Oncologie

200 mulets-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pêchés dans des eaux saumâtres puis acclimatés à l'eau douce, jusqu'à 96 d'entre eux sont privés de nuit pendant un mois par un éclairage continu, jusqu'à 96 reçoivent une alimentation contaminée par un biocide, et 33 à 48 cumulent les deux. Le porteur reconnaît que les effets du biocide sont difficiles à anticiper faute de littérature, et envisage dans le pire des cas des lésions internes, un arrêt de la prise alimentaire ou une mortalité. 36 poissons sont isolés une heure dans une chambre de choix, ce que le porteur décrit lui-même comme potentiellement très stressant pour une espèce grégaire.

Objectifs

L’objectif général du projet est d’acquérir des connaissances concernant les effets de stress urbains sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Plus précisément, il s’agira d’évaluer les impacts de la pollution lumineuse nocturne et d’une pollution par un produit chimique sur le mulet-porc Chelon ramada, un poisson très commun dans les eaux côtières et saumâtres urbanisées européennes (ex : les ports, le long des quais). Le produit chimique, un biocide largement utilisé dans les détergents et produits ménagers en Europe, a été choisi car il est fréquent d’en retrouver dans l’eau. Les poissons que nous allons impliquer seront exposés soit à la pollution lumineuse, soit à la contamination de leur alimentation, soit aux deux, pendant un mois. A l’issue de cette période, nous mesurerons les effets de ces pollutions sur 1) leur niveau de stress via l’hormone « cortisol » que l’on pourra retrouver dans l’eau de leur bac et dans leur sang et via la présence de lipides spéciaux qui témoignent de la dégradation des cellules de l’animal ; 2) l’accumulation du polluant dans les organes des poissons ; 3) la façon dont les poissons se nourrissent et s’ils continuent à acquérir des acides gras qui leur sont essentiels ; 4) quelle(s) zone(s) en fonction de leur luminosité les poissons favorisent. Les résultats obtenus auront une portée internationale, les facteurs de pollution étudiés étant largement répandus.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de l’étude sont, à court terme, de compléter les connaissances en matière de réaction, par le mulet-porc, à un stress lumineux d’une durée d’un mois. A moyen terme, les résultats obtenus permettront d’appréhender les effets singuliers et combinés de deux facteurs de stress urbains sur cette espèce largement répandue dans le monde. A long terme, cette démarche expérimentale qui intègre des analyses sur plusieurs éléments biologiques (biofilms, poissons), permettra d’apporter des éléments de connaissance scientifique robustes sur les effets de la lumière artificielle nocturne et d’une pollution chimique émergente provoquée par le polluant testé et leurs éventuelles interactions, sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques urbains. Ces connaissances permettront de proposer des solutions pour optimiser la gestion des espaces publics en ville, en facilitant notamment l’arbitrage entre suppression, réduction ou mitigation des éléments susceptibles d’avoir des répercussions sur l’environnement.

Procédures

Les mulets-porcs seront pêchés dans des eaux saumâtres impactées par l’urbanisation. Des filets seront maintenus face au courant pendant 5 mn permettant de limiter le risque de les blesser. Ils seront transportés en moins de 2 h dans des sacs adaptés, dans un véhicule agréé, jusqu’au lieu de l’expérimentation où ils recevront un traitement antibiotique contre les pathologies. Les mulets-porcs étant une espèce capable de s’adapter à des changements de salinité, c’est-à-dire pouvant vivre aussi bien en eau douce qu’en eau salée, il faut qu’ils s’acclimatent à l’eau de rivière qui alimentera les dispositifs expérimentaux et qui est d’une salinité inférieure à celle du milieu de capture. Pour cela, des seuils d’acclimatation progressifs seront réalisés, accompagnés d’observations comportementales continues. Les poissons seront nourris avec un aliment commercial dont l’appétence en captivité a été éprouvée lors d’une étude préalablen. Un mois après, les poissons seront répartis en 12 lots de 11 à 16/17 individus (selon la survie des surnuméraires), exposés à des cycles d’éclairage différents (c’est-à-dire à une photopériode normale avec un cycle journalier comprenant des successions jour/nuit et une photopériode altérée avec un éclairage en continu) et à une alimentation saine ou contaminée à une concentration retrouvée dans le milieu naturel (comme dit dans le point 5.5.1). 36 poissons seront ensuite soumis à des tests comportementaux d’une durée d’1 h : une fois placés individuellement dans un dispositif appelé « chambre de choix », ils pourront se déplacer dans des zones plus ou moins éclairées. Ceci permettra d’évaluer l’effet de leur conditionnement précédent (exposition à une photopériode altérée ou normale, alimentation saine ou contaminée), sur leur comportement en matière de choix d’ambiance lumineuse. Tous les poissons seront anesthésiés à diverses étapes pour la réalisation d’une prise de sang par individu, nécessaire à l’évaluation de leur niveau de stress via le dosage du cortisol suite à leur exposition. Ils seront ensuite tous euthanasiés aux diverses étapes du projet (pêche, tests d’éclairage et d’alimentation et des chambres de choix).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à d’éventuelles blessures (écaillage, lésions externes) et à un stress lors de leur capture, puis lors du transport et de la phase d’acclimatation à l’eau de rivière. Une mortalité, faible selon une précédente étude, est possible au cours de ces étapes. Duant le projet, 66 à 96 individus (selon la survie des surnuméraires) seront exposés à une absence totale de nuit pendant un mois. C’est l’effet de ce stress, mimant une exposition à la pollution lumineuse nocturne en milieu urbain, qui sera quantifié par l’expérimentation. Les effets attendus sont d’ordres comportemental (mobilité accrue, frénésie alimentaire) et physiologique (accumulation du cortisol dans le sang et excrétion de cortisol dans l’eau). Dans un deuxième temps, 66 à 96 individus selon la survie des surnuméraires seront exposés, pendant un mois, à une alimentation contaminée par le biocide à des doses similaires à celles que l’on retrouve dans la nature. Des effets physiologiques ou comportementaux pouvant potentiellement affecter l’état de santé des animaux sont là aussi possibles, mais ils sont difficiles à anticiper en raison du faible nombre, voire de l’absence, d’articles scientifiques à leur sujet. On peut toutefois, dans le pire des cas, s’attendre à des lésions internes, une modification du comportement des animaux (arrêt de la prise alimentaire, mobilité accrue ou au contraire comportement de prostration) voire une mortalité (bien que peu probable de par les faibles concentrations de polluant utilisées). Ce sont ces effets qui seront analysés. Enfin, 33 à 48 animaux selon la survie des surnuméraires seront soumis à ces deux facteurs de stress réunis : la pollution lumineuse et la pollution chimique dans l’alimentation. Les effets attendus sont identiques à ceux décrits précédemment, avec une intensité éventuelle plus importante liée au cumul des stress. Enfin, 36 poissons seront transférés individuellement dans les chambres de choix décrites dans le point 5.6.1 où ils seront isolés durant une heure, ce qui peut générer un stress important. Les effets attendus sont dans ce cas d’ordre comportemental (agitation ou prostration) et physiologiques (excrétion et accumulation de cortisol).

Devenir

Les 200 poissons impliqués seront tous euthanasiés pour des analyses de leurs tissus et organes.

Remplacement

L’expression du stress et les réponses comportementales complexes attendues par cette expérimentation ne peuvent pas être abordées par l’usage d’un modèle de remplacement simplifié (par exemple, des cultures cellulaires) en l’état actuel des connaissances. De plus, le choix d’une espèce sauvage très répandue dans les écosystèmes aquatiques urbanisés d’Europe, plutôt que d’un modèle biologique expérimental plus standardisé (poissons zèbres ou medaka par exemple) permettra d’optimiser les résultats du projet à large échelle et dans un contexte appliqué et adapté aux objectifs du projet de recherche.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisé correspond au strict minimum requis pour l’obtention de résultats fiables et interprétables vis-à-vis de la question de recherche abordée. Ce nombre a été contraint pour respecter le principe de réduction en se limitant à tester l’interaction entre absence ou présence d’un à deux facteurs de stress. Les nombres impliqués permettront néanmoins d’obtenir des conclusions statistiques robustes. Chaque lot de poissons impliqués est constitué d’un nombre minimum d’animaux suffisant dont un total de 63 mulets-porcs surnuméraires pour pallier une mortalité éventuelle au cours des étapes de l’expérimentation.

Raffinement

Les animaux ne seront manipulés à l’aide d’épuisettes à mailles fines que lorsque ce sera strictement nécessaire (étapes de capture/transport puis répartition dans les bacs d’accueil). Tous les transferts opérés sur le lieu de l’expérimentation se feront à l’aide d’un pichet avec couvercle, grâce auquel seront évités les émersions et les risques de blessure. Les pêches seront réalisées selon des protocoles utilisés en routine par notre établissement ce qui permettra d’en optimiser l’efficacité. Les poissons seront capturés avec des haveneaux de surface positionnés face au courant (pas de tractage actif) pendant 5 min seulement afin de limiter les dommages causés par le filet. La sélection d’individus immatures juvéniles limitera l’impact des pêches sur les ressources naturelles. Un traitement antibiotique post-pêche sera appliqué pour limiter l’incidence de pathologies pouvant affaiblir les poissons. Une surveillance quotidienne de leur état sanitaire et général sera garantie. Les poissons seront nourris à satiété avec un aliment dont l’appétence a été éprouvée au cours d’une précédente étude. Des mesures continues de température, salinité et oxygène dissous et hebdomadaires des produits azotés garantiront la qualité de l’eau. Les bassins offriront un espace de mobilité confortable aux animaux : en fonction des étapes du projet, la quantité de poissons par bac sera faible et donc garante de leur bien-être. Les poissons seront tout le temps conservés en groupe, ce qui correspond à leur mode de vie habituel, à l’exception d’une durée d’une heure pendant laquelle 36 poissons seront placés dans des chambres de choix comme évoqué précédemment. A l’exception de cette dernière étape, un couvercle transparent sera posé sur chaque bac pour éviter tout échappement (saut) tout en permettant la diffusion de la lumière et le contrôle des poissons par les animaliers sans les perturber. Les bacs seront nus car un abri serait de peu d’intérêt pour le mulet-porc qui est une espèce mobile grégaire se déplaçant dans la colonne d’eau en dehors des activités alimentaires sur le fond. Les bacs seront en matériau opaque de couleur sombre, ce qui permettra de les distinguer visuellement les uns des autres et de produire une ambiance proche de celle du milieu d’origine des poissons.

Choix des espèces

Le mulet-porc Chelon ramada est présent dans la majorité des masses d’eaux saumâtres urbanisées de climat tempéré, ce qui en fait un modèle d’étude pertinent pour aborder l’impact des stress urbains sur les écosystèmes aquatiques. Son statut de conservation est non-préoccupant et c’est l’espèce dominante dans la zone de pêche ciblée si bien que l’impact de sa capture sur les ressources naturelles sera minimisé. Les animaux seront des juvéniles de 10 ± 3 cm de longueur totale, un stade de développement où ils consomment exclusivement du biofilm. Les jeunes mulets constituent ainsi un vecteur essentiel des transferts d’énergie entre compartiments benthique (fond) et pélagique (colonne d’eau) des réseaux alimentaires. Cette caractéristique permet d’appréhender l’effet des stress urbains non seulement sur l’espèce cible mais plus largement sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques urbains où l’espèce est représentée. La sélection d’individus juvéniles limitera également les effets potentiels des captures sur les ressources naturelles. Leur forte capacité d’adaptation à l’eau salée et à l’eau douce permettra de faciliter leur acclimatation à l'eau douce au sein des dispositifs expérimentaux. Enfin, le savoir-faire scientifique et technique de notre équipe, ainsi que ses connaissances de l’espèce cible, permettront d’optimiser l’ensemble des interventions durant le projet.

Pour un premier criblage in vivo de radiotraceurs à visée diagnostique ou thérapeutique, 2 400 souris sont utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses après leur mort. Certaines portent une tumeur greffée sous la peau, et toutes reçoivent une injection intraveineuse puis, si besoin, un prélèvement sanguin par jour pendant dix jours sur animal vigile maintenu dans un appareil de contention. Ce projet ne teste aucun traitement, il sélectionne les molécules qui feront l'objet d'études ultérieures, elles-mêmes soumises à une nouvelle demande d'autorisation. Le porteur présente ce criblage comme un raffinement, au motif qu'il réduira les effectifs des études suivantes.

Objectifs

Notre équipe de recherche est spécialisée depuis de nombreuses années dans le développement de radiotraceurs à visée diagnostique et/ou thérapeutique dans le domaine de l’oncologie. Après validation de nos molécules in vitro, il est indispensable d’effectuer un premier criblage in vivo des molécules précédemment sélectionnées afin de déterminer leur biodistribution et leur spécificité pour leur cible in vivo grâce à un suivi par imagerie nucléaire. Après injection du radiotraceur, l’imagerie nucléaire est réalisée in vivo chez l’animal anesthésié à différents temps. Les animaux utilisés pourront être des individus sains ou être porteurs de tumeurs implantées en sous-cutané en fonction du modèle d’étude et de la spécificité des molécules à tester. Ce premier criblage permettra d’identifier les molécules les plus prometteuses afin de pouvoir les engager dans un second temps dans des études plus conséquentes qui feront l’objet d’une demande d'autorisation de projet spécifique.

Bénéfices attendus

L’imagerie permettra de sélectionner plus rapidement des molécules potentiellement candidates au transfert clinique dans différentes pathologies cancéreuses et permettra de réduire le nombre d’animaux en engageant dans de plus grosses études seulement les molécules les plus pertinentes. A plus long terme, une sélection rapide des molécules candidates, permettra d'engager plus rapidement ces molécules dans des études plus appronfondies en vue d'un passage en "first into Human".

Procédures

Pour tous les animaux : - une injection intra veineuse (durée

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle (tumeur sous cutanée) peut entrainer une gêne voir une douleur légère en terme de déplacement de l'animal et de ressenti cutanée. Les injections intraveineuses se faisant sur animal vigile dans un appareil de contention (durée inférieur à 1 minute), l'animal peut ressentir un stress modéré pendant la procédure.

Devenir

Des analyses ex vivo sont prévues à l'issue de la procédure. Ainsi, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de cette procédure.

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules diagnostique et/ou thérapeutiques requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation statistique des résultats en prenant en compte l’homogénéité des modèles notamment pour les animaux porteurs de tumeur. De plus, les examens d’imagerie permettent également de réduire le nombre d’animaux grâce à la possibilité d’un suivi longitudinal où un animal est son propre contrôle au cours du temps. Nous prévoyons au plus performant de notre activité 2400 souris immunocompétentes et souris immunodéprimées. Il s’agit ici d’un nombre maximal sur 5 ans.

Raffinement

Ces études préliminaires constituent un raffinement à part entière car elles permettront une présélection des molécules sur un faible effectif d’animaux. Les molécules ayant montré le meilleur potentiel pourront être ensuite engagées dans des études requérant un effectif plus important et feront l’objet d’une nouvelle demande d’autorisation. Les examens d’imagerie permettent de raffiner l’étude grâce d’une part au caractère non invasif de la technique et d’autre part à la possibilité d’un suivi longitudinal au cours duquel chaque animal est son propre contrôle. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être réduits par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette dans chacune des cages.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptées pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Certaines lignées cancéreuses provenant de la souris, il est possible d’utiliser des souris immunocompétentes. Souris adultes âgées de 5 à 6 semaines pour optimiser la prise de greffe et éliminer toute modification du statut hormonal des animaux due à la puberté

528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun 12 à 15 heures avant chaque test pour être motivées à boire des solutions sucrées, reçoivent une solution sur la langue sous anesthésie générale, et pour un groupe une chirurgie stéréotaxique du cerveau suivie d'une semaine d'hébergement isolé. Le porteur détaille les tests, accès bref à sept solutions sucrées, consommation libre pendant vingt minutes, et test de tolérance au glucose avec cinq prélèvements de sang à la queue. Il rattache le projet à l'obésité et au diabète, tout en renvoyant les applications thérapeutiques à un "plus long terme".

Objectifs

Les informations sensorielles provenant de la bouche sont essentielles pour reconnaitre les sources de nutriments dans l’environnement et déclencher leur consommation. Or, la détection et la consommation de nourriture contenant du glucose est indispensable à la survie car ce nutriment est une source d’énergie primordiale pour le corps. Cependant, les mécanismes dans le système gustatif spécifiquement impliqués dans la détection du glucose et la différenciation avec les autres composants sucrés (fructose, autres sucres, …) ne sont pas encore compris. De plus, l’ingestion orale de glucose induit une production rapide d’insuline au début du repas, avant même que les taux de glucose sanguin augmente. Cette réponse anticipée est appelée phase céphalique de sécrétion d’insuline (PCSI), et permet une meilleure tolérance au glucose. Cette PCSI est médiée par le nerf gustatif depuis le système du goût, mais les mécanismes responsables de la PCSI dans le système du goût ne sont pas définis. L’information sucrée perçue dans le système gustatif est transmise dans les régions postérieures du cerveau, d’où le signal est ensuite distribué dans des circuits cérébraux spécifiques qui déterminent la perception du goût, la motivation à consommer ou non l’aliment, et/ou les réflexes physiologiques nécessaires pour préparer le corps à l’arrivée de cet aliment. Or, comment l’information provenant de différents composants sucrés (le glucose, le fructose, …) est traitée dans le cerveau pour induire une réponse spécifique à chaque composant est mal compris. Le but de ce projet sera donc 1) de mieux comprendre les mécanismes impliqués spécifiquement dans la perception sensorielle du glucose et la régulation de la glycémie au niveau du système gustatif, et 2) comment l’information sucrée est traitée au niveau cérébral. De plus, des différences entre les mâles et les femelles en ce qui concerne la perception gustative, la motivation et la prise alimentaire, ont été observées dans la littérature. Par exemple, les femelles ont une sensibilité différente de celle des mâles à l’égard de certains goûts. Le dernier objectif de ce projet sera donc d’analyser 3) d’éventuels effets du sexe sur les résultats obtenus.

Bénéfices attendus

Le glucose est un nutriment important pour l’être humain. A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment ce dernier est spécifiquement détecté et sa consommation régulée au niveau du système du goût, et comment l’information est traitée au niveau du cerveau. Il permettra également de mieux comprendre les différences entre les mâles et les femelles dans les comportements ingestifs. De plus, l’évolution rapide de nos sociétés modernes vers un accès facilité à des aliments transformés riches en sucres ajoutés est l’un des déterminants majeurs de l’émergence dans le monde de l’obésité et du diabète. Ces résultats sont donc importants pour permettre sur un plus long terme le développement de moyens thérapeutiques plus ciblés et plus efficaces contre l’obésité/diabète, ayant moins d’effets indésirables. Ils sont également importants pour les décisions sociétales et politiques concernant l’utilisation des sucres ajoutés dans l’alimentation et leurs effets indésirables sur la santé humaine.

Procédures

1er groupe de souris (durée maximale 5 semaines) : Protocole diminuant l’expression d’une protéine d’intérêt dans le système du goût (mise à jeun alimentaire/hydrique d’1 heure, anesthésie générale, application sans incision d’une solution sur la langue à l’aide d’une pipette) puis souris soumises deux fois (différents stimuli) à un des trois tests comportementaux (A : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures pour motiver l’animal à consommer les solutions, 4 fois pour l’entrainement ; 2 fois pour les tests puis accès bref à 7 solutions sucrées, 10 secondes par solution, pendant 20 minutes ; B : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures, 2 fois pour l’entrainement ; 2 fois pour les tests puis accès à une solution sucrée pendant 20 minutes ; C : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures, 3 fois pour l’entrainement ; mise à jeun alimentaire de 6 heures, 2 fois pour les tests de tolérance au glucose : consommation de glucose 5 minutes puis prélèvements de sang à la queue 5 fois une minute) puis souris mise à mort par injection d’euthanasiant chimique. 2ème groupe (durée maximale 2 semaines) : Prélèvement des cerveaux après consommation de solutions sucrées : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures pour motiver l’animal à consommer les solutions (2 fois pour l’entrainement ; 1 fois pour le test), mises à jeun hydrique/alimentaire d’1 heure (1 fois avant le protocole de diminution d’expression linguale décrit groupe 1, 1 fois après le test), mise à mort par perfusion intracardiaque sur animal profondément anesthésié. 3ème groupe (durée maximale 12 semaines) : Chirurgie stéréotaxique (1 heure par animal), surveillance post-opératoire d’une semaine avec hébergement individuel et injections d’analgésique, puis souris soumises deux fois à chacun des trois tests comportementaux (même interventions que précédemment décrites groupe 1), puis mise à mort dérogatoire par perfusion intracardiaque sur animal profondément anesthésié.

Impact sur les animaux

Les effets sur les animaux seront : - un stress (maximum une journée) au réveil de l’anesthésie générale effectuée pour l’application sur la langue de la solution induisant une diminution d’expression de la molécule d’intérêt, - une douleur locale et passagère (maximum 5 minutes) lors des injections systémiques ainsi que lors de prélèvements sanguins, - un stress et une douleur locale post-opératoire (en moyenne trois jours) après l’anesthésie générale et la procédure chirurgicale au niveau du cerveau, - un léger risque d’hémorragie ou d’infection du site chirurgical les jours suivants la chirurgie, - un stress chronique lors de l’hébergement individuel des animaux suite à la chirurgie stéréotaxique (maximum une semaine), - un stress chronique et une perte de poids à chaque mise à jeun alimentaire des animaux lors des tests comportementaux (maximum 15 heures chacune).

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort et les tissus et organes seront prélevés pour analyses histologiques ou moléculaires. En effet, suite au protocole d’infusion linguale ou d’injection au niveau cérébral, il est nécessaire de vérifier la localisation correcte et l’effet sur le tissu/l’organe, pour pouvoir les associer aux modifications comportementales observées. D’autres tissus/organes seront également prélevés pour analyser des variations potentielles dans l’expression de diverses molécules d’intérêt liées à la régulation du glucose ou de la prise alimentaire.

Remplacement

La vérification du rôle précis de la protéine d’intérêt présente dans le système gustatif dans la consommation alimentaire et le métabolisme glucidique, ainsi que l’analyse du traitement de l’information au niveau cérébral, ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants. La motivation à consommer des aliments ainsi que la régulation du métabolisme impliquent une communication entre différents organes. Il n’existe pas actuellement de modèle de substitution permettant d’étudier les dialogues inter-organes. Ce projet sera donc réalisé chez la souris, modèle de référence pour les études métaboliques et de physiologie alimentaire.

Réduction

Le nombre optimal d’animaux, c’est-à-dire nécessaire à l’obtention de résultats significatifs sans être trop élevé, est calculé grâce à des analyses de puissance statistique. Différents tests statistiques seront ensuite utilisés pour analyser les différences significatives entre les groupes expérimentaux. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux sont utilisés pour différents tests comportementaux après une période de repos et de récupération.

Raffinement

Dès la réception des animaux à l’animalerie, tout est mis en place pour réduire leur stress et inconfort. A leur arrivée, une semaine d’acclimatation au nouvel environnement et personnel, sans expérimentation, sera observée. Les animaux seront hébergés dans un environnement avec taux d’humidité et température contrôlés, en cycle jour-nuit 12h-12h. Ils seront élevés en environnement enrichi grâce à des dômes de nidation et carré de coton, et seront répartis à quatre par cage sauf lorsqu’un isolement sera nécessaire. Dans ce cas, pour réduire le stress les animaux bénéficieront d’un enrichissement supplémentaire dans leur cage d’hébergement. Un suivi quotidien par le personnel compétent sera effectué. Les animaux seront manipulés régulièrement par les expérimentateurs dans le but de réduire le stress. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés pour s’assurer de l’état de santé des animaux. Les différentes manipulations seront réalisées par du personnel compétent, conformément à la législation. Lors des prélèvements de sang, la douleur des animaux sera diminuée grâce à l’application locale d’un analgésique, suivi après le prélèvement d’une désinfection à la bétadine. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie générale et une analgésie appropriée seront fournies. Les souris seront gardées sur un coussin chauffant et surveillée jusqu’à leur réveil complet. Un suivi post-opératoire de minimum trois jours sera effectué, avec ajout d’analgésique chaque jour, et il sera prolongé jusqu’à une semaine si l’animal n’a pas atteint son état pré-opératoire. A la fin des expériences, les animaux seront mis à mort. Tout au long des expérimentations, si un animal présente un comportement anormal (perte de poids, prostration, piloérection, activité ralentie, …), il sera surveillé avec attention et retiré de l’étude. Si son état clinique ne s’améliore pas dans les 2 jours, il sera mis à mort.

Choix des espèces

Les résultats préliminaires obtenus ainsi que les données bibliographiques dans ce domaine d’étude sont pour la grande majorité réalisés avec le modèle souris. Afin d’éviter la duplication inutile de travaux déjà publiés, et de pouvoir effectuer des comparaisons avec les travaux précédents, il est important de continuer sur des modèles similaires. Des souris âgées de 9 semaines à leur arrivée à l’animalerie seront utilisées dans ce projet de recherche. Cela correspond au stade de l’état jeune adulte, la maturité sexuelle est atteinte par les deux sexes. Il n’y aura pas d’effet confondant sur les résultats dû au développement du système du goût ou du système nerveux central lors de la phase juvénile et adolescente de la souris.

Greffées d'une tumeur sous la peau puis irradiées sous anesthésie, 2 800 souris sont toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à huit injections d'immunomodulateurs dans l'abdomen après l'irradiation, et le porteur indique que la croissance de la tumeur peut gêner leurs déplacements et provoquer des douleurs modérées. Les souris qui ne développent pas de tumeur, ou dont la tumeur n'atteint pas la taille voulue, sont tuées sans même avoir servi à l'expérience, un taux d'échec de greffe d'environ 20 % étant intégré aux effectifs. Le porteur revendique l'absence d'"alternative non animale" pour étudier les cellules immunitaires dans leur environnement tumoral.

Objectifs

La radiothérapie constitue l’un des trois piliers de l’arsenal thérapeutique contre les cancers. Elle est utilisée dans plus de la moitié des nouveaux cas de cancer, ce qui représente environ 200 000 patients en France chaque année. Pour augmenter les chances de guérison, les techniques de radiothérapie peuvent être associés à des molécules capable de réguler la réponse immunitaire l'avantage des combinaisons radiothérapie et immunothérapie ont été parfois démontrés mais sont souvent associé à des échecs thérapeutiques car de nombreux patients ne répondent pas dans l'identification des mécanismes moléculaires et cellulaire capable d'augmenter l'efficacité thérapeutique des associations radiothérapie + immunothérapie est en plein essor. En effet d'un point de vue conceptuel, ces combinaisons permettraient potentiellement de réduire le volume d'irradiation de la tumeur et ceci pour des tumeurs soit trop grosses soit placées à des endroits trop à risque pour les patients. In fine l'association radiothérapie en condition d'irradiation partielle plus immunomodulateur permettrait de limiter à la fois la toxicité aux tissus sains mais aussi de pouvoir traiter des patients pour lesquels aujourd'hui il y a des échecs thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Dans ce projet nous proposons dans différents modèles de tumeurs de souris chez la souris d'étudier le potentiel d'une association entre une radiothérapie en condition partielle et un traitement ayant un effet sur le système immunitaire. Nous proposons d'étudier en profondeur les mécanismes associés à cette réponse dans les 2 modèles les plus pertinents. Ces données permettront d’apporter la preuve de concept de la faisabilité de ce type d'approche dans un modèle intégré mais aussi potentiellement d'identifier de nouvelles cibles moléculaires capables d'optimiser ces associations thérapeutiques.

Procédures

Injections de cellules tumorales en sous cutanée chez tous les animaux : une injection par animal sous anesthésie gazeuse. La souris aura préalablement été rasée sur le flanc ou minium un jour avant l’injection des cellules tumorales. L’injection des immunomodulateurs se fera par injection intrapéritonéale. La première injection aura lieu après l‘irradiation et sera renouvelée tous les 2 à 3 jours sur une période de deux semaines suivants l’irradiation (soit au maximum 8 injections par animal). L’irradiation des tumeurs sera réalisée sous anesthésie pour tous les animaux chez qui la tumeur aura atteint la taille attendue, excepté pour le groupe contrôle. Après l’irradiation, les souris sont placées en thermacage pour le réveil. Les animaux n’ayant pas développé de tumeurs ou n’ayant pas de tumeurs à la taille souhaitée seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales et par la croissance des tumeurs. La croissance de la tumeur peut engendrer une difficulté à se déplacer et des douleurs modérées. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur au maximum. A cette fin, les animaux seront surveillés quotidiennement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de tissus et tumeurs pour analyses ultérieures.

Remplacement

Dans sa globalité, ce projet a pour but d'objectiver et de comprendre comment une tumeur irradiée partiellement peut être traiter en association avec une molécule capable de réguler la réponse immunitaire. Les données obtenues sont primordiales pour pouvoir in fine passer à des applications potentielles chez l'homme. Dans ce projet les modèles animaux permettront d'étudier finement la relation entre la radiothérapie et l’immunothérapie dans un organisme vivant et intégré. Nous proposons d'étudier ceci sur plusieurs modèles de tumeurs afin de savoir si les mécanismes identifiés sont associés à des caractères oncologiques généraux. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales et des cellules immunitaires dans leur environnement tumoral, ce qui justifie l’utilisation d’animaux vivants dans cette étude.

Réduction

Les modèles animaux d’expérimentation pour l’étude des tumeurs implantées présentent un certain taux d’échec de prise de greffe (environ 20%) et sont, d’autre part, influencés par la physiologie des animaux, ce dont nous devons tenir compte pour établir les effectifs de souris par groupe. L’approche go/no go entre la procédure 1 et la procédure 2 va nous permettre également in fine de réduire le nombre d'animaux. Pour l’étude de la survie et de la croissance des tumeurs, nous envisageons des groupes de 30 animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, du plasma et en cytométrie, des groupes de 30 animaux sont également nécessaires. Pour les analyses génétiques, des groupes de 10 animaux sont suffisants, car les tests statistiques sont réalisés sur des milliers de cellules par échantillon, ce qui augmente significativement la puissance statistique.

Raffinement

Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton et des niches en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Du papier Craft pour également être ajouté si besoin. Les souris seront suivies quotidiennement et des mesures des tumeurs seront réalisés 2 à 3 fois par semaine à partir de l’injection des cellules tumorales. Les points limites seront strictement appliqués. Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de poids, prostration) seront évalués trois fois par semaine. L’euthanasie des souris sera envisagée dès qu’un point limite sera atteint.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de biologie des rayonnements. Elle est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. Les outils de biologie sont très développés chez la souris, ce qui permet des études poussées. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez cette espèce en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus vers des applications cliniques. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures pour ce type d’étude.

Pour tester des vésicules extracellulaires issues de cellules infectées par un virus candidat, 948 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans la veine de la queue, trois injections de virus et deux prélèvements sanguins, avec apparition attendue de tumeurs sous-cutanées ou pulmonaires pouvant entraîner perte de poids, mobilité réduite et cyanose. Un amendement porte les groupes de 15 à 21 souris parce qu'au cinquième jour toutes ne présentaient pas de tumeur palpable. Le porteur affirme qu'aucun modèle non animal ne récapitule les mécanismes de la mise en place des tumeurs.

Objectifs

Les vésicules extracellulaires (EVs) circulent dans l’organisme et agissent comme des messagers entre les cellules. Elles suscitent un intérêt croissant lié à leur capacité à transférer du contenu biologique entre cellules. En effet, les EVs ouvrent la porte à de nouveaux concepts et opportunités tant biologiques que thérapeutiques. Les cellules cancéreuses sont particulièrement de bonnes productrices d’EVs. Elles peuvent favoriser la croissance tumorale ou jouer un rôle dans l'inhibition de la croissance tumorale. Ainsi, les EVs ont un double rôle dans la régulation du cancer. Les données actuelles montrent que l'immunothérapie basée sur l’utilisation d’EVs est une approche prometteuse dans le cadre du cancer, suggérant que les EVs pourraient devenir des vaccins très efficaces. Ainsi, des études récentes avec un virus candidat dans le cadre de la thérapie contre le cancer ont montré l'apparition d'EVs contenant des protéines codées par ce virus thérapeutique. Le but de ce projet est donc d’analyser l'effet des EVs libérées par des cellules infectées par des candidats viraux et leur utilisation potentielle dans la thérapie anticancéreuse. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence l'effet des EVs sur des lignées de tumeur greffées dans un modèle de Souris. Les effets seront suivis sur la croissance tumorale mais aussi sur les facteurs circulant au niveau sanguin. Les données générées nous permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes d'action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d'action et son efficacité en fonction de la vitesse de croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets d'un candidat médicament sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre sa capacité d'action et l'impact sur des lignée tumorales déjà installées. Cette connaissance nous permettra de mettre en place un candidat médicament permettant de soigner certaines tumeurs chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par injection sous-cutanée ou intra-veineuse à la queue, durée 1 minute. Par la suite, des injections de virus seront pratiquées (3 fois), durée moins d’une minute. Deux prélèvements sanguins seront aussi effectués chacun durant environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous anticipons l'apparition de tumeurs sous-cutanées ou pulmonaires, qui pourraient déclencher une éventuelle perte de poids, une mobilité réduite, un mauvais toilettage, une cyanose. Ce protocole aura une durée maximale de 60 jours. Deux prélèvements sanguins d'un volume de 200μL seont effectués ainsi que trois injections de virus, pouvant entriner un léger incomfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J60 ou à l'atteinte d'un point limite. Ils ne sont pas réutilisables du fait de la présence de cellules tumorales et de candidats médicaments dans leur organisme.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l'oncologie ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèle non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexe à l'oeuvre dans la mise en place de tumeurs ou la réponse immunologique associée.

Réduction

Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, pour l’étude pilote 6 animaux par condition seront suffisants sur conclure sur la toxicité et l’immunogénicité des EVs. Puis d’après nos connaissances des modèles tumoraux sous-cutanés et intra-veineux chez la souris des groupes de maximum 15 animaux par condition seront suffisants. Cet effectif nous permettra de disposer de conclusions statistiquement relevantes. Nous mesurerons les tailles de tumeurs et le poids de manière répétées. Nous analyserons ces données par analyse statistique à deux paramètres (avec ou sans EVs/ concentration de cellules). Amendement : Nous souhaitons augmenter le nombre d’animaux de la PE2 suite à l’obtention de nos premiers résultats. En effet, lorsque nous démarrons le traitement à J5 toutes les souris ne présentent pas de tumeurs palpables. Afin de conserver cette chronologie de traitement nous souhaitons augmenter le nombre d’animaux dans la procédure sur les modèles tumoraux sous-cutanés chez la Souris (PE2) ainsi les groupes de 15 animaux par condition seront remplacés par des groupes de 21 souris.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement avec la présence d’un enrichissement (Maisonnettes en carton ou de kraft). Nous injecterons les cellules tumorales sur le flanc. Ensuite l'apparition de tumeurs et leurs croissances seront mesurées trois fois par semaine afin de suivre la progression ainsi que l'effet possible du candidat médicament sur celle-ci. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique tiédi. Nous suivrons à chaque pesée (trois fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, les sites d'injection et l'aspect des tumeurs. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray désinfectant seront attribués.

Choix des espèces

Le modèle Souris constitue un bon modèle pour l'étude de modèle tumoraux. En effet, il s'agit de mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme pour disposer d'une apporche translationnelle valide. Nous analyserons des animaux agés de 8 semaines au moment de l'injection. A cet age, le système immunitaire est suffisamment développé.