Oncologie

800 souris vont être utilisées dans la création et le maintien de lignées de vieillissement prématuré, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux porteurs d'une seule copie de la mutation sont transférés vivants vers un autre site avant six mois, ceux qui en portent deux copies sont tués avant l'âge de deux mois. Le porteur indique que la mutation entraîne à terme perte de poids, dos voûté et atteintes cardiaques, et fixe un point limite fondé sur des tests de réflexe de retournement et de préhension. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces mécanismes et qu'une étude sur "l'organisme entier" est "nécessaire".

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’évaluer chez l'animal comment le vieillissement, et plus spécifiquement l’induction du vieillissement au niveau de la cellule, perturbe les fonctions métaboliques, et en particulier le contrôle du métabolisme glucidique ainsi que les adaptations métaboliques du foie liées au jeûne alimentaire. Au regard d’autres études préalables menées sur le modèle de veillissement prématuré utilisé dans cette étude, les phénotypes dommageables envisagés ici sont de classe modérée. Néanmoins, pour limiter l’impact de ces phénotypes au moment des analyses prévues dans le projet, ainsi que leur survenue trop précoce, seuls les animaux porteurs de la mutation d'intérêt à l’état hétérozygote (une seule copie du gène muté) seront maintenus en élevage et transférées dans des zones d’expérimentation dédiées avant l’âge de 6 mois. Des études précédentes indiquent que ces animaux présentent un poids et une fertilité normale jusqu’à l’âge de 8 mois et une survie moyenne de 15 mois. Les analyses du métabolisme seront réalisées sur des animaux agés de 6 mois.

Bénéfices attendus

Le projet devrait permettre de générer des connaissances permettant d’ouvrir de nouvelles pistes pour la prévention et le traitement des maladies associées au vieillissement. Cette étude aidera à mieux comprendre les changements biologiques qui accompagnent le vieillissement et à éviter les déficiences métaboliques des tissus des personnes âgées tel que le diabète de type 2.

Procédures

Aucune procédure invasive n’est prévue dans le cadre de l’élevage de ces animaux, en dehors des actes à des fins d'élevage, de la biopsie prélevée pour le génotypage, ainsi que des actes nécessaires à la prise en charge d'un vieillissement prématuré.

Impact sur les animaux

Les souris seront élevées jusqu’à l’âge de 6 mois, moment où les phénotypes dommageables envisagés ne sont pas détectables selon les données déjà publiées. Les phénotypes plus tardifs (au-delà de 8 mois) liés à cette altération génétique incluent de nombreux signes de vieillissement prématurés, incluant une perte de poids, des perturbations métaboliques, un dos voûté, des problèmes de pigmentation du pelage, des atteintes cardiaques, etc... Aucune procédure invasive n’est prévue dans le cadre de l’élevage de ces animaux.

Devenir

Les individus seront produits uniquement à des fins d'élevage afin de générer des cohortes qui seront transférées dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux présentant l’altération génétique en deux copies (homozygotes), associé à la survenue très précoce des phénotypes liés à l'âge, seront euthanasiés avant l'âge de 2 mois.

Remplacement

Les analyses que nous allons réaliser nécessitent l'utilisation d'animaux puisqu'à l'heure actuelle, aucun modèle in vitro ne permet de récapituler la complexité des mécanismes physiopathologiques (et notamment ceux liés à la perturbation du métabolisme) associés au vieillissement. Aussi, dans le cadre de ce projet, une étude sur l’organisme entier est nécessaire.

Réduction

Le total d'animaux a été définis d'après des analyses statistiques comme nécessaires et suffisants (ni trop, ni trop peu) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs qui nous permettront de conclure. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, 2 tests métaboliques différents seront réalisés à 48h d’intervalle sur les mêmes animaux en suivant une approche de randomisation des animaux pour ne pas introduire de biais expérimental. Par ailleurs, les animaux utilisés pour les tests en cages métaboliques seront également utilisés pour des analyses tissulaires et moléculaires. Du fait de différences possibles liées au sexe décrites dans la littérature, il est nécessaire de constituer des groupes de mâles et de femelles. Le nombre d'animaux par groupe expérimental est fixé à 10 pour les tests métaboliques choisis et les analyses en cages métaboliques, et à 5 pour les études moléculaires et tissulaires.

Raffinement

Cette lignée présente des caractéristiques phénotypiques spécifiques de vieillissement accéléré dont il faudra tenir compte mais qui ne devraient pas être limitants à l’âge auquel les animaux seront élevés puis transférés vers les zones d’expérimentation (l’espérance de vie moyenne est de 15 mois pour les animaux portant l’altération génétique en une seul copie (hétérozygotes)). De fait, la principale stratégie de raffinement consistera à utiliser des animaux de moins de 6 mois, âge au-delà duquel certains phénotypes de vieillissement pourraient apparaître. Les animaux feront néanmoins l’objet d’un suivi quotidien pour détecter et renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux de la douleur ou d’éventuelles anomalies (isolement, absence de mobilité, perte d’appétit, hérissement des poils, dos voûté…). L’état de santé général sera évalué par le test de réflexe du retournement et par la capacité d'agrippement qui constitueront un point limite entrainant la mise à mort de l’animal. Si les animaux sont stressés et ne se nourrissent pas convenablement, de la nourriture gélifiée sera placée dans la cage pour faciliter leur réhydratation et pour diminuer leur stress avant euthanasie. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (batonnets en coton, frisottis, cabane en carton ). Le change est fait de façon hebdomadaire.

Choix des espèces

Les génotypes complexes nécessaires à cette étude ne sont accessibles que chez la souris. Les souris utilisées seront des souris adultes, l'optique étant de favoriser l'émergence des caractéristiques phénotypiques du vieillissement.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit jusqu'à quatre injections et subit jusqu'à quatre séances d'imagerie TEP sous anesthésie générale sur quatre semaines, avant un prélèvement d'organes post mortem. Le projet cherche à mesurer la biodistribution de quinze peptides candidats, dont huit seulement sont disponibles, pour orienter de futures applications médicales. Le porteur affirme que l'étude in vivo de l'élimination et de l'accumulation dans les organes ne peut se faire que sur des animaux.

Objectifs

Au cours des dernières années, les peptides ont connu une augmentation de leur utilisation en médecine que ce soit pour des applications en tant agents diagnostiques ou comme composés thérapeutiques. Ils bénéficient d’une meilleure bio-distribution et bio-disponibilité que les anticorps tout en possédant une plus forte affinité et sélectivité que les “petites molécules”. Cependant, les peptides naturels sont souvent difficilement utilisables sans modification préalable de leurs structures en raison de leurs temps de demi-vie faibles in vivo. Les modifications chimiques permettent de générer des peptides ou des pseudo peptides (endo thio-peptide, uréido-peptides par exemple) ainsi que des peptides portant des chaines carbonées ou fluorées qui améliorent considérablement leurs demi-vies mais qui modifient aussi leurs bio-distribution in vivo. L’objectif de ce projet est de déterminer par imagerie non invasive la biodistribution et la biodisponibilité de ces peptides après une administration par voie intra-veineuse, intra-péritonéale ou en sous cutanée et également de définir précisément les voies d’élimination et les zones potentielles d’accumulation afin d’anticiper une toxicité potentielle de ces peptides et de sélectionner les meilleurs candidats pour de futures applications en médecine. L’imagerie in vivo nous permettra également d’étudier la capacité de peptides modifiés à traverser les membranes (paroi intestinale, barrière hémato- encéphalique, peau). Les résultats seront comparés à ceux obtenus avec les peptides natifs mais aussi comparés entre eux selon les méthodes d’administration. Retombées attendues : ce projet doit ouvrir la voie à l’utilisation des peptides comme outil thérapeutique pour le traitement de maladies ou comme agents d’imagerie pour le diagnostique. Le 2eme objectif de ce projet est de permettre de sélectionner les meilleurs candidats médicaments ou à orienter les travaux de recherche visant à améliorer les propriétés pharmaco-cinétiques et dynamiques des peptides. 15 molécules sont envisagées (8 sont d’ores et déjà disponibles) pendant la durée du projet. Nous travaillerons sur souris blanches Balb/c mâles ou femelles indifféremment. Cette phase de sélection permettra de choisir les molécules les plus prometteuses qui feront l’objet de demande d’expérimentation spécifique ultérieurement si les résultats préliminaires sont suffisants.

Bénéfices attendus

est doit permettre de sélectionner les meilleurs candidats médicaments ou à orienter les travaux de recherche visant à améliorer les propriétés pharmaco-cinétiques et dynamiques des peptides. 15 molécules sont envisagées (8 sont d’ores et déjà disponibles) pendant la durée du projet. Nous travaillerons sur souris blanches Balb/c males ou femelles indifféremment. Cette phase de sélection permettra de choisir les molécules les plus prometteuses qui feront l’objet de demande d’expérimentation spécifique ultérieurement si les résultats préliminaires sont suffisants.

Procédures

Les animaux recevront au maximum 4 injections de produit selon 3 voies maximum d'une durée de 1 minute chaucune sur une période de 4 semaines sous anesthésie générale isoflurane. Chaque animal aura 4 examens d'imagerie maximum d'une durée de totale de 120 minutes et minimale de 10 minutes sur une période de 4 semaines sous anesthésie générale. Pas de chirurgie ni de prélèvement sur animal vigile ou anesthésié dans ce projet.

Impact sur les animaux

Les doses de radio-activité injectées et les doses de rayons X reçues n'induisent pas d'effets indésirables sur la durée de l'étude .Un léger hématome peut apparaitre au site d'injection intraveineux mais qui se résorbe en 48 h selon notre expérience.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure car différents organes d'intérêt seront prélevés post mortem pour des analyses ex vivo ultérieures.

Remplacement

L'objectif de ce travail étant d’évaluer in vivo la biodistribution, l’élimination et/ou l’accumulation dans des organes de différents petpides elle ne peut se faire que sur des animaux.

Réduction

L’imagerie TEP/TDMX est non invasive, les quantités de produits injectées sont de l’ordre de 0,01 mg/Kg ce qui est extrêmement faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. En effet, chaque animal recevra le peptide selon les 3 modalités d'injection après une période wash out de 24 heures minimum. En fin de protocole, les organes seront prélevés pour des études ex vivo complémentaire sans augmenter le nombre d'animaux. Nous utiliserons 10 à 15 souris par groupe pour pouvoir faire des statistiques sur les résultats obtenus. Ce nombre d'animaux par groupe est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité.

Raffinement

Avant le début du protocole, les animaux sont habitués à la présence du personnel pendant une période minimale de 7 jours et maximale de 14 jours. En dehors des périodes d’examen les animaux sont manipulés le moins possible tout en faisant attention à minimiser le stress induit par la manipulation et la présence du personnel du laboratoire. Les animaux sont placés à plusieurs par cage et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les intercations sociales et une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite la thermorégulation de l’animal ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Un gel ophtalmique est appliqué sur la rétine pour éviter le déssechement occulaire et une injection sous cutané de NaCl 0.9% à température corporelle (10 ml/kg) pour éviter la déshydratation lors des anesthésies (examens TEP/TDMX et injection). La température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorés en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax respectivement pendant les examens d'imagerie afin de déceler tout signe précoce de mal être. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés .

Choix des espèces

Le projet vise à déterminer les voies d’élimination, le stockage dans des organes cibles ainsi que des paramètres pharmacologiques. Etant donné que notre objectif n’est pas de déterminer l’efficacité de chaque produit, sur un modèle spécifique, des souris blanches peuvent être utilisées pour cette étude. Les souris utilisées seront agées de 6 à 8 semaines (adulte) lors de l’injection des radiotraceurs.

672 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracardiaque de cellules de cancer du sein sous anesthésie, un suivi par bioluminescence, puis sont tuées par cohortes de un à trente jours après l'injection pour prélever cerveau, foie et poumons, le développement métastatique pouvant réduire la mobilité. Le porteur cherche à identifier des régulateurs des métastases cérébrales, les bénéfices pour les patientes étant situés "à moyen ou long terme". Il indique utiliser en amont un dispositif "métastase-sur-puce" pour présélectionner les cibles.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier les régulateurs moléculaires majeurs (master regulators) impliqués dans les étapes précoces du développement métastatique cérébral des cellules cancéreuses de sein triple négatif.

Bénéfices attendus

Les métastases cérébrales représentent un enjeu majeur dans le cancer du sein du sous-type triple négatif. Environ 25% des patientes atteintes de ce type de cancer développeront une métastase cérébrale à la suite d’une tumeur primaire, leur conférant une survie médiane de 6 mois. Dans ce contexte, il est nécessaire d’identifier des acteurs impliqués dans le développement métastatique cérébral qui représenteront de potentielles cibles pour en limiter le développement. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires activés lors de la dissémination de cellules cancéreuses dans le parenchyme cérébral et ainsi découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles bloquant le développement de métastases cérébrales. Ce projet sera donc bénéfique à moyen/long terme pour les patientes atteintes de cancer du sein métastatique (santé humaine).

Procédures

Après l’arrivée et l’acclimatation pendant 7 jours des animaux en zone d’hébergement, l’ensemble des 336 animaux seront manipulés tous les 2 jours pendant 3 semaines par l’expérimentateur avant le début des procédures afin de réduire leur stress et de les habituer à la manipulation humaine. Le projet se déroulera ensuite en trois parties. Plusieurs étapes sont communes à l’ensemble des parties. L’ensemble des animaux (336) sera soumis à une anesthésie gazeuse (durée 15min) afin, dans un premier temps de tondre une partie de leur pelage au niveau du torse. Ensuite, les animaux recevront une injection intracardiaque de cellules cancéreuses (cellules humaines de cancer du sein ; parties 1 et 2 : 240 animaux), de placebo (parties 1 et 2 : 24 animaux) ou de cellules cancéreuses dont on a retiré ou non une cible préalablement identifiée (partie 3 : 72 animaux). Tout au long de l’injection intracardiaque, les souris seront maintenues sous anesthésie à l’aide d’un masque et l’injection se fera sans chirurgie. Une fois les injections réalisées, l’état des souris sera contrôlé et les animaux seront pesés tous les 2 jours (2 min par animal). Une lecture de bioluminescence sera réalisée après injection intracardiaque puis une fois par semaine afin de suivre le développement des cellules tumorales. Pour cela les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse et recevront une injection de luciférine afin de permettre la lecture (durée totale de l’intervention : 10 min par animal). Pour les parties 1 et 2 : des cohortes de 44 animaux seront mises à mort à 1, 3, 5, 10, 15 et 30 jours après l’injection des cellules. Le foie, les poumons et le cerveau seront récupérés afin d’analyser le développement métastatique par imagerie et par analyse des gènes. Pour la partie 3 : les 72 animaux seront mis à mort 30 jours après l’injection des cellules. Le foie, les poumons et le cerveau seront récupérés afin d’analyser le développement métastatique et d’évaluer le potentiel d’inhibition du développement métastatique de la cible choisie.

Impact sur les animaux

Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation, de plus, le développement métastatique cérébral pourrait être à l’origine d’une réduction de la mobilité ou encore une perte de poids. Le suivi régulier des animaux permettra de pallier rapidement ces conséquences. L’étape initiale d’injection des cellules et les étapes ultérieures d’imagerie nécessitant l’injection d’une molécule pour visualiser la bioluminescence pourraient entraîner un stress ou une douleur chez les animaux. Par prévention, les souris subiront donc une anesthésie gazeuse pour ces différentes étapes. Les cellules injectées conduisant à la dissémination de métastases au niveau du parenchyme cérébral, un soin tout particulier sera apporté à la surveillance du comportement des animaux et à l’apparition d’un changement dans ce dernier ou d’éventuels signes de souffrance au moyen d’une grille de score.

Devenir

La récupération des différents organes pour analyse étant essentielle dans ce projet, les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Nous avons réalisé une série d’expérience in vitro afin de définir au mieux les modèles à utiliser, ainsi que les conditions expérimentales à conduire in vivo. En parallèle, nous avons développé des dispositifs micro-fluidiques "métastase-sur-puce" pour réaliser une pré-validation des cibles identifiées. Le dispositif comprend une microvascularisation perfusée intégrée dans une matrice de collagène obtenue avec des canaux latéraux de collecte. Cette plateforme permet le suivi par imagerie confocale de cellules cancéreuses métastatiques traversant une structure de type endothélial vers un environnement modulable. Ce dispositif servira à sélectionner les cibles les plus pertinentes à valider in vivo.

Réduction

Pour ce projet, nous focalisons notre recherche sur le développement métastatique au niveau du cerveau, mais nous allons également récupérer de manière complémentaire les poumons, le foie et la moelle osseuse afin d’éviter une répétition de l’approche expérimentale pour chaque lieu métastatique. La veille de la littérature scientifique ainsi que des analyses statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux strictement nécessaires pour l’obtention de résultats scientifiques valides.

Raffinement

Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement par l’expérimentateur tous les deux jours pendant 3 semaines avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant chaque geste pouvant induire un stress ou une angoisse chez l’animal : tontes, injections intracardiaques et mise à mort. Une fois l’injection intracardiaque de cellules tumorales réalisée, les animaux seront suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids...) un traitement analgésique sera envisagé. Les points limites à ne pas dépasser ont été définis. Dans le cas où un seuil limite serait atteint et que le traitement mis en place n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable).

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix dans les modèles d’études en cancérologie de par, notamment, la disponibilité des outils moléculaires et sa proximité génétique avec l’homme. Dans le cadre de notre étude, nous devons injecter des cellules cancéreuses humaines à notre modèle pré-clinique qui de ce fait doit être immunodéficient. Les animaux utilisés seront des souris femelles adultes âgées de 6 à 8 semaines (ayant atteint la maturité sexuelle) afin de bénéficier d’un environnement propice au développement de métastases de cellules de cancer du sein.

205 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif, des traitements quotidiens sur cinq jours et l'injection d'un radiotraceur pour imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant atteindre 2000 mm³ avant mise à mort. Le porteur évalue un radiotraceur pour détecter ces tumeurs et suivre l'effet de traitements, en présentant l'imagerie longitudinale comme un moyen de réduire le nombre d'animaux. Il retient la souris comme le modèle majoritaire de la communauté pour tester les molécules anticancéreuses.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est le cancer féminin le plus important en France et dans le monde en termes d'incidence et de décès. Le CS dit triple-négatif (CS TN) est très agressif et de mauvais pronostic. Il est important de trouver de nouveaux moyens de le soigner. Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules de CS TN. Nous avons identifié des traitements qui bloquent la production de cet oncométabolite et le développement des CS TN. Nous avons développé un nouveau radio traceur qui est capté par les cellules de CS TN en culture qui produisent cet onco-métabolite. Les objectifs de ce projet sont d'étudier, par imagerie médicale, la capacité de ce radio traceur à détecter les CS TN chez l'animal et à suivre l'inhibition du développement des tumeurs suite aux traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont de valider, in vivo, le radio-traceur pour la détection non-invasive, par imagerie médicale, des tumeurs qui produisent cet onco-métabolite. De plus, les bénéfices seront de démontrer l'intérêt de ce radio-traceur pour le suivi de l’efficacité de deux traitements que nous avons identifiés pour inhiber les effets de l’onco-métabolite sur le développement des cancers mammaires triple-négatifs (CS TN). Les retombées seront de déposer de publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer un radio-traceur pour la détection non-invasive des CS TN et le suivi des nouveaux traitements pour traiter les cancers du sein TN, qui sont de très mauvais pronostic et pour lesquels peu de thérapies efficaces sont disponibles.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection/expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/souris ; Traitement avec une molécule : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules 1 fois par jour, 5 jours, avec une durée de 3 min/souris.

Impact sur les animaux

Les études in vitro et in vivo avec le traceur n’a pas montré d’effets indésirables. Le radio-traceur n’a jamais été étudié et injecté chez la souris. L’onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires TN (dont celui étudié dans ce projet) et aucun effet indésirable n'a été observé. Les deux thérapies qui seront testés, ont déjà été utilisés in vivo (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées mais jamais en combinaison. Les différents traitements qui seront administrés aux souris causeront une douleur modérée due à la piqure de l’aiguille lors de l’injection. Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux car la piqure d’une aiguille pour injection du radio-traceur par voie intraveineuse dans la veine caudale est réalisée sous anesthésie des animaux. L’induction des tumeurs dans les animaux peut affecter la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que l’animal ne souffre pas de douleur, de la faim ou de la soif, d'inconfort, de blessures ou d’immobilité. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que les animaux ne souffrent pas de ces différents maux. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement mis à mort sous anesthésie.

Devenir

Pour les procédures 1 et 2 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J30-J45, car les organes et la tumeur seront prélevés à la fin des acquissions d'imagerie pour analyser la biodistribution du radio-traceur. Pour la procédure 3 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J80-100, car nous ferons un suivi dans le temps de l'efficacité des traitements d'intérêts par imagerie médicale non invasive et les souris seront mises à mort sous anesthésie au temps J80-J100 qui permettra d'analyser la croissance tumorale et la survie des animaux.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie médicale est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale. Ainsi, il sera possible d’étudier la distribution du radio-traceur et sa captation dans la tumeur dans les mêmes cohortes de souris, dans le temps, au cours du développement tumoral. De même, cette méthode permettra de détecter les tumeurs et de suivre l’efficacité des thérapies. Cette procédure permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en jeu par comparaison aux procédures classiques de biodistribution nécessitant le sacrifice d’un groupe d’animaux par condition et par temps d’observation.

Réduction

Le choix du nombre de souris par groupe selon les expériences et la répétition des expériences se base sur des travaux réalisés précédemment avec l'onco-métabolite sur les mêmes modèles de lignées cellulaires implantés chez la souris et sur l'analyse statistique des données. De plus, le suivi longitudinal des animaux par imagerie permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en œuvre par comparaison avec la procédure de biodistribution ex-vivo nécessitant le sacrifice d’un groupe de souris par temps d’observation et par condition expérimentale. La fiabilité des résultats obtenus est par ailleurs renforcée du fait que le suivi d’un même animal au cours du temps permet de réduire le biais statistique induit par la variabilité interindividuelle.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales (Hébergement en surpression, 5 animaux par cage IVC ventilée, sous un éclairage et une température (19-21°C) contrôlés) avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Ils seront manipulés dans des enceintes protégées. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général) et pesés 2 fois par semaine afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur (selon une grille de scoring). Une attention particulière sera apportée au maintien de la température corporelle des animaux anesthésiés qui seront mis sur un tapis chauffant. Si une souffrance est observée (selon une grille de scoring), un traitement pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire désigné. Si des symptômes correspondant à des critères d’arrêt de l’expérience sont observés, voir ci dessous, l’animal sera mis à mort sous anesthésie. De même, les animaux seront mis à mort sous anesthésie si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3, si elle est nécrosée ou présente une inflammation ou si des signes de souffrance apparaissent, voir ci-dessous. Les critères d’arrêt de l’expérimentation afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids rapide > 20 % du poids initial ou longue période de perte de poids, ulcération des tumeurs, comportement moribond, automutilation, diarrhée prolongée, paralysie, râle, écoulement nasaux, signes d'atteinte du système nerveux central, anorexie, saignement abondant par un orifice ou lésions interférant avec la prise de nourriture et d'eau.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et pour l’imagerie médicale et permet de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce. Les souris sont achetées à l’âge de 6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu'elles sont traitées car le cancer du sein se développe chez l'adulte.

1584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau, puis des injections de traitement trois fois par semaine sur animal vigile, la tumeur étant laissée croître jusqu'à un volume défini, avec perte de poids, altérations cutanées et nécroses possibles. Le porteur cherche à re-sensibiliser des mélanomes résistants au moyen d'une molécule ciblant le cuivre, ces validations étant présentées comme "indispensables" à un développement clinique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des interactions aussi complexes.

Objectifs

Le mélanome est un cancer très agressif qui risque fortement de développer des métastases, au niveau du foie ou des poumons par exemple. Si il est découvert assez tôt, le mélanome peut se soigner en retirant la partie cancéreuse par chirurgie. En revanche, si des métastases sont déjà présentes lors du diagnostic, le pronostic est souvent mauvais et il est alors nécessaire de traiter de manière systémique, c’est-à-dire sur tout le corps, afin de tuer les cellules de la tumeur d’origine ainsi que les métastases. En termes de traitements, il existe deux familles de médicaments qui sont utilisés aujourd’hui pour traiter le mélanome métastatique, les thérapies ciblées et les immunothérapies. Les thérapies ciblées, dont fait partie le PLX4032, (aussi appelé le Vemurafenib), sont utilisées en première intention et sont efficaces mais seulement chez les 50% de patients qui présentent une mutation spécifique (B-Raf). Cependant, après une période de traitement, le mélanome va se modifier pour devenir résistant au traitement, ce qui va entrainer une rechute. L'autre famille de traitements utilisés est l'immunothérapie, dont font partie les inhibiteurs de point de contrôle ou anti-PD1. Ils sont également utilisés pour traiter les patients atteints de mélanomes métastatiques et fonctionnent en interférant avec le système immunitaire pour induire la mort des cellules cancéreuses mais entrainent cependant une réponse positive dans seulement 10 à 30% des cas. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes cellulaires qui entrainent l’apparition de résistance aux traitements actuellement sur le marché. Pour cela nous étudierons une nouvelle molécule qui interfère avec les changements cellulaires induits par la résistance aux traitements dans le but que le traitement redevienne efficace afin d’éviter les rechutes. L’idée de ces expériences est de traiter la combinaison de cette nouvelle molécule avec les traitements utilisés aujourd’hui afin d’observer une resensibilisation des cellules de mélanome envers ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une validation in vivo, chez la souris, des observations faites in vitro, sur la capacité d'une molécule ciblant le cuivre ainsi que d’autres inhibiteurs du métabolisme du cuivre, à re-sensibiliser les cellules de mélanomes résistantes aux thérapies ciblées. Il permettra également de vérifier les effets de ces drogues dans le contexte du système immunitaire et d’évaluer leurs rôles dans la résistance aux immunothérapies. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos approches thérapeutiques (inhibiteurs en association avec les thérapies ciblées ou les immunothérapies) et permettre d’ajouter une nouvelle ligne de traitement aux patients atteints de mélanomes résistants aux traitements déjà existants.

Procédures

Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome (humaines ou murines). Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini. Ces interventions ne nécessitent pas d’anesthésie et seront effectuées sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Au niveau des expérimentations spécifiquement, les nuisances que subiront les animaux seront des contentions pour injecter les cellules tumorales ou les traitements, ainsi que des injections sous cutanées pour les cellules ou des injections intra-péritonéales (dans l'abdomen) pour les traitements. En ce qui concerne la croissance tumorale, la présence de la tumeur grossissante sur le flanc de la souris pourra être une nuisance. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de procéder à l’analyse des tissus et cellules récupérés de la tumeur formée ou des éventuelles métastases.

Remplacement

Pour ces expériences, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Les études in vitro que nous avons réalisées dans un premier temps ont montré l’efficacité de la molécule ciblant le cuivre dans la resensibilisation de cellules de mélanome résistantes aux traitements utilisés aujourd'hui chez des patients.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique indiquant la quantité minimale d’animaux qui permet d’observer une différence significative. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 1584 souris. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs, les métastases et les organes (comme le foie, la rate ou les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi (igloo) au sein de l’animalerie et surveillées quotidiennement. L'expérience ne commence qu'après une semaine d'acclimatation à l'animalerie et d'habituation aux expérimentateurs. Les souris seront observées trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est régulier et s'effectue par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure ainsi que la démarche à effectuer en fonction du point limite observé tels que la désinfection d'une plaie ou le changement des points d'injection en cas de gêne ou signes d'infections par exemple.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.

756 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pancréatiques humaines, puis on injecte des molécules par la veine de la queue avant de les mettre à mort pour prélever tumeurs et organes, afin de tester un traitement à base d'ARN transporté par un dendrimère. Le porteur suit la taille des tumeurs et prévoit une mise à mort dès qu'un point limite est atteint. Il affirme avoir essayé des approches cellulaires en deux et trois dimensions sans pouvoir se passer de l'animal, invoquant l'étude au sein d'un "organisme entier", les retombées contre ce cancer restant conditionnées à l'efficacité du modèle.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer de très mauvais pronostique. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement efficace, et l’espérance de vie du patient excède rarement 6 mois. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer le traitement personnalisé à base de l’ARN, car l'utilisation de petits ARN interférents (siARN) et de petits ARN d'activation (saARN) pour réguler l’expression des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur émerge comme un traitement précise, offrant une thérapie efficace et personnalisée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est l’évaluation et la validation d’un nouveau traitement pour le cancer du pancréas, une maladie de très mauvais pronostic sans traitement efficace à ce jour. Si notre stratégie thérapeutique se révèle efficace sur ce modèle tumoral, nous pourrions envisager de tester cette approche sur d’autres cancers résistants à la chimiothérapie classique ou à la radiothérapie, ou sur d’autres maladies pour lesquelles il n'existe pas de traitement efficace.

Procédures

Pour atteindre les objectifs de ce projet, les souris seront étudiées pour la biodistribution et l’efficacité anti tumorale après injection intraveineuse, dans la veine de la queue, de molécules fluorescentes sous anesthésie générale. À terme, les souris seront mises à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes.

Impact sur les animaux

Les souris seront sous anesthésie générale par gaz lors de l'implantation des tumeurs afin de faciliter la manipulation tout en réduisant le stress et la douleur des animaux. Les animaux recevront, si nécessaire, un antidouleur. L’efficacité et la toxicité de des combinaisons seront étudiées en mesurant les tailles des tumeurs, les poids et les comportements des souris. À terme, les souris seront mise à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes pour l’analyse biochimique et histologique

Devenir

Les animaux seront mise à mort sous anesthésie générale à la fin de cette étude ou lorsqu’un des points limites suscités sera atteint (voir annexe I). Le sang et les tumeurs seront prélevées, tout comme le cœur, le foie, la rate, les poumons, les reins, le pancréas et le cerveau afin de chercher des lésions éventuelles sur ces organes.

Remplacement

Dans le respect de la règle des 3R et concernant le remplacement, nous avons tenté d'utiliser toutes les méthodes substitutives possibles notamment les approches cellulaires 2D et 3D, mais nous ne pouvons pas nous passer du recours à l’animal pour l’étude de l’efficacité et la bio-distribution de nos traitements. Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation de souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale et ont fait l’objet de plusieurs milliers de publications, est justifiée et ne peut être remplacée pour plusieurs raisons. Le fait que ces souris ai un système immunitaire diminué facilite la prise de la greffe de cellules tumorales pancréatique humaine, et limite le phénomène de rejet. De plus, l’utilisation de ces modèles de souris immunodéficientes permettent le maintien des caractéristiques moléculaires, histologiques, phénotypiques et génotypiques des tumeurs pancréatiques d’origine, ce qui ne peut pas être obtenu in vitro. Ces souris nous permettront d’étudier au sein d’un organisme entier l’efficacité et la bio-distribution de nos nanomédicine, et obtenir des résultats fiables représentatifs de la tumeur d’origine.

Réduction

Concernant la réduction dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d’animaux grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant d’optimiser la taille des effectifs. Nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de t de Student. En conséquence, des effectifs de 8 individus par groupe devraient permettre d’obtenir des résultats statistiques fiables pour l’évaluer l’efficacité, et des effectifs de 5 individus par groupe pour étudier la bio-distribution de chaque, soit sur chaque modèle de tumeur, il faut 12 groupes de 8 souris (en total 96 souris) pour l’évaluer l’efficacité de chaque nano-médicine, et 6 groupes de 5 souris (en total 30 souris) pour étudier la bio-distribution de chaque combination. Le nombre total d’animaux pour ce projet est estimé à 756 souris : 576 souris pour évaluer l’efficacité (procédure 1) et 180 souris pour la bio-distribution (procédure 2) sur les ensembles de 6 modèles de cancer pancréas primaire.

Raffinement

Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement (rouleaux de papier, dôme de cellulose, carrés de coton, etc.) ; les litières sont changés toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement (groupe de 5 souris pour une cage de 530cm²) ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum Les souris sont endormies sous anesthésie gazeuse Vetflurane pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs états le nécessitent, Une grille de score a été mise en place pour évaluer les signes de souffrance, identifier les points limites et indiquer la conduite à tenir en fonction de l’état de santé de l’animal.

Choix des espèces

Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d’une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des greffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien étbalies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et, d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité des agents thérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu couteuse, ce qui fait un modèle expérimental de choix pour notre projet.