Oncologie

552 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 504 femelles gestantes tuées pour que leurs embryons soient prélevés à treize jours et demi puis seize jours et demi de gestation, tandis que 24 mâles et 24 femelles reproducteurs sont gardés vivants et réutilisés jusqu'à la fin du projet. Le geste infligé aux mères tient en trente secondes, un gavage unique. Les souriceaux, eux, sont anesthésiés par le froid pendant dix minutes puis décapités. Le laboratoire développe en parallèle des organoïdes cardiaques humains en trois dimensions qui reproduisent déjà le début de la trabéculation, et le bénéfice annoncé pour les patients tient en une ligne, comprendre le mécanisme "permettra d'agir pharmacologiquement".

Objectifs

Le syndrome de non compaction cardiaque est une malformation congénitale d’origine diverse. La non compaction s’observe souvent dans les maladies métaboliques. Le cœur en développement forme à partir des parois ventriculaires et auriculaires des trabécules se projetant dans les chambres afin d’augmenter la surface d’échange entre les cardiomyocytes et le sang avant que le système coronaire ne soit mis en place. On parle alors de trabéculation Vers le stade embryonnaire E13.5 (milieu de la gestation) chez la souris, les trabécules régressent et les parois ventriculaires s’épaississent. On parle alors de compaction. Nous connaissons assez bien les mécanismes cellulaires de la trabéculation mais très mal l’origine incluant le signal de la compaction. Nous avons déjà des nombreuses données incluant des données d 'expression génique montrant que la régression des trabécules est due à une sénescence des cellules cardiaques bordant le trabécules puis par leur élimination par des macrophages. De plus, le changement du métabolisme cardiaque au mileu de la gestation semble impliqué dans le processus de sénéscence. Pour valider ces données, nous délèterons un gène essentiel pour la sortie des cellules du cycle prolifératif et un gène impliqué dans le changement métabolique preferentiellement dans les cardiomyocytes embryonnaires et étudierons le phenotype des cœurs à différentes étapes du développement cardiaque.

Bénéfices attendus

La non compaction impacte l’hémodynamique cardiaque et est à l’origine de défaillance cardiaque. Elle ne peut pas contrairement aux autres malformations cardiaques être réparée par chirurgie. Comprendre ce mécanisme permettra d’agir pharmacologiquement

Procédures

gavage 30 s une seule fois dans leur vie. Anesthésie par le froid pour les souriceaux (10 min) avant mise à mort par décapitation

Impact sur les animaux

Le gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiqué par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Il permet la diffusion de la molécule à chaque embryon et sera appliqué qu’une seule fois pour chaque souris.

Devenir

504 animaux femelles utilisés dans le projet seront mis à mort au moment de la collection d 'embryons à E13.5 et E16.5 . Les mâles (24) et les femelles (24) ayant donné naissance aux souriceaux seront conservés et pouront être réutiilisés juque la fin du projet .

Remplacement

Nous etablissons un modèle cellulaire d'organoides cardiaques en 3D in vitro. Nous utilisons en effet en parallele des cellules souches embryonnaires humaines differenciées en different types de cellules cardiovasculaires au sein de cardioides en 3D. Ce modèle humain montre des trabecules naissant mais requiert encore une optimisation pour mimer la trabéculation et la compaction.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d un phénotype lié à l’utilisation de notre modèle avec une significativité statistique. il existe une variabilité inter-portée c'est pourquoi il nous faut 6 portées par condition expérimentale. Nous effectuerons un test statistique de comparaison de la variance à 2 facteurs pour comparaison inter groupes . Les données acquises sur le modèle cellulaire d'organoides cardiaques humains en 3D in vitro validant des données acquises chez les souris permettront de diminuer les effectifs de souris par groupe.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum , cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle de développement cardiaque reflétant les étapes du développement cardiaque humain y compris les phénomènes étudiés dans ce projet ( trabéculaton et compaction). Les stades de développement E13.5, E16.5 et nouveau-nés ont été choisis de part les phenomènes biologiques se déroulant à ces stades (trabéculation versus compaction et changement de métabolisme cardiaque, respiration de l 'O2...)

Sous anesthésie générale, 360 souris reçoivent une inflammation de la patte ou une opération témoin et 360 autres une lésion nerveuse, 100 recevant en plus quatre injections de tamoxifène. Au total, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes anesthésiées puis tuées pour prélever leur moelle épinière. Le but est de comprendre comment le toucher devient douleur, en suivant l'activité des neurones de la corne dorsale chez des souris génétiquement modifiées porteuses d'un capteur calcique. Le porteur annonce deux jours de tests comportementaux avant l'induction du modèle puis trois semaines de tests après, sans préciser lesquels, et écrit qu'aucune procédure du projet n'entraîne d'effet indésirable majeur en dehors de la douleur qu'il provoque.

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les autres neurones ? Comment l’information tactile se propage-t-elle à travers ce circuit ? En combinant des techniques de pointe – imagerie calcique en microscopie multiphotonique, enregistrements électrophysiologiques ciblés – chez des souris exprimant génétiquement un marqueur d’activité neuronale, nous visualiserons en temps réel la dynamique de l’activation de ce circuit et identifierons les neurones impliqués. Nous étudierons le rôle de neurotransmeteurs dans ces mécanismes de plasticité, notamment la sérotonine et l'ocytocine.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre le rôle des neuromodulateurs dans la plasticité des réseaux neuronaux spinaux en conditions physiologiques et pathologiques.

Procédures

Les animaux subiront entre 4 et 5 interventions au total (cf description annexe schématique du projet). Le groupe de souris CFA est composé de 180 Sham + 180 CFA = 360 animaux. Le groupe de souris neuropathiques est composé de 360 animaux. L'ensemble de ces animaux seront testés pendant 2 jours pour étudier leur comportement avant tout modèle de douleur, puis pendant 3 semaines une fois le modèle établi. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Aucune des pocédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeures. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio-dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistentes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'excitabilité neuronale de la corne dorsale. L'objectif du projet est d'étudier l'activité neuronale de la moelle épinière et les contraintes techniques de cette approche nécessitent de réaliser l'étude ex vivo.

Remplacement

Pour ce projet, l'utilisation de souris transgéniques permettant la visualisation de l'activité neuronale de la moëlle épinière est nécessaire. Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant au maximum 4 males ou 5 femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois toutes les 2 semaines. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h). Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les procédures expérimentales impliquant une anesthésie et une analgésie se feront à l'aide de mélanges de Kétamine et de Xylasine. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet, et seront euthanasiés en cas de points limites atteints, après consultation de la SBEA et selon le fascicule « la douleur de l’animal au cours d’une expérimentation », élaborée par le service communication de l’école Vétérinaire de Lyon.

Choix des espèces

Les souris transgéniques GCamp sont les seules espéces animales dotées d'un senseur calcique exprimé au sein de leurs cellules neuronales. L'utilisation d'autres marqueurs calciques exogènes est toxique pour les neurones qui y sont exposés et est donc peu recommendé pour l'étude de réseaux neuronaux physiologiques et physiopathologiques. Par ailleurs, seules les souris permettent à l'heure actuelle de cibler l'expression du senseur calciques dans des populations spécifiques de neurones spinaux. Adultes (P21-35) pour comparaison avec les autres données de la littérature

Obtenir un foie gras sans gavage : 600 canards de trois génotypes vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. De l'éclosion à dix-sept semaines, ils subissent six heures par jour à dix degrés sous leur optimum thermique, des variations d'éclairage, deux semaines de restriction alimentaire à -25 %, puis une remise à volonté destinée à les faire manger au-delà de leur besoin. Vingt canards par groupe et par semaine sont saignés au sinus occipital pour doser un marqueur d'engraissement du foie, avant l'abattage et le prélèvement des tissus. Le porteur situe la recherche dans "un contexte d'intensification du questionnement sociétal relatif au bien-être animal" et juge "nécessaire" de porter l'effort sur le canard, l'oie ne représentant que 2 % de la production française.

Objectifs

Aujourd’hui, la production de foie gras repose sur le gavage des animaux. Dans un contexte d’intensification du questionnement sociétal relatif au bien-être animal, des recherches ont été entreprises sur des méthodes alternatives à cette pratique pour la production de foie engraissé. Les premiers travaux concluants ont été réalisés sur l’oie mais celle-ci ne représente que 2 % de la production française de foie gras. Il est donc nécessaire à présent de concentrer les efforts de recherche sur le canard. L’objectif du présent projet est d’utiliser plusieurs leviers physiologiques et métaboliques susceptibles d’induire un engraissement hépatique en les mettant en œuvre de façon précoce, dès le développement embryonnaire, de façon à bénéficier des périodes où l’oiseau présente une grande plasticité d’adaptation métabolique et physiologique et de les tester chez trois génotypes de canards (Barbarie, mulard et Pékin) et les deux sexes. Le canard mulard résulte du croisement d’un mâle Barbarie avec une femelle Pékin. Ces trois génotypes de canard ne présentent pas la même sensibilité aux variations de la photopériode et de la température, la même vitesse de croissance, le même comportement alimentaire, ni la même aptitude à la production de foie gras lorsqu’ils sont gavés. Ce projet a pour objectif d’explorer la réponse de ces génotypes face à une combinaison de différentes modalités de stimulation du développement des organes digestifs, de l’hyperphagie (surconsommation spontanée d’aliment) et/ou de la capacité de synthèse et de stockage des lipides par le foie. En conditions standards d’élevage, la capacité d’engraissement corporel global des femelles est en général supérieure à celle des mâles d’où l’intérêt d’étudier la réponse des canards des deux sexes. Les leviers testés seront l’exposition à une baisse de température au cours de la dernière phase de développement embryonnaire et de la croissance, la composition (ratio énergie/protéines, teneurs en fibres et antioxydants) et les modalités de distribution de l’aliment (durée et fréquence des repas, restriction suivie d’un apport à volonté), la durée et l’intensité de l’éclairage.

Bénéfices attendus

Sur le plan scientifique, ce projet mettra à profit les connaissances récemment acquises sur la programmation thermique embryonnaire et post-éclosion des oiseaux (poulets, canards) et devrait permettre d’enrichir celles portant sur le métabolisme des lipides du canard en croissance et la régulation de son ingéré alimentaire sous l’effet conjugué de différents facteurs, la photopériode (durée et intensité d’éclairage), les modalités de distribution de l’aliment (durée et fréquence des repas, restriction, distribution à volonté) et la composition de l’aliment (ratio énergie/protéines, teneurs en fibres et antioxydants). Ce projet permettra aussi d’enrichir les connaissances sur le comportement alimentaire du canard. L’objectif de ce projet est de chercher une alternative à l’alimentation forcée représentée par l’acte de gavage pour l’obtention d’un foie engraissé. Si la combinaison des leviers précités permet d’atteindre cet objectif, il représentera un changement évident de pratique d’élevage. Il s’agira ensuite de la valider et de l’optimiser puis d’évaluer son impact sur les aspects environnementaux, économiques et sociétaux. Les résultats de ce projet permettront aussi d’ouvrir un large champ d’investigation pour décortiquer les mécanismes comportementaux, physiologiques et métaboliques mis en œuvre chez les animaux aux différents stades de leur croissance et de la phase d’engraissement du foie.

Procédures

A l’éclosion, les canetons seront sexés, pesés et leur aspect visuel et leur vivacité seront évalués. Au cours de la croissance, les canards seront pesés en semaines 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Une prise de sang au sinus occipital sera réalisée sur 20 canards vigiles par groupe et par semaine d’abattage lors de la période d’alimentation à volonté de S13 à S17 soit un total de 600 canards. Cela nous permettra de déterminer la concentration plasmatique en chémerine, un marqueur de l’engraissement du foie et de vérifier que ce marqueur reste robuste même si l’engraissement du foie est éventuellement plus modéré que celui obtenu par gavage. Ces canards seront abattus pour évaluer leur composition corporelle et prélever des échantillons de différents tissus. De J1 à J70, les canards seront exposés à une diminution temporaire quotidienne (6h/24h) de la température ambiante de 10°C par rapport à leur optimum thermique, à des variations de l’intensité lumineuse (40-50 lux pendant les repas et 5-10 lux entre les repas) et de la durée d’éclairage (diminution de 24h à 16h d’éclairage de J1 à J21 puis de 16h à 8h de J70 à J78 et augmentation de 8h à 16h à J85) à une restriction alimentaire de -25% par rapport à l’ingéré à volonté de J70 à J84 suivie par une distribution à volonté de l’aliment de J85 à J119.

Impact sur les animaux

L’exposition à une baisse de la température de 10°C pendant 6 h/24 h pourra induire un inconfort thermique en particulier au cours de la première semaine d’élevage (exposition à 20°C au lieu de 30°C), mais dès l’éclosion, les canetons sont capables de maintenir leur température corporelle lorsque la température ambiante ne descend pas au dessous de 20°C. Ce seuil de température ambiante au-dessus duquel les canards sont capables de maintenir leur température corporelle diminue progressivement avec l’âge et la température dans le bâtiment d'élevage diminue également. Les canetons seront élevés en groupe et sur des copeaux de bois qui apportent un confort thermique lorsque les animaux sont couchés. La phase de restriction alimentaire pourra induire une frustration des animaux. L’apport de fibres dans l’aliment et la mise à disposition de grit (mélange de graviers et de coquilles broyées) et de bottes de pailles sur le sol ont pour objectif de ralentir le transit digestif et de favoriser le comportement exploratoire des canards et donc de réduire leur nervosité éventuelle. La diminution de l’intensité lumineuse favorisera aussi une ambiance calme dans le bâtiment. Le prélèvement de sang peut engendrer une réaction de stress lors de la contention et l’animal peut ressentir une douleur modérée lors de la piqûre. Le diamètre des aiguilles qui seront utilisées pour les prélèvements de sang sera adapté au gabarit de l’animal. Il n’y a pas en principe de saignement post-prélèvement et la cicatrisation est très rapide. La prise de sang est réalisée avec du matériel stérile dans un environnement propre pour limiter le risque d’infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur (abattage dans des abattoirs agréés) pour évaluer leur composition corporelle, l’engraissement du foie et prélever des échantillons de différents tissus.

Remplacement

Etant donné que cette étude porte sur les alternatives au gavage du canard en utilisant différents leviers physiologiques et métaboliques, l’utilisation de l’animal ne peut pas être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.

Réduction

L’effectif total d’animaux mis en procédure dans cette étude est 600. La concentration du plasma en chémerine (une hormone marqueur de l’engraissement du foie) sera déterminée sur 20 canards par sexe et par génotype qui seront abattus chaque semaine au cours de la dernière période d’élevage (S13-S17) lors de l’alimentation à volonté. Les paramètres de composition corporelle et d’expression tissulaire de la chémerine seront mesurés sur 20 canards par sexe et par génotype. Ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence un effet significatif des conditions d’élevage au regard de l’expérience acquise sur des études précédentes concernant ces différents paramètres.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe et au sol sur une litière de copeaux de bois dans un bâtiment d’élevage standard. Ils disposeront de mangeoires circulaires pour la première semaine afin de permettre un accès plus facile à l’aliment puis ensuite de mangeoires linéaires qui sont plus hautes pour éviter le gaspillage alimentaire. L’accès à l’eau sera effectué avec des abreuvoirs en cloche. En dehors des repas, l’intensité lumineuse sera réduite à 5-10 lux pour limiter la nervosité des animaux. Le milieu sera enrichi avec des bottes de paille permettant aux animaux d’exercer une activité exploratoire en particulier lors de la période de restriction alimentaire. Les effets des conditions d’élevage sur le comportement et l’activité des animaux seront évalués à 35 jours pour la phase de croissance, à 85 jours pour la phase de restriction alimentaire et à 105 jours pour la phase d’alimentation à volonté à l’aide d’une méthode d’évaluation du bien-être. Cette méthode comporte 3 étapes : un questionnaire regroupant tous les indicateurs de moyens, qui sont liés à l’environnement de l’animal, des mesures de comportement sur un échantillonnage d’animaux et des informations sanitaires. Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Une grille d'évaluation (indicateurs physiologiques, comportementaux et d'état corporel) sera mise en place afin d'assurer un suivi quotidien et de détecter précocement toute altération du bien-être des animaux. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal blessé et/ou prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation pour un placement en infirmerie ou une mise à mort selon l’état corporel de l’animal.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de tester une combinaison de leviers physiologiques et métaboliques susceptibles d’induire un engraissement du foie chez le canard en croissance. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. La possibilité d’expérimenter chez l’animal cible du projet (canard) est la plus adaptée. Le canard mulard résulte du croisement d’un mâle Barbarie avec une femelle Pékin. Ces trois génotypes de canard ne présentent pas la même sensibilité aux variations de la photopériode et de la température, la même vitesse de croissance, le même comportement alimentaire, ni la même aptitude à la production de foie gras lorsqu’ils sont gavés. Ce projet a pour objectif d’explorer la réponse de ces génotypes face à une combinaison de différentes modalités de stimulation du développement des organes digestifs, de l’hyperphagie (surconsommation spontanée d’aliment) et de la capacité de synthèse et de stockage des lipides par le foie. Nous élèverons les canards de l’éclosion jusqu’à l’âge de 13 à 17 semaines correspondant à la période de distribution à volonté de l’aliment afin de suivre l'évolution hebdomadaire de l’engraissement du foie. Pour stimuler la surconsommation d’aliment et donc la synthèse de lipides par le foie, les canards vont être soumis au préalable à une période de restriction alimentaire pendant les semaines 11 et 12. Cette restriction alimentaire ne peut pas intervenir trop tôt dans la croissance des animaux afin d’éviter un impact à long terme sur leur développement corporel.

Deux heures de chirurgie pour fixer un support sur le crâne, jusqu'à quarante séances d'IRM en contention sur six à huit mois, une prise de sang par semaine pendant deux mois : 64 souris et 64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains reçoivent en plus une injection de virus fluorescent dans le cerveau pendant l'opération. Le projet est présenté comme une amélioration du bien-être des animaux non-humains, puisqu'il vise un berceau d'IRM plus confortable que les barres d'oreilles habituelles, et les prises de sang hebdomadaires dosent l'hormone du stress. Tous les rongeurs sont tués à la fin pour chercher dans leur cerveau les marqueurs moléculaires de ce même stress.

Objectifs

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie très courante. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet d’obtenir des évaluations non invasives de l’activation cérébrale rendant ainsi possible un suivi à long-terme. Le développement de cette technique chez le rongeur, avec le but d’établir une cartographie fonctionnelle de leurs fonctions cognitives, permettra d’établir un lien avec la recherche humaine. Pour cela, il est nécessaire d’effectuer les mêmes modalités d’imagerie et dans les mêmes conditions physiologiques chez les rongeurs et dans l’espèce humaine. Jusqu’à présent, les contraintes liées à l’IRMf notamment en terme d’immobilité, ont conduit essentiellement à la réalisation de protocoles sur rongeurs anesthésiés. Cependant, l'utilisation d'anesthésiques pendant l'IRMf empêche toute investigation sur les modalités de traitement des informations par le cerveau de façon consciente . La réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente donc un intérêt majeur. Nous souhaitons construire un tout nouveau berceau IRM qui sera utilisé dans un protocole d’habituation pour l'adaptation des rongeurs à l'environnement du scanner, améliorant ainsi le bien-être animal et permettant d’obtenir des résultats non biaisés par un état de stress et limitant le nombre de rongeurs nécessaires par étude car induisant une diminution des variabilités inter individus. Ce nouveau berceau sera jugé sur l’amélioration du confort des animaux lors des acquisitions IRMf et la diminution de leur niveau de stress. Les animaux seront maintenus à l’intérieur du berceau à l’aide d’un système de fixation implanté sur le dessus du crâne et évitant donc l’utilisation de la contention par des barres d’oreilles. De plus, l’innovation majeure de notre berceau sera la présence d’un tapis roulant placé dans le berceau qui permettra aux rongeurs de marcher à l’intérieur de l’IRM lors des sessions, ce qui aura pour effet de limiter leur niveau de stress. Une fois l’animal mis en confiance avec son environnement, il augmentera alors ses périodes d’inactivité pendant lesquelles les acquisitions IRM pourront avoir lieu.

Bénéfices attendus

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie d’imagerie médicale aujourd’hui très développée et répandue. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet de visualiser, de manière indirecte, l’activité cérébrale. L’IRMf est un outil performant pouvant être utilisée sur un grand nombre d’animaux, ce qui en fait un pont majeur vers la recherche humaine. Le développement de cette technique chez le rongeur afin de pouvoir dresser une cartographie fonctionnelle des fonctions cognitives complexes et donc essentiel pour ensuite établir un lien translationnel entre la recherche animal et humaine. Cela nécessite que les acquisitions se déroulent dans les mêmes conditions à la fois chez l’homme et chez l’animal pour qu’une comparaison puisse se faire. Les acquisitions IRMf chez l’homme se font chez des patients éveillés c’est pourquoi la réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente un intérêt majeur. De plus, les quelques exemples d’IRMf de rongeurs éveillés sont réalisés dans des conditions stressantes pour l’animal (fixés par des barres d’oreilles, maintenus immobiles…). L’intérêt de notre projet est donc de pouvoir réaliser des enregistrements en IRMf tout en améliorant le bien-être animal afin de réaliser des expériences plus fiables.

Procédures

Ce projet consiste à développer une technique fiable et appropriée d’IRM fonctionnelle chez le rongeur éveillé à l’aide d’un berceau innovant et d’un protocole d’habituation adapté. Pour pallier aux contraintes liées à l’IRMf en terme d’immobilité, les rongeurs devront être soumis à une procédure chirurgicale de courte durée (2h) afin de positionner un système de fixation. Lors de cette intervention, certains animaux recevront une injection (5min) de virus fluorescent au niveau des structures cérébrales. Cela permettra de mesurer lors des acquisitions IRM l’activité neuronale au niveau des structures ciblées. Ces acquisitions IRM auront une durée maximum de 2h en fonction du comportement de l’animal, avec un maximum de 2 séances par semaine (une période d’une semaine entière sera laissée à l’animal pour récupérer entre deux séances consécutives). L’objectif sera de pouvoir acquérir des données sur une période de 6 à 8 mois avec un maximum de 40 sessions sur cette période. En début de procédure, pendant une période de 2 mois, en plus des phases d’étude IRMf, les animaux auront des prélèvements sanguins réguliers (5min, 1 fois par semaine) afin de contrôler leur taux de corticostérone dans le sang (également appelée l’hormone du stress), et des tests de comportements visant à évaluer l’anxiété et la socialisation des animaux seront également réalisés chaque semaine (2 tests de 10min) pour compléter les résultats obtenus avec l’ensemble des données physiologiques.

Impact sur les animaux

Les chirurgies de mise en place des systèmes de fixation et d’injection de virus pourront entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. La présence d’un dispositif chirurgical intracérébrale pérenne pourra induire une gêne chez l’animal. Les premières sessions d’habituation pourront stresser les animaux induisant une modification du comportement. L’immobilisation par contention des animaux pourra induire un stress chez les animaux. Les prélèvements sanguins effectués chaque semaine pourront induire un stress chez les animaux.

Devenir

La suite du projet prévoit des analyses histologiques du cerveau afin d’étudier certains marqueurs moléculaires pouvant être lié à l’état de stress des animaux. Les animaux seront donc euthanasiés afin de conserver le cerveau dans un état le plus proche possible de son état physiologique.

Remplacement

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie d’imagerie médicale aujourd’hui très développée et répandue. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet de visualiser, de manière indirecte, l’activité cérébrale. L’IRMf est un outil performant pouvant être utilisée sur un grand nombre d’animaux, ce qui en fait un pont majeur vers la recherche humaine. Le développement de cette technique chez le rongeur afin de pouvoir dresser une cartographie des fonctions cognitives complexes est donc essentiel pour ensuite établir un lien direct entre la recherche animale et humaine. Cela nécessite que les acquisitions se déroulent dans les mêmes conditions à la fois chez l’homme et chez l’animal pour qu’une comparaison puisse se faire. Les acquisitions IRMf chez l’homme se font chez des patients éveillés, et c’est pourquoi la réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente un intérêt majeur pour la comparaison des données. De plus, les quelques exemples d’IRMf de rongeurs éveillés sont réalisés dans des conditions très stressantes pour l’animal (fixés par des barres d’oreilles, maintenus immobiles…), l’intérêt de notre projet est donc d’accéder à ces données tout en améliorant le bien-être animal afin d’obtenir des expériences fiables.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de rongeurs à utiliser dans chaque groupe avec un logiciel de statistique et en s’appuyant sur des expériences antérieures similaires d’évaluation du niveau de stress lors d’acquisitions IRM sur rongeurs éveillés. Nous arrivons à 49 rongeurs par groupe. D’après notre expérience, nous savons que chaque rongeur a besoin d’un calendrier différent pour l’entraînement et que certains ne seront jamais en mesure de réaliser des acquisitions IRM éveillés dans de bonne condition, sans stress. Cette proportion d’animaux non entraînables est estimée à 30%. Nous souhaitons pouvoir mettre au point ce protocole à la fois chez la souris et chez le rat. De plus, le but étant de développer un protocole général qui sera utilisé par tout projet ultérieur, il va donc être nécessaire de faire des tests avec les deux sexes. Nous arrivons donc à un total de 128 animaux pour ce projet. Ce nombre pourra être diminué en analysant en continu les données enregistrées. Chaque rongeur étant acheté au fur et à mesure, il n’y aura donc pas d’animaux inutilisés.

Raffinement

Les critères qui seront les plus importants pour cette étude seront l’amélioration du confort des animaux lors des acquisitions IRMf et la diminution de leur niveau de stress. Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pendant les interventions chirurgicales les animaux sont anesthésiés et recevront un analgésique ainsi que des injections d’anesthétique locales afin d’éviter toutes douleurs. Pour le suivi post chirurgie d’implantation des posts de fixation, nous utiliserons une grille de score dans laquelle des points limites sont déterminés afin de s’assurer que l’état de santé des animaux ne se dégrade pas. Si une souffrance est observée, l'animal sera pris en charge, et des soins adaptés seront mis en place en fonction de son état avec administration d’analgésique pour pallier à cette souffrance. Si un des points limites est atteint alors l’animal sera sortie d'expérimentation.

Choix des espèces

Les résultats précliniques de l'IRMf sur les rongeurs (que ce soit les souris ou les rats) ont été vérifiés à plusieurs reprises chez l'homme, ce qui en fait un bon modèle pour tester des médicaments ou étudier des hypothèses sur le fonctionnement du cerveau. En outre, les scanners IRM précliniques ont de petites cavités, ce qui permet d'utiliser uniquement de petits animaux, et conviennent à l'IRMf sur les rongeurs. Enfin, nous utiliserons des rongeurs adultes mâles et femelles, car l'étude que nous voulons réaliser ne nécessite pas de rongeurs jeunes ou très jeunes. Nous n'utiliserons donc, que des rongeurs entre 2 mois et un an et demi.

Six heures de jeûne, une laparotomie, une ligature de l'œsophage et la pose d'un cathéter dans le canal biliaire : 60 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées sous anesthésie à la fin de l'intervention pour prélever leurs organes. L'opération mesure les sécrétions du pancréas et de la bile chez des souris privées du récepteur CD36 dans les papilles gustatives, pour préciser le rôle du "goût du gras" dans la préparation de la digestion. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à la description de cette nouvelle lignée, qui pourra ensuite servir de modèle pour d'autres questions. Le choix de l'espèce tient à la lignée elle-même, le porteur écrivant que ce modèle génétiquement modifié n'existe que chez la souris, ce qui le rend selon lui "indispensable".

Objectifs

Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. C’est plus précisément les récepteurs gustatifs, exprimés par les cellules des bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) qui permettent la détection des saveurs. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Le signal gustatif est transmis au cerveau par les nerfs gustatifs, conduisant à une augmentation des sécrétions digestives préparant le corps à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue – cerveau – intestin. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas CD36 ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras, due à une altération de l’axe langue – cerveau – intestin, avec notamment une diminution des sécrétions digestives déclenchées lors d’une application linguale de lipides. Comme CD36 est exprimé dans plusieurs tissus et organes, il a été difficile de déterminer chez ces souris, le rôle oral dans les effets observés. Ainsi, des souris génétiquement modifiées qui n’expriment pas CD36 uniquement dans les papilles gustatives ont été générées. Le but de ce projet est d’étudier le rôle de CD36 lingual dans l’activation des sécrétions digestives chez les souris qui n’expriment pas CD36 dans les papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description d’une nouvelle souche de souris génétiquement modifiées qui n’exprime pas le récepteur CD36 dans les papilles gustatives et qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur l’expression de CD36 et le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard et sera pesé de façon hebdomadaire. Six heures avant la manipulation, les souris seront mises à jeun (de nourriture seulement). Lors de la manipulation, une injection sous-cutanée d’analgésiant puis une injection intrapéritonéale d’anesthésiant seront effectuées. Un anesthésique local sera également appliqué. Les souris endormies seront tondues au niveau de l’abdomen. Une laparotomie, une ligature de l’œsophage et cathétérisation du canal biliaire seront réalisés sous anesthésie générale. Un prélèvement sanguin intracardiaque (sous anesthésie toujours) sera réalisé puis les souris seront mises à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux, ils auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaire pour les injections sous-cutanées (analgésiques) et intrapéritonéales (anesthésiques). Une douleur est également à prévoir lors de cette injection sous-cutanée et lors de cette injection intrapéritonéale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

La sécrétion pancréato-biliaire est une étude faisant intervenir une communication inter-organes ainsi qu’une sécrétion pancréatique in vivo. C’est un paramètre métabolique qui ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable . Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur, la désinfection des surfaces, l’utilisation d'un champ stérile, la stérilisation des outils de dissection, la tonte de la zone d’incision et la désinfection de la peau.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la phase post-ingestive et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude.

Dépilés à la crème jusqu'à dix fois, immunisés jusqu'à douze fois, piqués jusqu'à sept fois pour des prises de sang, 1 500 rats et 750 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but est de produire des anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d'un seul animal, à la demande de partenaires industriels qui commandent les cibles. Les animaux dont la réponse immunitaire reste faible sont tués sans attendre, les autres partent vivants chez le client, qui prélève ensuite le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Aucun calcul statistique n'a fixé les effectifs, le porteur indiquant s'être entendu avec ses partenaires sur trois à dix animaux par cible.

Objectifs

L’objectif de ce projet est la création d’une grande diversité d’anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d’un seul animal. Pour cela, un antigène (sous forme d’ADN ou de peptide/protéine) est administré à des rongeurs, afin que le système immunitaire produise des anticorps multiples. Le sang (contenant les cellules lymphatiques) et les organes (ganglions lymphatiques, la rate et la moelle osseuse) de ces animaux seront collectés pour récupérer ces anticorps. Les antigènes en question seront des récepteurs cellulaires humains ciblés et permettront de développer de nouveaux candidats médicaments. La découverte et le développement de ces anticorps appropriés à l'action très spécifique est donc indispensables dans le traitement de maladies infectieuses et des cancers ainsi que dans le diagnostic de ces maladies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'obtention d'outils thérapeutiques afin de traiter des pathologies telles que les cancers, les maladies inflammatoires et neurologiques notamment. Ils constituent donc des solutions thérapeutiques majeures.

Procédures

Les animaux seront soumis aux dépilations (jusqu'à 10), aux immunisations (jusqu'à 12) et aux prélèvements sanguins (juqu'à 7). Chaque intervention dure environs 3 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la douleur des administrations/injections/prélèvements sanguins, la douleur aux niveaux des sites d'administrations/injections (irritations, légères réactions inflammatoires), et le stress causé au moment de la dépilation (crème dépilatoire), des immunisations, des prélèvements de sang et de la contention aux moments de ces interventions.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort. Si aucune réponse immunitaire significative ne peut être détectée chez un animal, l’immunisation est arrêtée et l’animal est mis à mort. Par contre si la réponse immunitaire est présente, les animaux sont expédiés a notre partenaire pour collecter les Anticorps.

Remplacement

La bibliographie montre que le remplacement des anticorps d’origine animale par des anticorps synthétiques a été initié depuis plusieurs années dans différents domaines mais que, dans l’état actuel de la technologie, il reste des situations dans lesquelles soit les anticorps synthétiques restent inadaptés donc inutilisables (anticorps dirigés contres des protéines dénaturées, anticorps anti-peptides), soit l’évolution vers l’utilisation d’anticorps d’origine non animale en production sera un processus de longue durée et les obstacles techniques subsistent (anticorps à usage thérapeutique ou diagnostic). La production d’anticorps monoclonaux et polyclonaux spécifiques de l'antigène, nécessite l'interaction complexe de toutes les cellules (surtout des cellules B) et d’organes lymphatiques impliqués dans le système immunitaire d'un organisme vivant mammifère. Le développement d’une grande diversité d’anticorps par leurs séquences n'est pas possible en l'état actuel de la recherche, tant par les techniques de culture cellulaire que par l'utilisation d'organes isolés, raison pour laquelle l'immunisation d'organismes entiers (souris et rats) est nécessaire. Les dernières découvertes oncologiques ont montré que des facteurs individuels dans les voies de signalisation cellulaire humaines qui jouent un rôle central dans le développement du cancer (ou d'autres maladies importantes) sont donc appropriés comme "cibles" de nouveaux médicaments pour combattre ces maladies. Les anticorps conviennent particulièrement bien comme "candidats médicaments", car ils se caractérisent généralement par une spécificité d'action très élevée et une action sélective par rapport à la cible (moins d'effets secondaires), contrairement à de nombreux autres candidats médicaments (par ex. par voie chimique) qui ont des effets secondaires importants, car ils agissent de manière très peu spécifique. C'est pourquoi la découverte et le développement d'anticorps appropriés et très spécifiques sont indispensables pour de meilleures mesures thérapeutiques contre des maladies telles que le cancer.

Réduction

Nous réalisons ce protocole à la demande de nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre leurs objectifs scientifique. Aucune approche statistique n'a été réalisée. Le nombre d'animaux utilisés par projet d'immunisation varie entre 3 et 10 animaux par immunogène ; le nombre d'animaux utilisés dépend de l'antigène et de l'espèce animale à immuniser. Afin d'obtenir une diversité suffisamment élevée des anticorps à développer, 3 à 10 animaux sont immunisés par groupe et par cible, en fonction de la cible et de l'espèce. Une fois l'immunisation effectuée, les cellules lymphatiques (provenant des organes cibles pertinents pour les cellules immunitaires comme la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse) sont prélevées sur les animaux immunisés. Il n'y a pas de groupe d'animaux de contrôle par essai/antigène cible. Les sérums pré-immunitaires des mêmes animaux immunisés servent de contrôle dans les essais. De plus, pour une bonne campagne d'immunisation pour le criblage des cellules B, il est important de prélever les organes des animaux le plus frais possible et de les traiter directement après le prélèvement. Une cryoconservation des organes lymphatiques ou de leurs cellules après le prélèvement serait réalisable, mais serait également responsable d’une très grande perte de matériel cellulaire, en raison de la mort des cellules due au processus de congélation et de décongélation, ce qui nécessiterait l’utilisation de plus d’animaux immunisés pour avoir la quantité d’anticorps voulu. C’est pour cette raison, que les animaux immunisés sont transportés vivants jusque chez notre client, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour une campagne d'immunisation.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant de l'enrichissement (bâtons de bois et matériel de nidification) et une surveillance est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation. Les contentions, épilations, immunisations et prélèvements sanguins sont réalisés par un personnel formé et expérimenté. En cas d'inflammation (au niveau des sites d'administrations/injections), une injection sous-cutanée d'analgésie sera réalisée, elle pourra etre répétée 24 h après si nécessaire.

Choix des espèces

Les animaux à immuniser doivent être des mammifères possédant une réponse immunitaire humorale (anticorps sécrétés par les cellules lymphocytaires B). Pour qu'une immunisation avec un antigène cible humain s'accompagne d'une réponse immunitaire significative de l'espèce immunisée, il est nécessaire que l'homologie de l'antigène cible entre l'animal et l'homme soit suffisamment différente pour que l'antigène cible soit reconnu comme "étranger" chez l'animal et que celui-ci produise des anticorps spécifiques à l'antigène cible. C'est le cas chez le rat et la souris qui produise des anticorps de bonne qualité. Les animaux seront tous utilisés au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Les animaux utilisés auront au minimum 6 semaines d’âge et maximum 20 semaines (au démarrage du protocole). A cet intervalle d'âge, les animaux présentent une réponse immunitaire particulièrement bien développée et réagissent avec une diversité aussi grande que possible de différents anticorps contre un antigène. Une grande diversité de séquences d'anticorps différentes est importante pour le développement d'anticorps candidats, car l'objectif est de reconnaître le plus grand nombre possible d'épitopes et de liaisons à l'antigène avec différentes affinités. A partir de l'âge d'environ 20-25 semaines, la réactivité et la diversité peuvent diminuer.

Greffées de cellules leucémiques prélevées chez des enfants, par voie intraveineuse ou directement dans le fémur sous anesthésie générale, 3 842 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à douze prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse, une irradiation sub-létale de sept minutes et un gavage quotidien pendant quatre semaines. Les souris développent une leucémie qui provoque perte de poids et affaiblissement général, et toutes sont tuées, pour analyse post-mortem ou parce qu'elles sont transgéniques. Le projet se donne pour objectif d'identifier des approches alternatives à l'utilisation d'animaux non-humains pour l'étude des leucémies pédiatriques, tout en prévoyant 3 842 souris sur sa durée.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes. Irradiations sub-léthale, une seule fois, durée 7 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvements de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries. Les irradiations sub-léthales n'ont aucun effet indésirables au-delà des manipulations légères pour les pratiquer.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.

Tatouées et biopsiées de la queue avant huit jours, puis injectées quatre jours de suite dans la cavité abdominale, 688 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem. Le tamoxifène injecté peut provoquer chez les mâles un œdème testiculaire, voire une hernie inguinale. Deux à cinq prises de sang et jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse au genou suivent l'apparition d'une leucémie lymphoblastique aiguë, dont le porteur écrit ignorer le délai, et qui dégrade l'état des souris en quelques jours: perte de poids, détresse respiratoire, anémie, masses sous la peau, prostration. Il présente ces prélèvements comme respectant "les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux", tout en indiquant que la ponction du genou peut léser le cartilage et perturber les déplacements.

Objectifs

Sur la base de données scientifiques obtenues au laboratoire à partir de patients atteints de leucémies aiguës lymphoblastiques B d’un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de déterminer l’implication, dans le processus leucémogène de cette hémopathie, de deux protéines retrouvées dans les cellules leucémiques de ces patients. Pour cela, nous développerons un modèle murin dans lequel ces deux protéines sont exprimées dans les cellules lymphoïdes pour voir si elles sont à l’origine de la maladie. Ce modèle, s’il mime cette hémopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsable de l’émergence de ce type de leucémie chez l’Homme. Notre projet a pour but : (1) de caractériser les anomalies morphologiques, cellulaires et moléculaires dans le système hématopoïétique des souris qui expriment les deux protéines dans leurs cellules lymphoïdes, (2) de comparer ces anomalies aux anomalies décrites pour ce type de leucémies chez l’Homme, (3) d’étudier expérimentalement la pathogénicité de ces deux protéines. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour développer des thérapies adaptées à ce sous-type particulier de leucémie lymphoblastique qui échappe aux thérapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intégre dans une projet de recherche translationnelle, à partir d’observations cliniques, qui ont permis de mettre en évidence un sous-type particulier de patients atteints de leucémies lymphoblastique B de mauvais pronostic. Une meilleure compréhension des mécanismes de leucémogenèse de ce type particulier de leucémies permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le projet décrit ici est intégré dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autre, le criblage de molécules sur des lignées cellulaires de patients de ce sous-groupe de leucémie pour identifier de nouveaux médicaments qui permettraient de cibler ces cellules leucémiques particulières, et de guérir les patients.

Procédures

Les souris transgéniques seront tatouées et une biopsie de queue sera réalisée avant 8j. Les animaux au génotype d'intérêt seront soumis à quatre injections dans la cavité abdominale de produits chimiques (1 injection par jour pendant 4 jours sur animal vigile) au cours de la procédure. Pour suivre l’évolution de la leucémie attendue, 2 à 5 prises de sang, à raison d’une prise par ou au maximum deux prélèvements de moelle osseuse réalisés sur animal anesthésié), avec au minimum 2 mois entre les deux prélèvements, pourront être réalisés sur ces souris. Les souris immunodéprimées seront soumises à une injection de cellules de moelle osseuse murine (sur animal vigile en contention). Deux à quatre prises de sang, à raison d’une prise par mois (sur animal anesthésié ou vigile selon la voie de prélèvement choisie pourront être réalisées pour suivre l’évolution de la leucémie.

Impact sur les animaux

Le tatouage et la biopsie de queue induiront une douleur légère de courte durée. Les animaux transgéniques recevront une dose définie de tamoxifène par injection intra-péritonéale. Ceci peut s’accompagner d’une inflammation au site d’injection et de douleur abdominale au moment de l’injection. Chez les mâles, un œdème testiculaire peut apparaître secondairement, voire une hernie inguinale. De même, l’injection intra-veineuse de cellules de moelle osseuse murines dans les souris immunodéprimées peut s’accompagner d’inflammation au site d’injection. Etant donné l’immunodépression des souris , il ne devrait pas y avoir de réaction de rejet. Sur le plus long terme, notre hypothèse de travail est que les souris développeront des leucémies aiguës lymphoblastiques. Nous ne connaissons pas le délai d’apparition des symptômes. Lorsque la maladie se déclare, l’état de santé des souris se dégrade rapidement (quelques jours). Les cellules leucémiques se propagent, se multiplient et envahissent la moelle osseuse. Ceci entraine une forte perturbation de la production de cellules sanguines. Les souris perdent généralement du poids et, dans les stades avancés, présentent des signes de détresse respiratoire, d’anémie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostrées, et leur pelage n’est plus bien entretenu. La ponction de moelle osseuse étant réalisée au niveau du genou, la souris peut avoir des lésions au niveau du cartilage qui perturbent ses déplacements. Enfin, il existe toujours un risque d’infection au niveau du point de ponction.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

La fonction des deux protéines dans la cancérogénèse sera étudiée sur les modèles animaux, en les exprimant dans leur environnement médullaire complexe difficilement modélisable in vitro ou ex vivo. Les études mécanistiques seront réalisées à partir de modèles de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lignées cellulaires humaines exprimant ou non les deux protéines en culture. Nos collaborateurs disposent également de lignées de B-LAL du sous-type CDX2/UBTF. Mais ces lignées ne permettent pas répondre aux questions concernant l’émergence des leucémies dans une moelle saine.

Réduction

Les chiffres indiqués dans le dossier correspondent au nombre estimé maximal d’animaux utilisés pour les expériences envisagées. Comme il s’agit d’études exploratoires, il est difficile de prévoir exactement l’impact des de l’expression des deux protéines étudiées sur la leucémogenèse. Sur la base de notre expérience et de la littérature, et en tenant compte de la variabilité observée dans les études précédentes entre les animaux eux-mêmes, un nombre d’animaux minimum et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été estimé à n=4 à 20 animaux par groupe expérimental en fonction de l’étude. Le nombre d'animaux nécessaire par expérience a été déterminé par fonction mathématique à 10 animaux par groupe pour obtenir des résultats robustes et fiables statistiquement. De plus, la possibilité d’analyser la numération sanguine des animaux par prise de sang et d’immunophénotyper les cellules de moelle osseuse ponctionnées au niveau du genou permet une étude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilisés. Dire seulement qu’une partie du projet repose sur une étude longitudinale avec réalisation de prélèvements répétés sur les mêmes animaux en respectant les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux entre chaque prélèvement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal dans des portoirs ventilés (baton, coton et frisure pour faire un nid). Ils seront acclimatés au moins deux semaines après leur arrivée à l’animalerie et avant le début de toute procédure. Les procédures ont été établies afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux expérimentations. Une anesthésie sera pratiquée pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement durant les procédures. En cas de signes d’infection, la plaie sera traitée avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre les procédures et garantir le bien-être animal en évitant des souffrances inutiles.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui représente l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : •nombreux protocoles bien établis pour cette espèce •possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés •modèles mimant très bien les cancers hématologiques et qui ont déjà fait l’objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilisés car les potentielles applications thérapeutiques s'adresseront à une population humaine adulte.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un nématode intestinal par gavage et par un Plasmodium responsable du paludisme murin, puis saignées deux fois par semaine par incision de la queue, la croûte de cicatrisation étant retirée à chaque nouveau prélèvement. L'infection détruit leurs globules rouges et provoque une anémie qui culmine autour du quatorzième jour. Le porteur affirme que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier le rôle d’effecteurs immunitaires spécifiques dans la dynamique de l’infection par un nématode intestinal et un Plasmodium murin lorsqu’ils coïnfectent leur hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque le deuxième parasite infecte un hôte préalablement infecté par l’autre espèce (indépendamment de l’ordre avec lequel les deux parasites infectent l’hôte) on constate un rebond de la dynamique de l’infection. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle que joue la réponse immunitaire de l’hôte dans ce rebond.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de l’infection quand les hôtes sont coïnfectés par un nématode intestinal et Plasmodium. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection la dynamique des deux parasites est altérée avec des rebonds qui peuvent affecter la santé de l’hôte. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la réponse immunitaire de l’hôte joue dans ces rebonds et par extension dans le risque encouru par les populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des différents groupes expérimentaux): gavage (une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Cependant, l’infection par Plasmodium produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie. Cette anémie est transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection) et après jour 24 les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Le gavage ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animale vigile et sont réalisées en quelques secondes (volume injecté = 100 µl), la nuisance étant donc limitée à cette phase de contention. Les injections intraveineuses sont réalisées à la veine caudale sur animal vigile à l’aide d’un appareil de contention. La nuisance est attendue est donc également liée au stress engendre par la contention. Cependant, la contention et l’injection durent moins d’une minute. Les prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier prélèvement et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs, ce qui ne devrait pas engendre des nuisances particulières. Les collectes de fèces sont effectuées en isolant les souris. L’isolement peut provoquer du stress, cependant les souris ne sont isolées que pendant 1 heure, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever les organes en vue d’analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de la coïnfection mettant en jeu un nématode intestinal et un Plasmodium murin. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental. Une analyse de puissance montre qu’avec les différences que nous avons observé dans la dynamique de la coïnfection lors d’expériences précédentes, un effectif de 10 souris par groupe confère une puissance de 90% au seuil de significativité de 0.01.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

Une anesthésie tous les deux jours pendant deux semaines, chacune précédée d'une injection intrapéritonéale: 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, développent des tumeurs pulmonaires ou péritonéales, et certaines déclarent une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et perte de poils. L'objet est de tester deux modifications génétiques de cellules immunitaires humaines, censées mieux attaquer les tumeurs solides. Le porteur décrit les cocultures en deux et trois dimensions déjà menées au laboratoire, puis conclut que le modèle animal reste "indispensable" avant toute application clinique.

Objectifs

Le développement des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) a révolutionné l'immunothérapie du cancer pour certains types de cancer. Ce nouveau type de traitement par immunothérapie consiste à prélever les cellules immunitaires du patient, de les modifier génétiquement en laboratoire pour qu’elles expriment le CAR, puis elles sont réinjectées au patient afin qu’elles reconnaissent et combattent les cellules cancéreuses. Cependant, des améliorations des thérapies CAR restent nécessaires afin de cibler d'autres types de tumeurs et d'assurer une fonction antitumorale durable des cellules modifiées. Nous proposons ici deux nouvelles stratégies de modification génique ciblant chacune des cellules immunitaires différentes, les lymphocytes T et les macrophages, dans le but d'amplifier leurs fonctions antitumorales. Ces cellules sont des leucocytes (globules blancs) qui ont pour but de détruire d’autres cellules : les lymphocytes T détruisent les cellules reconnues comme étrangères (immunité cellulaire) ; et les macrophages phagocytes « mangent » les cellules étrangères ou leurs débris et participent à la présentation des antigènes et à la libération de cytokines. Dans la première stratégie, nous augmenterons la fonction antitumorale des cellules CAR issues de lymphocytes T, augmentant leur production d'interféron (cytokine/protéine produite par les cellules immunitaires afin d’activer la réponse immunitaire chez d’autres cellules impliquées dans la réponse inflammatoire) grâce à de nouveaux mécanismes que nous avons récemment découverts. Dans la deuxième stratégie, nous améliorerons la survie des CAR issus de macrophages, en les dotant d'une protection anti-apoptotique (=mécanisme de mort cellulaire). Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous utiliserons des approches expérimentales similaires dans les deux stratégies, pour établir la preuve de concept d'une activité antitumorale accrue in vivo. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie cellulaire par récepteurs antigéniques chimériques (CAR) permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler les tumeurs solides, ii) elle rencontre des rechutes et des résistances chez près de 50% des patients répondeurs à deux ans. Nous proposons donc deux stratégies pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, le tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires. La première stratégie permet l’amélioration de la fonction antitumorale des CAR-T (lymphocytes T modifier génétiquement). Cela est assuré par le contrôle de la production d’interféron par les cellules T. La forte production d’interféron induite par ces manipulations a permis l’augmentation de la capacité de destruction des cellules tumorales. La deuxième stratégie tend à améliorer la persistance et la survie des CAR-MAC (macrophages modifier génétiquement). Ces cellules sont prometteuses pour la thérapie cellulaire contre les tumeurs solides par leur capacité à se diriger vers la tumeur et leur capacité de phagocytose des cellules tumorales. La solution apportée pour améliorer leur survie a permis d’obtenir des effets thérapeutiques plus importants. De plus, elle a l’avantage de reposer sur une ingénierie génétique stable. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire (sous-catégorie de lymphocytes, proches des lymphocytes T, qui ont un rôle cytotoxique). Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.

Procédures

Dans les trois procédures, nous visons à évaluer l’effet d’un traitement cellulaire sur la progression tumorale, par différentes étapes : A. Plusieurs lots (un par lignée tumorale) d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de comparer la cinétique de progression des différentes lignées tumorales. B. D’autres lots d’animaux vigiles recevront les cellules thérapeutiques par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer la localisation et la persistance des cellules. C. D’autres lots d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après les animaux vigiles recevront un traitement par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer l’efficacité de notre traitement sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires humaines transplantées attaquent le corps de l'hôte, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux développeront des tumeurs pulmonaires ou dans le péritoine, en fonction de la voie d’injection. Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet, avec des lymphocytes T et monocytes modifiés, ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroïdes qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera expriment la luciférase, ce qui permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence qui sera faite deux fois par semaine. Une corrélation entre le niveau de bioluminescence pour chaque lignée cellulaire utilisée et l’état général des souris (évalués à l’aide de la grille de score jointe) sera faite, afin de s’assurer que les tumeurs ne dépassent pas un niveau maximal de bioluminescence et éviter le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en recherche de thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 et 10 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique.