Oncologie

Le thon rouge n'étant pas manipulable en captivité, 24 bars d'élevage sont utilisés à sa place pour mettre au point une balise électronique implantée censée suivre les migrations d'un poisson de forte valeur commerciale. Ces 24 individus, tués à l'issue, subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré : implantation d'électrodes sous la peau et dans le muscle dorsal sous anesthésie, moins de trente minutes d'opération, 24 heures dans un couloir de nage, puis exposition à des courants électriques. Les électrodes sont récupérées sur les cadavres. Le porteur cale l'intensité des courants sur les consignes applicables aux êtres humains et en déduit qu'elle ne "devrait pas causer des nuisances", tout en indiquant qu'elle pourrait provoquer un picotement dans le muscle.

Objectifs

Les expérimentations décrites dans cette demande visent à avancer sur la compréhension du cycle de vie du thon rouge, un poisson migrateur de grand valeur culturel et économique en France. Il est proposé de développer des moyens d’observation pour comprendre la réponse physiologique des animaux à leur environnement. Nous travaillons au développement d’une marque électronique combinant une marque interne pour collecter des informations physiologiques (température corporelle, fréquence cardiaque…) et une marque satellite de type ‘pop-up’ permettant de collecter des informations environnementaux (température, pression, lumière …) pendant les migrations, et de les transmettre par satellite à l’issue du déploiement à la surface de la mer. Pour cela, il est nécessaire d’établir une communication intracorporelle entre le capteur implanté (marque interne) et le concentrateur des informations (marque externe). Notre choix s’est porté sur l'utilisation de la conductivité électrique des tissus biologiques pour transmettre un signal électrique de très faible intensité. Nous souhaitons donc mettre en œuvre deux expérimentations. Avant toute chose, une expérimentation sur le thon rouge n’est pas envisageable. Nous proposons de réaliser ces expérimentations sur une espèce élevée en captivité, le bar, Dicentrarchus labrax. La première expérimentation vise à confirmer que les très faibles courants utilisés restent imperceptibles pour le poisson. La gamme d'intensité des courants de stimulation est basée sur les consignes pour les êtres humains et donc ne devrait pas causer des nuisances. Pendant l'exposition aux courants électriques, nous évaluons leur innocuité avec des indicateurs physiologiques et comportementaux. La seconde expérimentation a pour objectif de mettre en œuvre une communication intracorporelle afin de valider son principe.

Bénéfices attendus

Ces mesures permettront d’une part de vérifier l'innocuité des dispositifs de communication intracorporelle. La deuxième phase permettra de valider la possibilité de faire communiquer deux dispositifs électroniques au travers du corps de l'animal en vue du développement d'un réseau de capteurs implantés. A l’issue de ces deux expérimentations, nous devrions pouvoir concevoir un premier prototype de marque implantée communicante pour le thon rouge.

Procédures

Les poissons seront équipés avec des électrodes en Inox très fines et flexibles, sous cutanées et dans le muscle dorsal, sous anesthésie générale. La durée de l'opération est inférieure à 30 minutes. Cette chirurgie sera suivie par 24 heures de récupération, protégé des perturbations humaines. Puis, chaque individu sera soumis à des stimulations par courant électrique à très faible intensité.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress du poisson lors des manipulations et de l'anesthésie, puis la nuisance d'avoir des électrodes très fines sous la peau et à la surface du muscle. Les individus seront maintenus pendant 24 heures dans un couloir de nage. L'intensité maximale du courant pourrait provoquer un picotement dans le muscle mais cette intensité est imperceptible chez l'homme.

Devenir

A la fin de la procédure, les poissons seront euthanasiés pour récupérer les électrodes.

Remplacement

Cette étude, qui implique la mesure des facteurs de conditions corporelles et des réponses physiologiques doit être réalisée sur des animaux. Il n’est pas possible de remplacer les poissons par un autre modèle pour ce type de procédures.

Réduction

Le nombre de 12 individus pour chacune des procédures (12+12 = 24) est basé sur une analyse de puissance avec le logiciel G*Power.

Raffinement

Le protocole de manipulation et d’anesthésie est optimisé et parfaitement maîtrisé. Les électrodes sont très fines mais très résistantes et flexibles. Leur finesse et flexibilité minimisent la nuisance au poisson, et lui permettent une liberté de mouvement. Pendant les expériences les poissons seront protégés de toute nuisance visuelle et sonore. Pendant l'exposition aux courants électriques, nous évaluons leur innocuité avec des indicateurs physiologiques et comportementaux.

Choix des espèces

Le bar est une des principales espèces élevées en pisciculture et sa physiologie est bien étudiée. Les individus seront tous adultes et sexuellement matures, pour permettre le bon placement des électrodes.

Pour établir le rôle d'une enzyme dans la résistance des mélanomes aux traitements, 1 728 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau ou dans les poumons une greffe de cellules de mélanome, puis un gavage trois fois par semaine pendant cinq semaines ou des injections d'immunothérapie, avec un suivi de la rechute jusqu'à trois mois. Les tumeurs peuvent s'ulcérer et se nécroser, le gavage peut léser l'œsophage, et toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus tumoraux. Le porteur conclut qu'en l'absence de système artificiel reproduisant l'environnement d'une tumeur, la souris constitue "un modèle sans alternative".

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau qui reste difficile à traiter malgré les progrès récents grâce aux thérapies ciblées et aux immunothérapies. Globalement, plus de 50% des patients ont besoin de traitements supplémentaires, justifiant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La fonction des enzymes appelées déubiquitinases dans la réponse des mélanomes aux thérapies actuelles est très mal connue. Dans ce contexte, l’objectif du projet est de montrer l’importance de certaines enzymes comme RPN11 dans la réponse et la résistance thérapeutique des mélanomes.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra d’apporter la preuve de concept pré-clinique de l'importance de l’enzyme RPN11 dans la réponse des mélanomes aux thérapies ciblées et aux immunothérapies (bénéfices à court terme). A plus long terme, notre projet doit permettre d’identifier de nouveaux biomarqueurs de la réponse des patients aux thérapies actuelles ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des stratégies innovantes permettant de combattre le mélanome métastatique résistant.

Procédures

Pour les greffes sous-cutanées, les animaux sont anesthésiés et reçoivent sur un flanc une injection de cellules de mélanome (1 minute/animal). La croissance des tumeurs est suivie trois fois par semaine par mesure au pied à coulisse (1 minute/animal) jusqu'à 3 mois après le début du traitement pour suivre la rechute tumorale. Pour les greffes pulmonaires, les animaux sont anesthésiés puis injectées avec des cellules de mélanome bioluminescent (1 à 2 minutes/animal). La croissance des tumeurs est suivie par analyse de la bioluminescence sur les animaux anesthésiés le jour de l’injection puis une fois par semaine pendant le traitement (durée de l'analyse 30 min/groupe d'animaux). L’expérience est poursuivie jusqu’à 12 semaines après le début du traitement pour suivre la rechute tumorale. Une partie des souris reçoivent les traitements par gavage oral (1 minute/animal). L’administration des substances se fait trois fois par semaine pendant 5 semaines. Une autre partie des souris sera traitée par l’immunothérapie par injection en intrapéritonéale (1 minute/animal) à raison de 3 injections pendant 1 semaine.

Impact sur les animaux

- Ulcération/nécrose des tumeurs sous-cutanées - Les injections intrapéritonéale peuvent provoquer une inflammation locale - Perte de poids anormale suite au traitement - Risque de lésion de l’œsophage lors du gavage oral.

Devenir

Dans tous les cas, à la fin de l’expérience ou lorsque les points limites sont atteints, il est nécessaire de prélever post-mortem les tissus tumoraux afin de réaliser des analyses complémentaires permettant de confirmer l’intérêt des cibles thérapeutiques identifiées. Tous les animaux sont donc mis à mort et ne seront pas réutilisés.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement, nous avons réalisé un certain nombre d'expériences in vitro qui ont permis de déterminer les conditions optimales pour cibler l’enzyme RPN11 dans le mélanome. Cependant, en l’absence de système artificiel pouvant reproduire in vitro l’environnement complexe d’une tumeur, il est nécessaire de confirmer nos résultats dans des modèles pré-cliniques de réponse thérapeutique chez la souris. La combinaison de nos modèles permettra d’apporter une solide preuve de concept in vivo de l'importance de RPN11 pour l’amélioration des thérapies ciblées et des immunothérapies. En ce sens, le modèle murin constitue un modèle sans alternative pour les études pré-cliniques visant à valider de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Nos études sont réalisées dans le souci d'utiliser un nombre minimum d'animaux sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaires au projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables. Le recours à des techniques d'imagerie non invasive réduit de façon importante le nombre d’animaux nécessaires dans chaque groupe expérimental. Dans tous les cas, les tissus tumoraux sont prélevés post-mortem à la fin de l’expérience afin de réaliser des analyses complémentaires permettant de valoriser au mieux les expériences chez la souris.

Raffinement

Nous hébergerons les animaux dans des conditions enrichies d’hébergement prenant en compte leur bien-être et de soins afin de réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable. L’hébergement et la manipulation en condition stérile permettra d’éviter toute contamination des animaux. Les souris seront observées quotidiennement et très attentivement par du personnel qualifié pour permettre la détection très précoce des signes de souffrance ou de mal-être, une réaction immédiate si le point limite est atteint, et une surveillance accrue en cas de doute. Le personnel participant à ce projet maîtrisent les expériences de greffe et les modes d'administration des drogues. Les transplantations de mélanome réalisées sont bien supportées par les animaux. Afin de réduire le stress ou la souffrance éventuelle, une anesthésie est effectuée avant les injections. Le risque d'inflammation associée aux injections intrapéritonéales est diminué en alternant les sites d'injection ou en privilégiant l’administration des drogues par gavage oral. Le gavage est amélioré par l’utilisation d’une canule courbée terminée par une olive qui permet de minimiser le risque de lésion de l’œsophage. Tout changement de comportement significatif, modification physique, variation anormale de poids ou signes de douleur conduiront à l’euthanasie des souris. Si des ulcérations des tumeurs sont observées, la tumeur est traitée avec une solution antiseptique jusqu'à la résolution de la plaie. L’ensemble de ces procédures nous permettra d'intervenir au plus tôt en cas de souffrance des animaux dans les phases avancées de la maladie.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, systématiquement utilisée dans les études précliniques visant à étudier l'efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court et une natalité importante. Nos expériences seront réalisées sur des modèles de souris permettant d'éviter le rejet des greffes de cellules tumorales humaines et sur des modèles de souris permettant d’étudier la réponse immunitaire contre la tumeur. En l’absence de système artificiel pouvant reproduire in vitro l’environnement complexe d’une tumeur, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les expériences de greffes de mélanome seront réalisées sur des animaux âgés de 6 semaines, un âge auquel la prise tumorale est particulièrement efficace d'après les données de la littérature. Les souris sont commandées à l'âge de 5 semaines. A leur arrivée, elles sont acclimatées pendant une semaine à l'animalerie avant d'être utilisées.

58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par traitement, avec inflammation de l'intestin et perte de poids possibles, et chacune subit cinq injections intrapéritonéales et six pesées. Le porteur indique que les données obtenues hors de l'animal ne suffisent pas, faute d'y retrouver le système immunitaire et les facteurs circulants. Le bénéfice annoncé se limite à identifier "potentiellement" des cibles thérapeutiques pour les troubles digestifs liés au stress.

Objectifs

Le système nerveux entérique (SNE) régule la motricité digestive et les fonctions de la barrière épithélio-intestinale. Il est admis que le stress altère l’axe cerveau-intestin et contribue à un large éventail de troubles gastro-intestinaux, incluant le syndrome de l’intestin irritable. La survenue d’évènements stressants ou traumatisants affecte les fonctions digestives, qui en pratique se manifestent par des flatulences, des douleurs abdominales, plus ou moins associées à une accélération ou à une diminution de la vidange gastrique. La réponse biologique au stress implique l’activation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien, initiant une sécrétion de glucocorticoïdes. Bien que la synthèse de glucocorticoïdes ait lieu principalement au niveau des glandes surrénales, il a été décrit de nombreux autres sites de production, associés à une action locale des glucocorticoïdes via le récepteur aux glucocorticoïdes. Dans l’intestin, le système nerveux exprime le récepteur des glucocorticoïdes ainsi que l’enzyme responsable de leurs synthèses. Une étude préliminaire in vitro de notre équipe de recherche a permis de mettre en évidence une synthèse de corticostérone par le système nerveux entérique et une augmentation de la synthèse de corticostérone en conditions inflammatoires. De plus, des modifications de l’expression de protéines impliquées dans l’activité neuronale ont également été mises en évidence en conditions inflammatoires et lorsqu’on bloque l’effet des glucocorticoïdes. L’objectif de ce projet est d’étudier comment l’inflammation module le système nerveux entérique in vivo, et si les conséquences fonctionnelles de l’inflammation passent par l’action des glucocorticoïdes.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes de la synthèse locale des glucocorticoïdes au niveau de l’intestin afin de pouvoir potentiellement identifier des cibles thérapeutiques pour améliorer les troubles digestifs intestinaux liés au stress et à l’inflammation.

Procédures

Pesée quotidienne des animaux – 10 sec sur la balance – 6 au total Contention + injection intrapéritonéale – 30 sec – 5 au total

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent avoir une inflammation des intestins à l’issue du traitement et cela peut générer une perte de poids. Ils peuvent également avoir peur au moment des injections intrapéritonéales.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus d’intérêt (tube digestif) pour analyser les échantillons ex vivo.

Remplacement

Les données préliminaires obtenues dans un modèle ex vivo ne sont malheureusement pas suffisantes pour extrapoler les résultats obtenus à un individu entier. Plusieurs acteurs comme le système immunitaire et la présence de facteurs circulants sont absents de nos modèles ex vivo. C’est pourquoi il n’est pas possible de remplacer ce modèle d’induction de colite aigüe par un modèle ex vivo ou in vitro.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d’animaux minimum nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables (n=9 pour une augmentation de 40 % de la production de corticostérone). Pour s’assurer de la réussite de ce projet, nous avons prévu un lot d’animaux « pilote » de 10 souris qui permettra de valider les expérimentations in vitro sur les échantillons issus de nos animaux. Comme une partie des animaux va recevoir une injection intrapéritonéale d’antagoniste et que ce type d’injection peut rater malgré un personnel compétent, nous avons prévu un lot supplémentaire (n=3 par groupe) qui sera réalisé seulement si certains animaux doivent être exclus. L’utilisation d’un tel nombre (58 au total) devrait nous éviter de devoir répéter l’expérience.

Raffinement

Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. Elles seront également surveillées quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les souris seront habituées à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.

Choix des espèces

La colite expérimentale provoquée par le traitement chez les rongeurs est un modèle reconnu d’affections inflammatoires chroniques humaines. La souris représente un très bon modèle d’étude (plus petit) et est plus adapté à nos besoins qu’un modèle rat et nous permettra de faire un parallèle avec l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines) puisque ce projet s’intéresse à la régulation de la production de glucocorticoïdes à l’âge adulte.

Injectées tous les deux jours pendant neuf jours avec une molécule qui déclenche une crise migraineuse, 320 rates subissent ensuite l'application d'un filament sur la face pour mesurer leur hypersensibilité à la douleur. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les rates sont tuées sous anesthésie profonde pour prélever leurs tissus nerveux. L'objectif porte sur le rôle des astrocytes dans le déclenchement de l'allodynie, avec la perspective annoncée de nouvelles cibles contre la douleur chez l'être humain. Les nuisances attendues sont estimées à partir de travaux menés sur des rats mâles, alors que le projet porte sur des femelles.

Objectifs

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades. L’allodynie correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à une inflammation. En temps normal, les informations tactiles et douloureuses n’aboutissent pas au même niveau de la moelle épinière ou du tronc cérébral, les deux modalités sensorielles (tact et douleur) sont donc normalement séparées. En conditions pathologiques, par exemple lors d’une allodynie, l’information tactile devient capable d’activer des neurones nociceptifs, grâce à un circuit qui implique plusieurs cellules. Le tact va alors devenir douleur (allodynie mécanique). Ce processus va provoquer l'activation de plusieurs populations neuronales et implique également une population spécifique de cellules gliales, les astrocytes. Cependant, peu de choses sont connues sur ces cellules et leur implication dans le déclenchement de l’allodynie .L’objectif de ce projet va consister à étudier l’implication des astrocytes et plus précisément des canaux potassiques astrocytaires dans un modèle de migraine chronique .Ce projet combinera des études comportementales et d’expression protéique. Il présente donc un intérêt fondamental, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les douleurs pathologiques chez l’homme.

Bénéfices attendus

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques.

Procédures

Les injections intra péritonéales (fréquence: 1 injection tous les 2j pendant 9j/ durée: 30s) et les perfusions (fréquence: 1/ durée 30min/ sans réveil) seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal. Après une phase d'habituation, des tests comportementaux (test d'allodynie suite à l'application d'un filament au niveau de la face) seront réalisés (habituation+test: 35min/ test de la face tous les 2 jours).

Impact sur les animaux

Les résultats obtenus des travaux des autres laboratoires avec le modèle NTG ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que la développement d'une allodynie. Ce modèle a été réalisé sur des rats mâles, dont les nuisances sont le développement de l'allodynie mécanique au niveau de la zone péri orbitale après l'application de filament de vF (modérée). Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de NTG.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales et moléculaires est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux par groupe: habituation, injection,comportement, prélèvements et préparation des échantillons. C'est un modèle que le laboratoire veut mettre en place, donc, pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05. Les groupes non stimulés (NS) seront réalisés en priorité; si les résultats obtenus sont significatifs, nous ne réaliserons pas les groupes stimulés (St).

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats seront préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie. Si au cours de l’expérimentation, l’animal a de grosses difficultés à se déplacer, se relever pour se nourrir, l’animal sera euthanasié par dose létale de pentobarbital.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 7-10 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.

Les souris utilisées sont athymiques, dépourvues de thymus et donc incapables de rejeter les cellules tumorales qu'on leur implante. 625 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est injectée sous la peau du flanc sous anesthésie, puis viennent une injection intraveineuse de nanoparticules lipidiques, deux prélèvements de sang par incision du bout de la queue sur souris vigile, une injection de luciférine et dix à quinze minutes d'imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant gêner les déplacements et la toilette. Le calendrier est celui d'une société privée, cinq études de vingt-cinq souris par an pendant cinq ans, pour mesurer où se logent des nanoparticules destinées à transporter des médicaments.

Objectifs

Ce projet est centré sur l'adressage sélectif de nanoparticules lipidiques vectorisés (LNP-V) vers des tumeurs afin d’en améliorer leur diagnostic/traitement. L’imagerie par bioluminescence permet la détection et la quantification/accumulation in vivo de conjugués ou de cellules développées pour présenter une activité bioluminescente. L'objectif principal de ce projet est donc d’utiliser cette technique pour étudier les effets de l'utilisation de différents vecteurs sur la biodistribution et l'accumulation plus spécifique dans les tumeurs de LNP-V en limitant leur accumulation non spécifique dans les autres tissus. En effet un ARNm codant pour l'enzyme luciferase sera encapsulée dans les LNP-V et servira de read out de l'accumulation des différents LNP-V dans les tumeurs.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nanoparticules lipidiques vectorisées (LNP-V) permets de protéger la molécule thérapeutique de la dégradation et de permettre une distribution plus spécifique. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Chaque souris sera implantée avec un modèle de cellules tumorales par une injection en sous cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié. Après croissance tumorale, les souris recevront une injection par i.v. de nanoparticules lipidiques (LNP) vectorisées (V) contenant un ARNm codant pour la luciférase (protéine émettant de la lumière en présence de son substrat la luciférine), en solution isotonique stérile, sous anesthésie gazeuse. Après administration des petits prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés sur animaux vigiles en contention par une micro-incision de l’extrémité caudale, 3 à 5 gouttes de sang (≤50μl) suffiront pour quantifier la 1/2 vie plasmatique de nos conjugués. Au maximum seront réalisés 2 prélèvements de maximum 50μl, pour un volume total n’excédant pas 10% de la volémie. Vingt-quatre heures après, pour induire la bioluminescence, une injection intrapéritonéale de luciférine sera réalisée sous anesthésie, juste avant l’imagerie. Les imageries bioluminescentes dureront environ 10-15min et les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant la totalité de l'acquisition.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous-cutanées (réalisé une seule fois) sous anesthésie, les injections en i.v. des molécules (réalisé une fois) et en i.p du susbtrat Luciferine (réalisé une fois) sous anesthesie, les prélèvements sanguins intermédiaires ( 2 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie), ainsi que le développement de la tumeur primaire chez l’animal en tant que pathologie. Ce developpement de la tumeur en sous cutanée peut entrainer une gène physique, avec de possibles grattages et demangeaisons. Les animaux seront soumis à la mesure bi-hebdomadaire des volumes tumoraux. La pousse de la tumeur peut eventuellement entrainer chez l'animal une gêne physique au déplacement ou à la toilette par exemple. Les LNP-V peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure d'imagerie les animaux seront mis à mort et certains organes seront prelevés afin de valider ex vivo la biodistribtuion des LNP-V.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos LNP-V ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 125 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre total de souris pour cette étude s'élève à 625 souris. Il tient compte du suivi des modèles expérimentaux développés dans le projet et de la variabilité de développement des tumeurs qu’il peut exister dans les différents modèles. L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux répartis sur des études necessitants 25 souris chacune sera de 625 souris décomposé en 5 études de 25 individus/an sur 5 ans. Ce nombre sera suffisant pour appréhender la détection et l'accumulation de nos molécules dans les tumeurs. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédures nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique a été défini en déterminant le test statistique et l'effet biologique et la dispersion escomptés.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien, personne dument qualifiée, pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Dès leur arrivées les souris sont placées dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et alternance d'enrichissement, dômes, tubes, fibres pour faire des nids. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale) réalisera les injections des cellules tumorales qui se feront sous anesthésie gazeuse (Sévoflurane). Une observation bi-hebdomadaire des animaux par les expérimentateurs (poids, douleurs/souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs, en plus de leur observation quaotidienne par les animaliers. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie ou au cours du developpement tumoral constituera un point limite. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de deux fournisseurs extérieurs.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (sans thymus) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection du candidat imagerie) en fonction de la taille des tumeurs.

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir dix séances d'imagerie et six mesures de tumeur, toutes sous anesthésie. Une tumeur leur est implantée sous la peau, puis viennent cinq injections dans le péritoine, une injection dans la circulation sanguine et une injection directement dans la tumeur, avant l'échauffement par nanoparticules magnétiques. Le porteur annonce comme bénéfice de "développer de nouvelles nanoparticules performantes pour l'hyperthermie magnétique", en une phrase, quand les nuisances décrites incluent nécrose, douleur, perte de poids et fatigue liée aux anesthésies répétées. Le choix de la souris tient à la sensibilité de l'imagerie optique sur petit animal et à un poids qui, entre huit et douze semaines, reste "raisonnable" pour la manipulation.

Objectifs

Les thermothérapies regroupent un ensemble de méthodes basées sur l’utilisation d'un dépôt de chaleur local à des fins thérapeutiques incluant le traitement des cancers. Elles sont actuellement utilisées pour traiter directement la tumeur et/ou pour aider l'action des radiothérapies ou chimiothérapies. L’hyperthermie magnétique fait partie des thermothérapies et elle est déjà utilisée en clinique. Cependant les nanoparticules utilisées à l’heure actuelle pour réaliser cette hyperthermie doivent être améliorées afin d’augmenter leur efficacité. L’objectif de ce projet est de tester de nouvelles formulations de nanoparticules magnétiques in vivo dans l’optique de les transférer à la clinique.

Bénéfices attendus

Développer de nouvelles nanoparticules performantes pour l’hyperthermie magnétique afin de traiter les tumeurs solides.

Procédures

Injection sous la peau de cellules : 1 minute, 1 fois, durée anesthésie 5 minutes. Injection dans le péritoine : 10 secondes, 5 fois. Injection dans la circulation sanguine : inférieur à 1 minute, 1 fois, durée anesthésie 2 minutes. Injection dans la tumeur : 30 secondes, 1 fois, durée anesthésie 1 min 30. Imagerie : 10 fois, durée anesthésie 10 minutes. Mesure des tumeurs : 6 fois, durée anesthésie 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané : infection au niveau du site d’injection. 2. La présence d’une tumeur : douleur, gêne occasionnée, nécrose. Perte de poids liée à la croissance tumorale. 3. Hyperthermie et suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention.

Devenir

Les souris seront euthanasiées car elles auront une tumeur sous-cutanée.

Remplacement

Nous souhaitons développer de nouvelles nanoparticules qui permettraient d’améliorer la thérapie des tumeurs solides par hyperthermie magnétique. Même si leur potentiel thérapeutique, leur validité et l’absence de toxicité seront testés en amont sur des modèles de cultures cellulaires ou d'organoides quand cela est possible, la finalité est le test sur des modèles in vivo avant d’envisager un passage en clinique.

Réduction

Les nanoparticules seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les nanoparticules validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de bioluminescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal. Chaque animal est son propre contrôle. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Pour les anesthésie de longues durée de l’ocrygel est utilisé pour éviter l'asséchement des yeux. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur selon une grille de score. En cas de léger mal être un antidouleur sera administré à l'animal et de la nourriture sera déposée directement au fond de sa cage pour plus d'accessibilité.

Choix des espèces

L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.