Oncologie

2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un carcinome ovarien leur est implanté par chirurgie ou par injection, puis elles subissent jusqu'à deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie et jusqu'à cinq administrations de traitement par semaine, pendant douze semaines, ainsi que des prélèvements de sang par ponction submandibulaire. Le porteur décrit un gonflement de l'abdomen avec ascite pouvant apparaître huit semaines après l'implantation, et prévoit alors la mise à mort de l'animal. Ce laboratoire travaille à la demande de chercheurs extérieurs et affirme qu'aucune autre méthode n'apporterait un niveau d'information équivalent, sans nommer les approches écartées.

Objectifs

Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheurs extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer ovarien et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou à l'évaluation de nouveaux médicaments. Le cancer ovarien représente un défi majeur de santé publique en raison de son diagnostic tardif et de son impact sur la fertilité des femmes. Malgré des avancées significatives en termes de survie grâce aux chimiothérapies à base d’anticorps thérapeutiques, certaines patientes ne répondent pas ou peu aux traitements. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies afin d’améliorer l’efficacité antitumorale et de lutter contre les phénomènes de résistance. Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer ovarien à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Procédures

Induction de cancer ovarien : 1 acte par animal soit par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale) soit sans chirurgie : injection intrapéritonéale (quelques secondes), injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale) Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 12 semaines sous anesthésie générale Les examens d’imagerie ont une durée de 5 secondes à 30 minutes suivant le type d’imagerie. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 12. Il faut 30 secondes au maximum pour administrer un traitement. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire : en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours. Il faut environs 30 secondes pour effectuer ce type de prélèvement et appliquer un point de pression avec un crayon hémostatique au point de collecte pour arrêter le saignement.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux sont liés à la chirurgie lors de l’induction du modèle orthotopique et au développement de foyers tumoraux au niveau sous-cutané ainsi qu’au niveau de l’ovaire et des viscères. L’administration d’antalgique 1h avant et 24 h après la chirurgie et l’utilisation de l’anesthésie gazeuse permettent de réduire la souffrance animale due à l’incision des plans musculaires et cutanées. Une gêne pourrait apparaitre dans le modèle sous cutanée à partir du moment où la tumeur atteint un volume proche du point limite. Un gonflement de l’abdomen avec présence d’ascite peut apparaitre 8 semaines après l’induction lors de l’évolution des métastases péritonéales dans le modèle orthotopique et dans le modèle carcinose péritonéale. Cette nuisance sera prise en compte dans la grille de. Le point limite étant alors atteint, l’animal sera mis à mort. Nous n’attendons pas de douleur ou d’intolérance liées aux composés testés. Si des effets secondaires apparaissaient, le suivi des animaux via la grille de scoring permettra de les mettre en évidence et de prendre les mesures adéquates.

Devenir

Toutes les souris porteuses de cellules de carcinome ovarien seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

L'étude de tumeurs ou métastases résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en oeuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour réaliser des tests statistiques pertinents. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.

Raffinement

Les méthodes d'imagerie mises en œuvre sont non invasives et certains actes sont réalisés sous anesthésie ce qui limite la douleur et le stress infligé au cours de l’expérimentation. Par ailleurs, Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Elles seront hébergées au nombre de 6 animaux maximum dans des cages de type II (530cm²). Les cages sont enrichies avec des petits cylindres de coton pour la fabrication d’un nid. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. L'induction des modèles tumoraux sera réalisée sous anesthésie générale. Durant les actes de chirurgie, la douleur sera également prise en charge par l’administration d'anti inflammatoire le jour et 24h post opératoire. Les animaux seront observés quotidiennement et des grilles de scoring avec des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris (5 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.

Toutes tuées pour des prélèvements post-mortem, 860 souris reçoivent une greffe de tumeur puis des injections répétées sur animal vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur détaille jusqu'à huit injections intraveineuses par souris sur quatre semaines et annonce comme nuisances une douleur à l'injection, des infections au point d'injection, une perte de poids de plus de 10 %, une gêne liée à la tumeur ou à sa nécrose, et une dégradation de l'état général due à la toxicité des traitements. L'objectif consiste à vérifier chez la souris l'efficacité de complexes anticorps-médicament déjà validés sur cellules. Le porteur affirme avoir "besoin" de connaître les effets sur un organisme vivant, et présente ces études comme un prérequis obligatoire avant une première administration chez l'humain.

Objectifs

Dans beaucoup de cancers une des causes majeures de l’échec des traitements, que ce soit la chimiothérapie ou l’immunothérapie, réside dans la capacité des cellules tumorales à développer des mécanismes de résistance spécifiques qui dépendent du médicament utilisé. Afin de contourner cette résistance et améliorer la survie des patients, de multiples stratégies ont été envisagées, incluant l’utilisation de nouvelles molécules originales avec des mécanismes d’action différents ou l’utilisation de combinaisons de médicaments. Au laboratoire nous avons identifié une nouvelle classe de molécules qui ressemblent à de l’ADN et qui sont capables de bloquer la croissance de divers types de cellules tumorales humaines. Ces données nous ont poussé à développer un système dans lequel nos molécules sont associées à des anticorps utilisés en thérapeutique. Nous avons obtenu la preuve de concept sur des cellules que ces premiers composés sont capables de bloquer la croissance des cellules cancéreuses et nous souhaitons maintenant démontrer qu’ils présentent la même efficacité chez les souris en étant capables d’inhiber le développement tumoral.

Bénéfices attendus

Si nos molécules sont efficaces, nous devrions observer une diminution de la taille de la tumeur chez les souris traitées, voire même une disparition complète. Nous devrions également observer une synergie de l’association entre nos molécules et l'immunothérapie. Les résultats de ce projet permettront donc de confirmer les résultats d’efficacité des molécules que nous avons obtenus sur les cellules cancéreuses. Ces résultats pré-cliniques pourront également permettre, à termes, de proposer une nouvelle stratégie permettant d’améliorer la réponse aux immunothérapies en les combinant avec nos molécules pour augmenter les chances de survie des patients atteints de ce cancer.

Procédures

Tous les gestes seront réalisés sur animaux vigiles. -190 animaux recevront 2 injections intra-veineuse par semaine et sur 4 semaines (3 minutes par injection et par souris). - 430 animaux recevront 1 unique injection sous-cutanée (2 minutes par souris) et 1 unique injection intra-veineuse (3 minutes par injection). - 240 animaux recevront 1 unique injection sous-cutanée (2 minutes par souris). Puis, sur ces 240 souris : - 220 recevront 2 injections intra-veineuse (3 minutes par injection) par semaine pendant 4 semaines ; - 10 recevront 2 injections intra-péritonéale (2 minutes par injection) pendant 4 semaines ; - 10 recevront 2 injection intra-veineuse (3 minutes par injection) ainsi que 2 injections intra-péritonéale (2 minutes par injection) pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : - Une douleur légère au moment de l’injection ou stress ; - Une infection au site d’injection (iv ou ip) ; - Une perte de poids supérieure à 10% du poids initial ; - une gêne liée à la présence d’une tumeur ou nécrose tumorale précoce ; - Une dégradation de l’état général des animaux à cause de la toxicité des traitements.

Devenir

Pour chaque procédure, l'ensemble des souris seront euthanasiées afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Des études d’efficacité de nos complexes anticorps-médicaments sont réalisés in vitro, cependant ce système ne permet pas d’appréhender la complexité d’un organisme entier. Nous avons besoin de connaitre leurs effets sur un organisme vivant et d’étudier leur impact sur le stroma tumoral ainsi que sur la modulation de l’activité anti tumorale du système immunitaire. Par ailleurs, ce projet a pour ambition d’être transféré vers la clinique et ces études sont un prérequis obligatoire pour justifier l’investigation clinique et la première administration chez l’Homme.

Réduction

Afin de réduire à son minimum le nombre de souris utilisé pour l’ensemble des études, nous testerons in vivo les 5 complexes anticorps-medécament les plus efficaces in vitro parmi l’ensemble des complexes générés. Concernant l’approche statistique, chaque lot d’animaux comprendra 10 animaux afin de réaliser les tests statistiques pertinents sur un effectif suffisant. DAu total, sur les 5 ans du projet, le nombre maximal de souris utilisées sera de 860 souris.

Raffinement

Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne y compris les week-ends et jours fériés. Le suivi de la croissance tumorale ainsi que du poids des animaux seront réalisés 2 fois par semaine. Dans le cas où un animal présente un signe de souffrance, différentes décisions peuvent être prises comme l’adaptation des conditions d’hébergement, l’application de soins ou l’euthanasie. Les animaux seront euthanasiés si leur état général est fortement altéré ou si les points limites sont atteints.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est la mieux défini génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses. Les animaux seront utilisés à 6 semaines, âge de leur maturité sexuelle

Toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus, 180 souris reçoivent des cellules de cancer de l'ovaire puis des injections répétées d'anticorps, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les injections intrapéritonéales répétées risquent de provoquer des péritonites, que la chirurgie de pose des mini-pompes peut causer douleur et infection, et que le développement tumoral peut entraîner perte de poids et inactivité. Chaque souris subit en outre une séance hebdomadaire d'imagerie par fluorescence sous anesthésie. Les retombées annoncées pour les patientes restent au conditionnel, et le porteur conclut que le recours au modèle animal est "indispensable" faute de pouvoir reproduire l'environnement tumoral in vitro.

Objectifs

Le cancer de l’ovaire est la principale cause de décès parmi les cancers gynécologiques. ll est responsable de plus de 140 000 décès chaque année dans le monde, représentant la cinquième cause de décès liés au cancer. Sa forme la plus commune est le cancer épithélial de l'ovaire (CEO), généralement diagnostiqué à un stade avancé, avec plus de 95% des tumeurs malignes de l'ovaire. Les traitements standard actuels ne sont toujours efficace pour améliorer la survie des patientes car il y a des récidives à cause du développement de résistances au traitement. La complexité biologique et génomique des CEO a conduit chercheurs et cliniciens à explorer des stratégies ciblées et plus adaptées pour contourner la toxicité des molécules utilisées en chimiothérapie. A ce jour, l’ensemble des tentatives thérapeutiques n'ont que très rarement conduit à des résultats concluants. Depuis une quinzaine d’années, la recherche s’intéresse à l’étude d’une famille de protéines d’intérêt. Ces protéines sont spécifiquement exprimées dans les tissus endocrines (ovaire, testicule, cortex surrénal et placenta) où elles agissent sur les cellules endothéliales (cellules tapissant les vaisseaux sanguins). Nous avons démontré que les niveaux circulants d’une de ces protéines étaient significativement plus élevés chez les patientes atteintes de CEO, suggérant qu’elles joueraient un rôle important dans le développement et ou la progression de ce type de cancer. De plus, une collaboration récente avec des chercheurs du Pays-de-Galles a également mis en évidence l’implication d’un récepteur dans de nombreux cancers dont notamment celui de l’ovaire. Leur équipe ont pu mettre au point un anticorps dirigé contre ce récepteur qui a déjà démontré de son efficacité sur la croissance tumorale du cancer de l’endomètre. Par ailleurs, une étude préliminaire clinique nous a permis de démontrer que les récepteurs des protéines d’intérêt étaient fortement exprimés par les adipocytes (cellules permettant dans le stockage des lipides) et les cellules immunitaires de l’environnement tumoral, plus particulièrement par les macrophages et les neutrophiles. En raison de l’absence de l’environnement tumoral dans les études in vitro, nous souhaitons développer un modèle murin du cancer de l’ovaire afin d’évaluer l’efficacité, in vivo, de l’anticorps dirigé contre le récepteur en combinaison avec un traitement avec les protéines d’intérêt .

Bénéfices attendus

Les analyses, réalisées précédemment sur des échantillons cliniques (de patientes atteintes du CEO) et sur modèles précliniques, suggèrent une implication de la famille des prokinéticines dans la croissance des tumeurs ovariennes par action directe sur l’environnement tumoral. L’action combinée entre un anticorps dirigé contre la tumeur et les prokinéticines pourrait représenter une nouvelle voie thérapeutique prometteuse, notamment chez les patientes qui développement des résistances aux traitement conventionnels. Le projet a pour but d’évaluer et de démontrer la valeur et l’efficacité thérapeutiques de l’anticorps seul ou en combinaison avec les prokinéticines dans le traitement de ce type de cancer.

Procédures

Les souris seront traitées par injection de l’anticorps sur animal anesthésié (durée : 1 minute), deux fois par semaine pendant 2 semaines, entre le 40ème et le 60ème jour après injection de cellules tumorales. La pose des mini-pompes dureront 20 minutes au maximum et Et seront installées pour deux semaines. Les souris seront imagées 1 fois/semaine par, un système d’imagerie utilisant la fluorescence. Cette procédure dure 15 minutes sous anesthesie. Au moment de l’euthanasie des animaux, un prélèvement sanguin qui durera au maximum 5 minutes, sera réalisé sur animaux préalablement analgésiés et anesthésiés.

Impact sur les animaux

L’étude implique des injections intrapéritonéales répétées qui risquent de provoquer le développement de péritonites, un stress à la souris, un léchage de la région d’injection La chirurgie pour la mise en place des mini-pompes peut présenter un stress chez la souris et un léchage de la région opérée, ainsi que de la douleur si une inflammation et une infection se développent. Le développement tumoral chez les souris peut aussi causer une perte de poids et de l’inactivité.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour effectuer des prélèvement de sang pour des dosages sanguins et tissulaires pour faire différentes analyses comparatives du développement tumoral in situ en utilisant les techniques permettant d’étudier les protéines d’intérêt qui serviront à caractériser l’effet de l’anticorps et des protéines d’intérêts sur le développement tumoral

Remplacement

Une étude récente sur le cancer de l’ovaire a permis de faire la preuve de concept que les prokinéticines et leurs récepteurs sont directement impliqués dans l’ensemble des causes de ce cancer. Les protéines d’intérêts semblent agir directement sur l’environnement tumoral pour atténuer de façon indirecte sa croissance et progression. Ainsi, nous souhaitons avoir recours à des animaux, pour valider ces observations et combiner leurs actions avec celles de molécules qui agiraient directement sur la tumeur comme le nouvel anticorps. Les modèles in vitro ne nous permettant pas de démontrer les effets des cellules immunitaires sur la progression de ce cancer le recours au modèle animal est donc indispensable. Ces études sont à réaliser sur des animaux qui peuvent intégrer les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie.

Réduction

Au total nous envisageons d’utiliser 180 animaux répartis en 2 groupes : 60 animaux dans le groupe 1 et 120 animaux dans le groupe 2. Nous avons choisi d’inclure 20 souris pour chaque condition dans le groupe 1 (et 20 souris pour chaque condition dans le groupe 2 pour avoir le nombre nécessaire de souris différentes par technique envisagée dans ce projet. Ce nombre a été déterminé afin d’atteindre des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) quotidiennement. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Le poids des souris sera mesuré tous les jours. Des points limites spécifiques à ce projet seront également pris en compte afin de veiller au bien-être des animaux. Les interventions seront realisées sur animal anesthésié.

Choix des espèces

Le projet a pour but de déterminer l’efficacité d’un anticorps dans le contexte du cancer de l’ovaire et de caractériser le rôle des protéines d’intérêts dans l’environnement tumoral de ce cancer. Les souris utilisées dans nos expériences sont des souris immunocompétentes, c’est-à-dire possédant un système immunitaire complet et compétent. Ce modèle nous permettra d’étudier les interactions complexes entre les différents composants du système immunitaire et la cellule tumorale du cancer de l’ovaire. Plusieurs études ont montré qu’il existe une grande similitude entre le développement tumoral chez la souris et chez la femme et dans l’expression et la régulation des gènes tumoraux et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse (phénomène de nouveaux vaisseaux sanguins) et de l’inflammation. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles.