visuelles. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément une fois par semaine au moment de la pesée des animaux. Enfin des points limites adaptés sont définis pour limiter d’éventuelles souffrances.

Choix des espèces

Les animaux auront 6 à 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur le comportement et l’immunologie, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques de comparaison. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné n’existent que dans ce modèle murin.