Oncologie

312 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Seuls des mâles sont retenus, recevant chaque jour pendant six semaines un antidépresseur ou du tramadol par micropipette, puis passant des tests comportementaux nommés, piscine de Morris, actimétrie et reconnaissance d'objet, avant une mise à mort par overdose d'anesthésique et décapitation pour prélever le cerveau. Le porteur décrit les troubles cognitifs recherchés, sédation, confusion et pertes de mémoire, comme l'objet même de l'étude. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne reproduit la "complexité de notre organisme" et justifie le rat par son "large répertoire comportemental" et son volume sanguin.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de l’administration chronique de médicaments psychoactifs sur la cognition et l’équilibre chez le rat. Nous souhaitons évaluer en particulier l’impact de l’administration chronique des antidépresseurs, largement prescrits chez la personne âgée du fait de la présence de troubles anxiodépressifs dans cette population. Les médicaments ayant une activité anticholinergique, comme certains antidépresseurs, sont un facteur de risque de troubles confusionnels, c’est-à-dire une altération de la vigilance ou des capacités attentionnelles. Cela peut toucher l’ensemble des fonctions cognitives : mémoire, orientation temporo-spatiale… Son incidence est élevée chez les personnes âgées et sa survenue associée à une augmentation de la morbi-mortalité. Cette étude permettra également d’évaluer le lien entre troubles cognitifs et potentiel anticholinergique des antidépresseurs testés. L’objectif de notre étude est donc d’évaluer les effets cognitifs à court et long terme de différents antidépresseurs, appartenant à des classes médicamenteuses différentes et ayant une affinité différente sur les récepteurs muscariniques, dans un modèle rongeur. Les différents effets observés seront comparés selon la population observée (animaux jeunes ou âgés). Dans le but de valider le protocole mis en place, et pour avoir une évaluation la plus sensible possible des troubles cognitifs, nous réaliserons ce même protocole une première fois avec le tramadol. En effet, le tramadol est une substance active connue pour ses effets indésirables négatifs sur la cognition et ses effets sont décrits dans la littérature. Il altère notamment les performances mnésiques. De plus, la méthode d’administration que nous souhaitons utiliser pour l’ensemble de cette étude n’a, à notre connaissance, jamais été utilisée pour le tramadol. Il s’agit de l’administration de substances actives par micropipette (méthode MDA pour Micropipette-guided Drug Administration) à l’aide de lait concentré sucré dilué au 3/10. Le tramadol sera donc utilisé pour valider le protocole mis en place et son utilisation. Ce protocole sera ensuite répété pour les antidépresseurs à tester : duloxétine, citalopram, paroxétine et imipramine. Les effets de ces différentes substances actives sur la cognition des animaux jeunes ou âgés seront évalués et pourront confirmer ou infirmer les effets observés chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’abord de développer un protocole complet d’étude des troubles cognitifs d’origine iatrogénique chez l’animal. Ce protocole sera ensuite utilisé pour l’identification des médicaments psychoactifs à risque d’entrainer des troubles cognitifs et potentiellement accroître le risque de chute, notamment chez la personne âgée. Ainsi, nous espérons prévenir l’apparition de ces troubles chez la personne âgée et ainsi avoir une action préventive en apportant un conseil quant aux posologies les plus adaptées chez la personne âgée ou des alternatives thérapeutiques lorsqu’il en est possible.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration quotidienne de substance active par micropipette pendant 6 semaines soit un total de 42 administrations. Lors de nos précédents travaux, nous avons mis en évidence que la durée de cette administration est d’une minute environ. Ces administrations seront précédées d’une pesée de chaque animal soit 42 pesées au total (1 minute par pesée).

Impact sur les animaux

Plusieurs tests comportementaux seront réalisés durant l’étude : piscine de Morris, actimétrie, reconnaissance d’objet. Ces tests peuvent entrainer un stress chez les animaux. Concernant les molécules administrées, elles peuvent entrainer des troubles cognitifs chez les animaux, c’est ce que nous cherchons à évaluer. Le tramadol est un antalgique de palier II, pouvant entraîner des troubles digestifs comme une constipation. La duloxétine est un IRSNa pouvant avoir un effet sédatif. La paroxétine et le citalopram sont des ISRS pouvant entrainer des troubles digestifs, une confusion par hyponatrémie, une somnolence. L’imipramine est un antidépresseur tricyclique pouvant entrainer une sédation, une confusion, une constipation.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure. En effet, la récupération de pièces cérébrales conditionne les études électrophysiologiques ex-vivo, sur tranches de cerveau. Par conséquent, ceux-ci seront mis à mort à l’issu du dernier test comportemental. Ces analyses nous permettent d’évaluer si l’administration chronique des différentes substance actives étudiées affecte la plasticité synaptique. Lors de la mise à mort, des prélèvements sanguins seront également réalisés pour un dosage sanguin en substances actives.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de la consommation chronique de substances actives dans l’apparition de troubles cognitifs et de l’équilibre. Il ne serait pas non plus possible de démontrer les mécanismes mis en jeu dans l’apparition de ces troubles. En effet, ce qui fait la complexité de la compréhension de l’installation des effets indésirables médicamenteux est justement la complexité de notre organisme (système sensoriel, système musculosquelettique, système nerveux etc.). Ce système complexe est modulé en fonction de nombreux facteurs, extrinsèques (liés à l’environnement, mode de vie) comme intrinsèques. Parmi les facteurs intrinsèques, on retrouve la prise de médicaments, qui peut entrainer des modifications physiopathologiques chez les patients. S’ajoute à cela un autre facteur intrinsèque, l’âge, qui va induire, là encore, une variabilité pharmacocinétique et pharmacodynamique. Il est donc nécessaire de réaliser ces tests comportementaux in vivo car il est impossible de prévoir la résultante cognitive à toutes ces contraintes. De plus, nos résultats seront comparés aux données obtenues chez l’Homme lors de nos précédents travaux, il est donc important de travailler chez l’animal pour avoir une meilleure comparabilité, le rongeur ayant un large répertoire comportemental, les résultats seront comparables à ce qui peut être observé chez l’Homme. Pour les enregistrements électrophysiologiques, nous avons besoin de tranches de cerveaux obtenues à partir d’organismes ayant été exposés de façon chronique aux substances actives d’intérêt dans notre projet. La technique utilisée dans notre étude est la MultiElectrode Array (MEA). Celle-ci permet de réaliser des enregistrements extracellulaires et fournit une vue globale du réseau neuronal. Les études électrophysiologiques consisteront en l’enregistrement de potentiels par l’évaluation de la transmission de base et de la potentialisation à long terme dans l’aire CA1 hippocampique (tranche d’hippocampe). Nous avons également besoin d’échantillons sanguins pour réaliser des dosages pharmacocinétiques, ce qui n’est pas possible in vitro ou in silico. Nous avons choisi le modèle rat afin d’avoir un répertoire comportemental plus large et un volume sanguin plus important pour nos prélèvements et ainsi réaliser les dosages nécessaires.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus dans les expérimentations a été réduit à son strict minimum. Seuls des mâles seront utilisés dans cette étude afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Dans la littérature, les mâles représentent la majorité des animaux utilisés dans la recherche sur les rongeurs. Notre méthode d’administration est par voie orale par micropipette en utilisant du lait concentré sucré dilué. Après la puberté, les femelles montrent une nette augmentation de la préférence pour la saccharine, qui est en partie sous contrôle hormonal. Après la maturation, les mâles préfèrent une solution de glucose, tandis que les femelles préfèrent une solution de saccharine. Les femelles préfèrent également des concentrations plus élevées de saccharine que les mâles. Le lait concentré sucré contient du sucre de betterave et du sucre de canne, qui sont tous deux des saccharoses. Si les rats mâles sont suffisamment motivés pour prendre la micropipette, les femelles le seront encore plus. Des groupes de 12 rats mâles seront formés afin d’avoir une puissance statistique suffisante. De plus, en utilisant des rats (et non des souris), nous pouvons réduire le nombre d’animaux utilisés car le rat possède un volume sanguin plus important que celui de la souris et nous permet donc de pouvoir effectuer tous les dosages sanguins en un seul prélèvement. Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront également utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Les animaux seront hébergés par deux tout au long de l’expérimentation dans des cages standards, répondant aux normes d’éthique. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Les animaux seront maintenus dans des conditions contrôlées d’hébergement, c’est-à-dire dans un environnement stabilisé en température, hygrométrie, luminosité et en cycle normal. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux ne seront pas manipulés (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) pendant 1 semaine afin de les laisser s’acclimater à leur nouvel environnement. La semaine suivante, les animaux seront habitués à leur expérimentateur, pendant 5 min par jour, afin de réduire le stress lié aux manipulations. Lors des tests comportementaux, les rats seront placés dans la pièce expérimentale 1h avant le début des tests pour s’acclimater à la pièce. Leur environnement est enrichi avec des lamelles de papier kraft et un rouleau de carton afin d’assurer un enrichissement minimum, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). L’eau sera fournie ad libitum et l’apport en nourriture sera contrôlé. Leur poids sera mesuré tous les jours et un responsable des animaux vérifiera leur apparence physique externe (poils hérissé, chromodacryorrhée…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA concernant son éventuelle mise à mort sous anesthésie et analgésie si jugé nécessaire (cf grille de points limites). Lors de la mise à mort des animaux, une overdose d’anesthésique sera réalisée sous isoflurane suivie d’une décapitation pour récupération des cerveaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la rat (Rattus norvegicus), il s’agit avec la souris, d’espèces très utilisées en recherche pré-clinique. Le rat est une espèce facile à maintenir, en termes de coût et de place, son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (anxiété, mémoire, locomotion). Du fait de sa taille supérieure, le rat possède un plus grand volume sanguin que la souris et permet donc d’augmenter le nombre d’analyses sanguines réalisées tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés Pour les expérimentations sur rats jeunes, des rats âgés de 6 semaines seront utilisés. Ils auront plus de 4 mois pour l’étude de la plasticité synaptique hippocampique par électrophysiologie, leur croissance et développement cérébral seront atteints. Pour les expérimentations sur rats âgés, des rats âgés de 22 semaines seront utilisés. Ce groupe permettra de réaliser une comparaison avec le groupe de rats jeunes.

375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections de candidats-médicaments ou de sondes, subit jusqu'à huit anesthésies gazeuses sur une semaine pour l'imagerie et jusqu'à dix micro-prélèvements de sang. Le porteur teste la biodistribution de molécules aux applications variées, du traitement anticancéreux à l'antidépresseur, et affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit l'absorption et l'élimination d'un médicament dans l'organisme. Il indique renoncer à toute grille de score, celle-ci supposant de "maintenir la souffrance de l'animal pour en évaluer l'évolution".

Objectifs

Pour le développement de nouveaux médicaments ou de cibles thérapeutiques, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active ou de la sonde dans l'organisme, dans le but de déterminer l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du médicament (dose administrée et fréquence d'administration) ou permettre la mise en évidence du devenir de la sonde et in fine la localisation in situ de cible. L’objectif scientifique est de suivre la biodistribution de produits pharmacologiques ou de sondes en cours de développement chez la souris, visualisée par fluorescence ou par bioluminescence à l’aide d’un imageur. Les produits pourront être de différentes natures: chimique, peptidique, oligonucléotidique et pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…

Bénéfices attendus

La mesure de la bio-distribution des candidats-médicaments permettra de sélectionner les candidats-médicaments ou les sondes les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les critères tels que l’ADME, l'affinité et la spécificité de la sonde pour sa cible et sa capacité à atteinte la cible. Ces caractéristiques sont indispensables pour les futures études pharmacologiques. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments et des sondes pour le traitement des pathologies humianes ou leur diagnostique et permettra de séléctionner les molécules les plus interressante. Cette séléction évitera de mesurer ensuite l'activité pharmacologique chez l'animal de toutes les molécules éliminées et permettra donc de réduire le nombre d'animaux nécéssaire tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis a des injections effectuées afin d'administrer les candidat-médicaments, sondes, médicaments et/ou compétiteurs étudiés. Les molécules pourront être administrées par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intra-dermique, intr-anasale ou par voie orale. Généralement 1 (sonde) à 2 (sonde + compétiteur) administrations seront effectuées. Pour l'aquisition des images ("photos"), des anesthésies gazeuses de quelques minutes chacune sont nécessaires pour que la souris soit parfaitement immobile. Ces anesthésies pourront être répétées jusqu’à 8x sur une période de 24h à 7j pour suivre la liaison puis l'élimination de la sonde et determiner son activité. Afin de suivre la concentration sanguine de la sonde au cours du temps, des micro-prélèvements de sang pourront être réalisés à l’extrémité de la queue. Ces prélèvements seront réalisés durant l’anesthésie nécessaire à la "photo"ou sur les animaux vigiles et non contraints. Un maximum de 10 micro prélèvements de sang seront réalisés sur une durée minimum de 48h.

Impact sur les animaux

Les administrations uniques du candidat médicament, de la sonde (administrations orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous cutanée ou intradermique ou intranasale) et/ou répétée de la luciférine (intrapéritonéale) nécessite une préhension et une contention des animaux. Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse durant les "photos" : quelques minutes chacune et pouvant être répétée jusqu’à 8x sur une période de 24h à 7j. Des micro-prélèvements de sang sont réalisés à l’extrémité de la queue sur les animaux anesthésiés (simultanément à une "photo") ou vigiles et non contraintes. Un maximum de 10 micro-prélèvements de sang seront réalisés sur une durée minimum de 48h.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.

Remplacement

Les candidats-médicaments et les sondes auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la bio-distribution sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et qu’elle permet d’avoir recourt à des animaux génétiquement modifiés.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testées. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques ou d’images. Aucune comparaison statistique n’est requise. Le plus souvent 2 à 5 conditions seront testées pour un composé (doses, voies d’administration, en présence ou absence d’un compétiteur). La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre les paramètres sanguins mesurés. Il est prévu de mesurer la bio-disponibilité de 5 candidats-médicaments ou sondes par an chez la souris (30 à 75 souris) sur une période de 5 ans, soit un maximum de 375 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation d'une semaine sera respectée. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre des acquisitions efficaces et parfaitement répétables. Les souris seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative. Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés lorsque les animaux seront anesthésiés ou sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention) à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La mesure de la biodistribution sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments, le plus souvent car sa petite taille permet d’utiliser moins de composés (des composés souvent difficiles à synthétiser) et qu’elle permet d’avoir recourt facilement à des animaux génétiquement modifiés. Le recourt à des animaux génétiquement modifiés, déficients pour la cible, peuvent s’avérer indispensable pour la validation de la spécificité de la sonde dans l'organisme. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’évolution de l’expression de la cible durant la vie de l’animal selon les informations disponibles dans la littérature. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À cinq jours de vie, les souriceaux subissent une chirurgie du cou pour isoler la carotide et, pour une partie, une privation d'oxygène à 8 % pendant quarante-cinq minutes destinée à provoquer des lésions cérébrales proches de la paralysie cérébrale humaine, avec des séparations maternelles répétées. Le porteur reconnaît que ces séparations déclenchent des appels à la mère et cherche à tester des molécules neuroprotectrices, avec des tests comportementaux jusqu'à l'âge adulte. Il juge le recours à la souris "indispensable" pour suivre la plasticité cérébrale sur le cerveau entier.

Objectifs

La paralysie cérébrale (PC) est la première cause de handicap moteur de l’enfant. En France, elle concerne 4 nouveau-nés chaque jour, avec une vulnérabilité accrue chez les garçons. La prématurité, une hypoxie-ischémie (HI) et le stress sont des facteurs de risque de la PC, pouvant engendrer des lésions cérébrales. La problématique générale du projet est de valider chez l’animal des approches de neuroprotection périnatale, en comparaison avec les effets du MgSO4 (unique molécule, à effet neuroprotecteur partiel, recommandée en clinique). Un modèle expérimental chez la Souris permet d’induire ces lésions en réalisant une HI périnatale, tout en reproduisant les différences intersexuelles observées en clinique. La vulnérabilité cérébrale en période périnatale évolue rapidement, montrant des profils lésionnels dépendants de l’âge d’exposition et du sexe. En effet, la période de la naissance correspond à une phase tardive du développement cérébral (gliogénèse, migrations cellulaires, synaptogénèse, vasculogénèse). La compréhension des mécanismes lésionnels et de plasticité cérébrale sont un préliminaire aux études de neuroprotection. Celles-ci consistent à tester à court et long termes les effets de molécules pharmacologiques sur le comportement sensori-moteur et cognitif des souris ayant subi une HI néonatale, ainsi qu'à analyser leurs effets aux niveaux tissulaire, cellulaire et moléculaire.

Bénéfices attendus

Les études cliniques ont permis d’affirmer qu'à court terme le MgSO4 diminue significativement les séquelles neuromotrices graves à type de paralysie cérébrale justifiant son administration en routine aux mères en menace d’accouchement prématuré. Le projet permettra d'étudier les effets mécanistiques et comportementaux du MgSO4 administré seul, en différenciant les sexes. D'autre part, des travaux récents du laboratoire rapportent que l’administration de MgSO4 chez le souriceau hypoxo-ischémié à P5 prévient à court terme, les déficits sensorimoteurs, l’inflammation et l’apoptose induits pas une HI néonatale. Cependant, il est remarquable qu’à long terme, le MgSO4 ne parvient pas à prévenir les troubles moteurs et cognitifs alors qu’il semble prévenir les modifications tissulaires induites par l’HI (désorganisation des fibres myélinisées du corps calleux). En clinique, aucun effet délétère du MgSO4 n'a été rapporté chez la mère ni chez le foetus. Cependant, des études précliniques ont alerté sur le fait qu'une dose élevée de MgSO4 pouvait entrainer des altérations de l'angiogenèse corticale. Ainsi, ce projet permettra également de tester les effets de l'association du MgSO4 avec d'autres molécules pharmacologiques. L'une des molécules qui sera étudiée dans le cadre de ce projet est le 4-Phénylbutyrate (4-PBA) qui a des propriétés neuroprotectrices, qui est un inhibiteur d'histone déacétylase (iHDAC) et qui est administré chez le nouveau-né en clinique pour traiter des troubles du cycle de l'urée.

Procédures

Les souriceaux subiront une procédure chirurgicale (uniquement isolement de la carotide ou hypoxie-ischémie) à 5 jours de vie (P5) afin d'induire des lésions cérébrales similaires à celles observées dans le cerveau de certains enfants nés prématurément entre 24 et 32 semaines d'aménorrhée. Tous les souriceaux subiront 4 isolements maternels, respectivement de 8, 10, 45 et 10 minutes, le jour où seront réalisés à la fois la chirurgie et les traitements. Ils ne seront isolés de la fratrie que pendant l’acte chirurgical et la phase de réveil (8 minutes en tout). La chirurgie impliquera de faire une injection sous-cutanée (d’analgésique), une incision de la peau du cou et du tissu sous-jacent afin d’isoler la carotide, puis de réaliser deux points de suture. Tous les animaux seront tatoués pendant l’anesthésie. Les traitements nécessiteront de réaliser 2 injections intrapéritonéales par individu. Les animaux des groupes hypoxo-ischémiés subiront une hypoxie à 8% d’O2 pendant 45 minutes. Les tests comportementaux réalisés chez le souriceau, la souris adolescente puis chez l’adulte visent à évaluer son développement sensorimoteur et ses capacités cognitives lors d’activité spontanées.

Impact sur les animaux

Les phases d’isolement maternels provoquent systématiquement des appels à la mère de la part des souriceaux. Les manipulations des petits et de la mère se font quotidiennement dès 24h après la naissance et évitent ainsi des stress répétés lors des tests comportementaux. La molécule A peut provoquer une vasodilatation, bradycardie et myorelaxation, mais à la dose injectée, le comportement des souriceaux et de la mère envers ses petits n’est pas altéré. La molécule B ne provoque pas non plus d’altération du comportement des souriceaux ni de la mère envers ses petits. Du fait de la variabilité interindividuelle, certains animaux hypoxo-ischémiés présenteront à court et long termes des déficits sensorimoteurs et cognitifs très discrets, mis en valeurs par des tests comportementaux spécifiques. Les animaux restent autonomes et tout à fait mobiles. Ils maintiennent des interactions sociales. Les souriceaux étant retirés progressivement à la mère pendant la chirurgie, celle-ci n’est jamais totalement dépourvue de ses petits.

Devenir

Les souriceaux opérés sont maintenus en vie pendant une durée allant de 6 à 60 jours post-opératoires puis euthanasiés sous anesthésie profonde pour le prélèvement des cerveaux en vue des différentes expérimentations

Remplacement

Il est indispensable pour notre étude d'avoir recours à l'animal, ici la Souris: 1) Le stress est connu pour être l’un des facteurs de risque de la PC. Les séparations subies par le couple mère-souriceau à P5 renvoient aux difficultés rencontrées par les parents d'enfants prématurés pour être en contact avec leur enfant en couveuse, intubés et portant de multiples sondes; 2) Plasticité cérébrale: celle-ci apparaît au cours du développement cérébral ce qui nécessite de travailler de façon longitudinale sur le cerveau entier. L'analyse à long terme des altérations comportementales, histologiques et neurochimiques et de la neuroprotection, nécessite de travailler sur l'animal au stade juvénile, adolescent et adulte; 3) Interactions intercellulaires: les altérations tissulaires induites par l'HI à P5 ciblent préférentiellement, mais pas seulement, la substance blanche cérébrale produite par les oligodendrocytes (OL). La prolifération, la migration et la différenciation des OL sont vasculo-dépendantes et fonction de l'activité neuronale. Une approche intégrée est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Nous aurons 8 groupes de souris : 4 groupes contrôles et 4 groupes ayant subi une chirurgie. Chez les contrôles, comme chez les opérés, nous testerons les effets de deux traitements A et B, séparés ou combinés. Notre modèle de chirurgie reproduit les variabilités interindividuelles rapportées en clinique, nous contraignant à avoir des effectifs importants par groupe. Notre modèle chirurgical reproduit également les variabilités sexuelles rapportées en clinique. Dans un 1er temps, les groupes d’animaux seront constitués sans différencier les sexes. Ce n'est que dans le cas où des différences intersexuelles sembleraient apparaitre que le dédoublement des groupes sera fait afin de pouvoir analyser statistiquement les potentiels effets sexe. Les mêmes animaux réaliseront à la fois les études comportementales à court et à long terme et leur cerveau sera prélevé pour les études histologiques et/ou neurochimiques. Les données obtenues chez les groupes contrôles pourront être utilisées pour la mise au point de protocoles afin d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Les chirurgies réalisées à 5 jours de vie seront effectuées dans une pièce isolée, au calme, avec seulement un ou deux manipulateurs expérimentés présents. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale. On pratique une hyperoxygénation avant anesthésie. Un analgésique sera injecté. Le souriceau sera maintenu sur une couverture thermique. Après la chirurgie, les souriceaux seront remis dans leur cage avec la mère dans un environnement calme permettant la nidification et les soins maternels et stabilisé. Les comportements des souriceaux et de la mère seront observés très attentivement et ceci de façon répétée pendant les 24 premières heures post-chirurgie. Un suivi post-opératoire quotidien sera réalisé : suivi du poids des animaux, observation de leur apparence, vérification de l'accès aux mamelles, léchage des petits. Chez l'adulte, l'indice de grimace facial sera utilisé pour évaluer le niveau de douleur et le comportement de l'animal sera régulièrement observé.

Choix des espèces

La Souris est une espèce couramment utilisée en Neurosciences. L’espèce est prolifique (cycle de reproduction court (21 jours)), à faible coût d’élevage, utilisée abondamment dans la bibliographie scientifique. Une Hypoxie-Ischémie (HI) réalisée chez la Souris à 5 jours de vie permet d'induire des lésions cérébrales similaires à celles observées dans le cerveau de certains enfants nés entre 24 et 32 semaines d'aménorhée. Ce modèle expérimental permet également de reproduire les différences intersexuelles observées en clinique. Les souris NMRI étant non consanguines, les données obtenues sont plus proches de ce que l'on observe chez l'Humain. L'inconvénient est que cela est à l'origine d'une plus forte variabilité interindividuelle que chez des souris consanguines, ce qui nécessite des effectifs plus importants pour le traitement statistique des données. Les souriceaux seront utilisés : - durant les deux premières semaines de vie (le stade de 5 jours de vie chez le souriceau correspond au stade 24-32 semaines d’aménorrhée chez l’Humain au cours duquel la substance blanche est particulièrement vulnérable). Durant ces deux premières semaines, des tests sensorimoteurs seront réalisés ainsi que des études histologiques et/ou neurochimiques. Le sevrage sera réalisé à 21 jours de vie si le poids corporel est supérieur à 10 grammes. - puis à l’adolescence (P30-P45), - puis à l’âge adulte (60 à 90 jours). Ce sont souvent les mêmes souriceaux qui seront utilisés aux différents âges car de potentielles corrélations seront recherchées entre d'une part les déficits comportementaux discrets et les altérations histologiques observés à long terme et d'autre part les altérations comportementales discrètes observées à court terme. Les souris femelles non utilisées dans le projet pourront être mises en reproduction, si besoin, à partir de l'âge de 8 semaines et pour une durée maximale de 6 mois. Entre le sevrage d'une portée et le prochain accouplement, un repos d'une durée de 14 jours est respecté pour les mères. Les pères seront mis en reproduction à partir de 8 semaines pour une durée totale de 1 an.