Oncologie

Greffées de cellules d'adénocarcinome colorectal humain sous anesthésie, 80 souris mâles portent une tumeur pendant deux à trois semaines, traitées tous les trois jours et passées deux à trois fois en microtomographie à rayons X. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune nuisance ni douleur n'est prévisible puisque les animaux sont anesthésiés pendant les manipulations puis tués en fin de protocole, tout en listant la perte de poids, le stress et la perte de mobilité parmi les effets à surveiller. Le projet transpose au cancer colorectal des peptides déjà testés sur un modèle de mélanome, jugé moins utile parce que ce cancer est plus rare et de meilleur pronostic.

Objectifs

Avec plus de 43000 personnes touchées par an en France, le cancer colorectal se situe au troisième rang des cancers les plus fréquents chez l’homme et au deuxième rang chez la femme. Il constitue la deuxième cause de décès par cancer et représente près de 12 % de l’ensemble des décès par cancer, en particulier chez les 65 ans et plus. Le choix du traitement du cancer colorectal dépend du stade, de sa localisation et de l'état général du patient. Bien que la  chirurgie  soit utilisée en première ligne, la chimiothérapie peut être prescrite à tous les stades de la maladie, et plus récemment, des thérapies ciblées sont utilisées en association avec la chimiothérapie . Malheureusement tous les patients ne répondent pas à ces thérapies et des phénomènes de résistance se développent très souvent. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du cancer colorectal demeure donc un défi majeur.

Bénéfices attendus

Historiquement, nos premiers résultats sur les effets anti-cancéreux de nos peptides ont été obtenus sur un modèle de mélanome, en association avec un laboratoire de dermatologie. Toutefois, en France, le mélanome cutané se situe au 9ème rang des cancers tous sexes confondus et ne représente que 2 à 3 % de l’ensemble des cancers. C’est également un cancer de bon pronostic avec une survie à 5 ans supérieure à 80% dans le cas du mélanome de stade I, représentant lui-même 84% des cancers diagnostiqués. A l’heure actuelle, les traitements sont souvent efficaces depuis les progrès de l’immunothérapie. Le cancer colorectal est, quant à lui, le troisième cancer le plus fréquent, tous sexes confondus, en France où il représente la deuxième cause de décès par cancer. Les traitements peuvent être très lourds avec de nombreux effets secondaires. Il apparaît donc important de cibler de nouvelles approches thérapeutiques, c’est pourquoi nous souhaitons vérifier que l’activité anti-tumorale de notre molécule et de ses analogues, observée in vivo dans un modèle de mélanome murin, est transposable au cancer colorectal. En effet, les résultats préliminaires obtenus dans un modèle in vitro de tumeur 3D sont très prometteurs.

Procédures

Pour nos expériences, les animaux seront sous anesthésie générale (quelques minutes) pour l'injection des cellules de cancer colorectal. 7 jours après, les animaux seront traités tous les 3 jours (quelques secondes par animal) pendant 2 à 3 semaines. Le suivi longitudinal (imagerie 3D par microtomographie rayons X) des animaux se fera sous anesthésie (10 à 15 minutes) à raison de 2 à 3 fois au cours des 2 dernières semaines du projet.

Impact sur les animaux

Pas de nuisances ou critère prévisible de douleur dans la mesure ou les animaux seront sous anesthésie générale durant les manipulations puis euthanasiés en fin de protocole. Douleur potentielle modérée et passagère (piqure) à l'injection des molécules. Une surveillance quotidienne du développement des tumeurs permettra de s'assurer du bien-être des animaux (absence de gêne à la locomotion ou de signes visibles de souffrance). Les effets indésirables surveillés pourraient être : perte de poids, stress, perte mobilité.

Devenir

Pour chaque procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations, afin de prélever et d'analyser les tumeurs.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisées in silico, in vitro et ex vivo. Les peptides testés ont fait l’objet d’une étude in silico afin de sélectionner les meilleurs candidats potentiels. Ces candidats ont ensuite été validés par des études in vitro (migration et invasion cellulaire, modèles 3D multicellulaires) et ex vivo (anneaux aortiques) et nous testerons dans ce projet les peptides ayant donnés les meilleures réponses. Ce projet vise donc à valider in vivo les effets observés. Aucune méthode de substitution n’existe actuellement pour mesurer les effets sur la croissance tumorale.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les peptides candidats ont été sélectionnés sur des modèles de sphéroïdes 3D. Ainsi seuls les peptides à fort potentiel seront testés. Ainsi l’étude considérée dans sa globalité est susceptible de concerner un nombre maximal de 80 souris mâles, réparties en 4 groupes et 2 procédures : 1 groupe contrôle, 3 groupes de test. Afin d’obtenir des résultats significativement robustes, un nombre maximal de 10 souris par groupe sera utilisé. L’analyse statistique se fera avec le test U de Mann-Whitney bidirectionnel.

Raffinement

Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (tubes de jeu, niche, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 7 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du Bien-être animal et les animaux seront anesthésiés lors des procédures pouvant apporter un stress (jusqu'à l'euthanasie), de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris. Il s’agit du modèle de référence pour l’étude de la croissance tumorale.

Douze semaines de régime enrichi en graisse jusqu'à l'obésité, puis six semaines de restriction calorique avec un gavage cinq fois par semaine : 168 souris suivent ce protocole de 18 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées trois fois dans un tube de mesure de la composition corporelle, et mises à jeun six heures avant chacun des deux tests de tolérance au glucose, avec six gouttes de sang prélevées à la queue sur trois heures, à vif. Le porteur annonce une dyslipidémie, une hyperglycémie chronique et une intolérance au glucose comme effets attendus du régime, et un risque d'irritation de l'œsophage lié au gavage. À la dix-huitième semaine, toutes sont tuées pour prélever le tissu adipeux, le foie et le muscle.

Objectifs

L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement des maladies cardiovasculaires et du diabète. Différentes stratégies existent pour réduire le poids corporel (restriction calorique, chirurgie bariatrique ou traitements pharmacologiques) qui induisent à court terme une amélioration, mais qui ne perdurent généralement pas dans le temps, avec fréquemment un rebond pondéral avec retour des anomalies métaboliques, en particulier la dysfonction du tissu graisseux. Par exemple, les anomalies fonctionnelles du tissu adipeux comme la fibrose (définie par l'accumulation excessive de matrice de collagène dans le tissu gras), présente chez de nombreux patients en situation d'obésité ne sont pas résolues au cours de la perte de poids, et constituent un facteur important d'échec des interventions thérapeutiques de réduction pondérale. Cette situation peut être reproduite chez la souris rendue obèse par un régime riche en graisse, qui développe une fibrose du tissu adipeux comme les patients. Ce sont les cellules souches du tissu adipeux qui produisent l'excès de matrice extracellulaire. Notre objectif est de tester l'efficacité de stratégies visant ces cellules souches pour éviter leur transformation. Nous avons identifié deux traitements potentiels a administrer pendant la période de réduction pondérale, que nous souhaitons valider in vivo dans le modèle souris. Ces traitements se basent sur l'administration de 2 molécules déjà administrées chez l'homme dans d'autres contextes. Nous testerons si elles peuvent améliorer la réponse a la perte de poids lorsqu'elles sont administrées en combinaison à la restriction calorique chez des souris préalablement rendues obese par régime gras.

Bénéfices attendus

Ce protocole doit constituer une preuve de concept chez la souris de l'efficacité des traitements combinés avec la restriction calorique pour restaurer la santé métabolique, en utilisant des approches ciblant la fibrose du tissu graisseux. A terme ces experiences constitueront une indication de ces traitements vers une application en clinique humaine.

Procédures

Pendant 18 semaines, des changements de régime alimentaire seront effectués, avec mise sous régime enrichi en graisse (12 semaines) puis retour à un régime standard (pendant 6 semaines). La stabulation sera effectuée a thermoneutralité (30degrés Celsius) dans une enceinte a climat constant afin de limiter la dépense d'énergie liée au maintien de la température corporelle. Pendant 6 semaines a partir de la semaine 12 les animaux recevront un gavage avec les composes A ou B ou véhicule. Le gavage est réalisé sur animal vigile par simple contention a raison de 5 fois /semaine, et dure moins de 30 secondes. La nuisance est liée au risque d'inflammation de l'oesophage. Ni A ni B n'entrainent d'effet toxiques, ces composés sont approuvés et utilisés chez l'homme dans d'autres contextes. Le suivi métabolique longitudinal comprend des pesées hebdomadaires. Nous réaliserons des mesures non invasives de la composition corporelle à 3 temps : avant la mise sous régime, à la fin du régime gras, et à la fin de la période de traitement. Cette mesure implique de placer les animaux dans un petit tube et de placer l’animal dans l’appareil de mesure durant 2 minutes. Le test de tolérance au glucose est réalisé 2 fois a 12 et 18 semaines, comportant la mise a jeun pendant 6h suivie de prélèvements séquentiels de gouttes de sang a la queue (1 goutte x 6 pendant 180 minutes) sur animaux vigiles. Apres 18 semaines : prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse suivie immédiatement d'euthanasie pour prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus du projet sont ceux liés à l’induction de l’obésité et aux altérations métaboliques associées. En effet, la consommation d’un régime enrichi en lipides tel que celui utilisé ici, peut mener à une dyslipidémie, des altérations de la glycémie avec notamment une hyperglycémie chronique, une intolérance au glucose et une altération de la sensibilité à l’insuline, facteurs de risque cardiovasculaires chez la souris comme chez l'homme. Une fois l'obésité constituée nous initierons une période de restriction calorique pour induire une perte de poids, ce qui permet de reverser partiellement les troubles métaboliques. Cependant le gavage avec les composés a tester nessecite des manipulations de contention, et peut aussi induire des effets indesirables par irritation de l'oesophage. Pour l’évaluation métabolique des animaux, nous privilegions les procedures non invasives pour limiter le stress/douleur. Il est cependant necessaire de proceder au prélèvement de gouttes de sang a la queue pour le test de tolérance au glucose et les mesures de glycémie et de cétonémie, qui doivent etre réalisées sur animaux vigiles pour l'obtention de résultats valides. Les prélèvements sanguins peuvent générer un stress/douleur de courte durée.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux sont euthanasiés en vue de prelever et d'etudier differents organes (tissu adipeux, foie, muscle etc). Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et que cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux

Remplacement

Le tissu adipeux excerce une fonction de stockage de l'energie en exces et de production de molecules signalisatrices qui va être déterminée par le microenvironnement tissulaire complexe. Ainsi, il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire les fonctions de ce tissu in situ, en particulier sa flexibilité et les changenement ponderaux. L’évaluation de l’activité du tissu adipeux en réponse à des changements d'environnement métabolique et nutritionnels sont des processus biologiques et physiopathologiques complexes qui ne peuvent être explorés que par des approches expérimentales in vivo.

Réduction

Chaque animal (au total 168) sera exploité afin d’apporter le maximum d’information. Si possible, nous utiliserons les données de manière transversale entre les protocoles afin de réduire le nombre d’animaux. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. Lorsque cela est possible techniquement, sans affecter la qualité des données recueillies, les souris partageant un même groupe contrôle seront étudiés en même temps afin de réduire le nombre d’animaux. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. Le calcul de puissance indique que 12 souris par groupe est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables compte tenu de la variabilité interindividuelle des paramètres mesurés (poids,tolérance au glucose, tailles des adipocytes, contenu en collagène, analyse de cytométrie en flux).

Raffinement

Un suivi du poids des animaux sera effectué avant mise sous régime puis de manière hebdomadaire pendant les 12 semaines de régime riche en graisse. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (regroupés à 4 animaux par cage) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les animaux seront maintenus à une temperature de 30 degrés Celsius qui correspond a la thermoneutralité pour les petits rongeurs (absence totale de stress thermique, réduction de la thermogénese). Nous utilisons une enceinte climatique homologuée permettant de contrôler la température, l'humidité et le niveau d'éclairage. De plus, le personnel expérimenté de l'animalerie veille au bien-être des animaux et l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement pour vérifier le respect des points limites définis pour ce projet. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux et de les habituer aux manipulations afin de reduire le stress potentiel lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose). Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations des animaux (pesées, gavages) par des personnes expérimentées afin de réduire le stress au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un laps de temps de minimum 1 semaine entre les actes sera respecté afin de laisser un temps de récupération aux animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent car les mécanismes de régulation de la balance énergétique sont très proches de ceux a l'œuvre chez l'homme. En cas de surnutrition, les souris développent une obésité (accumulation de tissu adipeux) qui ressemble à la situation chez l'homme avec des troubles du métabolisme glucidique (diabète) et d’autres perturbations métaboliques. Il est à noter que les modèles murins ont généré des apports conceptuels dans le domaine de la régulation du poids corporel, avec la découverte de la leptine, hormone d'origine adipocytaire qui contrôle la prise alimentaire. Cette hormone a été découverte grâce a des mutations naturelles chez la souris (mutation ob). De plus en rapport avec le projet, les souris répondent a des restrictions caloriques par perte de poids, elles peuvent aussi, comme les patients atteints d'obésité, développer une fibrose du tissu adipeux, avec des conséquences deletaires sur leur santé. Nos études requièrent que les animaux soient sexuellement matures avec un métabolisme adulte. Les souris seront donc mises sous régime à partir de l’âge de 6-8 semaines, pour une étude de durée totale de 18 semaines.

Quinze minutes : une injection d'anesthésique dans l'abdomen, puis une chirurgie qui ne se termine pas par un réveil. 800 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet cartographie l'innervation de l'hypothalamus, centre de régulation du comportement alimentaire et social, en comparant des souris sans flore intestinale et des souris de souche classique à 14, 21 et 56 jours de vie. Le porteur annonce des lots de 10 souris par condition, ce qui laisse l'essentiel des 800 animaux sans justification chiffrée, et écrit par ailleurs que la procédure "n'induit pas de nuisances sur les animaux".

Objectifs

Le cerveau est divisé en différentes régions, noyaux et sous-noyaux produisant de nombreux neuropeptides avec son rôle propre dans le comportement de l’hôte. L’hypothalamus est le centre de régulation du comportement motivationnel : alimentaire, social. Il produit des neuropeptides et des récepteurs qui vont influencer le comportement motivationnel de l'hôte. Des mutations des gènes produisant ces neuropeptides ou récepteurs peuvent influencer ces comportements. L'objectif du projet est d'étudier l'innervation de l'hypothalamus par différentes populations neuronales impliquées dans le comportement motivationnel (comportement alimentaire, comportement social notamment), en conditions normale et pathologiques.

Bénéfices attendus

Une meilleure visualisation et l’établissement d’une cartographie des cellules nerveuses exprimant ces différents peptides et récepteurs permettra de mieux appréhender les mécanismes de communication neuronale, et ce chez différentes espèces ayant des métabolismes et comportements différents (sociaux, alimentaires). Une quantification des neurones positifs peut être faite pour comparer l’expression entre les souches. Une quantification de l’expression des peptides et récepteurs permettra de compléter ces datas et de comparer entre les souches l’expression des ARN messagers.

Procédures

Les animaux soumis à la procédure 1 recevront une injection intra-péritonéale d'anesthésique/analgésique, suivie d'une chirirgie terminale sous anesthésie générale. La procédure complète dure 15 minutes à compter de l'injection. cette procédure n'induit pas de nuisances sur les animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une douleur au niveau du site d'injection et a un éventuel stress dû à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Cependant, les gestes étant réalisés par des personnes habilités et habitués à ces procédures, la durée et l'intensité de ces effets sera minime, 2 minutes maximum.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements d'organes pour des études histologies

Remplacement

Les techniques de prélèvement du cerveau pour des etudes d'histologie et d'imagerie sont à ce jour irremplaçables pour observer les projections neuronales entre les différentes régions cérébrales. Ce sont des techniques classiques utilisées en neurosciences, tant pour observer l’expression génique que l’expression protéique. Des méthodes in vitro existent pour étudier la structure et le fonctionnement d'un organe en condition physiologique et pathologique. Nous pouvons notamment citer les techniques d'organes sur puce (organ on chip), qui sont tout à fait pertinentes pour étudier les effets de molécules / médicaments sur l'organe ainsi que réaliser des tests de toxicité sur le tissu. Cependant, dans le cadre de ce projet, nous souhaitons observer les différentes structures anatomiques (noyaux neuronaux) et l'architecture mise en place dans le cerveau pour relier les différents noyaux (fibres), ce qui n'est pas reproductible in vitro. De plus, nous souhaitons également voir l'impact du microbiote intestinal sur le développement du cerveau (souris axéniques vs souris C57Bl6), impliquant 2 organes, ce qui est actuellement pas reproductible in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, des marquages multiples seront réalisés sur un même tissu. De plus, l’utilisation de ce type de modèles animaux permet de réduire le nombre de souris utilisées puisque le génotype est plus garanti que via des mutations spontanées. De mêle pour les études d'expression génique, plusieurs marqueurs peuvent être ciblés par tissu. Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les marquages seront analysés sur des lots de 10 souris par condition. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement comparables. Nous allons quantifier le nombre de cellules positives par région, et comparer les différences entre les conditions (age et sexe). Nous évaluerons aussi la densité des fibres nerveuses positives, chaque noyau possédant plusieurs projections neuronales. Les 30 animaux par sexe correspondent donc à 10 souris à P14, 10 à P21 et 10 à P56.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à trois à cinq par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale). Bien que la mise au point de ces modèles animaux soit couteuse, cela permet d’éviter la souffrance des animaux induite par l’administration des toxines.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère entier, donc in vivo chez l’animal, peut nous permettre de comprendre de façon globale l’organisation des neuropeptides dans un tissu entier. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques liées à la prise alimentaire, le comportement social, permettant ainsi une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. Nous étudierons les animaux avant le sevrage (P14) ainsi qu’au sevrage à P21 et à l'age adule P56, afin d’observer le processus de développement chez les jeunes animaux et comparer les circuits hypothalamiques qui se développement principalement après le sevrage.

Immunodéficientes puis greffées avec des cellules souches de sang de cordon humain, 480 souris femelles portent un système immunitaire humain reconstitué, ce qui les expose à une maladie du greffon contre l'hôte, à des pertes de poids et à des plaies cutanées. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées sur le flanc, elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire humaine sous la peau, deux injections dans l'abdomen par semaine et deux mesures de la tumeur au pied à coulisse, sans anesthésie. Le porteur écarte les analgésiques, susceptibles selon lui d'interférer avec les résultats, et prévoit la mise à mort 35 jours après la greffe, ou plus tôt si un point limite est atteint, pour analyses cellulaires et moléculaires.

Objectifs

Le cancer est la seconde cause de mortalité en France après les maladies cardio-vasculaires. Le cancer du sein est la première cause de décès par cancer chez la femme. Malgré d'importants progrès, il reste encore de nombreux traitements à tester, en particulier dans le champs des immunothérapies. Dans le cadre général de notre projet d'immunothérapie du cancer, nous cherchons à valider des anticorps thérapeutiques dans un modèle de cancer du sein implanté par la voie sous cutanée chez la souris humanisée. Les souris humanisées sont des souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain après transfert de cellules souches de sang de cordon ombilical. Avec ce protocole, les souris régénerent un système immunitaire humain complet et fonctionnel quelques semaines après la greffe. Les objectifs du projet sont donc d'évaluer l'effet thérapeutique de différents anticorps sur la croissance de la lignée tumorale en l'absence ou en présence d'un système immunitaire humain. Le choix de la lignée de souris utilisée dans chaque expérience dépend de la cible de la thérapie, ces lignées de souris présentant des caractéristiques de reconstitution immunitaire particulières. La comparaison de la croissance des tumeurs avec ou sans traitement dans des souris humanisées ou non va nous renseigner sur l'efficacité des anticorps à aider le système immunitaire à contrôler la croissance de la tumeur. Ces informations pourraient être importantes pour développer de nouveaux traitements pour le cancer du sein.

Bénéfices attendus

La comparaison des croissances tumorales dans différents groupes de souris traitées nous renseignera sur la qualité de la réponse immunitaire contre le cancer du sein dans un modèle proche de la physiologie humaine donc plus pertinent que les études in vitro ou des études dans des modèles purement murin. Nous testerons des combinaisons thérapeutiques originales de médicaments destinés à la clinique humaine, susceptibles d'être transposées chez l'homme. Les bénéfices potentiels du projet sont donc nombreux, justifiant le recours à l'expérimentation animale.

Procédures

Les animaux humanisés vigiles sont prélevés à la veine mandibulaire une semaine après leur arrivée pour mesurer la qualité de la reconstitution en cellules humaines. Ce geste dure deux minutes par souris. Les animaux vigiles sont rasés sur le flanc droit avec une tondeuse dédiée puis greffés avec une lignée tumorale humaine par injection sous cutané avec une aiguille adaptée. Ce geste dure cinq minutes par souris. Les animaux sont traités deux fois par semaine avec les médicaments à tester avec une injection dans le péritoine avec une aiguille adaptée et pesées simultanément, avec contention appropriée. La taille de la tumeur est mesurée deux fois par semaine avec un pied à coulisses, sans anesthésie, avec contention appropriée. Les animaux sont euthanasiés pour analyses complémentaires soit à la fin de l'expérience (35 jours après la greffe de la tumeur), soit si un point limite est atteint.

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles sont injectés par la voie sous cutanée. La croissance des tumeurs sous la peau pourrait conduire à une gêne dans les déplacements, des infections des plaies pouvant conduire à des nécroses, ou encore des douleurs. L'immunodéficience des animaux pourraient conduire à leur infection par des agents opportunistes, conduisant à des atteintes oculaires ou pulmonaires. Le prélèvement sanguin pourrait conduire à une hémorragie incontrôlée. Les injections répétées des traitements par la voie intra péritonéale pourraient conduire à des douleurs locales ou à des infections opportunistes. L'humanisation des souris immunodéficientes pourraient induire une maladie du greffon contre l'hôte, entrainant une perte de poids et/ou des plaies cutanées et/ou une diarrhée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par une méthode réglementaire pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires, si ils ont atteint un des points limites définis ou si la durée de la croissance de la tumeur dépasse 35 jours.

Remplacement

Ce projet repose sur la mesure chez la souris des croissances tumorales d'une lignée de cancer du sein humain dans différentes conditions expérimentales et en présence d'un système immunitaire humain. Dans ce cas précis de recherches pré cliniques visant à évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux, il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale par des expériences in vitro, incapables de reproduire la complexité physiologique de la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur. De plus, seul le modèle des souris humanisées permet de répondre aux questions du projet et d'obtenir des résultats potentiellement transposables à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet (480) est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le groupe contrôle recoit les véhicules des deux molécules testées en combinaison. La taille des effectifs a été fixée à 6 animaux / groupe pour détecter une différence de 20 pour cent dans la croissance tumorale avec une puissance de 80 pour cent. Du fait de la variabilité de croissance tumorale entre souris, nous répéterons l’expérience pour chaque condition testée. Les groupes expérimentaux tests et contrôles seront réalisés simultanément, réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Chaque souris sera inclus dans un protocole d'analyse complet, allant de la mesure de la croissance tumorale aux analyses cellulaires et moléculaires subséquentes.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par les membres de l'équipe et/ou par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Il n'est pas prévu d'utiliser des analgésiques, ceux ci pouvant interférer avec les résultats de l'étude. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du papier et une maison pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Des points limites basés sur différents critères extérieurs (poids, comportement, aspect général,...) ont été établis.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes humanisées représentent le seul modèle d'une réponse immunitaire humaine contre une tumeur humaine in vivo. A ce titre, elles représentent le seul modèle vivant dans lequel des drogues à destination d'un usage clinique peuvent être testées. Il devient ainsi possible d'apprécier l'efficacité de telle ou telle drogue sur la réponse immunitaire contre la tumeur. Cette hypothèse est développé depuis de nombreuses années par l'équipe et le modèle nous a permis de proposer une nouvelle stratégie de traitement pour le cancer du sein. Le présent projet vise à utiliser les souris humanisées pour développer 5 nouveaux traitements contre le cancer du sein. Les souris humanisées sont livrées par le fournisseur entre 15 et 18 semaines d'âge. Ce temps est nécessaire pour le développement complet des lymphocytes T humains chez la souris à partir des progéniteurs humains greffés dans les souris à l'âge de 3 semaines environ. Les animaux non humanisés sont livrés à l'âge de 6 à 10 semaines. Seules des souris femelles sont utilisées dans ce projet.

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de parasites du paludisme, puis un médicament dans l'eau de boisson ou par voie orale, et une goutte de sang prélevée à la queue tous les un à deux jours pendant sept à vingt-et-un jours. Un groupe est anesthésié puis exposé quarante-cinq minutes aux piqûres de moustiques, sans réveil. L'affaiblissement et l'anémie liés à l'infection figurent parmi les contraintes annoncées, et le porteur affirme qu'aucun système de culture continue de Plasmodium berghei ne permet de remplacer la souris pour les manipulations génétiques du parasite.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser les mécanismes d'infection par Plasmodium, l'agent du paludisme, à l'aide d'un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei. Ce parasite peut être étudié à tous les stades du cycle parasitaire, notamment après infection de moustiques Anopheles à partir de souris infectées. Le modèle d’infection de la souris par P. berghei reproduit de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permet d’étudier le rôle de facteurs parasitaires au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés. Le projet vise à caractériser la fonction de protéines candidates à différents stades du cycle parasitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'améliorer notre connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, en identifiant des protéines essentielles à différents stades du cycle parasitaire. Les résultats pourraient permettre d'identifier de potentielles cibles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le paludisme.

Procédures

Un premier groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 7 à 10 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang par ponction terminale (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés). Un deuxième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 7 à 21 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Un troisième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 4 à 5 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes) suivie de l’exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes, sans réveil a posteriori). Un quatrième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 5 à 8 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang par ponction terminale (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés).

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales ou intraveineuses sur animaux vigiles, stress ou douleur de courte durée lors de l'administration orale de médicament sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Le projet vise à caractériser dans un modèle murin la fonction de protéines du parasite Plasmodium, l'agent du paludisme, à l'aide d'approches génétiques. Il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue de Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour les manipulations génétiques du parasite et pour les études fonctionnelles (étude de la croissance parasitaire dans le sang et transmission aux moustiques). Par contre, nous utiliserons des systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires) pour l'analyse de l'infection des cellules du foie par les parasites mutants (obtenus à partir de moustiques infectés).

Réduction

Au total ce projet utilisera 980 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires aux études fonctionnelles. La taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites infectant l'homme. Ce modèle est en particulier pertinent pour étudier la fonction de protéines essentielles du parasites lors de l'infection in vivo, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.