Oncologie
- Autre recherche fondamentale
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- Éthologie / comportement / biologie animale
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Caractérisation de lignées de rats portant des mutations dans le gène CLCN4
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Placés seuls en cage de 17 h à 9 h pendant trois nuits, en gardant un contact visuel avec leurs congénères, pour un test de préférence du saccharose, les rats passent aussi des tests de locomotion, d'anxiété, de coordination, de force, de mémoire et de comportement compulsif, ainsi qu'une prise de sang et une mesure de la fonction musculaire sous anesthésie. 100 rats porteurs de mutations du gène CLCN4 vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet vise à vérifier si ces lignées reproduisent une maladie neurodéveloppementale rare, et le porteur indique qu'une des mutations rend les mâles "plus chétifs, plus agressifs". Hormis le test du saccharose, il désigne chaque test par ce qu'il mesure sans dire lequel est employé, et mentionne un "test impliquant de l'eau", après lequel les rats sont séchés sous une lampe chauffante, sans l'identifier.
Objectifs
La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.
Bénéfices attendus
Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.
Procédures
Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); AMENDEMENT - ajout d'un test pour évaluer la dépression (3*16h); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide AMENDEMENT - sous anesthésie. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant.
Impact sur les animaux
Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype, les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention durant quelques secondes. AMENDEMENT - une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux. AMENDEMENT - Le test de préférence du saccharose nécessite d'isoler les animaux pendant 3 nuits, tout en gardant le contact visuel avec leurs congénères: les animaux seront placés seuls dans des cages d'hébergement de 17h à 9h le lendemain matin pendant 3 jours. De 9h à 17h, les animaux retrouveront leur cage et leur congénère d'origine.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. AMENDEMENT- L'isolement des animaux lors du test de préférence du saccharose (3*16h) se déroulera dans des cages d'hébergement avec enrichissement (nid, bâton et balle à ronger). Ces cages sont transparentes et les animaux continueront d'avoir un contact visuel avec leurs congénères.
Choix des espèces
Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.
Implication du système immunitaire dans la résistance à la castration
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales destinées à déclencher des tumeurs de la prostate, puis, trois, cinq ou neuf mois plus tard, une ouverture de l'abdomen avec ou sans retrait des testicules, et enfin des injections de traitements stimulant ou bloquant les cellules natural killer jusqu'à quatre fois par semaine. Le porteur qualifie les suites opératoires de "douleurs mineures facilement prévenues" et écrit que l'étude pourra ouvrir de "nouvelles pistes thérapeutiques" contre les cancers résistants à la castration. Il affirme que la complexité des lésions précancéreuses "rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo", tout en indiquant que l'équipe étudie déjà une partie des paramètres sur des organoïdes dérivés des tumeurs.
Objectifs
Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles murins de cancers prostatiques. En effet, le traitement du cancer de la prostate chez l'homme repose sur la chirurgie et l'utilisation de traitement anti androgénique appelé castration chimique. Malheureusement, après un temps limité de sensibilité aux traitements, 20% des patients développent des résistances à ces traitements et les cancers "résistants à la castration" sont de très mauvais pronostic. Il est donc primordial de mieux comprendre la résistance à la castration. Les études récentes menées au laboratoire mettent en évidence une implication forte du facteur de transcription Hif1a induit par l'hypoxie dans le développement de la résistance à la castration. Ainsi nous voulons étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent pour mieux comprendre par quel biais l'inactivation de Hif1a rend ces tumeurs sensibles à la castration. Nos données préliminaires montrent un infiltrat de cellules natural killer majeur dans les souris sensibles à la castration comparé à celles qui présentent des tumeurs résistantes à la castration. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle les cellules natural killer sont bloqués ou stimulés afin de voir la réponse sur la croissance des tumeurs après castration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si les cellules natural killer permettent de rendre les tumeurs de prostate sensibles à la castration dans le cancer de la prostate et par quels mécanismes. Si cela s'avère être le cas, cette étude pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration.
Procédures
Les souris subiront 5 injections intra-péritonéales sur 5 jours pour induire l'apparition des tumeurs (5 minutes par souris), puis une intervention chirurgicale (castration/sham) 3, 5 ou 9 mois plus tard (30 min par souris) et les injections intra-péritonéales de traitement stimulant ou bloquant les cellules natural killer 1 à 4 fois par semaine pendant au plus 4 semaines (jusqu'à 12 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Le blocage des cellules natural killer a été déjà éffectué dans de nombreuses études chez la souris et sont administrés en routine par un laboratoire collaborateur sans observation d'effets secondaires. L'activation des cellules natural killer peut engendrer une perte de poids transitoire des souris traitées dans les 48h suivant l'administration, les souris reprennent habituellement leur poids de départ dans la semaine qui suit l'injection. La croissance des tumeurs de prostate est lente et donc les variations de poids liée à leur croissance ou régression sur 2 semaines est négligeable.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.Par ailleurs, nous utilisons des organoïdes dérivés des tumeurs pour étudier un certain nombre de paramètres, cependant l'étude du microenvironnement nécessite de se placer en condition in vivo stricte.
Réduction
Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 3860 souris maximum.
Raffinement
On procèdera à l'anesthésie générale des souris par inhalation, et après l'induction, une analgésie en injection intrapéritonéale sera faite. En post-opératoire, une injection en sous cutannée d'ant- inflamamtoire sera faite. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, une analgésie supplémentaire sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Par ailleurs, les animaux castrés (ouverture abdominale avec retrait des tesitcules) et les animaux sham (ouverture abdominale sans retrait des tesitcules) seront séparés: une cage sham versus une cage castré par exemple pour éviter tout risque de domination. En cas de signe de douleur (dos voute, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation), l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Après les injection-intrapéritonéales, les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter une éventuelle infection sur les sites d'injection, et en cas d'observation de rougeur, de voussure ou de signe de douleur, les animaux seront retirés de l'étude et un avis vétérinaire sera pris. Par ailleurs, pour prévenir une éventuelle perte de poids liée aux traitements, le poids sera pris 1 fois par semaine pendant la durée de l'étude et en fonction de la différence de perte de poids observée, soit de la nourriture enrichie sera administrée aux souris, soit les animaux seront mis à mort et retirés des études.
Choix des espèces
La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes. A l'âge de 8 semaines, nous administrons le Tamoxifène pour induire le développement de tumeurs. Puis, 3, 5 ou 9 mois plus tard, nous débutons les expériences (castration et neutralisation des cellules NK, stimulation de ces cellules) avec les différents groupes expérimentaux et nous euthanasierons les animaux à un temps court et un temps long après les traitements.
Génétique des maladies auto-immunes sur modèle murin (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
153 850 souris vont être utilisées, chacune recevant une puce électronique sous la peau avant le sevrage et une biopsie d'un fragment de queue dès deux à trois semaines d'âge. 250 d'entre elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales d'un agent chimique mutagène à quatre, cinq et six semaines, qui peut rendre stériles 70 % des mâles, les autres naissant, étant génotypées et maintenues pour l'entretien de la lignée. Toutes seront tuées dès les premiers signes biologiques de la maladie auto-immune, ce que le porteur présente comme un moyen d'éviter toute souffrance. Il annonce un effectif établi sur des études statistiques permettant d'utiliser "le moins d'animaux possible", sans expliquer comment ce calcul aboutit à 153 850 souris.
Objectifs
Ce projet concerne les maladies auto-immunes qui ont une cause génétique et sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs. Le but est de caractériser les gènes impliqués en utilisant la souris comme modèle. Dans ce projet nous induirons des mutations au hasard dans le génome grâce à l’injection d'un agent chimique. Nous identifierons les mutations qui modifient les caractéristiques physiques de la maladie en suivant les descendants des souris traitées. Les mutations qui modifient de manière significative les caractéristiques de la maladie seront ainsi identifiées. Les protéines codées par les gènes identifiés seront des cibles thérapeutiques potentielles chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie. Cette démarche donnera accès à de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie ainsi qu’à de nouveaux marqueurs génétiques et/ou biologiques permettant de dépister la maladie à des stades précoces. Nous prévoyons que de nouveaux gènes modifiant les caractéristiques de la maladie seront découverts.
Procédures
Chez certaines souris une injection unique intrapéritonéale sera pratiquée dans les 3 jours qui suivent la naissance (le geste dure 15 secondes). Le projet comporte l'injection intrapéritonéale de 250 animaux avec un agent chimique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (à 4, 5 et 6 semaines d'âge) (chaque geste dure moins de 15 secondes). Chez certaines souris un prélèvement unique de sang sera effectué à 6 semaines sous anesthésie générale (le geste dure 30 secondes). Toutes les interventions citées précédement seront réalisées dans un seul établissement utilisateur. Une puce électronique sera implantée à tous les animaux avant le sevrage par voie sous cutanée et des biopsies d’un fragment de queue seront effectuées à partir de 2-3 semaines d’âge (le geste dure 15 secondes). Ces deux interventions pourront être réalisées dans les deux établissements utilisateurs
Impact sur les animaux
Les injections de l’agent chimique peuvent entraîner une infertilité chez 70% des mâles. L'injection intrapéritonéale peut en soi être à l'origine d'une douleur, les prélèvements de sang sous anesthésie peuvent être associés à une douleur à l'œil au réveil, les biopsies de queue peuvent engendrer une douleur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes biologiques de la maladie afin d'éviter toute souffrance.
Remplacement
Ce projet concerne l'étude de maladies auto-immunes qui sont d’origine génétique. Il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico pour aborder le sujet. D’où le besoin d'avoir recours aux modèles de souris dont les caractéristiques récapitulent la maladie humaine. Les expériences proposées nécessitent de comparer des individus qui ne diffèrent pas de façon majeure pour leur fond génétique ou l’environnement. C’est le cas de la souche de souris que nous proposons d’étudier.
Réduction
Pour respecter le principe de la Réduction, le nombre proposé de souris a été établi sur la base d’études statistiques permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables. La méthode utilisée permet de cumuler les individus à des temps différents de suivi en diminuant ainsi de manière très importante le nombre de souris analysées à chaque temps individuel. Pour les expériences impliquant des croisements, le nombre d’individus prévus tient compte de notre expérience dans le domaine. Par ailleurs, le protocole prévoit un nombre limité de croisements (3) pour constituer les groupes d'animaux qui feront l'objet de l'analyse génétique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour respecter le confort maximum des conditions d’hébergement, faire pratiquer les gestes nécessaires par un personnel formé et ayant de l’expérience des pratiques, réduire le stress et la douleur. Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés. Les cages sont dotées de tunnels d’enrichissement rouges et de cotons de nidification. Pour les prélèvements sanguins et les biopsies une prise en charge de la douleur sera mise en place avec des antalgiques et des anesthésiques. Une observation quotidienne avec une grille de points limites sera effectuée afin qu’en cas de besoin des mesures soient mises en place pour garantir le bien-être de l‘animal. Quand des livraisons d’un établissement à l’autre seront réalisées, les animaux aptes au transport seront livrés via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux (colis comprenant alimentation, gel d'hydratation et enrichissement). Une période d’acclimatation sera appliquée après réception des animaux.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est une souche de souris qui développe une maladie dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie humaine correspondante. Les souris sont engagées dans les procédures dès la naissance. La maladie apparait chez les souris adultes après 12 semaines d’âge. Les souris sont suivies une fois par semaine, à partir de 10 semaines d’âge, pour détecter de manière précoce la survenue de la maladie. Les expériences seront toujours interrompues dès les premiers signes biologiques de la maladie avant que celle-ci n’ait donné lieu à des manifestations physiques entraînant une souffrance des animaux.
Etude des interactions hôtes-pathogènes et de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte de tuberculose
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par Mycobacterium tuberculosis par voie intranasale ou intraveineuse, puis gavées ou injectées cinq à sept jours par semaine pendant trois à huit semaines, ces souris peuvent aussi recevoir un second agent pathogène. 6 704 souris vont être utilisées, 5 028 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 676 un niveau sévère. Le porteur affirme que la surveillance biquotidienne permet "l'arrêt total des souffrances de l'animal par sa mise à mort", tout en jugeant "indispensable" d'observer chez les souris infectées par Plasmodium au moins deux signes de neuropaludisme, ataxie, hémiplégie ou tétraplégie, spasmes, coma. Toutes sont tuées par dislocation cervicale en fin d'expérience, pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
Le projet présente trois objectifs distincts: - étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose. - évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. - étudier l'évolution de la co-infection (par un agent pathogène secondaire) dans un modèle de souris infectée de manière latente par M. tuberculosis.
Bénéfices attendus
Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,3 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2023 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19. Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent à identifier de nouveaux composés à visée thérapeutique efficaces sur les souches multiresistantes et à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec les mycobactéries, afin de comprendre tous les mécanismes responsables de l’infection, mais également de caractériser et étudier l'impact d'une co-infection chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.
Procédures
Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage (durée d'intervention : 1 minute) ou voie intrapéritonéale (durée d'intervention : 30 secondes) ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale - durée d'intervention : 2 minute) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale (durée d'intervention : 3 minute) ou intranasale (durée d'intervention : 1 minute) peut également être utilisée 3 à 5 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes est réalisée par voie intranasale (durée d'intervention : 1 minute) sous anesthésie ou par voie intraveineuse (durée d'intervention : 2 minute), intrapéritonéale (durée d'intervention : 30 secondes) ou sous cutanée (durée d'intervention : 1 minute) sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis (ou BCG) (durée d'intervention : 1 minute), puis (ii) un des autres pathogènes étudiés (durée d'intervention : 1 minute).
Impact sur les animaux
Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés. Des points limites basés sur l’apparence et le comportement des souris sont observés quotidiennement, afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques est utilisée et le « score de douleur » permet de déterminer le niveau de souffrance de l’animal. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables (score supérieur à 5) sont euthanasiés. Dans cette procédure, la perte de poids constitue le point limite majeur pris en compte. L’évolution du poids est suivie au minimum 2 fois par semaine. Une perte de poids > 20%, seule, entraine l’euthanasie de la souris. La prostration est également un des indicateurs de douleur pertinent dans le cas d’infection de certaines souris transgéniques. Lors de l'infection par Plasmodium, la mise à mort fait suite à l'observation de deux symptômes caractéristiques du neuropaludisme : ataxie, hémi ou tétraplégie, spasmes, coma pour les souris infectées par Plasmodium berghei ANKA. Aussi, il est indispensable pour l'étude du neuropaludisme d'observer au moins ces deux signes cliniques, la pathologie étant cérébrale et ne pouvant être diagnostiquée que par ces signes. Néanmoins, l'apparition de ces signes cliniques étant dans une fenêtre connue (6 à 10 jours après infection), les animaux seront surveillés toutes les demi-journées, permettant l'arrêt total des souffrances de l'animal par sa mise à mort.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire.
Réduction
Les expériences sont répétées en triplicate sur 4 animaux par groupe expérimental. Les résultats sont analysés statistiquement avec le test de Student. Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires.
Raffinement
De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées au moment des différentes administrations invasives. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des animaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables (score supérieur à 5) seront euthanasiées. Les souris seront euthanasiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues. Le cas échéant les souris sont préalablement anesthésiées: - à l’aide d’une solution d’isoflurane (2%) par la voie aérosol. Les souris sont placées par série de 4 dans une boite d'induction étanche en plexiglas avec joint (L21,8*l12,8*H12,9 (3,6 l)) pendant environ 5 à 10 minutes où elles respirent les vapeurs d’isoflurane. La durée d'anesthésie est d'environ 1 minute. - par injection intrapéritonéale d'une solution contenant 1 mg/ml de Xylazine (Rompun®) ou Diazépam et 10 mg/ml de Kétamine (Clorketam 1000-Vétoquinol®), préparée en PBS. 50 à 100 μl de ce mélange est administré pour 10 g de souris (soit 5 à 10 mg/kg de Xylazine et 80 à 100 mg/kg de Kétamine). La durée d'anesthésie est d'environ 20 minutes.
Choix des espèces
1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Rôle d’une protéine dans la résistance aux chimiothérapies dans un modèle de xénogreffe murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
390 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules cancéreuses humaines dans le flanc, jusqu'à quarante gavages et six injections intraveineuses, et une immobilisation trois fois par semaine pendant huit semaines pour mesurer sa tumeur au pied à coulisse. Le porteur indique que le gavage peut provoquer une inflammation de l'œsophage et que la chimiothérapie entraîne une fatigue généralisée. L'objectif est de vérifier si le blocage d'une protéine restaure la sensibilité des tumeurs à la chimiothérapie, ce qui permettrait selon lui d'en abaisser les doses. Les souris qui ne développent pas de tumeur sont tuées elles aussi, le porteur écrivant qu'elles "ne peuvent pas être considérées comme naïves".
Objectifs
La protéine que nous étudions est impliquée dans la chimiorésistance. Quand nous retirons cette protéine des cellules cancéreuses, elles deviennent de nouveau sensibles aux chimiothérapies. Sachant que 90% des morts par cancers sont la conséquence de chimiorésistances, nous voulons voir dans des modèles de souris si quand on enlève notre protéine de la tumeur, nous sommes capables de contrer ce phénomène de chimiorésistance. Si c’est le cas, nous pourrons diminuer la dose de chimiothérapie et donc les effets secondaires et également proposer un nouveau traitement pour des patients qui ne répondent plus à la chimiothérapie et son donc dans une impasse thérapeutique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mettre en évidence le rôle de notre nouveau traitement en combinaison avec une chimiothérapie. Nous pouvons imaginer pouvoir baisser la dose des chimiothérapies car elles seraient plus efficaces en combinaison avec notre traitement, ce qui permettrait de diminuer les effets secondaires de ces chimiothérapies. Aussi, 90% des morts par cancer font suite à une chimiorésistance, il y a donc une urgence pour contrecarrer ce phénomène.
Procédures
Les animaux recevront une injection de cellules tumorales dans le flanc (1x, 40sec). A la suite de cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine pendant 8 semaines, l’animal est maintenu immobile environ 30 sec. Les composés sont administrés par injection intraveineuse (3x par semaine de traitement pendant 2 semaines, 1min dont 3sec d’injection) et par gavage (5x par semaine pendant 8 semaines, 1min dont 5sec de gavage) sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Un stress peut être observé lors de la contention des animaux (greffe, administration de composés, et pesées). Les traitements avec chimiothérapie peuvent induire une fatigue généralisée. Le gavage peut provoquer une inflammation de l’œsophage.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour le prélèvement des tumeurs en vue d’analyses des tissus. Les souris qui n’auront pas développées de tumeurs seront mises à mort, car elles ne peuvent pas être considérées comme naïves.
Remplacement
Les travaux menés in vitro montrent que la stratégie de blocage de la protéine X induit la mort des cellules cancéreuses. Mais ces tests ne bénéficient pas d’un microenvironnement tumoral et d’un environnement hôte complexes. Aussi il est nécessaire d’avoir recours à l’in vivo pour étudier la capacité du nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur, pour analyser son comportement dans cet environnement complexe, évaluer son efficacité et pouvoir valider cet outil. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.
Réduction
Le nombre de souris a été calculée en fonction de l’importance de l’effet attendu afin d’observer une différence entre les groupes à l'aide d'un test statistique.
Raffinement
Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur formé à cette technique. Il est important de noter qu’une surveillance adaptée (3 fois par semaine) permettra la détection et notation des signes de souffrance grâce à une feuille de scoring contenant des points d'arrêt objectifs, reproductible et standardisés et qui conduiront à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux si nécessaire. En cas de souffrance n’allant pas jusqu’à un point limite, l’injection d’analgésique pourra être envisagé pour réduire la douleur. Les analyses de croissance des tumeurs seront non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d’injection d’anesthésiant. En revanche, les souris seront anesthésiées lors de l’injection sous-cutanée des cellules.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules, tout en permettant de faire des suivis de croissance tumoral dans le cadre d’essais de nouveaux traitements. Par ailleurs les schémas d’administration des chimiothérapies sont bien standardisés (voie, doses, posologies...) contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles de 6 à 7 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène.
Mesure du pH tumoral à l’aide de nouveaux agents de contraste: application aux modèles murins MDA-MB231 et 4T1 de cancer du sein 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deux heures d'IRM sous anesthésie générale et jusqu'à deux injections d'agents de contraste radiomarqués à vingt-quatre heures d'intervalle: 920 souris femelles immunodéficientes vont être utilisées, dont 100 tuées sans reprendre conscience et 790 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection de cellules cancéreuses dans la mamelle pour induire une tumeur du sein triple négatif, puis passe d'un établissement à l'autre en véhicule climatisé entre l'imagerie et les études de biodistribution. Le porteur écrit que les acquisitions IRM sont indolores et atraumatiques et qu'aucun antalgique n'est utilisé pour les injections d'agents de contraste, les nuisances déclarées se limitant au développement des tumeurs. Toutes sont tuées sous anesthésie, par ponction cardiaque pour certaines, afin de récupérer la tumeur et de mesurer la radioactivité retenue par chaque organe.
Objectifs
Malgré les avancées dans le dépistage et le développement de thérapies, le cancer du sein reste un problème de santé public majeur. Il s’agit du cancer le plus fréquent chez la femme. L’incidence du cancer du sein est en constante augmentation dans la plupart des pays malgré les efforts fournis pour la prévention de cette maladie. Une caractérisation tissulaire du cancer du sein est indispensable pour une détection plus précoce, ce qui permettra d’augmenter les chances de réussite du traitement, mais aussi de minimiser les séquelles. Il Il est connu que le pH extracellulaire des tumeurs est plus acide que celui du tissu sain . Ceci est dû à une augmentation de la production d’acide lactique. Nos collaborateurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au pH. L’objectif de ce projet est dans un 1er temps d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur. Une fois injectés par voie intraveineuse, l’intensité du signal de la tumeur sur l’image IRM va varier en fonction de la valeur de son pH. Ceci permet de calculer le pH tumoral et d’étudier sa variation tout au long du développement de la tumeur mammaire. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. Dans un 2nd temps, nous allons étudier la biodistribution ex vivo (prélèvements d'organes post mortem à des temps précis) de ces même agents de contraste, sur souris saines et souris modèle de cancer du sein triple négatif à l'aide des analogues marqués soit à l'111In soit avec un autre radiométal. Ils ne sont donc pas éligibles aux traitements ciblant ces trois types de marqueurs et donc plus difficile à soigner. Ce projet se fera donc sur 2 EU
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste sensibles au pH pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur et de quantifier la biodistribution de ces agents de contraste dans les différents organes. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement du cancer triple négatif puisque le pH est directement lié à l’agressivité tumorale et au développement de métastases.
Procédures
Dans l'EU1 (IRM), certaines souris vont recevoir une injection intra mammaire unique pour l’induction des tumeurs (durée moins de 2 minutes). Tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en imagerie par résonnance magnétique (IRM). Dans l'EU2, tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en biodistribution. Certaines souris venant de l'EU1 serviront pour les études de biodistribution dans l'EU2 et recevront au maximum 2 injections à 24h d'intervalle. Le temps d'injection est de 5 secondes environs. L’induction tumorale et les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie générale. Le temps total d'examen d'imagerie est de 2 heures maximum. Certaines souris vont avoir un prélèvement de sang qui se fera juste avant la mise à mort de l’animal sous anesthésie générale (Dans l'EU1 ou l'EU2).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont liées au développement des tumeurs mammaires. Si des signes de souffrance apparaissent, ils feront l'objet de points limites. L’injection IV de agents de contraste ne provoque pas de douleur, juste celle équivalent à une piqure d’aiguille. Notre expérience de l’injection d’agents de contraste fait que nous n’utilisons pas d’antalgiques pour ce geste. Les acquisitions IRM sont totalement indolores et atraumatiques. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée des acquisitions IRM et durant la ponction cardiaque. Les souris immunodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficience.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris anesthésiées à l'isoflurane seront mises à mort pour pouvoir récupérer la tumeur et les organes d'intérêt.
Remplacement
Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs et la distribution des agents de contrastes in vivo. Pour ces raisons, l’étude préclinique de biodistribution des agents de contraste et l’induction de tumeurs mammaires ne peuvent se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM (imagerie par résonance magnétique) pour le suivi du développement des tumeurs mammaires ainsi que la SRM (spectroscopie par résonance magnétique) permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.
Raffinement
Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Toutes les tumeurs seront induites dans l'établissement 1. Après l'imagerie RM, les souris seront transportées à l'établissement 2 (situé sur le même campus) dans un véhicule climatisé. Les animaux sont transportés dans des cages à couvercle filtrant et des procédures strictes sont appliquées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…) évitant la contamination des animaux durant les séances d'imagerie.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines et murines. On utilisera des souris femelles adultes de 8 à 10 semaines; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation, ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins).
Formation à la physiologie de la nutrition par la recherche : Effet des boissons sucrées sur l’induction de la lipogenèse et le comportement.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 60
Former des étudiants ingénieurs et de master à la physiologie de la nutrition: 60 souris et 60 rats reçoivent une boisson sucrée à 20 % de saccharose pendant quatre semaines et sont tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal passe deux tests de comportement de dix minutes, dont le RNT ne dit pas la nature. Les mises à mort sont échelonnées pour que les encadrants corrigent les gestes des étudiants pendant les prélèvements, l'enseignante ouvrant l'abdomen avant que les binômes ne prélèvent le foie et les tissus adipeux. Le porteur écrit que comprendre ces mécanismes est "indispensable" à la formation, et justifie le choix indifférencié du rat ou de la souris par la réutilisation possible de rongeurs venant d'autres protocoles.
Objectifs
Notre école forme des ingénieurs et des étudiants en master en recherche et développement capables d’intégrer la nutrition dans les bénéfices santé de l’alimentation et de comprendre les effets sur l’apparition de dysfonctions métaboliques. Acquérir les connaissances concernant le lien alimentation / santé, les besoins nutritionnels, le comportement alimentaire au travers d’enseignement par la recherche est un objectif majeur de nos formations. Un problème majeur en nutrition, qui est un sujet d’actualité dans le cadre de la pandémie mondiale d’obésité, est la prise de poids et l’augmentation de la masse grasse, qui en retour induit des dysfonctions métaboliques (diabète, maladies cardiovasculaires, accumulation de lipides dans le foie, hypertension).Comprendre les mécanismes par lesquels le poids et l’adiposité augmentent est indispensable pour la formation des ingénieurs et des étudiants en master de nutrition. Ces connaissances, en plus de la formation théorique sur les voies métaboliques , nécessitent d’appréhender la complexité du problème par une approche par la recherche, pour évaluer l’effet de l’alimentation sur le comportement des animaux et sur l’interaction entre les organes et les molécules de signalisation associées, afin de comprendre la mise en place de ces dysfonctions métaboliques. L’objectif de ce projet est de former les étudiants à la physiologie de la nutrition en étudiant les effets de l’ingestion de boissons sucrées (saccharose à 20% dans l’eau) sur l’augmentation de la masse grasse. Les effets des boissons sucrées sont complexes et font intervenir une non compensation énergétique lorsque l’apport énergétique est sous forme liquide et une augmentation de la glycémie et en conséquence de l’insulinémie. En effet, la consommation de sucres, notamment sous la forme de boisson, induit une augmentation de l’ingéré énergétique qui s’ajoute à la consommation de l’énergie quotidienne. De plus, le glucose, le fructose et l’insuline vont stimuler directement la synthèse des lipides dans le foie qui vont être ensuite exportés et stockés dans les graisses.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de former les étudiants à la nutrition, au comportement et à l’analyse statistique des données obtenues ainsi qu’à l’anatomie. Il porte sur l’effet des boissons sucrées sur le comportement et la prise de de graisses. Comprendre les mécanismes responsables de l’effet de la consommation de boisson sucrées sur la prise de poids et les conséquences sur le surpoids et l’obésité est un enjeu majeur en santé publique.
Procédures
Administration de boisson sucrée donnée dans l’eau de boisson (pour 120 animaux sur une durée de 4 semaines) et tests de comportement pour 120 animaux (2 tests de 10 minutes chacun). A la fin de l’expérimentation, tous les animaux (n=120) seront anesthésiés par injection en quelques secondes à l’animalerie 15 minutes avant la mise à mort. Les animaux anesthésiés seront ensuite mis à mort par injection léthale en quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les tests de comportement pourraient induire un stress léger dû à la nouveauté de l’environnement qui fait partie du principe de ces tests. L’injection sur animal vigile est susceptible d’induire de la douleur et un stress modéré mais de courte durée. Le stress induit par l’injection lors de la mise à mort sera atténué par l’injection préalable d’anesthésique.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’étudier sur les organes et tissus l’activation de la synthèse de graisse et l’augmentation de la masse grasse.
Remplacement
Cette étude permettra de former les étudiants à la nutrition en étudiant sur des modèles animaux les effets de l’alimentation sur les différents organes, au comportement et à l’analyse des données obtenues, ainsi qu’à l’anatomie sur les animaux morts. Le projet de recherche proposé dans le cadre de ces travaux pratiques requière la mesure des conséquences de l'ingestion des boissons sucrées sur le comportement et la prise de poids et de masse grasse, ce qui empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Ainsi, les objectifs de ce projet de recherche ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal.
Réduction
Nous avons estimé l'effectif minimal requis pour observer un effet des boissons sucrées à 10 animaux par sexe et groupe. Les données seront mutualisées dans 4 unités d’enseignement sur une durée de 2 ans. Pour chaque année, trois groupes de TP de 15 étudiants au maximum participeront aux prélèvements des organes sur 20 animaux pour chaque groupe de TP et 48 étudiants organisés en 4 groupes de TP de 12 étudiants mesureront le comportement de 4 animaux par groupe de TP, soit 16 animaux pour les 48 étudiants. Les résultats obtenus seront également utilisés pour former 30 étudiants par an aux tests statistiques, en utilisant soit ceux obtenus par leur promotion, soit ceux obtenus par les promotions antérieures (étude de la reproductibilité).
Raffinement
Le projet n’imposant pas un suivi de la prise alimentaire, les animaux sont mis en cage collective de trois à quatre animaux. Les cages seront enrichies avec des tunnels transparents. L’expérimentateur ou le personnel animalier passera tous les jours pour vérifier l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement, ainsi que la disponibilité de la nourriture et de la boisson de chacune des cages. Les points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures. Au cours des travaux pratiques, les étudiants seront sous la responsabilité des enseignants titulaires du diplôme de niveau 1 et de chirurgie, assistés de l’animalière et d’un assistant ingénieur. Les étudiants seront divisés en 4 groupes de 12 pour l’étude du comportement et de 3 groupes de 15 pour les études physiologiques.Pour ces derniers TP, les animaux seront mis à mort en séquentiel pour permettre aux encadrants du TP de suivre et corriger les gestes des étudiants au cours des prélèvements post mortem. Au début de la séance, l’enseignante procède à une démonstration sur un animal pour deux binômes (4 animaux). Par la suite, l’enseignante vérifie la mort de l’animal, ouvre la cavité abdominale, effectue le prélèvement sanguin au niveau de la veine cave, et ensuite, les étudiants prélèvent le foie et les différents tissus adipeux. Avant les travaux pratiques, les étudiants suivent des enseignements sur l’expérimentation animale (1h30) incluant la présentation de la réglementation dispensés par la responsable de l’animalerie et l'animalière et 3h de cours sur l’éthique dispensé par l’enseignant spécialiste du comportement animal.
Choix des espèces
Comme l’homme, le rat et la souris ont un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie du système digestif du rat et de la souris présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ces espèces présentent également une réponse positive à la prise de poids et de masse grasse par l’absorption de boisson sucrée. Le choix indifférencié de la souris ou du rat se justifie par le fait que nous favoriserons la réutilisation d’animaux d’autres protocoles, si cela est possible. Les animaux arriveront à l’âge de jeunes adultes (4-8 semaines), période propice à la prise de masse grasse sous l’effet des sucres.
Mise en place d’un modèle de radio-nécrose chez la souris portant un gliome (1/3)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Cent souris reçoivent des cellules cancéreuses implantées directement dans le cerveau, cinquante autres par voie intraveineuse, puis toutes passent sous radiothérapie ou restent sans traitement comme témoins. 150 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, transportées vers un second établissement pour le suivi par IRM, puis tuées en fin de projet pour confronter les images aux coupes histologiques. Le porteur décrit des titubations, une léthargie, des tremblements, des crises d'épilepsie et une perte de poids suivie jusqu'à 15 %, et affirme que la radionécrose de la tumeur ne devrait pas provoquer de douleur, celle du tissu cérébral sain pouvant en revanche devenir douloureuse. Le RNT laisse la radiothérapie en "session unique ou répétée" et ne précise ni le nombre de séances ni le nombre d'examens IRM par souris, alors que ces répétitions sont l'objet même du projet.
Objectifs
Chaque année, environ 65 000 européens sont diagnostiqués avec une tumeur cérébrale primitive. La radiothérapie est une option thérapeutique établie en association avec une chimiothérapie ou une résection chirurgicale. Même si son efficacité a largement été prouvée, la radiothérapie peut cependant engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. En effet, la progression tumorale et la radio-nécrose ont des approches thérapeutiques et des pronostics différents : des sessions supplémentaires de radiothérapie peuvent être bénéfiques pour les patients présentant une récidive de la maladie, alors qu'elles sont contre-indiquées lors de présence de radionécrose. Par conséquent, des biomarqueurs spécifiques et sensibles sont nécessaires pour différencier le plus tôt possible les deux effets. Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie. Ainsi, l’objectif de cette demande est de développer un modèle de radionécrose chez la souris portant un gliome.
Bénéfices attendus
Ces modèles sont représentatifs de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement. L’IRM devrait permettre de détecter la radionécrose, et de la différencier de la pseudo-progression. Les données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour 1) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies chirurgicales et 2) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie. Ces informations sont cruciales pour mieux orienter le traitement du patient.
Procédures
Un premier groupe de 100 animaux sera soumis à une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Un deuxième groupe de 50 animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses en intraveineux (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse d'un agent de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d'au minimum 3 jours.
Impact sur les animaux
Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.
Devenir
A l’issue de la radiothérapie (ou pas pour les contrôles), les animaux seront transférés à un autre établissement utilisateur pour les héberger à proximité d’une plateforme d’imagerie pour leur suivi par IRM. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de confirmer les résultats IRM avec des coupes histologiques.
Remplacement
Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic précoce et fiable de la radionécrose. Il n'existe pas de modélisation suffisamment aboutie pour reconstituer un micro-environnement tumoral, une immunité, et une vascularisation tumorale suffisamment intégrée pour reconstituer un modèle proche de l'homme. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.
Réduction
Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de quatre jours entre chaque examen. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Pendant les chirurgies et les examens IRM, l'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Au cours du suivi post-opératoire, les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si des signes de souffrance apparaissent, les animaux seront soit euthanasiés soit pris en charge par un analgésique. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur. Les animaux sont observés 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant les chirurgies puis 1 fois par jour. La fréquence repassera à 2 fois par jours en cas de début de perte de poids (10%).
Choix des espèces
Les souris sont des animaux permettant d'obtenir des modèles oncologiques, proches de ceux rencontrés chez l'homme. De plus, leur variabilité inter-individuelle est faible, permettant d'établir des protocoles IRM reproductibles, avant tout transfert à l'homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.
Rôle modulateur des agonistes des récepteurs GABAA dans la signalisation hormonale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
700 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune subissant jusqu'à cinq microcoupures de l'extrémité de la queue et cinq injections, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Les hormones administrées, glucocorticoïdes et hormones thyroïdiennes, peuvent selon le porteur induire une obésité, une résistance à l'insuline, une dyslipidémie, une myopathie, une ostéoporose et une hausse de la mortalité cardiovasculaire. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, trouver une molécule limitant les effets secondaires des traitements du syndrome de Cushing. Après avoir énuméré ces atteintes, le porteur écrit que la dose retenue se situe "dans la plage de doses sûres, sans aucun effet secondaire significatif signalé", et que l'injection et le prélèvement "n'entraînent pas de douleur".
Objectifs
Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim. Cette protéine agit comme un stimulateur de production de graisse (lipogenèse) et un stimulateur de l'appétit. Elle a un mode de sécrétion unique, conservé au cours de l’évolution des organismes, notamment les cellules de mammifères. Cette protéine joue un rôle crucial en aidant les cellules et les organismes à s'adapter au stress nutritionnel, par exemple dans le cas de jeûne, nous pouvons observer sa libération rapide dans le milieu extracellulaire, déclenchant ainsi des réponses adaptatives, telles qu'une modification du comportement alimentaire chez la souris. Nous pouvons aussi observer que cette augmentation de niveau est prolongée dans des conditions telles que le vieillissement, l'obésité, les syndromes métaboliques (dont le syndrome de Cushing), l'inflammation chronique et l'insuffisance rénale. Il est donc essentiel d’étudier l’impact (patho)physiologique de ces dérégulations de la sécrétion de cette protéine. Nous avons mené des expériences préliminaires et avons découvert que l'activation de certains récepteurs stimule la libération de cette protéine à partir de cellules en culture et augmente sa concentration plasmatique chez la souris. De plus, la transcription des hormones thyroïdiennes régule à la baisse le niveau de la protéine. Le rôle des récepteurs des hormones thyroïdiennes doit donc être étudié dans le cadre de la thérapie métabolique. Ainsi, ces expériences nous permettront de clarifier les différents mécanismes d'action de deux hormones liées au métabolisme (thyroxine et glucocorticoïdes) avec notre protéine ainsi que de préciser si notre protéine d'intéret peut servir de pont pour participer aux effets synergiques et antagonistes entre ces hormones.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de trouver une molecule capable de limiter les effets secondaires (comme l'obésité) des traitements actuels pour soigner des syndromes métaboliques tel que le syndrome de Cushing
Procédures
Dans les deux premières procédures, les souris recevront une injection (durée moins d’une minute) et auront un prélèvement de sang (durée d’une minute). Dans les quatre autres procédures, les souris auront toutes 5 prélèvements de deux gouttes de sang après une microcoupure de l’extrémité de la queue (durée moins d’une minute) ainsi qu’un prélèvement de sang (durée d’une minute). Cinq injections (durée moins d’une minute), seront administrées en plus à certaines souris.
Impact sur les animaux
Les injections ou prélèvements sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. Ils sont par ailleurs très petits, ce qui evite les risque d'infections. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les hormones peuvent induire l'obésité, la résistance à l'insuline, la dyslipidémie, la myopathie, l'ostéoporose et une augmentation de la morbidité et de la mortalité thrombotiques cardiovasculaires. La dose de médicament à tester que nous allons utiliser se situe dans la plage de doses sûres, sans aucun effet secondaire significatif signalé.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite qu’exclusivement in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs ( in silico, organoïdes, organes sur puce) permettant d’étudier dans son ensemble notre problématique. En effet, il nous faut mesurer la concentration d’une protéine dans le sang et, en même temps, la variation de prise de poids sur un organisme entier selon les effets métaboliques que peuvent avoir certains traitements.
Réduction
Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Il existe des différences entre les sexes dans les réponses hormonales c’est pourquoi ces procédures seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne) et nous utiliserons des petites aiguilles stériles, ce qui évitera les risques d'infection. Le prélèvement sur la queue sera réalisé après une microcupure indolore qui se refermera très rapidement par coagulation. L'injection ou le prelevement n'entrainent pas de douleur mais nous mettrons en place une grille de suivi stricte des points limites qui permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués (l'atteinte d'un des critères entrainent l'euthanasie de l'animal). Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé
De nouveaux régulateurs impliqués dans l’établissement de la tolérance immunitaire dans le thymus
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
La paralysie part de la queue et remonte le long de la moelle épinière, et le porteur limite la procédure à trente jours pour cette raison. 660 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 570 en sévère, toutes tuées pour analyse. Elles reçoivent des injections sous-cutanées et intraveineuses sous anesthésie gazeuse pour induire une sclérose en plaques, ou des cellules tumorales injectées sur chaque flanc suivies de quatre injections de traitement, avec une mesure quotidienne des tumeurs et une mise à mort au vingt-et-unième jour parce que le modèle devient létal au-delà de trente jours. L'objectif déclaré est d'identifier deux régulateurs de l'éducation des lymphocytes T, avec un bénéfice renvoyé au conditionnel face à une immunothérapie qui, selon le porteur, n'est efficace que chez 20 % des patients.
Objectifs
Les lymphocytes T sont un sous-type de globules blancs qui combattent les virus, les bactéries ou encore les cancers. Ces lymphocytes sont éduqués à ne pas reconnaître nos propres tissus comme des éléments étrangers dans un organe du système immunitaire appelé le thymus. Des dérégulations dans leur éducation peuvent conduire à des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques ou le diabète de type 1, mais également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. Dans le thymus, les cellules épithéliales médullaires thymiques, appelées mTEC, sont critiques à l’éducation des lymphocytes T. L’identification de régulateurs de l'éducation des lymphocytes T constitue un défi majeur pour améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la protection contre les maladies auto-immunes et les cancers. Dans ce contexte, notre équipe a identifié deux nouveaux régulateurs associés au développement de la sclérose en plaques. Nous avons alors émis l’hypothèse que ces facteurs pourraient contribuer à l’éducation des lymphocytes T. Notre projet visera à 1) caractériser le rôle de ces facteurs dans la protection contre des pathologies auto immunes à l’aide d’un modèle murin de sclérose en plaques ; 2) analyser l’impact de ces facteurs sur l'éducation des lymphocytes T et 3) déterminer l’impact de la déficience de ces facteurs sur la réponse antitumorale. En résumé, l’ensemble de ces travaux de recherche permettra de mettre en évidence la fonction de ces nouveaux facteurs clé dans la protection contre des maladies auto-immunes et l’éradication des tumeurs.
Bénéfices attendus
Les maladies auto-immunes touchent 5 à 10% de la population mondiale. Cependant, face à la complexité de ces maladies, il n’existe actuellement aucun traitement permettant de guérir les patients atteints. Par ailleurs, un défaut d’éducation des lymphocytes T peut également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. La stratégie actuelle utilisée pour booster la réponse des lymphocytes T contre la tumeur est basée sur l’utilisation d’anticorps : l’immunothérapie. Cependant, elle n’est efficace que chez seulement 20% des patients. Identifier les régulateurs de l'éducation des lymphocytes T pourrait constituer une nouvelle stratégie pour améliorer l’éradication des tumeurs et la protection contre les maladies auto-immunes. Ce projet pourrait démontrer que ces régulateurs sont critiques dans la lutte contre des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques et à plus long terme pourrait orienter les médecins vers des tests génétiques plus précis pour un meilleur diagnostic. De plus, ces régulateurs pourraient être impliqués dans l’efficacité de la réponse anti tumorale dans des contextes de tumeurs comme le mélanome ou le fibrosarcome. Notre approche de ciblage de ces régulateurs en combinaison avec une immunothérapie basée sur l’utilisation d’anticorps devrait améliorer l’efficacité des agents thérapeutiques pour améliorer la réponse anti tumorale.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse générale combinée a une injection sous cutanée d’analgésique (3 minutes par animal). Pour le protocole de sclérose en plaque, ces souris recevront en plus deux injections intraveineuse (3 minutes par animal) sous anesthésie gazeuse générale. Pour les deux types de tumeurs, les souris recevront sur chaque flanc des cellules tumorales par injection sous-cutanée sous anesthésie gazeuse générale (2 injections simultanées, pour une intervention d’environ 3 minutes par animal). Les souris recevront également 4 injections intra-péritonéales de traitement anti-tumoral (30 secondes par injection). Les tumeurs seront mesurées tous les jours post-injection sous anesthésie gazeuse générale (2 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées et intraveineuses seront réalisées sous anesthésie générale légère par anesthésie gazeuse générale minimisant le stress, l'inconfort et la douleur liés à ces injections. Concernant le modèle de sclérose en plaque, la maladie peut générer des nuisances importantes caractérisées par la paralysie progressive de l’animal en commençant par la queue et remontant le long de la moelle épinière. Pour limiter la durée de souffrance des animaux, ces derniers seront suivis quotidiennement et la procédure n’excèdera pas les 30 jours. Concernant le modèle de sclérose en plaques ainsi que l’immunisation, l’injection sous-cutanée peut éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée attentivement de manière quotidienne. La probabilité d’apparition de ces nuisances et leur intensité sont susceptibles d’augmenter progressivement au cours de la procédure et devront être contrôlés. Concernant les modèles de cancer, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort, une douleur prolongée. Ce modèle pouvant être létal au-delà de 30 jours, les souris seront suivies, mises à mort et analysées à un temps de 21 jours dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress lié à la manipulation, une perte de poids, une gêne à la mobilité, une douleur.
Devenir
Les animaux d'intérêt générés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale ne permet d’étudier la tolérance immunitaire et les cellules épithéliales thymiques. De plus, cette étude prend place dans un contexte pathologique, à savoir les pathologies auto-immunes et le cancer dans notre cas. Notre projet nécessite une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Nous essaierons autant que possible de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Le choix du nombre animaux est réalisé en prenant en considération la variabilité interindividuelle, la variabilité de réponse au traitement antitumoral et la variabilité de prise et de pousse des cellules tumorales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Ainsi, des cohortes de 4 à 5 animaux par groupe, selon les procédures, seront utilisées avec un total de trois expériences indépendantes. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront randomisés en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Du coton pour confectionner des nids est introduit dans chaque cage. Les animaleries bénéficient d'une température régulée à 21°C, d'une hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur par lignée sauf pour l’étape de randomisation dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse générale avant chaque injection et mesure. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne dès le début des procédures expérimentales afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur à l’aide d’une grille d’évaluation, à l’apparition de signes de douleurs des analgésiques seront administrés. En cas de faiblesse pouvant altérer la prise alimentaire ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Dans le cas du modèle de sclérose en plaques, les souris seront suivies quotidiennement et l’avancement de la pathologie sera mesuré à l’aide d’une grille constatant le niveau de paralysie de l’animal pouvant induire une augmentation de la surveillance à deux fois par jour.
Choix des espèces
L’espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés. La génétique de la souris est bien connue et étudiée depuis longtemps. De plus, la souris est le modèle de base pour étudier le système immunitaire et en particulier le thymus. Ce modèle animal couramment utilisé permet grâce à des techniques d’ingénierie génétique de cibler un gène précis dans un type cellulaire spécifique afin d’étudier sa fonction. Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines, correspondant à un stade développemental de jeune adulte. A ce stade, le thymus des souris est pleinement développé et atteint sa taille et sa fonctionnalité maximale.
Prélèvements de tissus pour la caractérisation de souris génétiquement modifiés en recherche thématique, avec ou sans phénotype dommageable.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris hébergées est immunodéprimée, donc fragilisée face aux infections, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable tout en affirmant que leur bien-être n'en est pas affecté tant que l'hébergement reste adapté. 25 960 souris génétiquement modifiées vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré tient en un prélèvement de moins de deux millimètres de queue ou d'oreille, réalisé une fois sur des souris vigiles au moment du sevrage, avec un second prélèvement possible entre cinq et douze semaines si le génotypage échoue. Ces souris passent ensuite en utilisation continue dans d'autres projets, et l'effectif déclaré est calé sur les statistiques des années précédentes, avec une marge prévue pour les projets des cinq prochaines années.
Objectifs
Notre établissement utilisateur élève des animaux génétiquement altérés dédiés à la recherche scientifique dans divers domaines tel que la cancérologie, l'immunologie, neurologie, maladies métaboliques etc. Pour cela, nous utilisons une méthode de prélèvement de queue pour la caractérisation génétique. De plus, nous hébergeons des lignées immunodéprimées caractérisées de phénotype dommageable pour certains projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
Les lignées immunodéprimées ont pour objectif de répondre à des questions scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie ou de surveiller le maintien du statut sanitaire SPF dans le cas des sentinelles. Le génotypage permet la caractérisation génétique des lignées génétiquement altérées avec ou sans phénotype dommageable pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques des différentes structures travaillant dans notre animalerie (thématiques développées : cancérologie, digestif, cardiaque, osseux...).
Procédures
Prélèvement de queue (
Impact sur les animaux
La biopsie au niveau de la queue ou de l’oreille peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue ou d'oreille permet le génotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études.
Remplacement
Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes alternatives moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de poils, de salive ou de fécès. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle soit applicable pour tous ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Les animaux immunodéprimés sont nécessaires pour des projets de recherche en immunooncologie. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est basé sur les statistiques des années précédentes et en lien avec les différents besoins en fonction des projets scientifiques. Ce dernier reste suffisamment important pour pouvoir y inclure de futurs projets d’ici les 5 prochaines années. Nous sommes en cours d'expertise pour développer des méthodes de génotypage moins invasives. Concernant les animaux utilisés comme sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode alternative aux animaux de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, cela nous affranchirai de l’utilisation des animaux. Lorsqu’une lignée n’a plus d’intérêt scientifique à moyen ou long terme, nous encourageons l'arrêt de l'élevage de cette dernière associé à une méthode de conservation autre (cryopréservation...).
Raffinement
La biopsie de queue ou la biopsie à l’oreille sont réalisées lors du baguage sur des animaux vigiles. Ces méthodes sont éprouvées, précises, rapides (quelques secondes), standardisées et réalisées par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. En cas de signes de stress ou de douleur, du Douxocalm pourra être appliqué. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptés avec un statut sanitaire stricte et une fréquence de change rapprochée.
Choix des espèces
Nous avons majoritairement des élevages de souris. Ces animaux sont utilisés en fonction des besoins pour les différents projets scientifiques. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.
Développements méthodologiques en IRM chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 150
Prélevés en priorité parmi les animaux surnuméraires d'élevage, ceux dont le génotype ou le phénotype ne correspond à aucun besoin et qui sont de toute façon destinés à la mise à mort, 150 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ils passent un examen d'IRM de une à trois heures sous narcose ou anesthésie, avec le cas échéant une injection de produit de contraste et des mesures de glycémie. Le porteur reconnaît qu'un réveil en cours d'examen ou un stress thermique ne peuvent pas être exclus, et indique que les souris et les rats sont tués à l'issue de la procédure. La finalité déclarée est l'amélioration de l'"offre de prestations" de la plateforme d'imagerie, et la rubrique consacrée à la réduction se limite à une phrase, sans justifier l'effectif de 300 animaux non-humains.
Objectifs
Notre plateforme de recherche est spécialisée dans l’imagerie préclinique (IRM) et la spectroscopie (SRM) par résonance magnétique. Les projets menés sur cette plateforme concernent des thématiques en biologie et en santé comme par exemple la cancérologie, la nutrition, les maladies neurodégénratives, la compréhension de pathologies ou encore la validation de nouveaux traitements. Pour améliorer son offre de prestations aux équipes de recherche et aux entreprises, la plateforme est amenée à développer en collaboartion avec les équipes support et utilsatrices, de nouvelles méthodes et de nouveaux protocoles d’IRM et de SRM. Ces développements méthodologiques sont toujours réalisés et validés dans un premier temps sur des objets-test spécifiques. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de valider in-vivo cette fois-ci, ces nouvelles méthodes sur un nombre limité d'animaux. L’objectif de la présente demande n’est pas de se substituer au dépôt d’une demande d'autorisation de projet spécifique.
Bénéfices attendus
Proposer des outils d'imagerie opérationnels en utilsant en prioprité des animaux surnuméraires destinés à être mis à mort, en vue d'étdues plus spécifiques.
Procédures
Les animaux feront l'objet d'un examen d'IRM d'une durée comprise entre 1h et 3h. Les interventions prévues sur les animaux concernent la narcose (isofurane), l'anesthesie et le cas échéant, l'injection intraveineuse ou intrapéritonéal d'un produit de contraste, ou encore de solution saline (NaCl) ou de glucose, ainsi que des mesures de glycémie réalisées sous anesthésie ou narcose avec analgésie locale.
Impact sur les animaux
Malgré les efforts de raffinement (cf. 3.3.6.2) on ne peut exclure, (i) un stress thermqiue dû à l'anesthésie et/ou la narcose ou à certaines séquences d'imagerie (ii) le réveil de l'animal en cours d’examen ou (iii) un stress lors de l'installation de l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure. Dans le plupart des cas, des organes pourrant être prélevés à l'issu de la procédure.
Remplacement
Dans la plupart des projets menés par la plate-forme, less développements méthodologiques sont réalisés et validés dans un premier temps sur des objets-test spécifiques. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de valider in vivo ces nouvelles méthodes et protocoles sur un nombre limité d'animaux afin d'optimiser ces nouvelles méthodes aux conditions expérimentales réelles (configuration matérielle nécessaire, posiiton de l'animal, suivi physiologique spécfique, synchronisation aux mouvements respiratiores ou cardiaques).
Réduction
Dans le mesure du possible, les animaux utilsés seront des animaux d’élevage destinés à la mise à mort (car génotype ou phénotype non cibles).
Raffinement
Pendant l'examen, une attention particulière est donnée au maintien de la températrue corporelle des animaux. De plus du gel ophtalmique est utilsé systèmatiquement. Les animaux bénéficient d'un enrichissement social et physique dans la zone d'hébergement. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une recherche systématique de points limites. Tous les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie générale avec une analgésie ad’hoc.
Choix des espèces
L'IRM de la platefrome est conçue principalemant pour l'imagerie pré-clinique. Le rat et la souris sont les espèces préférentielles des utilsateurs. Le stade de développement sera adapté en fonction du besoin méthodologique, ou en fonction des animaux disponibles si le stade de développement n'a pas d'influence sur le besoin méthodologique..