Oncologie

484 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur implante des fibres optiques ou des électrodes dans leur cerveau lors d'une chirurgie d'une heure et demie, puis les soumet à une restriction alimentaire les maintenant à 90-95 % de leur poids pendant jusqu'à quatre mois pour les motiver à une tâche comportementale. Il présente cette faim imposée comme n'affectant que "très peu" le bien-être des animaux non-humains, tout en la décrivant comme le ressort de leur motivation. Ce projet fondamental cartographie des circuits de la prise de décision, avec une "perspective translationnelle" vers les pathologies mentales, et le porteur affirme que seuls des "organismes entiers" permettent d'en étudier les bases neuronales.

Objectifs

La prise de décision est un processus essentiel du comportement humain. Ce processus complexe nécessite d’apprendre de son environnement afin d’emmagasiner des connaissances mais également de s’adapter aux changements. Une prise de décision adaptée nécessite ainsi un équilibre entre les comportements d’exploitation (utilisation des connaissances acquises) et d’exploration (recherche d’options plus favorables) qui peuvent être fidèlement modélisés chez le rat afin d’en établir les bases neurales. Le projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée dans un environnement changeant chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre ces différentes régions, puis nous testerons leur implication fonctionnelle en procédant à une déconnexion ou une activation réversible, afin de déterminer leur rôle précis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de préciser la connectivité des différentes régions impliquées dans la prise de décision ainsi que de préciser leur rôle . Une hypothèse majeure actuelle est que la prise de décision maladaptive qui caractérise un grand nombre de pathologies mentales est associée à un syndrôme de dysconnectivité de ces régions, ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure de fibre optique ou d’électrode d’enregistrement d’une durée maximale d’une heure et demie. Ils seront soumis également à une restriction légère d’accès à la nourriture (rationnement afin de conserver 90-95% de leur poids initial) qui durera maximum 4 mois ainsi qu'à une tâche comportementale dont les sessions durent entre 20mn et 1h15 par jour pour une durée maximale de 4 mois.

Impact sur les animaux

Les chirurgies d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation de fibres ou d’électrodes présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en restriction alimentaire légère (90-95% de poids corporel) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, l’approche neurocomputationnelle faisant appel à la modélisation est utile mais reste complémentaire des approches interventionnelles in vivo qui permettent de valider la véracité des modèles prédictifs.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques. Le recours à des méthodes réversibles permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. De plus, nous effectuerons les différentes procédures dans un ordre logique permettant de ne pas réaliser les expérimentations sur les voies n’ayant pas été validées par les procédures précédentes, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, tunnel et barre à ronger) et seront hébergés en cage collective, même après les chirurgies. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort.

Choix des espèces

D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille.

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur soumet une partie des souris à une irradiation du corps entier suivie d'une greffe de cellules, et l'ensemble à des injections intrapéritonéales répétées et à des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les quinze jours pendant trois mois, qu'il reconnaît pouvoir altérer leur vision. Ce travail vise à comprendre le rôle d'une molécule dans une forme agressive de mastocytose, un cancer du sang. Il cite un "dépôt de brevet" et des financements parmi les retombées attendues et affirme le modèle animal "indispensable", la complexité des interactions cellulaires n'étant selon lui pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les mastocytoses systémiques (MS) sont des formes incurables de maladies du sang particulièrement difficiles à traiter. Ces maladies très hétérogènes allant de formes indolentes à des leucémies fatales, sont caractérisées par l’accumulation et l’activation incontrôlée des cellules immunitaires appelées mastocytes dans la moelle osseuse. Plus de 30% des patients atteints de MS agressives ne répondent pas aux traitements administrés en clinique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le métabolisme des cellules est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses afin de répondre à leur besoin en énergie pour proliférer de façon aberrante. Nous avons donc identifié les altérations métaboliques dans les mastocytes de patients afin de tester le potentiel clinique de leur inhibition. Nous avons mesuré une forte concentration de kynurénine (L-Kyn), une petite molécule chimique, dans le plasma des patients atteints de formes agressives comparé aux indolentes et confirmé l’activité de la voie dont elle fait partie dans des mastocytes issus de la moelle osseuse de patients.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment la L-Kyn dont la concentration est élevée de façon physiologique dans le plasma des patients atteints de MS agressive, exacerbe les fonctions mastocytaires en régulant directement les fonctions des mastocytes ou leur microenvironnement (adipocytes médullaires). Ces analyses nous permettront d'une part de tester le potentiel de la voie de la kynurénine comme cible thérapeutique dans les MS agressives dans un contexte physiologique mais également d'identifier de nouvelles cibles en aval de la L-Kyn qui pourraient également être pertinentes. Cette étude est la première étape vers le développement de nouveaux médicaments ciblant ces régulations en combinaison ou non avec les traitements utilisés pour cette pathologie en routine clinique. Elle permettra également le dépôt de brevet et de financements indispensables pour la poursuite de ce projet. Ces pathologies agressives sont particulièrement invalidantes ; la médiane de survie des patients au diagnostic est de moins de 3 ans et de moins de 6 mois pour les formes les plus agressives. Cette étude est donc indispensable pour améliorer le devenir des patients et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de prévenir ou freiner le développement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux (procédures 1-2) recevront une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 3 fois par semaine pendant une semaine puis 5 fois par semaine pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins seront réalisés en rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à l’atteinte des points limites. Les animaux (procédures 3-5) recevront une irradiation sous-létale sur corps entier sur animaux vigiles. Une greffe intraveineuse en rétro-orbital unique sera réalisée. Une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 5 fois par semaine sera réalisée pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à atteinte des points limites.

Impact sur les animaux

La manipulation et la pesée pourraient entraîner du stress chez les animaux. Une mauvaise tolérance à l’irradiation sous-létale pourrait entraîner une inactivité et une mobilité réduite pendant quelques heures après l’irradiation (rare). Le même phénotype pourrait être observé après une greffe partielle des cellules injectées quelques jours après la transplantation. Une perte de poids pourra être observée et sera monitorée. Les prises de sang répétées dans le sinus rétro-orbital pourraient causer des problèmes de vision aux souris.

Devenir

La totalité des individus impliqués seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation de plusieurs modèles cellulaires in vitro seuls ne permet pas de rendre compte de la complexité des interactions cellulaires impliquées dans la maladie. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal afin de valider notre hypothèse. A cette étape du projet, il n’existe aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Le calcul d’effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul d'effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul statistique approprié. Cette approche nous permet de conserver une méthode scientifique rigoureuse tout en réduisant au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes contrôles. Afin de réduire à son minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes contrôles seront commun à plusieurs tests d'efficacité. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos expériences.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les expérimentateurs et le personnel qualifié de l'animalerie sont formés pour limiter au maximum le stress des animaux lors de leur manipulation. Les animaux utilisés dans ces expériences seront soumis à une surveillance quotidienne. Les objectifs de toute procédure étant de donner à l’animal la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute souffrance due aux procédures soit détectée et réduite. Pour ce faire, le suivi de la maladie se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs. Dès l’apparition des points limites, que nous avons choisis le plus précoce possible pour que l’animal reste asymptomatique, l’animal sera mis à mort. Par conséquent, cette mise à mort intervient avant l’apparition de symptômes et de nuisances dues à la pathologie. Nous optimiserons les conditions d'hébergement des animaux par la présence d'enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactes et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 4 ou 5 afin d'éviter le stress de l'isolement. Pour limiter au maximum la souffrance des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie, et une analgésie sera mise en place si nécessaire (voir points limites).

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici l'hématopoïèse). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. En effet, bien que des formes ancestrales de systèmes hématopoïétiques aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers parmi lesquels, le poisson zèbre et la souris, sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, les outils développés chez cette espèce et l’absence d’expertise sur le poisson zèbre au sein de l’institut satisfait aux exigences d’utilisation de la souris comme espèce la moins susceptible de ressentir de la souffrance ou de la douleur pour les expérimentations proposées. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ces types de modèle de MS et ce type d'injection de cellules néoplasiques mastocytaires en intraveineux, c'est à dire des souris "jeunes adultes" âgées de 6 à 10 semaines au moment de la transplantation et/ou des injections intra-péritonéale prévues.

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, porteuses d'une insuffisance rénale chronique d'apparition spontanée, reçoivent des traitements pharmacologiques quotidiens et subissent des passages en cage métabolique jusqu'à quatorze heures et une injection rétro-orbitaire pour mesurer la filtration rénale. Le porteur prévoit de tuer les animaux perdant plus de 20 % de leur poids ou présentant des signes de souffrance, seuils qu'il présente comme des points limites. Il affirme le recours à l'animal "indispensable", les mécanismes de la maladie étant selon lui impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si l’IRC n’est pas correctement traitée, elle peut conduire à la dialyse. L’IRC mettant en jeux plusieurs organes, la découverte de nouveaux traitements de cette maladie nécessite des études précliniques chez l'animal. Nos travaux antérieurs ont montré l’efficacité de certains traitements chez la souris diabétiques Notre objectif est de tester l’efficacité de ces traitements dans un autre modèle non-diabétique présentant un développement spontané et rapide de l’IRC .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre les mécanismes de mise en place de l'insuffisance rénale, et de proposer de nouvelles pistes de traitement.

Procédures

Les souris de 4 semaines seront soumis à des 3 séries de traitements pharmacologiques quotidiens jusqu'à 8 /10 semaines d'âge. Au cours du traitement, les souris seront soumises (1) à un suivi régulier de leur poids (1 fois par semaine), (2) à une mesure de leur composition corporelle (2 à 3 fois), (3) à la mesure de leur diurèse (1 à 2 fois), (4) à une évaluation du débit de filtration glomérulaire (DFG) (1 fois, 1 semaine avant la fin du traitement. A l’issue des traitements, les souris seront euthanasiées et analysées.

Impact sur les animaux

(1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vis versa (2) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) dans ll’EchoMRI (3) à la mesure de leur diurèse (1 à 2 fois): léger stress lié au passage (14h max) dans la cage métabolique (4) évaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine, et leurs organes.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans le développement de l’IRC et qui sont impossibles à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal. Il est prévu d’utiliser 410 souris. Le nombre de souris par groupe (n=10) est calculé au plus juste pour espérer observer une différence significative.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère : 4 souris par cage équipée d’éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), et alimentée en eau et en aliment ad libitum. Les animaux sont observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale, et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 2) Signes de souffrances (posture de prostration ou léthargie, comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Les traitements pharmacologiques débuteront sur des souris âgées de 4 à 6 semaines quel que soit le génotype. A ces âges, les reins sont pleinement développés et les souris ne présentent aucune altération détectable de protéinurie ou d’urémie (critères de détérioration de la fonction rénale). Les traitements seront poursuivis durant 8 à 10 semaines avant euthanasie.

1 926 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections de lymphocytes et d'anticorps, des gavages et des prélèvements de sang, pour étudier l'épuisement des lymphocytes T anti-tumoraux. Le porteur indique ne prévoir aucun analgésique ni anti-inflammatoire, y compris morphinique, au motif qu'ils interféreraient avec l'inflammation étudiée. Il affirme que la complexité de l'environnement tumoral ne peut être reproduite in vitro et impose un organisme intégré.

Objectifs

En France le cancer représente la première cause de mortalité, c’est pourquoi de nombreuses stratégies thérapeutiques ont été mises en place pour un meilleur traitement des cancers parmi lesquelles se trouve l’immunothérapie. L’immunothérapie repose notamment sur l’utilisation de lymphocyte T (LT) modifiés génétiquement (Cellules chimeric-antigen-receptor T ou CAR-T) et sur l’utilisation d’anticorps dans le but de redynamiser les LT anti-tumoraux fonctionnellement “épuisés” qui ont perdu leur capacité à tuer les cellules tumorales. Le phénomène d’épuisement lymphocytaire est un obstacle majeur pour l’efficacité des réponses immunitaires contre le cancer et constitue la cible principale des nouvelles immunothérapies du cancer. Ce projet vise à une meilleure compréhension des mécanismes qui régissent le phénomène d’épuisement des LT dans des modèles de tumeurs implantées et en particulier du rôle joué par deux régulateurs de l’expression des gènes appelés Id2 et Msc. En effet nos résultats préliminaires suggèrent que ces deux molécules pourraient réguler l’épuisement des LT anti-tumoraux. Les objectifs de ce projet de recherche consistent à : 1.) Évaluer le potentiel thérapeutique sur la croissance tumorale de la manipulation de l'expression de Id2 et Msc dans les LT anti-tumoraux. 2.) Déterminer si et comment Id2 et Msc contrôlent le programme génétique d’épuisement des LT.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet contribueront à l’optimisation de nouvelles approches thérapeutiques visant à améliorer l’efficacité des immunothérapies contre le cancer et aussi potentiellement pourraient permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris subiront 1 injection sous-cutanée sur le flanc d’une lignée tumorale (mélanome, Lymphome, adenocarcinome) ou dans le coussinet graisseux mammaire (lignée tumorale mammaire), une injection intraveineuse de lymphocytes T, des injections intrapéritonéales d'anticorps (1 injection tous les 3-4 jours pour un maximum de 4 semaines), des gavages (1 par jour pour un maximum de 4 semaines) et des prélèvements de sang mandibulaire (1 par semaine-maximum de 3 semaines). Toutes les injections ne durent que quelques secondes et s'effectuent sur animaux anesthesiés à l'exception des injections intrapéritonéales et des gavages qui s’effectuent sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et des gavages ainsi que des prélèvements de sang. Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et de manière très transitoire (secondes) . Certaines tumeurs sous-cutanées peuvent se nécroser dans ce cas les animaux sont euthanasiés, occasionnellement les animaux peuvent subir une perte de poids. La thérapie ICB peut induire un peu de diahrée et une perte de poids transitoire. Dans le cas des tumeurs mammaires des métastases pulmonaires peuvent être observées à un temps tardif pouvant engendrer un deficit d'oxygénation.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de cette pathologie humaine. L’utilisation de modèles expérimentaux intégrés est essentielle à ce projet. En effet, l’environnement tumoral et l’organisation tri-dimensionnel de la tumeur sont des paramètres clés qui régulent le recrutement, l'activation et les fonctions des LTs anti-tumoraux. A ce jour, cette complexité ne peut être entièrement reproduite in vitro. De même les différents acteurs du système immunitaire, cellules dendritiques et cellules T patrouillent par voie sanguine dans l’ensemble de l’organisme et leur recrutement dans la tumeur est défini par l’anatomie de la tumeur. Cette régulation de l'adressage tissulaire des cellules immunitaires, n'est à ce jour pas reproduit fidèlement par les systèmes de microfluidique.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux nous utilisons des modèles de tumeurs transplantées robustes dans des conditions expérimentales optimisées pour une prise de tumeur chez plus de 90% des animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos experiences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations expérimentales et les variations inter-individus. Les tests statistiques varient suivant les expériences et sont réalisés avec le module statistique de Prism.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage); et tous les deux jours-trois jours par l'expérimentateur qui vérifiera leur poids et apportera une aide à l’alimentation en cas de besoin (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)), et qui évaluera le développement de la tumeur, et l'état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies) . L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Si immédiatement après ou le lendemain d’un gavage ou d’une injection s.c., i.p. ou i.v., un animal cesse de s’alimenter et devient prostré, il sera euthanasié. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices.

Choix des espèces

La possibilité de générer des modèles soit sur-exprimant (transgénèse) soit déficient (KO) pour une molécule d’intérêt font des souris un modèle de choix pour mieux comprendre les interactions entre le système immunitaire et les tumeurs naissantes. Par ailleurs, les modèles murins pré-cliniques ont montré leur pertinence dans la découverte et le développement de nouvelles immunothérapies. La disponibilité d'anticorps spécifiques d'un nombre conséquent de molécules permet d'analyser finement les différentes composantes du sytème immunitaire et de leur environnement par cytométrie en flux ou par imagerie. De plus, nombre de ces anticorps sont des agonistes ou antagonistes des voies de signalisations induites par ces récepteurs, ils peuvent donc être utilisés afin de moduler le système immunitaire ou de préciser les mécanimes impliqués dans le processus biologique étudié. Des souris adultes, agées de 2 mois seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système immunitaire mature. Les souris sont considérées comme adultes entre 6-8 semaines d’âge. Avant toute procédure elles auront une semaine d’acclimatation.

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue puis une série de prélèvements de sang répétés sur animal vigile, échelonnés sur vingt-huit jours, pour suivre le devenir sanguin de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur indique que le micro-échantillonnage réduit le volume de sang prélevé et le nombre de souris. Il affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'aucune alternative ne peut remplacer la souris.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire. 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire (10min, 1h, 6h, 24h, 72h, 3 jours, 7 jours, 14 jours, 21 jours et 28 jours).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, ainsi que l’ensemble des animaux à l’issue de la procédure, seront euthanasiés.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 10% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes non anticipables afin de ne pas mettre en péril les résultats de cette expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.