Oncologie

618 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer colorectal sur le flanc, puis des injections répétées de chimiothérapies et d'un médicament donneur de monoxyde d'azote, avec un suivi de la tumeur qui peut gêner la mobilité de la patte arrière, pour tester si cette association améliore le traitement. Le porteur fixe un point limite de mise à mort à un volume tumoral de 2 centimètres cubes ou en cas de souffrance. Il affirme que les cultures cellulaires ne peuvent se substituer à l'étude du microenvironnement tumoral dans un organisme entier.

Objectifs

Le traitement du cancer demeure un défi nécessitant de trouver de nouvelles solutions de traitement pour améliorer l’espérance de vie des patients. L’objectif principal de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements (chimiothérapies) couramment utilisés pour le cancer colorectal. Pour cela nous proposons d’associer aux traitements existants un autre médicament. Certaines tumeurs cancéreuses peuvent libérer des facteurs suite à la chimiothérapie pour se protéger de leurs effets ce qui diminue l’efficacité du traitement. Le médicament étudié a la particularité d’éliminer les cellules cancéreuses lorsqu’il est en présence de ces types de facteurs. Des travaux préliminaires ont montré, dans un modèle de cancer colorectal chez la souris, que ces facteurs augmentaient en réponse au traitement par certaines chimiothérapies utilisées pour le traitement du cancer colorectal. Dans ce contexte, l’ajout du médicament après la chimiothérapie, en présence de ces facteurs, ralentirait le développement de la maladie. L’étude sera structurée en 2 parties qui permettront (1) d’étudier précisément le rôle des facteurs d’intérêts dans l’effet de la combinaison chimiothérapies/médicament contre la tumeur dans un modèle de cancer colorectal chez la souris ; (2) d’étudier l’effet de la combinaison chimiothérapies/médicament dans un autre modèle d’étude du cancer colorectal chez la souris. Les cancers colorectaux étant des pathologies très hétérogènes, l’utilisation du modèle animal souris est majeur en cancérologie car il permet de reproduire les caractéristiques de la pathologie cancéreuse humaine. Ce projet vise à démontrer que l’administration du médicament en question après les chimiothérapies (lorsque ces facteurs sont présents) peut s’appliquer à différents modèles de cancers colorectaux.

Bénéfices attendus

Les deux modèles d’étude du cancer colorectal chez la souris que nous proposons d’utiliser dans ce projet se distinguent par la capacité des cellules immunitaires à infiltrer la tumeur. Les tumeurs sont qualifiées de « froides » lorsqu’elles sont peu infiltrées par les cellules du système immunitaire. Au contraire, les tumeurs sont qualifiées de « chaudes » lorsqu’elles sont fortement infiltrées par les cellules immunitaires. Grâce aux deux modèles d’étude du cancer colorectal chez la souris que nous proposons d’utiliser dans cette étude, nous pourrons mimer deux microenvironnement tumoraux différents, proches de la pathologie humaine. Nous nous attendons à valider l’hypothèse initiale de notre stratégie de traitement qui repose sur l’administration du médicament sur la base de la présence des facteurs d’intérêts faisant suite au traitement par chimiothérapies. Ainsi, au travers de ce projet nous nous attendons (1) à démontrer le rôle charnière de ces facteurs pour l’utilisation du médicament dans une stratégie de traitement à base de chimiothérapies (2) à démontrer que la stratégie de traitement peut être appliquée à un autre type de cancer colorectal. A long terme ce projet a pour bénéfice d’améliorer l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies standards utilisées chez les patients atteints de cancers colorectaux. Ce projet s’inscrit dans le développement d’une thérapie anticancéreuse innovante.

Procédures

Anesthésie générale Inhalation d’anesthésiant pendant 5 minutes. Puçage Une puce sera injectée à l’aide d’un injecteur de puce en 3 secondes sous anesthésie générale, une seule fois au début de l’expérience. Rasage Le flanc droit de l’ensemble des souris sera rasé à l’aide d’un rasoir vétérinaire pour injecter les cellules tumorales et mesurer le volume tumoral au cours du temps. L’intervention durera environ 1 minute et sera réalisée une seule fois sur souris vigile au début de l’expérience. Injection des cellules tumorales Les cellules resuspendues dans du sérum physiologique seront injectées en sous cutanée sur le flanc droit de l’ensemble des souris sous anesthésie générale. L’injection des souris durera environ 5 secondes et sera réalisée une seule fois au début de l’expérience. Injection en intra-péritonéale Les injections de chimiothérapies, sérum physiologique, ou d’inhibiteurs d’un des facteurs étudié seront injectés individuellement. Les injections seront réalisées sur souris vigile et dureront environ 3 secondes. Injection en sous cutanée Le médicament/sérum physiologique seront injectés en sous-cutané au niveau du cou. Une seule injection de 3 secondes sera réalisée deux fois par semaine en vigile pendant environ 4 semaines. Mesure des tumeurs Un suivi de la croissance tumorale sera réalisé 3 fois par semaine pendant 4 semaines en vigile à l’aide d’un pied à coulisse. L’intervention durera environ 1 minute par souris. Prélèvement de sang en mandibulaire Le sang sera prélevé au niveau de la veine mandibulaire après anesthésie générale. Les souris seront maintenues endormies à l’aide d’un masque libérant l’anesthésiant pendant tout le temps du prélèvement. Le prélèvement durera environ 1 minute par souris et sera suivi du réveil de l’animal. Prélèvement de sang en intra-cardiaque Le sang sera prélevé en intra-cardiaque après anesthésie générale. Les souris seront maintenues endormies à l’aide d’un masque libérant l’anesthésiant pendant tout le temps du prélèvement. Le prélèvement durera environ 5 minutes par souris et sera suivi d’une euthanasie sans réveil préalable. Euthanasie des souris Les souris seront euthanasiées après anesthésie générale. L’intervention durera 3 secondes par souris et sera suivi du prélèvement des tumeurs.

Impact sur les animaux

Nuisances dues à l’anesthésie générale pour le puçage, l’injection des cellules tumorales et le prélèvement sanguin mandibulaire : - Stress au moment de l’endormissement dans la boite d’anesthésie - Diminution de la chaleur corporelle - Douleur au point d’injection de la puce Nuisances dues aux injections des chimiothérapies et du Nitronal : - Stress de la manipulation et de l’injection - Douleur au point d’injection - Effets indésirables dus aux traitements (perte de poids éventuelle) Nuisances dues au suivi de la croissance tumorale : - Stress de la manipulation lors de la mesure du volume tumoral Gêne occasionnée par la tumeur (gêne au niveau de la patte arrière, perte de mobilité)

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant pendant 5 minutes puis euthanasiés. En effet, tous les animaux étant porteurs de tumeurs colorectales, aucun ne pourra être réutilisés, replacés ou adoptés. De plus, même en cas de guérison, l’ensemble des souris auront reçu des traitements (chimiothérapies et/ou médicament) ce qui pourrait altérer leur état général en cas d’adoption ou les résultats de nouvelles expériences en cas de réutilisation.

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire in vitro ne peuvent pas se substituer totalement aux expérimentations in vivo étant donné que nous cherchons à étudier l’impact des traitements, d’une part sur le taux des facteurs d’intérêts issus de l’hétérogénéité du microenvironnement tumoral et d’autre part sur la croissance des cellules cancéreuses au sein de son microenvironnement, ce qui nécessite pour ces deux points un organisme vivant entier.

Réduction

Ce projet nécessitera l’utilisation de 618 souris sur une période de 5 ans. La maîtrise du modèle animal chez la souris au laboratoire permet de réduire le nombre d’animaux utilisé au minimum nécessaire pour les expérimentations envisagées afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Des études préliminaires ont été réalisées afin de définir les conditions de traitement et les doses de chimiothérapies et du médicament à utiliser. Ces études préliminaires ont également permis d’éliminer certains groupes témoins pour lesquels les effets des traitements seuls sont suffisamment connus pour ne pas avoir à les refaire. Une étude pilote sera réalisée pour déterminer la dose optimale et la fréquence d’injection d’un inhibiteur pour l’un des facteurs étudiés. Ces mises au point préalables permettent donc de réduire au maximum le nombre de groupe de souris utilisé. De plus, les expériences seront réalisées sur des groupes de souris randomisés pour limiter au maximum les biais expérimentaux et éviter de recommencer les expériences plus de fois que nécessaire.

Raffinement

Pour limiter au maximum les nuisances causées aux animaux et détecter le plus précocement possible toute forme de souffrance ou de mal-être potentiel, quotidiennement de façon à vérifier leur bien-être (absence de perte de poids, d’appétit, de déshydratation ou d’immobilité). Les animaux seront toujours hébergés en petits groupes pour limiter l’angoisse/le stress. De plus un enrichissement sera ajouté (matériel de nidification, petit récipient en verre) visant à améliorer la zone de confort tout au long de leur hébergement. Les manipulations (injections des cellules, prélèvements sanguins, puçage) pouvant générer un inconfort pour l’animal seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille de score regroupant les point limites a été mise en place (Annexe V) de manière à déterminer les critères d’arrêt. Dans tous les cas, un animal sera anesthésié puis euthanasié si 1) le volume tumoral atteint 2 centrimètre cube, 2) s’il présente une baisse de la masse corporelle ou des signes (comportementaux/posture) indiquant une souffrance ou une douleur significative qui ne peut pas être supprimée, 3) si la tumeur présente une plaie.

Choix des espèces

Les expériences que nous avons préalablement réalisées in vitro ont été menées sur des lignées cellulaires (cancéreuses) de souris. Nous utiliserons les espèces de souris dont sont issues les cellules préalablement utilisées in vitro. Les souris seront âgées d’environ 8 semaines de manière à ce qu’elles aient un système immunitaire suffisamment mature pour étudier les facteurs d’intérêts en réponse au traitement, sur la croissance tumorale.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une chimiothérapie par anthracyclines et des injections et prélèvements répétés au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, avec un suivi de la tumeur par bioluminescence, pour étudier l'effet d'une protéine sur la cardiotoxicité de la chimiothérapie. Le porteur indique que la croissance de la tumeur et la chimiothérapie peuvent être douloureuses. Il affirme que l'effet du traitement doit être vérifié in vivo, les cultures cellulaires ne représentant pas la complexité d'un organisme.

Objectifs

Depuis longtemps la cardio-toxicité des agents chimiothérapiques est établie chez l'Homme, cependant la chronologie et les facteurs aggravant de la maladie ne sont pas connus. Aussi, aucune stratification des patients n’est réalisable en amont du traitement car les mécanismes précis de cette cardiotoxicité restent complexes et imparfaitement étudiés. L’objectif du projet est de déterminer l’impact de l’inhibition de la Dipeptidyl Peptidase 3 (DPP3), une protéine fréquemment surexprimée dans différents cancers, sur le devenir des animaux traités aux anthracyclines , un des traitement de base du cancer du sein. Ce qui nous intéresse tout particulièrement sera la capacité du coeur à se contracter lorsque nous initierons le traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : 1. De valider l’hypothèse que les effets toxiques de la tumeur sur le coeur pré-traitement sont médiés par le DPP3 retrouvé dans la circulation 2. De confirmer l’intérêt d’utiliser le DPP3 dans la circulation comme biomarqueur prédictif de cardiotoxicité associée à la chimiothérapie 3. De prévenir la cardiotoxicité associée aux anthracyclines par l’utilisation d'un anticorps dirigé contre notre protéine DPP3.

Procédures

Anesthésies par voie intrapéritonéales: 1 à 2/semaine pendant 6 semaines, durée 20 minute. Prélèvements rétroorbitaires sur animaux anesthésiés: 1/semaine pendant 6 semaines, durée 5 min. Injection rétro-orbitaires 1/semaines pendant 3 semaines, durée 5 min. Injection sous cutané 1 fois en début de protocole, durée 5 min. Les produits utilisés seront un réactif luminescent présent chez les lucioles afin de suivre la croissance tumorale avec un appareil de bioluminescence, une chimiothérapie pour mimer le traitement de la tumeur chez l'homme, un anesthésiant à action rapide pour l'anesthésie en vue de l'échographie ou des injections/prélèvements sanguins dans le sinus rétroorbitaire, un analgésique à action rapide pour l'analgésie durant l'anesthésie, et notre anticorps dirigé contre la protéine d'intéret.

Impact sur les animaux

A la suite de l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses, les souris développeront une tumeur qui sera suivie au cours du temps par bioluminescence. Ce suivi est indolore mais nécessite une injection de réactif 3 fois par semaine et peut donc engendrer un stress pour l’animal. La croissance de la tumeur pourrait être douloureuse. La chimiothérapie utilisée peut elle aussi engendrer des douleurs pour l’animal.

Devenir

L'euthanasie de tout les animaux à la fin de la procédure permettra une analyse histologique des organes d'intérêts, ainsi qu'une analyse protéique et génétique de divers tissus selon les groupes d'appartenance des animaux.

Remplacement

Les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudié in vivo pour être sûr de son efficacité dans un organisme vivant complexe qui contient une multitude de tissus et organes qui peuvent être touchés.

Réduction

Nous avons effectué un calcul nous permettant d’avoir le nombre précis de souris nécessaire à l’étude. En utilisant les résultats d’une précédente étude de notre laboratoire sur un projet relativement similaire, nous sommes arrivés au chiffre de 12 souris par groupe en fin de protocole au moment dde l'euthanasie. Enfin, le suivi par bioluminescence permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d'acclimatation de 5 jours et seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie ainsi que par l'expérimentateur. Différents points limites seront particulièrement surveillés et seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux tous les jours. Les animaux âgés de 12 semaines recevront une injection sous cutanée de 200 microlitres de cellules cancéreuses du sein. A cette occasion, ils seront surveillés de manière visuelle (fréquence respiratoire) pendant 2h après injection. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé 3 fois par semaine par une technique d'imagerie par chimioluminescence qui permet: 1- une surveillance non invasive des points limites pour limiter le stress des animaux; 2- une réduction du nombre d'animaux nécessaires car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires. Les animaux seront préliminairement anesthésiés et après l'injection de produit fluorescent, ils seront placés dans l'appareil d'imagerie pour visualiser la taille de la tumeur. La manipulation dure 5 min max/animal. Ceux-ci seront ensuite replacés dans leurs cages d'origine à la fin de ce protocole. Deux semaines après l'injection de la tumeur, les animaux, mâles et femelles, recevront une injection intrapéritonéale de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours, laquelle peut engendrer des douleurs et donc une analgésie adaptée sera administrée en cas de besoin. Chaque semaine pendant 6 semaines, le prélèvement sanguin et l’échocardiographie seront faits l’un après l’autre pour limiter le nombre d’anesthésie hebdomadaire. Nous évaluerons la fonction cardiaque par échographie sous anesthésie légère, puis nous ferons des prélèvements sanguins via le sinus rétro-orbitaire, environ 100 microlitres à chaque prélèvement. Une pommade ophtalmique afin de réhydrater l'oeil de l'animal sera utilisée post prélèvement. La même procédure aura lieue pour l'injection de notre médicament candidat, avec l'ajout d'une pommade anesthésiante en amont. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement, l’apparence physique et la gêne pour se déplacer. En cas d’atteinte des points limites, les souris concernées auront alors un suivi adapté avec analgésie quotidienne, nourriture en gelée dans la cage, et si les points limite persistent, elles seront alors exclues de l'expérience.

Choix des espèces

La souris est utilisée en sciences expérimentales pour plusieurs raisons essentielles. Tout d’abord les souris partagent une grande homologie génétique et physiologique avec les humains, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Ensuite, les souris se reproduisent rapidement et sont relativement peu coûteuses à élever, ce qui permet d'obtenir rapidement des cohortes expérimentales. Troisièmement, les souris peuvent être facilement génétiquement modifiées pour étudier l'impact de gènes spécifiques sur les processus biologiques, offrant ainsi des informations précieuses sur la fonction des gènes. Pour notre étude, nous avons choisis des souris mâles et femelles d'une lignée de souris fréquemment utilisée dans la recherche en cancérologie pour sa capacité à développer des tumeurs injectées manuellement. Les animaux seront agés de 12 à 16 semaines dans un but de prendre des souris adultes, car le cancer du sein est une maladie fortement liée à l'âge. Prendre des souris plus jeune ne serait pas justifé pour ce protocole.

205 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer du sein triple-négatif, des traitements quotidiens cinq jours sur sept et des séances d'imagerie après injection d'un radio-traceur dans la veine de la queue, avant une mise à mort entre 30 et 100 jours pour prélever tumeurs et organes. Le porteur indique que le radio-traceur n'a jamais été testé chez la souris et attend une douleur modérée liée aux injections. Il présente le suivi par imagerie comme un moyen de réduire le nombre d'animaux par rapport aux mesures classiques.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est le cancer féminin le plus important en France et dans le monde en termes d'incidence et de décès. Le CS dit triple-négatif (CS TN) est très agressif et de mauvais pronostic. Il est important de trouver de nouveaux moyens de le soigner. Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules de CS TN. Nous avons identifié des traitements qui bloquent la production de cet oncométabolite et le développement des CS TN. Nous avons développé un nouveau radio traceur qui est capté par les cellules de CS TN en culture qui produisent cet onco-métabolite. Les objectifs de ce projet sont d'étudier, par imagerie médicale, la capacité de ce radio traceur à détecter les CS TN chez l'animal et à suivre l'inhibition du développement des tumeurs suite aux traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont de valider, in vivo, le radio-traceur pour la détection non-invasive, par imagerie médicale, des tumeurs qui produisent cet onco-métabolite. De plus, les bénéfices seront de démontrer l'intérêt de ce radio-traceur pour le suivi de l’efficacité de deux traitements que nous avons identifiés pour inhiber les effets de l’onco-métabolite sur le développement des cancers mammaires triple-négatifs (CS TN). Les retombées seront de déposer de publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer un radio-traceur pour la détection non-invasive des CS TN et le suivi des nouveaux traitements pour traiter les cancers du sein TN, qui sont de très mauvais pronostic et pour lesquels peu de thérapies efficaces sont disponibles.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection/expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/souris ; Traitement avec une molécule : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules 1 fois par jour, 5 jours, avec une durée de 3 min/souris.

Impact sur les animaux

Les études in vitro et in vivo avec le traceur n’a pas montré d’effets indésirables. Le radio-traceur n’a jamais été étudié et injecté chez la souris. L’onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires TN (dont celui étudié dans ce projet) et aucun effet indésirable n'a été observé. Les deux thérapies qui seront testés, ont déjà été utilisés in vivo (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées mais jamais en combinaison. Les différents traitements qui seront administrés aux souris causeront une douleur modérée due à la piqure de l’aiguille lors de l’injection. Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux car la piqure d’une aiguille pour injection du radio-traceur par voie intraveineuse dans la veine caudale est réalisée sous anesthésie des animaux. L’induction des tumeurs dans les animaux peut affecter la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que l’animal ne souffre pas de douleur, de la faim ou de la soif, d'inconfort, de blessures ou d’immobilité. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que les animaux ne souffrent pas de ces différents maux. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement mis à mort sous anesthésie.

Devenir

Pour les procédures 1 et 2 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J30-J45, car les organes et la tumeur seront prélevés à la fin des acquissions d'imagerie pour analyser la biodistribution du radio-traceur. Pour la procédure 3 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J80-100, car nous ferons un suivi dans le temps de l'efficacité des traitements d'intérêts par imagerie médicale non invasive et les souris seront mises à mort sous anesthésie au temps J80-J100 qui permettra d'analyser la croissance tumorale et la survie des animaux.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie médicale est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale. Ainsi, il sera possible d’étudier la distribution du radio-traceur et sa captation dans la tumeur dans les mêmes cohortes de souris, dans le temps, au cours du développement tumoral. De même, cette méthode permettra de détecter les tumeurs et de suivre l’efficacité des thérapies. Cette procédure permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en jeu par comparaison aux procédures classiques de biodistribution nécessitant le sacrifice d’un groupe d’animaux par condition et par temps d’observation.

Réduction

Le choix du nombre de souris par groupe selon les expériences et la répétition des expériences se base sur des travaux réalisés précédemment avec l'onco-métabolite sur les mêmes modèles de lignées cellulaires implantés chez la souris et sur l'analyse statistique des données. De plus, le suivi longitudinal des animaux par imagerie permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en œuvre par comparaison avec la procédure de biodistribution ex-vivo nécessitant le sacrifice d’un groupe de souris par temps d’observation et par condition expérimentale. La fiabilité des résultats obtenus est par ailleurs renforcée du fait que le suivi d’un même animal au cours du temps permet de réduire le biais statistique induit par la variabilité interindividuelle.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales (Hébergement en surpression, 5 animaux par cage IVC ventilée, sous un éclairage et une température (19-21°C) contrôlés) avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Ils seront manipulés dans des enceintes protégées. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général) et pesés 2 fois par semaine afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur (selon une grille de scoring). Une attention particulière sera apportée au maintien de la température corporelle des animaux anesthésiés qui seront mis sur un tapis chauffant. Si une souffrance est observée (selon une grille de scoring), un traitement pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire désigné. Si des symptômes correspondant à des critères d’arrêt de l’expérience sont observés, voir ci dessous, l’animal sera mis à mort sous anesthésie. De même, les animaux seront mis à mort sous anesthésie si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3, si elle est nécrosée ou présente une inflammation ou si des signes de souffrance apparaissent, voir ci-dessous. Les critères d’arrêt de l’expérimentation afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids rapide > 20 % du poids initial ou longue période de perte de poids, ulcération des tumeurs, comportement moribond, automutilation, diarrhée prolongée, paralysie, râle, écoulement nasaux, signes d'atteinte du système nerveux central, anorexie, saignement abondant par un orifice ou lésions interférant avec la prise de nourriture et d'eau.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et pour l’imagerie médicale et permet de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce. Les souris sont achetées à l’âge de 6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu'elles sont traitées car le cancer du sein se développe chez l'adulte.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de mélanome enrobées dans du collagène d'âges différents, puis des mesures et des injections de traitement trois fois par semaine sous anesthésie gazeuse pendant une cinquantaine de jours, pour tester si le vieillissement de l'environnement tumoral réduit l'efficacité d'une thérapie ciblée. Le porteur classe la procédure en modérée en raison d'un risque de métastases ou d'ulcération qu'il ne peut exclure. Il affirme que les méthodes in vitro ne prennent pas en compte la complexité d'un organisme et qu'il est "indispensable" de confirmer l'hypothèse sur un modèle vivant.

Objectifs

Le mélanome est le cancer de la peau le plus mortel du fait de son agressivité. Environ la moitié de ces cancers développent une protéine anormale responsable de cette agressivité. De nouvelles thérapies ont été développées, elles ciblent spécifiquement cette protéine anormale afin de bloquer son effet. Elles ont permis d'améliorer la survie globale des patients en stoppant la progression du cancer. L’effet anticancéreux de cette thérapie ciblée est rapide mais, après quelques semaines de traitement la tumeur peut développer une résistance. La résistance à cette thérapie est peu étudiée dans les cancers chez des patients âgés. Pourtant, le facteur vieillissement pourrait être impliqué dans l'échec de la réponse à ces nouvelles thérapies ciblées et, plus précisément, le vieillissement de l’environnement dans lequel se trouvent les cellules cancéreuses. En effet, la peau en vieillissant subit processus naturel qui modifie son organisation et qui pourrait empêcher le bon fonctionnement de la thérapie anticancéreuse. La population âgée étant en constante augmentation, il est indispensable d’évaluer les bénéfices/risques de cette nouvelle thérapie sur des organismes vivants tels que des souris. Les techniques d’étude du vieillissement du collagène en laboratoire se sont améliorées pour s’approcher au mieux de ce qu’il se passe dans le corps humain. Cependant, ces techniques ne tiennent pas compte de la complexité d'un organe ou d'un organisme vivant complet. C'est pourquoi nous devons confirmer nos hypothèses en utilisant des modèles vivants. Notre projet de recherche se concentre sur l'impact du vieillissement sur l'efficacité d'un traitement. Nous avons plusieurs objectifs : d'abord, confirmer que nous pouvons effectuer nos observations sur notre modèle vivant ; ensuite, comprendre comment l'environnement autour des tumeurs change avec l'âge et comment cela affecte leur évolution ; enfin, examiner comment le vieillissement de cet environnement influence la réaction des tumeurs à un traitement médicamenteux.

Bénéfices attendus

Ce protocole est un nouveau modèle d’étude mimant le vieillissement de l’environnement tumoral. En effet si le protocole d'injection de cellules cancéreuses enrobé de collagène a déjà été décrit, l'injection de ces mêmes cellules enrobées dans du collagène de différents âges n'a jamais été réalisée. Le bien-être animal sera amélioré avec un temps d’expérimentation réduit. Ce protocole représente donc une approche innovante dans l’étude de l’efficacité de traitements anticancéreux dans un organisme âgé.

Procédures

Injections des cellules cancéreuses (1 fois, sous anesthésie gazeuse), mesure des tumeurs (3 fois par semaine sous anesthésie gazeuse) , injections pour le traitement tumoral (3 fois par semaine pendant 4 semaines, sous anesthésie gazeuse). L'anesthésie gazeuse 3 fois par semaine pendant maximum 50 jours consiste en un flash anesthésique durant quelques secondes et permettant de réaliser nos mesures et nos injections en diminuant le stress chez la souris.

Impact sur les animaux

L'injection des cellules cancéreuses et l'injection du médicament pour traiter les tumeurs peut entrainer chez les souris de la douleur et du stress. La manipulation pour l’anesthésie peut entrainer du stress. Il n’est pas rapporté d’impact propre à notre protocole d'injection de cellules cancéreuse. Nous utilisons un protocole sans substance irritante ou inflammatoire. Cependant, le nombre d'étude reste relativement pauvre sur le sujet. Le suivi que nous mettrons en place, conforme aux exigences de l’éthique animale sera à même d’identifier de manière précoce le possible impact de notre protocole. Les cellules cancéreuses sont agressives, la procédure a été classée en catégorie modérée du fait d’une possibilité de survenue de métastases ou d'ulcération qui ne peut être exclue. Nous surveillerons ce risque. Les observations mises en œuvre durant la première partie du protocole nous permettront de réduire si justifié la durée de la procédure pour limiter la prévalence de métastases à l’origine de souffrances.

Devenir

L’euthanasie des animaux sera rendue nécessaire car les tumeurs seront prélevées afin d’être analysées. Dans le cas où le traitement anticancéreux administré serait seul efficace (réponse complète), la réutilisation de l’animal ne serait pas possible du fait du traitement préalable et du risque de moindre réponse à un nouveau traitement (source de variabilité inter-individuelle des sujets).

Remplacement

Les méthodes d’étude du vieillissement du collagène en laboratoire se sont perfectionnées afin de rendre les recherches in vitro plus proche de la réalité in vivo. Certaines d’entre elles connues et utilisées dans notre laboratoire ont permis d’obtenir de premiers résultats. Cependant elles ne prennent pas en compte la complexité d’un organe ou d’un organisme et ne peuvent être la méthode unique de remplacement de l’animal. Il est donc indispensable de confirmer notre hypothèse sur des modèles in vivo pertinents.

Réduction

Nous testerons dans un permier temps 2 lignées de souris différentes soit 1 male et 1 femelle par lignée (donc 4 souris). Ceci nous permettra de choisir le type de souris le plus adapté à notre protocole. Ceci s'intègre à terme dans la démarche de réduction. Après validation de la lignée de souris, Un nombre de 8 animaux par groupe sera nécessaire afin de pouvoir interpéter les résultats. Les expérimentations seront réalisées en deux temps, dans un premier temps ce protocole étant très peu réalisé nous souhaitons confirmer son efficacité sur un petit nombre de souris. En cas de résultats concluant dans cette première partie d’expérimentation, 4 lots de 8 souris seront nécessaires afin de répondre au dernier objectif : étude de l’impacte du vieillissement de l’environnement des tumeurs sur la réponse au traitement anti-cancéreux. Ce programme en 2 temps permet de réduire le nombre de souris, et de l’adapter préalablement aux expérimentaitons en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

L'hébergement des souris sera adapté à la de lignées des souris (Armoire ventilées) en groupe de 4 stables et harmonieux, nous surveillerons le risque d’agression entre congénères. Les cages seront enrichies en copeaux de papier permettant aux souris de se faire un nid / se cacher. Elles présenteront également des tunnels en carton leur permettant de ronger / se cacher, ainsi qu’un dôme avec une roue leur permettant de se dépenser (mobilité/exercice). Afin de réduire la perte de chaleur due à l’absence de poil, du coton sera ajouté dans la cage et la température de la table de manipulation sera augmentée d’un degré. Les souris seront stabulées en bas du portoir ventilé afin de limiter l’agression lumineuse. Les expérimentations ont été pensées pour être très courtes, permettant de diminuer les risques de chutes de températures et de stress de l’animal. L’injection des cellules cancéreuses, l’injection du médicament et la mesure des tumeurs se feront sous anesthésie gazeuse (flash anesthésie de quelques secondes) ceci permettra de réduire le stress lié à la procédure. La xénogreffe sera réalisée en sous cutanée sur le flanc des souris, ce site d’implantation étant considéré comme causant le moins de stress chez l’animal.

Choix des espèces

Des travaux antérieurs utilisant un protocole proche de celui que nous utiliserons ont été réalisés sur ces souris, ce qui justifie l’utilisation de cette espèce. Le traitement que nous allons tester a déjà été utilisé chez ces souris, aucun effet indésirable n’a été montré. Ces souris ont une éspérance de vie courte (8 à 9 mois), ce qui ne permet pas d’étudier le vieillissement naturel, mais qui justifie notre modèle. A notre connaissance il n’existe pas d’autre modèle animal rongeur adapté à ce protocole. Les tumeurs étudiées sont de tumeurs de l’adulte, c’est pourquoi dans le but de se placer dans conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité clinique, les souris seront âgées de 8 semaines ce qui correspond à un stade adulte. C’est l'âge de l’environnement qui sera injecté avec les cellule cancéreuses qui reproduira le vieillissement de l'environnement autour de la tumeur.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à trois injections de virus oncolytiques modifiés, avant un prélèvement de tumeurs et d'organes. Le porteur indique surveiller d'éventuels effets auto-immuns et fixe des points limites détaillés, dont une tumeur pouvant atteindre 1000 mm³. Il décrit disposer de cultures en trois dimensions et de puces microfluidiques, mais affirme que l'étude des effets sur "l'organisme entier" impose le recours à l'animal.

Objectifs

Les virus "oncolytiques" sont de nouveaux agents thérapeutiques capables de détruire spécifiquement les cellules tumorales sans attaquer les cellules saines. Deux virus oncolytiques sont actuellement approuvés comme traitements contre le mélanome métastatique (cancer de la peau) et le glioblastome (cancer du cerveau). Les virus oncolytiques présentent trois modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront produites uniquement dans les tumeurs. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux protéines à utiliser et aux conditions dans lesquelles les virus doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques codant pour différentes protéines impliquées dans la formation de structures lymphoïdes. Ces structures sont constituées de cellules immunitaires et permettent la mise en place de réponses anti-tumorales. Si les virus oncolytiques donnent des résultats très encourageants in vitro, l’évaluation des différents mécanismes impliqués requiert l'utilisation de modèles animaux vivants qui reproduisent la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires associées avant d'envisager un transfert vers la clinique.

Bénéfices attendus

Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouveaux virus oncolytiques immunoactivateurs, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections (1 challenge + 3 traitements) par animal.

Impact sur les animaux

Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant les protéines thérapeutiques codées par ces virus, il s’agit de cytokines et chimiokines connues. Les données de la littérature suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever des échantillons (tumeurs, rate, ganglions, autres tissus) qui serviront à obtenir des données supplémentaires sur ces expérimentations.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces - Taille de tumeur égale ou supérieure à 1000mm3 •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental

Choix des espèces

L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouveaux virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.