Oncologie

15 946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie au cours de laquelle l'utérus est exposé et chaque embryon transpercé par un capillaire de verre avant l'application d'un courant électrique, technique d'électroporation in utero destinée à modifier l'expression de gènes dans le cerveau en développement. Les femelles sont tuées pour collecter embryons et nouveau-nés, ces derniers subissant une injection dans le cerveau ou une perfusion intracardiaque terminale, tous étant tués pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Chez certains patients avec des maladies du développement cortical, il existe des mutations dans des gènes qui montrent une forte probabilité d’être la cause de la maladie. Ces pathologies sont associées aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différenciation neuronale. Comprendre les mécanismes par lesquels la mutation entraine la pathologie est essentiel pour faciliter le diganostic d’autres maladies et envisager un traitement. Pour comprendre ce qu’il se passe dans les neurones, nous allons adopter une approche génétique visant à modifier l’expression ou la fonction des molécules étudiées. Nous utiliserons l’électroporation in utero chez la souris. Cette technique permet l’introduction de matériel génétique contrôle et muté dans les cellules progénitrices de la zone ventriculaire du cerveau en développement, permettant donc l’étude de la structure, de la fonction et du développement du système nerveux central. Elle offre l’avantage d’un contrôle spatio-temporel de la délivrance d’ADN, permet des études de perte et de gain de fonction et est simple, rapide et efficace. On pourra ainsi étudier l’effet d’un gène : # sur la prolifération : électroporation au stade embryonnaire (un seul stade par gène selon le pic d’expression du gène étudié) et analyse du devenir des cellules modifiées 1 ou 2 jours plus tard. Dans ce cadre, les mères recevront une ou deux injection(s) nous permettant des analyses de données plus fines# sur la migration des neurones : électroporation au stade embryonnaire et analyse du devenir des cellules modifiées 3 ou 4 jours après # sur la différenciation et la connectivité neuronale en introduisant le gène d’intérêt au stade embryonnaire et en analysant 2, 4, 8 ou 21 jours après la naissance .

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction de protéines ou d'autres molécules impliqués dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels leur déplétion ou surexpression conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées pour les patients. En effet, notre collaboration avec des cliniciens nous permet de tester par cette approche des variants retrouvés chez des patients présentant des maladies du développement du cerveau. Comprendre les mécanismes peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les femelles gestantes vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, pour une durée de 1 à 10 secondes pour chaque embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes ( en moyenne 25 minutes pour un chirurgien expérimenté). Un courant électrique sera appliqué sur la paroi utérine, en 5 pulses de 50 ms espacés de 1 seconde (temps total entre 5 et 6 secondes par embryon). Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. Certaines recevront une ou deux injections (5 secondes) 1-2 jours après la chirurgie. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 10 secondes). Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes) puis d’un anesthésique (environ 5 secondes) avant de subir une chirurgie de perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

La barrière cutanée des femelles gestantes donc rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates, aiguille très fine, cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait privées de congénères pendant quelques jours de convalescence. Certaines recevront une ou deux injections sous cutanées 1-2 jours après la chirurgie, pouvant entrainer un stress et d'autre(s) rupture(s) le la barrière cutanée. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires ainsi que l'application d'un courant électrique sur leur tête. Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique puis d’un anesthésique (pouvant entrainer du stress) avant de subir une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou dès collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour collecter les cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.

Réduction

Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Les experiences (prolifération, migration, maturation) seront choisies en fonction de la nature du gène étudié, son profil d’expression et du phénotype observé chez les patients. Aussi toutes les expériences ne seront pas systèmatiquement éffectuées. Seules celles relevantes seront faites. En ce qui concerne les études post-natales, et afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris, nous avons adapté nos croisements pour obtenir des souris moins agressives et meilleures nourrices. La bonne maitrise de la technique chirurgicale acquise par l’équipe tout au long de ces dernières années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (40-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous prévoyons aussi dans cette étude 10 femelles gestantes pour la formation de nouveaux expérimentateurs afin de nous assurer de leur succès et d’un bon taux de survie.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Avant le début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la deshydratation. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relais de l’analgésique pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. 1) Etude de la prolifération : Femelles adultes gestantes de 13 jours ou 14, stades auxquels la proliferation des progeniteurs est à son maximum. Le choix du stade se fera en fonction du profil d’expression deu gène d’intérêt (un seul stade sera retenu pour les expériences, celui avec le pic d’expression de la protéine d’intérêt) : l’électroporation du matériel génétique d’intérêt en même temps qu’un marqueur fluorescent permettra de suivre la prolifération de ces cellules. Analyse à 14 ou 15 jours de gestation, stade d’étude de la prolifération cellulaire. 2) Etude de la migration cellulaire : Femelles adultes gestantes de 13,5, 14,5 ou 15,5 jours, stades auxquels les neurones migrent le long de la glie pour atteindre leur localisation finale. L’electroporation à ces trois stades permettra de visulaiser la migration de types neuronaux diffèrents (nés à chacun de ces stades). Analyse à 18,5 jours de gestation pour les visualiser grâce à un marqueur fluorescent électroporé en même temps que le matériel génétique à étudier. 3) Etude de la maturation neuronale et connectivité : femelles adultes gestantes de 15,5 jours (stade auquel les neurones callosaux sont générés). L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’intégrer le gène à étudier uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à 2, 4 et à 8 jours après la naissance respectivement et le branchement des axones à 21 jours post-natals, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer ces différentes étapes.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lésions précancéreuses de la prostate leur sont induites par des injections répétées, puis elles reçoivent pendant 28 jours des composés par injection intrapéritonéale ou par gavage, seuls ou combinés. Le porteur affirme que l'induction n'entraîne "pas de douleur ni de souffrance dans la fenêtre choisie" et n'attend pas d'effet indésirable des composés testés, l'objet étant de cibler une population cellulaire liée à la résistance du cancer. Il indique que des études en culture ont précédé le projet et envisage des organoïdes en trois dimensions s'ils reproduisent fidèlement les tumeurs.

Objectifs

Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements actuels. Notre laboratoire et d'autres ont identifié des populations des cellules épithéliales résistantes aux traitements dans des modèles "souris" qui reproduisent l'évolution du cancer de la prostate chez l'homme. Par des analyses moléculaires, nos collaborateurs ont identifié des molécules régulatrices de cellules résistantes aux traitements. Ces facteurs réprésentent donc des cibles thérapeutiques potentielles pour les formes aggressives du cancer de la prostate. L'efficacité des composés chimiques ciblant ces facteurs a déjà été demontré par nos collaborateurs dans des systèmes cellulaires en culture. Nous aimerions continuer leur charactérisation dans le modèle de souris pour étudier l'effet de ces drogues sur les tumeurs prostatiques aggressives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'effectuer l'analyse des potentielles cibles thérapeutiques sur un modèle du cancer de la prostate aggressif.

Procédures

Les animaux seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition des lésion précancéreuses prostatiques. Une fois que les lésions précancéreuses deviennent sufisamment avancées (3 ou 5 mois après injection initiale), des injections quotidiennnes d'un des composés en intra-péritonéale pendant 28 jours seront réalisées (30 souris/lot). Un autre composé sera administré aux souris par gavage tous les 3 jours pendant 28 jours (30 souris/lot). Enfin, une thérapie combinée sera également vérifiée avec un composé injecté en intrapéritonéal et l'autre - administré par gavage à la même souris (30 souris/lot). Les injections intra-péritonéales comprennent une préhension de souris et l'injection en elle-même ce qui prend environ 10 secondes. Les gavages comprennent une préhension de souris et le gavage en lui-même, environ 15 secondes sont réquises pour effectuer ce geste par le personnel formé.

Impact sur les animaux

Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux gavages.Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux composés administrés. L'induction des lésions précancereuses dans notre modèle de souris conduit à une augmentation de taille de prostate mais ne cause pas de douleur ou de souffrance dans la fenêtre choisie pour cette étude d'après les analyses longitudinales de cette lignée effectués dans le cadre du projet antérieur.

Devenir

Tous les animaux de l'étude seront mis à mort et sa prostate sera utilisé pour les analyses moléculaires et cellulaires.

Remplacement

Des études préliminaires ont été ménées par nos collaborateurs sur les modèles cellulaires en culture pour montrer l'efficacité des drogues sur les cellules épithéliales similaires à celles retrouvées dans notre modèle de souris. Nous allons mettre en place des cultures d'organoides (cultures cellulaires en 3D) à partir des souris non-traîtées et si ces derniers reproduisent de manière assez fidèle les charactéristiques moléculaires de nos tumeurs, nous envisageons de les utiliser davantage dans le cadre de ce projet.

Réduction

Nous prévoyons d'utiliser 30 souris par lot expérimental dont 10 souris pour les analyses histologiques, 10 souris pour les analyses de populations cellulaire et 10 souris pour les expériences sur les organoides. A l'aide des calculs statistiques, nous avons estimé que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement sur les populations cellulaires étudiées.

Raffinement

Immédiatement après et la semaine suivante les injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les signes de douleurs, des irritations ou d'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Immédiatement après le gavage oral, la souris sera surveillée pour détecter les signes de passage de traitement dans les conduits respiratoires. Suite aux traitements, les souris seront pésées quotidiennement. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage en cas de perte de poids. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude et mis à mort.

Choix des espèces

Notre modèle de souris récapitule de manière fidèle l'évolution des lésions précancéreuses et du cancer de la prostate chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'efficacité des traitements, nous allons étudier l'effet systémique de ces traitement ce qui est impossible en utilisant les systèmes in vitro. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.

1 530 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous la peau de cellules tumorales de prostate humaine, 180 d'entre elles subissant en outre une castration, avant l'administration répétée de composés de thérapie génique pendant onze semaines et le prélèvement terminal du sang et des tumeurs. Le porteur décrit une technologie "prometteuse" relevant de la médecine de précision, dont les bénéfices pour les patients sont renvoyés au futur, l'étape immédiate étant de mesurer l'efficacité de composés déjà criblés in vitro. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne peut se substituer à la souris pour cette phase préclinique.

Objectifs

Le cancer de la prostate est l'un des cancers les plus courants dans les pays développés. Les patients atteints d'un cancer localisé peuvent être traités par chirurgie ou radiothérapie, tandis que la castration est utilisée comme traitement initial pour les patients atteints d'une maladie avancée. Bien que la plupart des patients répondent initialement à cette thérapie hormonale, une résistance peut apparaître dans les deux ans, ce qui signifie que le cancer de la prostate devient résistant à la castration. Les chimiothérapies actuelles ne permettent qu'une survie de 12 à 18 mois, provoquant 9000 décès par an et faisant de ce cancer l’un des plus mortels. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration. Une stratégie appelée thérapie d'acides nucléiques ou thérapie génique peut améliorer les traitements actuels en ciblant les gènes actifs après la castration pour retarder ou empêcher l'apparition de la résistance aux traitements. La thérapie génique présente un intérêt thérapeutique pour notre laboratoire. Nous avons développé des composés qui ont été utilisés pour induire la mort des cellules tumorales in vitro et pour réduire la progression tumorale in vivo chez la souris. Notre laboratoire souhaite réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nos composés de troisième génération. Les modèles que nous utiliserons sont basés sur la transplantation de cellules de prostate humaines résistantes aux traitements à des souris immunodéficientes, capables de mimer la maladie observée en clinique. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.

Bénéfices attendus

La thérapeutique génique est de plus en plus considérée comme une solution prometteuse pour la prise en charge des cancers de la prostate. Elle s'intègre dans la médecine de précision et permet de fabriquer un traitement individualisé en quelques semaines, pour une guérison plus rapide et efficace. Contrairement aux médicaments classiques, qui peuvent prendre jusqu'à dix ans pour être développés et cibler spécifiquement la mutation génétique responsable de la tumeur, la technologie génique agit directement sur des gènes impliqués dans la prolifération tumorale. Notre technologie est conçue pour contourner les principales limites de l'expansion du marché des composés géniques, notamment la faible biodisponibilité, la toxicité et la difficulté à atteindre les tissus cibles. En utilisant des lipides comme vecteurs de délivrance des composés géniques, nous sommes en mesure d'augmenter la stabilité, la solubilité et la spécificité de nos composés. De plus, notre technologie offre également la possibilité de co-délivrer sélectivement des agents diagnostiques ou thérapeutiques, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour la médecine personnalisée. En résumé, notre technologie représentent une avancée majeure dans la lutte contre les cancers de la prostate, en offrant une approche plus ciblée, efficace et personnalisée pour le traitement de cette maladie complexe.

Procédures

Les interventions sont les suivantes : a) Xénogreffe sous-cutanée : Les 1530 animaux de ce projet seront injectés sous-cutanément avec des cellules tumorales prostatiques sous anesthésie. Cette procédure dure environ 3 minutes par animal. b) Castration : Cette procédure concerne un groupe de 180 souris. Elle sera réalisée directement après la xénogreffe pour les animaux concernés, sous anesthésie. La durée maximale de la castration est de 30 minutes par souris. c) Suivi par imagerie : Cette procédure sera effectuée pour un groupe de 180 souris. La fréquence des imageries dépendra de la vitesse de croissance tumorale : une fois par semaine les deux premières semaines, puis une imagerie tous les 15 jours pendant 11 semaines de traitement. Le temps d'imagerie sera adapté à chaque modèle de tumeur. d) Traitement : L'administration des composés thérapeutiques se fera pendant 7 jours consécutifs pour les 450 souris dans la procédure d'évaluation de la spécificité des composés, et 3 fois par semaine pendant 11 semaines pour les 1080 souris dans la procédure d'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Nous utiliserons l'injection intrapéritonéale, qui ne durera que quelques secondes par souris et ne nécessitera pas d'anesthésie. À la fin de l'étude, ainsi qu'en cours d'étude si nécessaire en fonction des critères limites, les souris seront euthanasiées et le sang ainsi que les tumeurs de tous les individus seront collectés.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales chez les souris peut causer des effets indésirables tels que des douleurs, une faiblesse générale et une perte de poids. De même, l'injection d'oligonucléotides peut également provoquer des réactions indésirables telles que des inflammations et des douleurs au site d'injection. En outre, la castration peut également avoir des effets négatifs sur le comportement et la santé des souris, tels que des changements hormonaux et des modifications de l'activité locomotrice. Les modalités d'imagerie choisi n'entrainent pas d'algie chez l'animal. Cependant, l'induction anesthésique est une source de stress potentiel avant et pendant l'imagerie et l'acte chirurgical.

Devenir

À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées. Le sang et les tumeurs de tous les individus seront collectés pour des analyses post-mortem afin de contrôler la toxicité de nos composés et de valider la spécificité de chaque composé testé.

Remplacement

Afin de vérifier la pertinence des composés développés dans le laboratoire, le premier criblage sera effectué in vitro sur des modèles cellulaires en culture. Seules les composés positives démontrant leur efficacité in vitro seront utilisées dans les études in vivo du présent projet. Cependant, le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie. La souris immunodéficiente est un modèle de choix puisqu'elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales humaines, de mimer la maladie observée en clinique. L'induction des tumeurs par xénogreffes chez la souris est une technique maîtrisée et documentée. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.

Réduction

Pour chacun des composés, nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux tout en restant une statistique fiable permettant de caractériser leur efficacité sur les modèles de xénogreffes de cellules tumorales de cancer de la prostate. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes témoins. Afin de réduire au minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes témoins seront communs à plusieurs tests d'efficacité. Par ailleurs, nous réaliserons des études pilotes sur un petit nombre d'animaux par groupe afin de garantir une bonne tolérance aux molécules et d'adapter les doses à administrer avant de passer aux tests d'évaluation d'efficacité thérapeutique sur un nombre plus important d'animaux.

Raffinement

Nos études in vivo seront réalisées de manière séquentielle pour déterminer l'action des drogues sur le développement tumoral. Des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de vérifier leur tolérance aux molécules et d'ajuster les doses à administrer à notre souche de souris. De plus, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des méthodes non invasives sur les animaux. Enfin, nous améliorerons les conditions d'hébergement des animaux en proposant de la litière enrichie (copeaux de bois compactés et/ou coton) et en maintenant les souris en groupe de 4 à 5 individus pour éviter le stress lié à l'isolement. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans une pièce avec des cycles de lumière obscurité de 12 heures, où la température et l'hygrométrie seront constamment contrôlées. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l'eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d'intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance. Pour minimiser la souffrance et le stress des animaux, les manipulations pourront être effectuées sous anesthésie gazeuse pour un endormissement et un réveil rapides, et une analgésie sera administrée en cas de signes de douleur. Tout signe ou comportement anormal tels que des difficultés respiratoires, une souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux entraînera la fin de l'expérimentation et leur euthanasie immédiate afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici le cancer de la prostate). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d'un individu ou d'une lignée d'une espèce donnée chez un individu hôte d'une espèce différente. L'accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de nos approches. En effet, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise tumorale et éviter la réaction de l'hôte vis-à-vis du greffon. Pour la réalisation de xénogreffes de lignées tumorales humaines, cette espèce constitue le modèle in vivo le plus adapté : la maîtrise zootechnique (élevage/confinement); la praticabilité chirurgicale (technicité, accessibilité du site sous-cutané ou orthotopique); les connaissances actuelles et la diffusion dans le domaine scientifique (littérature, collaborations). Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris mâles âgées de 6 semaines qui ont atteint leur maturité sexuelle, afin de garantir la sécrétion d'hormones masculines qui ont une influence sur le développement du cancer de la prostate chez l'homme.

176 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'hypersensibilité à la douleur induite par une séparation maternelle précoce. La moitié des nouveau-nés est séparée de leur mère, puis soumise à des tests de douleur et à des injections dans la moelle épinière, l'autre moitié subit une chirurgie sans réveil avec ablation d'une vertèbre pour enregistrer la moelle jusqu'à huit heures. Le porteur indique aussi que toutes les mères sont mises à mort après le sevrage, au motif que la séparation altère leur système nerveux. Il affirme que la nociception est un processus intégré, impossible à étudier sans sujets vivants dotés d'un cortex développé.

Objectifs

Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) est un modèle reflétant la prématurité humaine et des études ont montré que les animaux exposés à la SMN présentent des déficit de comportements et une hypersensibilité douloureuse. Des études récentes suggèrent également un déréglement de l'expression de certaines molécules pouvant ainsi contribuer aux altérations comportementales observées suite à la SMN. Dans ce contexte, nous chercherons à évaluer le rôle de certaines de ces molécules exprimées par les neurones de la moelle épinière impliqués dans la transmission de l'information douloureuse. L’objectif du projet sera d’étudier l’effet du bumétanide (BTD), qui pourrait rétablir a) les seuils de douleur chez l’animal SMN adulte et b) la transmission de la douleur par des neurones dans la moelle épinière d'animaux SMN.

Bénéfices attendus

Le modèle de séparation maternelle a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre les voies et mécanismes impliqués dans la douleur qui sont altérés lors d’un stress néonatal non douloureux, et plus particulièrement une séparation précoce avec la mère. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique du bumétanide sur le comportement modifié des animaux séparés et sur les modifications moléculaires observées dans ce modèle.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis au protocole de séparation maternelle néonatale, tandis que l'autre moitié des nouveau-nés resteront avec leur mère. Des tests d'évaluation de la douleur (durée 10min/animal), n'induisant pas de stress accru chez les animaux seront effectués une fois chacun du jour 30 au jour 60 postnatal pour la moitié des animaux. Ceux-ci recevront un total de 4 injections sous anesthésie générale 30 minutes avant chaque test comportemental. Une chirurgie durant 45 minutes sera effectuée sur l'autre groupe d'animaux puis des enregistrements de la moelle épinière seront effectués. Ces enregistrements dureront 8 heures maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. Les nuisances possibles liées à l'injection intrathécale seront le stress lié à l’anesthésie ainsi qu'une inflammation ou infection potentielle du site d’injection. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress.

Devenir

Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expérience, tous les animaux seront aussi mis à mort. Pour la moitié des animaux, la chirurgie subie est sans réveil puisqu'une vertèbre est ôtée lors de celle-ci et que leur moelle épinière est manipulée. Les animaux y prenant part seront mis à mort par excès d'anesthésie.

Remplacement

La nociception étant un processus intégré, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action d’une molécule d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.

Réduction

Chaque groupe de rats requiert 2 portées différentes (comportant chacune minimum 10 animaux) pour une bonne analyse statistique et confirmation des tests comportementaux. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées. Les résultats obtenus sont alors statistiquement robustes et exploitables.

Raffinement

Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Leur prise de poids sera contrôlée 2 fois par semaine. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour décider de la procédure. Pour l’appréciation de la perte de poids, si lors d’une pesée hebdomadaire, il est observé qu’un animal ne prend pas de poids ou en perd par rapport à la pesée précédente, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Si l’un de ces changements persiste plus de trois jours et est observé par un zootechnicien ou l’expérimentateur, le vétérinaire sera contacté et l’animal sera retiré de l’étude. Les injections seront effectuée sous anesthésie générale profonde (isoflurane 3%) pour limiter le stress des animaux. Les tests comportementaux sont realisés après une semaine d’habituation (manipulation par l'expérimentateur 5 minutes par animal chaque jour) afin de réduire le stress.

Choix des espèces

Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat. Le protocole de SMN intervient au stade nouveau-né, entre le jour 2 et le jour 12 postnatal. Cependant, les conséquences de ce stress seront observées à l’âge adulte (45 jours postnatal).

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour tester une lignée porteuse d'une mutation proche de celle des patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires. Elles subissent des tests de force et de locomotion répétés chaque semaine, un test de saignement pour évaluer la coagulation et des injections de traitement, avant une mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur présente la plupart des tests comme non invasifs tout en décrivant du stress et des douleurs liées aux injections. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur un organisme entier, s'agissant d'une maladie multisystémique.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM), associée au syndrome de Stormorken (STRMK) est une maladie touchant notamment les muscles, la coagulation sanguine et la peau. Cette myopathie peut être causée par différentes mutations génétiques, et il manque encore des modèles adaptées pour étudier la maladie et la traiter. Ce projet vise donc à étudier une nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Si les principaux signes de patients sont trouvés chez les souris, cette lignée serait confirmée comme un modèle approprié pour le TAM/STRMK. Ce modèle permettra de mieux comprendre le syndrome TAM/STRMK, en fonction de la mutation. En plus, dans ce projet, nous mettrons également en œuvre une stratégie thérapeutique visant à prévenir et à inverser la maladie dans le modèle murin en ciblant un acteur clé de la cause de la maladie.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d’approfondir notre connaissance des causes et du fonctionnement de la maladie. De plus, avoir en notre possession des modèles TAM/STRMK nous permettra de trouver la thérapie la plus appropriée, en fonction de la cause génétique spécifique. Enfin, cette étude présente un intérêt pour un éventail plus large de maladies comme la dystrophie de Duchenne ou la pancréatite aiguë.

Procédures

Des tests de comportement seront réalisés une fois par semaine sur les souris vivantes, à partir de 1 mois (cohorte 1) ou 4 mois (cohorte 2) et jusqu'à 4 mois (cohorte 1) ou 8 mois (cohorte 2) d'âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test permettant de mesurer la force musculaire des pattes de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement, utilisé pour évaluer la coagulation sanguin, sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. Le test de production de force du muscle durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera euthanasié. Le test pour l'obtention du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections pour administrer le traitement prendront environ 2 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Le nouveau modèle peut avoir un impact indésirable sur l'animal. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. De plus, les injections administrées pour le traitement peuvent causer de la douleur à l'animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Dans le cadre de notre expérimentation, nous employons des tests phénotypiques non invasifs, ce qui signifie que nous n'occasionnons aucun préjudice aux animaux que nous étudions. Cette approche nous permet d'effectuer un suivi longitudinal en répétant les expériences sur les mêmes individus au fil du temps. En ce qui concerne les analyses moléculaires et histologiques, elles seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui évite de constituer un groupe d'animaux pour chaque point du suivi sur la durée. . Nous cherchons également à réduire au minimum le nombre d'animaux afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nos recherches antérieures ont montré que l'utilisation d'un maximum de 15 souris par groupe est nécessaire pour mener à bien une étude concluante. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysées avec des statistiques adaptés.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 h jour/nuit sera imposé. Les animaux recevront de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l’aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo ce qui limite le développement de la douleur. Afin de diminuer le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour le temps de saignement et les prélèvements sanguins, l'animal sera anesthésié. Ainsi, pour les mesures de force musculaire, l’animal sera anesthésié avec un mélange de produits anesthésiants et analgésiants permettant d’éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L’animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure afin de maintenir la température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de souffrance de l'animal, nous mettrons en place des mesures pour minimiser son inconfort et sa douleur. Nous utiliserons une grille de scoring pour évaluer le niveau de douleur observé chez l'animal. Si nous constatons un niveau de douleur élevé, nous prendrons les mesures appropriées pour soulager la douleur et assurer le bien-être de l'animal. La grille de scoring nous permettra de surveiller attentivement l'état de l'animal et d'adapter les interventions nécessaires pour réduire toute souffrance.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris afin de mieux comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes suite à une modification génétique, ainsi que pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Cette approche globale de l'organisme revêt une importance particulière dans le cadre de notre étude sur le TAM/STRMK, une maladie multisystémique. Ayant précédemment étudié le TAM/STRMK dans un autre modèle murin de la maladie, nous souhaitons approfondir nos connaissances en utilisant cette nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Les souris utilisées seront étudiées à l'âge adulte, après 4 semaines jusqu'à 8 mois (pour la caractérisation de l'animal), et après 4 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement).

820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'inflammation de l'hypothalamus provoquée par un régime riche en graisses. Une partie subit une ou deux chirurgies du crâne pour implanter une pompe et une canule assurant des perfusions dans le cerveau pendant quinze jours, une autre reçoit un régime gras puis des injections et des prélèvements de sang à la queue. Le porteur qualifie lui-même ces chirurgies stéréotaxiques de lourdes et douloureuses, et décrit des pertes de poids, de la prostration et des douleurs au crâne. Il affirme qu'il est impossible de reproduire in vitro les échanges entre organes et conclut que l'utilisation de modèles animaux est "nécessaire".

Objectifs

Dans le contexte de l’obésité nutritionnelle, il est actuellement reconnu que la consommation d’un régime riche en lipides (HFD) entraine une inflammation très rapide de l’hypothalamus, une région du cerveau qui joue un rôle crucial dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Les médiateurs et les mécanismes impliqués dans la mise en place de cette réponse inflammatoire aigue de l’hypothalamus et des perturbations métaboliques associées restent cependant à élucider. Récemment, nous avons mis en évidence que l’inflammation hypothalamique induite par 3 jours de régime HFD s’accompagne d’une forte augmentation de la production hypothalamique d’une hormone (X) connue pour ses propriétés pro-inflammatoires et favorisant le développement de l’insulino-résistnace, principal facteur de risque du diabète de type 2. Dans ce contexte, ce projet vise à démontrer in vivo l’implication de cette hormone hypothalamique dans la mise en place de l’inflammation précoce de l’hypothalamus et de déchiffrer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous tendant ses effets. Il n’existe à ce jour aucune méthode de substitution aux animaux de laboratoire pour étudier l’impact physiologique d’un dérèglement nutritionnel. Le modèle animal envisagé dans cette étude est un modèle souris (souche C57BL6) particulièrement bien documenté dans la littérature pour ce type d’étude. Le nombre d’animaux est minimalisé en vue d'appliquer les réglementations européennes en terme de réduction. L’objectif de Raffinement et d’enrichissement est pris en compte afin de s’assurer du bien-être des animaux (surveillance quotidienne). Le recours à l'anesthésie et analgésie sont prévus pour éviter toute souffrance des animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de caractériser plus précisément les mécanismes et les médiateurs jouant un rôle crucial dans l'apparition de la neuroinflammation hypothalamique et à l'origine de désordre métabolique. Identifier ces facteurs pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques permettant de prévenir les effets de l’obésité au niveau hypothalamique et ainsi éviter le développement du Diabète de type II.

Procédures

400 souris au total subiront une chirurgie stéréotaxique, et 160 souris au total subiront 2 chirurgies stéréotaxiques : une 1ère chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) afin d'injecter la tat cre, et une 2ème chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) une semaine plus tard pour poser le système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires (perfusion de 15j). 420 souris au total seront nourries avec pour moitié un régime normal et pour moitié un régime riche en graisse pendant 3 à 8 jours et toutes les souris seront soumises à des mesures de glycémie à différents temps ( 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min au plus) suite à une injection rapide en intraperitonéale (2-3 secondes) de glucose, d'insuline ou de pyruvate. Ceci implique plusieurs prélèvements à la queue d’une goutte de sang (6x5μl de sang au plus = 30μl). Une seule incision au niveau de la queue a lieu au début de l'expérience, elle est faite en une seconde.

Impact sur les animaux

Les procédures font intervenir des injections et perfusions et des chirurgies qui peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux tels qu’une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crâne. Toutes les précautions seront prises pour éviter au maximum ces effets.

Devenir

400 souris au total serviront à toutes les analyses immunohistochimiques et hybridation in situ pour étudier les ARN et protéines sur tissus et 420 souris serviront aux études de HITS CLIP pour l’identification des cibles, de PCR quantitative pour évaluer les niveaux d'expression des ARN et de western blot pour l'expression protéique. Tous les détails sont précisés dans chacune des procédures en réponse à des objectifs précis.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscle, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l’organisme des besoins énergétiques. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions, c’est pour cela que l’utilisation de modèles animaux est nécessaire pour ce projet. Cependant, veuillez noter que pour réduire le nombre d’animaux au maximum une partie des expériences sera réalisée in vitro, sur des lignées de cellules microgliales et neuronales hypothalamiques afin de déchiffrer les voies de signalisations sous tendant les effets proinflammatoires de l’ hormone X. Cependant, les expériences prévues sur les tanycytes seront réalisées sur des cultures primaires à partir d’hypothalamus de souris car il n’existe pas à ce jour de lignée de tanycytes commerciales. Ceci nécessite par conséquent l’utilisation de beaucoup d'animaux, et ne permet donc pas le remplacement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, tout ce qui est possible de faire in vitro a été planifié. De plus, des tests de puissance ont été réalisés au laboratoire pour chaque test planifié et notre expertise depuis plusieurs années sur ce type d'expérience nous permet vraiment d'évaluer à juste titre nos besoins expériementaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en cage individuelle puisqu’il est primordial pour notre étude de contrôler quotidiennement et individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Il est indispensable d'avoir un suivi personnalisé du poids corporel et de la prise alimentaire, en effet, si nous n'obtenons pas de résultats homogènes au sein d'un groupe expérimental, nous remonterons l'historique de l'animal en comparant sa prise alimentaire et son poids corporel notamment afin de vérifier s'il a plus ou moins mangé/pris de poids qu'un autre individu du même groupe expérimental, ce qui permettra d'expliquer certaines différences. Bien que les procédures chirurgicales soient lourdes et douloureuses, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. En effet, les chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous Isoflurane accompagnée d'une injection de Lidocaïne au niveau de site de l'incision avant en tant qu'anesthésique local. Durant toute la procédure chirurgicale, les animaux reposent sur un tapis chauffant et reçoivent une injection de solution saline en sous-cutanée pour prévenir leur déshydratation. Aussi, lors de la phase de réveil, les animaux, toujours sur un tapis chauffant, reçoive une injection intrapéritonéale de glucose. De plus, en période post-opératoire, dès la fin des sutures, un analgésique est injecté en sous-cutané, idem le jour suivant l'opération. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux. Elle se compose de scores et d'actions à réaliser selon le score. La grille de contrôle du poids est la suivante : normal : score = 0 ; perte de 5 à 10 % : score = 1 ; perte > 15 % : score =2. La grille de contrôle du comportement est la suivante : normal : score = 0 ; prostration, manque de toilettage : score = 1 ; hyperactivité lors de la manipulation, vocalisations sonores répétées : score = 2. Un score égal à 1 dans les deux grilles déclenche la sortie de l'animal de la procédure. Un score égal à 2 dans les deux grilles entraine la sortie de l'animal de la procédure et l'euthanasie si absence d'amélioration des scores.

Choix des espèces

Le modèle de souris est un outil complémentaire essentiel, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.