Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
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- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle de sous-populations de neurones à POMC dans la préférence à la nourriture hypercalorique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
3 709 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont hébergées seules dès sept semaines, subissent une neurochirurgie avec injection intracérébrale sous anesthésie, des gavages cinq jours de suite, une immobilisation en tube et un séjour de dix jours en cage métabolique fermée, pour étudier des neurones qui pourraient pousser à consommer des aliments hypercaloriques. Le porteur reconnaît que l'isolement social est une source de stress amplifiée par les cages métaboliques. Les retombées annoncées contre l'obésité sont renvoyées au long terme, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne peut remplacer l'animal pour étudier le comportement alimentaire.
Objectifs
La capacité à identifier et consommer des aliments riches en calories est primordiale à la survie des individus dans le règne animal, en particulier lorsque l’accès aux sources de nourriture est dangereux et/ou incertain. Des mécanismes biologiques, notamment cérébraux, œuvrent ainsi à analyser la nourriture consommée et guider l’individu vers des aliments caloriques, permettant de constituer des réserves qui assureront sa survie en cas de pénurie. Cependant, ces mêmes mécanismes biologiques peuvent devenir un handicap lorsque de la nourriture hypercalorique est disponible facilement et sans aucune restriction. En effet, en favorisant l’accumulation excessive de graisse corporelle, ces mécanismes peuvent conduire au développement de l’obésité et de nombreuses comorbidités associées (diabète de type 2, maladies cardiovasculaires, certains types de cancers, etc.). Dans ce contexte, il existe dans notre cerveau des neurones capables de détecter différents nutriments issus de l’alimentation, afin d’adapter nos choix alimentaires. Certains de ces neurones ont longtemps été considérés comme responsables de la satiété, mais des études récentes ont dévoilé leur grande hétérogénéité. Une sous-population particulière de ces neurones s’active préférentiellement lorsque des aliments hypercaloriques sont ingérés. Les raisons et conséquences de cette activation ne sont cependant pas connues, et c’est ce que nous cherchons à étudier dans ce projet. Notre hypothèse est que certains de ces neurones pourraient, dans des conditions particulières, augmenter la consommation d’aliments hypercaloriques, ce qui irait à l’encontre du rôle de promoteur de la satiété qu’on leur connaît actuellement.
Bénéfices attendus
À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes obèses à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malheureusement, les traitements disponibles à l’heure actuelle ne sont que peu efficaces pour lutter contre cette pathologie, et seules des techniques chirurgicales extrêmement invasives permettent une perte de poids durable (sans garantie de succès systématique). Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au développement de l’obésité, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques qui favorisent la consommation d’aliments hypercaloriques et participent ainsi au développement de l’obésité et des comorbidités associées. En outre, il s’inscrit pleinement dans un contexte de recherche international visant à décrypter les rôles spécifiques des différentes sous-populations de « neurones de la satiété ». À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité.
Procédures
Voici la liste des interventions sur les animaux : 1) Hébergement individuel (3709 souris) : toutes les souris de ce projet seront hébergées de manière individuelle dès l’âge de 7 semaines, jusqu’à la fin de l’étude, pour une durée variant de 6 à 17 semaines, suivant les lots. 2) Neurochirurgie (3533 souris) : cette technique d’injection intra-cérébrale est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 90 minutes. Une injection sous-cutanée sera réalisée sur souris vigiles 30 minutes avant la neurochirurgie, puis 1 par jour dans les 2 jours suivants, afin d’administrer les médicaments anti-douleurs. Six autres injections sous-cutanées seront réalisées lorsque les souris seront anesthésiées (2 d’anesthésiques locaux, 1 d’anti-douleur et 3 de réhydratation). Les souris concernées ne subiront qu’une seule neurochirurgie au cours de l’étude. 3) Injections sous-cutanées (3533 souris) : en-dehors de la neurochirurgie, les souris recevront des molécules par injection sous-cutanée ponctuelle sans anesthésie. Au maximum, 6 injections séparées d’au moins 1 semaine. 4) Injection abdominale (3621 souris) : ces souris recevront un euthanasiant par voie abdominale (injection unique), sans anesthésie préalable. 5) Gavage oral (2696 souris) : un gavage oral sera réalisé 1 fois par jour durant 5 jours, sans anesthésie. 6) Immobilisation (2016 souris) : l’analyse de la composition corporelle nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours du projet, espacées de 4 semaines. 7) Cages métaboliques (2016 souris) : les souris seront transférées dans des « cages métaboliques » hermétiquement fermées, ce qui augmente leur état d’isolation social. Elles vivront dans ces cages pour une durée de 10 jours. Cela n’aura lieu qu’une seule fois au cours de l’étude. 8) Mise à jeun (1605 souris) : pour certaines expériences, les souris seront mises à jeun pendant 3 heures, au cours de la phase diurne (phase inactive, équivalent de la nuit pour les rongeurs).
Impact sur les animaux
Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Toutes les souris de ce projet seront donc hébergées de manière individuelle dès l’âge de 7 semaines et jusqu’à la fin des procédures. Cette absence d’interactions sociales est une source de stress pour les animaux. Ce stress d’isolement sera amplifié chez les souris qui vivront pendant 10 jours dans les cages métaboliques, hermétiquement fermées. Certaines souris subiront un stress d’immobilisation (de 5 min) lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Enfin, des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris qui subiront une neurochirurgie. Ces douleurs devraient s’estomper dans les jours suivant la chirurgie, grâce au traitement analgésique mis en place.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité de certains neurones et la consommation d’aliments hypercaloriques. Dans ce contexte, les neurones nous étudions interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec d’autres organes qui influencent leur activité, notamment via des hormones. Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre tous ces acteurs biologiques. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et les caractéristiques étudiées ici telles que le comportement alimentaire nécessitent évidemment un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d’informations à partir des mêmes animaux. Par exemple, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes souris, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment (par exemple en regroupant les mâles et les femelles dans nos analyses, si nous constatons que le sexe n’influence par les résultats de nos tests).
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux seront habitués pendant au moins 2 semaines avant le début des expériences. Celles-ci seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite de réaliser sur certains animaux une neurochirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique ou de vaseline médicale. Le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser les atlas cérébraux de référence nécessaires à la neurochirurgie.
Effet des centrales photovoltaïques flottantes sur la biodiversité aquatique et le fonctionnement des écosystèmes lacustres
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
4 500 poissons sauvages au maximum vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité relâchée après capture et une mortalité annoncée sous 0,5 %. Ils sont capturés par pêche électrique ou au filet, anesthésiés pour la mesure et un prélèvement de nageoire, afin d'évaluer l'effet des centrales photovoltaïques flottantes sur les peuplements de poissons. Le porteur indique que la capture peut altérer le mucus et les écailles et qu'un piégeage prolongé peut être fatal. Le projet répond au développement rapide de ces installations dont les impacts écologiques restent mal connus.
Objectifs
Les centrales photovoltaïques flottantes constituent une nouvelle alternative aux centrales photovoltaïques terrestres pour la production d’énergie, en vue de la transition énergétique. Les prédictions de croissance de ces installations sont exponentielles, ces dernières représenteront d’ici 2030 une part importante de la production d’énergie photovoltaïque. Ainsi, ces installations et projets d’installations sur les plans d’eau connaissent un fort développement sur le territoire national, sans que les impacts écologiques potentiels, négatifs ou positifs, sur la biodiversité aquatique et le fonctionnement des écosystèmes lacustres ne soit connus. En particulier, les plans d’eau de gravière, écosystèmes artificiels, sont spécifiquement utilisés par les développeurs de ces technologies. Or, à ce jour, il n’existe aucune étude scientifique qui quantifie les effets écologiques de ces installations sur les écosystèmes aquatiques ni sur les plans d’eau de gravière en particulier. Le projet vise donc à combler ce manque de connaissances et de répondre aux attentes des différents services de l’état sur cette question. Le projet a pour objectif d’évaluer les effets des centrales photovoltaïques flottantes sur la biodiversité et le fonctionnement des écosystèmes lacustres. En particulier, il s’agit de quantifier ces effets sur le peuplement de poissons. Les observations porteront sur l’abondance, la structure en classe de taille, et la biomasse. L’analyse des isotopes stables des tissus des différentes espèces de poissons sera effectuée pour reconstituer le réseau trophique de chaque lac.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances essentielles sur les effets des panneaux solaires flottants sur la structure des peuplements de poissons et la structure du réseau trophique. Les connaissances aquises auront des répercussions opérationnelles sur la configuration et le déploiement de nouvelles centrales. Elles permettront de répondre, par des données scientifiques, aux questionnements des services de l’Etat en vue du déploiement de cette technologie.
Procédures
L'objectif est d'évaluer l'identité, la densité, et le régime alimentaire des poissons de lacs équipés de centrales photovoltaïques flottantes et des lacs contrôle. Des pêches scientifiques (pêche à l'électricité ou pêche au filet) seront effectuées dans 10 lacs chaque année. Les filets seront posés une fois pendant 1h30 au lever du jour. Dans chaque lac, 15 individus maximum par espèce (maximum de 5 individus pour chacune des 3 classes de taille - juvénile de l'année, juvénile et adulte ) seront mesurés et feront l'objet d'un prélèvement d'un fragment de nageoire (pelvienne). Ces poissons seront anesthésiés pour effectuer la mesure de taille et le prélèvement. Chaque lac contient en moyenne 6 espèces de poissons différentes et la pêche ne garantie pas de pouvoir collecter systématiquement toutes les classes de taille et 5 individus par classe de taille et espèce. Un maximum de 900 poissons sera soumis à la procédure chaque année, soit un maximum de 4500 poissons.
Impact sur les animaux
La capture des poissons par pêche électrique et filets maillants, malgré des poses très courtes, peut induire des altérations du mucus et des écailles. Le piégeage du poisson dans un filet peut entrainer sa mort. Lors de la stabulation, le maintien du poisson en vie peut être compromis si l'eau est chaude et peu oxygénée. Le renouvellement de l’eau très régulier (entre chaque point de pêche électrique et entre chaque filet) dans les seaux permet cependant de limiter très fortement les risques de mortalité. La mesure de la taille des poissons implique un stress léger dû à la manipulation des animaux. Le prélèvement d’un petit fragment de nageoire pelvienne (‘fin clipping’) implique une douleur de sévérité moyenne.
Devenir
Seuls les poissons n'ayant pas subi de dommages au cours des opérations de capture seront utilisés pour l'expérimentation. Les poissons seront remis à l'eau à l'issue de la procédure. Nous pouvons prévoir une faible mortalité consécutive à cette procédure (largement inférieure à 0,5%) représentant moins de 5 poissons pour 10 lacs (0,5% x 900) et donc moins de 25 poissons au cours des 5 ans du projet sur les 4500 poissons utilisés au maximum.
Remplacement
Le projet a pour but de comprendre comment l’installation des panneaux solaires modifie la structure des communautés de poissons présents dans les plans d’eau de gravière. Les réponses observées sont susceptibles de différer selon l’espèce de poisson et sa classe de taille. Il s’agit aussi d’évaluer les conséquences des installations de panneaux sur la niche trophique occupée par les poissons et sur l’ensemble du réseau trophique. Toutes les espèces présentes dans l’écosystème doivent être caractérisées, aucune espèce n’est donc remplaçable ni substituable, car nous en intégrons l’ensemble de la diversité piscicole.
Réduction
Il existe une forte variabilité trophique intraspécifique chez les poissons, en partie associée à des changements ontogéniques. Notre projet repose sur une approche à l’échelle des communautés de poissons tout en prenant en compte la variabilité trophique, notamment ontogénique, au sein des populations. L’objectif d’un nombre de 5 individus par classe de taille et donc de 15 individus par espèce permettra de disposer d’un effectif de qualité pour prendre en compte cette variabilité interindividuelle, tout en limitant le nombre d’animaux concernés par le prélèvement pour l’analyse des isotopes stables. Ce nombre de 15 individus est un compromis optimal qui permettra, si besoin, de mesurer la taille de la niche trophique des populations à l’aide d’approches bayésiennes (SEAb), et sera très robuste au niveau de la communauté. L’analyse du peuplement de poissons dans chaque lac (c’est-à-dire la richesse spécifique et l’abondance) sera effectuée en identifiant et comptabilisant l’ensemble des poissons capturés lors de la pêche. Entre 3 et 11 espèces de poissons sont présentes dans les 20 lacs étudiés, avec une moyenne de 6 espèces par lac. Un maximum de 900 individus sera donc échantillonné annuellement (10 lacs) x (6 espèces) x (3 classes de taille) x (5 individus) parmi environ 7500 poissons capturés annuellement (750 poissons échantillonnés par pêche scientifique par lac). En particulier, les 15 individus seront prélevés pour les espèces les plus abondantes du lac. 20 lacs seront suivis dans ce projet en suivant une approche Before-After-Control-Impact (BACI) qui est particulièrement robuste pour modifier les conséquences des changements environnementaux. Nous utiliserons 9 sites avec centrales (Impact) et 11 sites sans centrales (Control). Chaque lac sera échantillonné une fois tous les 2 ans, limitant ainsi l’impact potentiel de la capture et des prélèvements sur la communauté d’un lac.
Raffinement
Notre groupe de recherche possède une très forte expérience de plus de 10 ans de suivis dans ces plans d’eau et de leurs communautés de poissons. Lors des suivis des plans d’eau, nous réalisons pour chaque plan des mesures de multiples paramètres physico-chimiques (température, pH, conductivité, oxygène…). Par expérience, nous savons que lors de ces échantillonnages, le taux de saturation en oxygène dissous est élevé dans les plans d’eau. Les conditions physico-chimique seront contrôlées régulièrement dans les bacs (Sonde YSI proDSS) et l’eau renouvelée dès qu’elles dévieront des valeurs observées dans le plan d’eau au moment de l’échantillonnage. Aussi, lorsque la température sera trop élevée, nous annulerons nos échantillonnage (e.g. vague de chaleur). Néanmoins, ces conditions météorologiques seront ont évitées en travaillant sur la période allant de mi-septembre à mi-octobre. Les poissons seront anesthésiés (densité inférieure à 20 individus par bac) dans des bacs de 50 L. Une fois une dizaine d’individus capturés (sauf dans le cas de gros spécimens dépassant 800 g (extrêmement rares) qui seront anesthésiés et mesurés individuellement), les animaux seront anesthésiés avant la mesure de taille et le prélèvement du fragment de nageoire pelvienne pour limiter le stress et la douleur liés à la manipulation et au prélèvement avant d’être réveillés dans un bac de 50 L puis relâchés. L’exondation (mesure et prélèvement) est particulièrement courte et dure, en générale, moins de 30 secondes. Le niveau de cicatrisation n’est pas connu précisément en milieu naturel mais lors de la recapture de poissons, nous constatons que le recouvrement de la plaie par du mucus permet une cicatrisation des nageoires pelviennes au bout d’une saison en milieu naturelle. Sur une durée de deux ans, les nageoires pelviennes prélevées repoussent totalement et il n’est pas possible de reconnaitre un individu prélevé deux ans plus tôt. La probabilité de recapture est excessivement faible mais, si elle arrive, elle n’a pas de conséquence ni sur le poisson ni sur les résultats.
Choix des espèces
Le projet vise à analyser la réponse des poissons à l’échelle de la communauté dans son ensemble et vise à prendre en compte la variabilité trophique au sein des espèces de poissons. Ainsi, i) toutes les espèces de poissons présentes dans chaque plan d’eau seront prises en compte pour évaluer la structure de la communauté et du réseau trophique et ii) des individus aux différents stades de vie (juvénile à adulte) seront inclus dans les analyses car ils sont susceptibles de présenter des réponses différentes selon les espèces.
Association de l’ocytocine à la corticothérapie dans la myopathie de Duchenne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
652 souris du modèle mdx de la myopathie de Duchenne vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'ocytocine ou de prednisolone trois jours par semaine pendant cinq semaines à cinq mois, puis passent une batterie de tests comportementaux nommés, labyrinthe en croix surélevé, test clair-obscur, open-field, interaction sociale et contention. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des injections et justifie le recours à l'animal par l'interaction entre plusieurs organes. L'ocytocine étant déjà approuvée par la FDA, le porteur présente son passage en clinique comme facilité, au conditionnel.
Objectifs
En l'absence de traitement, la corticothérapie est le seul traitement palliatif actuellement utilisé pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le corticothérapie (prédnisolone) présente des avantages modestes sur le maintien de la force musculaire et présente également des effets secondaires indésirables comme le développement de l'anxiété, de la dépression et paradoxalement d'une faiblesse musculaire, sur le long terme. L'ocytocine (OT) est connue pour ses effets bénéfiques sur la fonction cardiaque, la régénération musculaire et dans le comportement social. En utilisant le modèle murin mdx, modèle classique de la maladie de Duchenne, le projet évaluera si la combinaison de l'OT avec la corticothérapie peut améliorer la fonction musculaire squelettique, cardiaque ainsi que le comportement social.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que l'OT seule ou en combinaison avec la prédisone/prédnisolone pourrait constituer un traitement dans la maladie de Duchenne. En effet, les résultats obtenus fourniront des indications sur l'intérêt de combiner les 2 traitements, notamment sur le niveau d'OT des souris traitées dans les différentes conditions. Étant donné que l'OT est un médicament approuvé par la U.S. Food and Drug Administration (FDA), la faisabilité d'une application clinique rapide est forte.
Procédures
Les animaux seront injectés 3 jours par semaine avec de l'OT ou de la prédnisolone. Le traitement durera soit 5 semaines soit 5 mois selon les groupes. Des évaluations fonctionnelles non invasives de la force musculaire (newtonmètre), de la fonction cardiaque (échocardiographie) et respiratoire (plésthysmographie) seront réalisées. Une série de tests comportementaux sera réalisée une fois après 5 semaines de traitement et après 6 mois de traitement. Les tests sont les suivants : Les délais entre tests sont de 24h, avec la succession suivante : 1. Plus maze (durée 5 min) 2. Clair/obscur (durée 5 min) 3. Open-field (durée 15 min) 4. Interaction sociale (durée 5 min) 5. Réponse à un stress léger par contention (durée 5-6 min)
Impact sur les animaux
Il n'y a pas de nuisance ou d'effet indésirable attendus suite à l'injection d'ocytocine ou de prednisolone. Néanmoins, les animaux seront surveillés pour évaluer une possible réaction inflammatoire au site d'injection. Le stress, dû à des contentions répétées des animaux, sera également surveillé. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations musculaire fonctionnelles et comportementales(tests d'anxiété et d' interaction sociales) sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur, cependant, les animaux seront surveillés quotidiennement.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour le prélevement des tissus (muscles, coeur et cerveau) pour des analyses biochimiques et histologiques post-mortem.
Remplacement
Le but du projet est d'explorer le rôle de l'OT thérapeutique dans la maladie de Duchenne. Dans ce contexte, afin de déceler les processus physio-pathologiques impliqués, il est nécessaire d'utiliser des animaux car les mécanismes de dégénérescence musculaire impliquent l'intéraction entre plusieurs types cellulaires et organes différents. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiopathologiques et ne serait donc pas pertinent pour la mise au point d'un traitement thérapeutique.
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous avons calculé la taille de chaque groupe d'échantillon nécessaire pour une analyse statistique.
Raffinement
Les animaux d'une même fratrie sont regroupés dans une cage. Les cages sont enrichies avec un tunnel et une maison en carton. Nous utilisons une grille de suivie et des points limites ont été déterminés en fonction des paramètres observés pour évaluer la souffrance, la détresse et l’inconfort des animaux. Selon les procédures la surveillance est effectuée par les animaliers et/ou par deux chercheurs statutaires ayant suivi la formation Expérimentation Animale. Les animaux sont observés et pesés trois fois par semaine avant chaque injection. S'il apparait que les animaux ont des difficultés pour se nourrir une supplémentation avec du dietgel , nourriture et eau au sol sera envisagé.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieurs (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiopathologique. De plus, la souris mdx est le modèle le plus reconnu pour étudier la maladie de Duchenne. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 6 semaines, âge où la dégénérescence musculaire reste très faible et permet ainsi d'évaluer le potentiel thérapeutique de molécules sur une période de traitement allant de 6 semaines à 5-6 mois, période où la dégénérescence musculaire cardiaque apparaît.
Rôle du facteur de transcription PLZF dans l’inflammation et le vieillissement du système hématopoiétique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Une partie est irradiée puis greffée de moelle osseuse et reçoit des injections de molécules pro-inflammatoires, tandis que les reproducteurs sont mis à mort après six mois d'accouplement et les animaux au génotype non recherché également éliminés. Le projet étudie le rôle du facteur PLZF dans le vieillissement du système sanguin, ou "inflammaging". Le porteur affirme que le dialogue entre cellules souches et microenvironnement ne peut être reproduit et rend le "modèle murin" impossible à remplacer.
Objectifs
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines (dans un processus appelé hématopoïèse) subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d'hémopathies. Dans le cadre d’un précédent projet, nous avons montré que le facteur de transcription PLZF est impliqué dans la régulation du vieillissement du système sanguin. PLZF participe à la régulation du compartiment des cellules souches hématopoiétiques (qui sont à l'origine de toutes les cellules du sang) et est associé à l'augmentation de certaines sous-populations que nous avons identifiées comme des cellules préactivées dans des voies de signalisation impliquées dans l'inflammation. Ces résultats suggèrent que PLZF pourrait être un acteur clé dans le vieillissement du système sanguin lié à l'inflammation chronique. Notre projet propose d'élucider le rôle de PLZF dans la physiologie du vieillissement des cellules sanguines soumises à des processus inflammatoires. Nous souhaitons donc étudier en détail les effets d’une inflammation chronique sur les différents types de cellules hématopoïétiques (notamment les cellules souches et les progéniteurs) ainsi que leurs altérations moléculaires et fonctionnelles dans des modèles murins où l'expression de PLZF est altérée.
Bénéfices attendus
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines, subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d'hémopathies. Le vieillissement du système sanguin est notamment lié aux inflammations subies tout au long de la vie de l'individu, processus connu sous le nom d'"inflammaging" qui favorise l'émergence d'hémopathies malignes. Nous souhaitons élucider certains mécanismes responsables de ce processus, pour mieux comprendre les causes du développement des hémopathies et cibler les acteurs clés de ce phénomène.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 6-7 minutes. La greffe de cellules de moelle osseuse qui s'ensuit est réalisée sous anesthésie gazeuse d’une durée de 3 à 4 minutes. Les animaux seront soumis à des injections de molécules pro-inflammatoires (durée 1 à 4 semaines, injection 3 fois par semaine) nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. Les animaux recevront des traitements par des molécules inflammatoires. Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation suivie d’une transplantation de moelle osseuse sous anesthésie gazeuse. L'irradiation est réalisée au sein d'un appareillage bruyant, ce qui peut être source de stress. Lors de ces transferts adoptifs, l'irradiation et le délai de reconstitution entraînent une période de fragilité immunitaire des animaux récipients, que nous compenserons par l'administration d'une antibiothérapie maintenue sur une durée de deux semaines à 1 mois après la greffe. Les animaux seront soumis à des observations et pesées quotidiennes, qui peuvent être source de stress.
Devenir
Ce projet nécessitera 456 souris. Les animaux reproducteurs sont mis à mort à l’issue de la période de 6 mois d’accouplement qui permet de générer les animaux de génotype d'intérêt. Les animaux ne présentant pas les génotypes d’intérêt sont également mis à mort. Les animaux d'intérêt utilisés dans ce projet sont mis à mort à l'issue des procédures à des fins d'analyse.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre le vieillissement des cellules souches hématopoïétiques, lequel implique des mécanismes largement dépendants d'une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux (cytokines, molécules d’adhésion). Ce dialogue permanent entre la cellule souche hématopoïétique et son microenvironnement nécessite d’avoir recours aux modèles murins qu’il n’est donc pas possible de remplacer actuellement.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d'animaux grâce à l’utilisation des techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre expérience passée nous a permis d'estimer le nombre d'animaux nécessaires à l'obtention d'un nombre suffisant de cellules souches et progéniteurs (populations rares) pour les analyses pré-citées, et nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage et en mettant à disposition de la nourriture humide. Tous les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et expérimenté, le cas échéant sous anesthésie gazeuse (injections et prélèvements sanguins).
Choix des espèces
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, à partir de 6-7 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures. Les greffes par transfert adoptif s'effectuent sur des animaux receveurs C57BL6/J Ly5.1 âgés de 7 à 8 semaines, qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe .
Production in vivo d’un anticorps monoclonal dirigé contre un marqueur de l’hémostase destiné à l’industrie du diagnostic in vitro
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.
Bénéfices attendus
L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).
Procédures
Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.
Remplacement
L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.
Raffinement
Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.
Choix des espèces
Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).
Variations neurobiologiques en lien avec des différences de comportements sociaux chez plusieurs espèces de macaques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Macaques rhésus : 40
Autres primates : 40
120 macaques de trois espèces vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés, chaque animal subissant un examen IRM d'une à quatre heures sous anesthésie générale. Le projet compare la neuroanatomie et les comportements sociaux des espèces pour étudier l'hypothèse du "cerveau social" des primates. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale et que les rongeurs ne conviennent pas, l'étude de cerveaux post-mortem ne suffisant pas selon lui. Les retombées annoncées relèvent de la connaissance fondamentale, avec la constitution d'atlas anatomiques.
Objectifs
L'hypothèse du "cerveau social" évoque la possibilité que certaines parties du cerveau des primates soient dédiées à la gestion des interactions sociales et la représentation abstraite de la structure du groupe social. En étudiant l'évolution biologique du système nerveux de différentes espèces de macaques montrant des comportements sociaux différents (ici Macaca mulatta, M. fascicularis et M. tonkeana), le but ultime de nos recherches est de participer à l'étude du fonctionnement et des origines du cerveau social des primates. À terme, notre projet de recherche permettra de comparer les comportements et la neuroanatomie de différentes espèces de primates non-humains. Un maximum de 120 macaques (jusqu’à 40 individus de chaque espèce de macaques) sera étudié. Leurs comportements sociaux seront étudiés par des observations éthologiques classiques et des prises de données semi-automatisées. Leur neuroanatomie fonctionnelle sera étudiée par une technique d’imagerie par résonnance magéntique peu invasive (IRM). Des études complémentaires sont déjà effectuées par notre équipe sur des échantillons post-mortem de cerveaux de macaques. L’étude de macaques vivants est indispensable pour étudier, entre autres, l’activité cérébrale au repos des macaques (accessible dans le cadre d'acquisitions de données IRM chez le primate non-humain anesthésié). Nos recherches permettront de mieux comprendre l’architecture du système nerveux des primates en relation avec leurs comportements sociaux. Ces connaissances fondamentales pourraient apporter de nouvelles perspectives concernant les cibles biologiques dans la prise en charge des maladies mentales humaines se caractérisant par des comportements sociaux inadaptés à la vie en société.
Bénéfices attendus
Les retombées potentielles de ce projet scientifique seront multiples. Elles permettront de mieux comprendre l’évolution et l’architecture du système nerveux des primates en relation avec leurs comportements sociaux. D’un point de vue fondamental, elles permettront d’émettre de nouvelles hypothèses concernant les causes biologiques des différences de socialité observées au sein du genre Macaca. Nos recherches participeront à établir des atlas de l’anatomie du cerveau pour des espèces de macaques, encore actuellement inconnue comme c’est le cas du macaque de Tonkean. D’un point de vue pratique, nos recherches pourraient nourrir de nouvelles perspectives quant aux cibles biologiques en lien avec des maladies mentales humaines, se caractérisant par des comportements sociaux maladaptés à la vie en société.
Procédures
Les animaux seront soumis à un examen IRM non invasif d’une à quatre heures sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Toutes les nuisances sont considérées comme légères. Les nuisances sont limitées au stress, en lien avec la capture, séparation des congénères, au transport et à l’anesthésie (nausée, hypothermie, désorientation).
Devenir
Les animaux impliqués dans ce projet de recherche vivent en semi-liberté en groupe naturalistique multi-mâles, multi-femelles. L’utilisation des animaux dans le présent projet n’a pas d’impact sur leur santé physique et mentale future, d’où la possibilité de les garder en vie.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non-animale à ce projet. Au vu des différences comportementales, neuroanatomiques et phylogénétiques, l’utilisation de rongeurs n’est pas une alternative envisageable pour décrire les différences de neuroanatomie fonctionelle corrélant avec les différences de socialité au sein du genre Macaca. Notre équipe étudie aussi des échantillons de cerveau post-mortem de différentes espèces de macaques. Toutefois, cette étude post-mortem ne permet pas d’acquérir des données de neuroanatomie fonctionelle, impliquant ainsi la nécessité d’étudier des individus vivants dont nous pouvons observer les comportements sociaux et les corréler aux images neuroanatomiques.
Réduction
D’après la littérature, un nombre raisonnable d’individus pour étudier la neuroanatomie d’une espèce de primates non-humains, mâles et femelles, est de 30-40 individus. Notre projet impliquera donc un maximum de 40 individus par espèce considérée. Nos données seront comparées aux acquisitions IRM existante en libre accès web. La neuroanatomie de certaines espèces que nous étudierons (macaques rhésus et macaques crabiers) est déjà décrite dans la littérature. Toutefois, ces études concernent des sujets vivants dans des environnements peu ouverts et au sein de groupes sociaux peu nombreux – ce qui influence la neuroanatomie des individus. Les aménagements du site offrent des configurations de groupes sociaux unique, permettant ainsi d’avoir accès à des données neuroanatomiques plus fidèles et plus représentatives des conditions écologiques dans lesquelles ces animaux vivent à l’état sauvage.
Raffinement
Les animaux vivent en groupe social dans des parcs en semi-liberté. L’examen d’imagerie (IRM) auquel ils sont soumis est non invasif et sera réalisé sous anesthésie générale avec surveillance vétérinaire. L’examen IRM n’occasionne pas de capture supplémentaire des animaux, il sera réalisé à la faveur de leur contrôle sanitaire périodique.
Choix des espèces
Afin d'étudier l'évolution du cerveau social des primates, il est nécessaire d'impliquer différentes espèces de primates non-humains. En effet, les différences interspécifiques ont une importance cruciale concernant des mécanismes d'évolution biologique étudiés. De plus, nous savons qu'il existe un lien entre la phylogénie et les comportements sociaux au sein du genre Macaca. Ainsi, il existerait une dimension héréditaire et génétique, entre socialité et neuroanatomie chez ces différentes espèces de macaques. Par conséquent, l’utilisation du modèle macaque en IRM est indispensable et pleinement justifié par la nature et les objectifs de notre projet de recherche. Les animaux seront impliqués dans notre procédure à partir de l’âge de 18 mois, ce qui correspond à un âge supérieur où le sujet serait sevré en condition naturelle.
Rôle des glucocorticoïdes dans la régénération musculaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés subissent une amputation de la première phalange pour génotypage, puis les animaux reçoivent des injections de tamoxifène et une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle, dont on étudie ensuite la régénération sous glucocorticoïdes. Le porteur affirme que le recours à un "organisme entier" est nécessaire parce que cellules immunitaires et hormones interviennent dans la régénération, et indique n'attendre aucun effet secondaire majeur. Les bénéfices thérapeutiques évoqués restent une compréhension des mécanismes, sans application décrite à court terme.
Objectifs
Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.
Procédures
Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Tatouage et biopsie sont alors non douloureux. La phalangéctomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. La phalangéctomie et le tatouage sont des techniques d'identification utilisées depuis plusieurs décénies dans le laboratoire et ne présentent pas d'effets secondaires majeurs. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).
Devenir
A l'issue de la procédure tous les animaux expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.
Raffinement
Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 15 semaines pour éviter les variations causées par la puberté. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Dans un premier temps, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3 et 5 jours après injection de la cardiotoxine. Puis, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la régénération musculaire et les mécanismes anti-inflammatoire en analysant les animaux à 7, 14, 28 et 60 jours après l’injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine, constituant ainsi le jour 0. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée constitutive ne nécessitant pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée constitutive.
Optimisation de la prise de greffe hématopoïétique chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est irradié puis reçoit une injection intrafémorale décrite comme douloureuse, et une partie est transplantée avec des cellules souches hématopoïétiques humaines, avant euthanasie pour quantifier la prise de greffe. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce processus in vitro et que la transplantation chez l'animal est le "seul outil" disponible. Les retombées annoncées pour les patients greffés de moelle osseuse sont renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
L’utilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) suscite un fort intérêt médical du fait de leur potentiel de régénération et de différenciation. Elles sont présentes dans la moelle osseuse et sont à l’origine des cellules sanguines. Elles sont utilisées au cours des transplantations hématopoïétiques dans le but de traiter les patients atteints de leucémies ou de maladies génétiques affectant les cellules du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes). L’une des limites de la greffe cependant, provient de la faible proportion de CSH capables de migrer vers les niches hématopoïétiques localisées dans la moelle osseuse et de s’y implanter. La grande majorité des CSHs est en réalité perdue ou détruite avant d’atteindre la moelle osseuse. Ainsi, une proportion importante des greffons, notamment ceux issus des sangs de cordons ombilicaux présentant de faibles quantités de CSHs, ne peut pas être utilisée pour la greffe. Une solution permettant d’augmenter le nombre de greffons disponibles consiste à augmenter la proportion des CSHs « utiles », c’est à dire capables de s’implanter dans la moelle osseuse. Cette amélioration permettrait en outre de limiter les risques d’échec de greffe chez les patients transplantés. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est d’évaluer l’effet de l’injection de molécules impliquées dans le guidage des cellules vers les niches hématopoïétiques médullaires, en association ou non avec des complexes stabilisateurs, préalablement à l’injection des CSHs, sur l’efficacité de l’implantation des CSHs humaines dans la moelle osseuse. Les expériences de transplantations seront réalisées dans un modèle de souris n’ayant pas de système immunitaire, ne rejetant donc pas la greffe de cellules humaines.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait d’établir la preuve de concept que l’injection de molécules (sélectionnées sur la base de leur effet sur les CSHs) augmente la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) lors d’expérience de transplantation. A terme, ces résultats concourront à l’optimisation des protocoles de transplantation de cellules hématopoïétiques chez l’humain, dans le but d’augmenter les chances de réussite thérapeutique et le nombre de patients pouvant bénéficier d’une greffe de moelle osseuse.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe (entre 3min environs et 5 min environ selon la lignée de souris) et à l’injection intrafémorale d’une molécule sélectionnée sur la base de son activité sur les CSHs. Cette injection qui dure quelques minutes sera réalisée sous anesthésie (1h environ) avec une prise en charge analgésique. Certains animaux seront également transplantés avec des CSHs humaines par voie intra veineuse. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Ces procédures permettront de tester 5 molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs
Impact sur les animaux
L’injection dans l’os est douloureuse. Elle sera effectuée sous anesthésie et sera accompagnée d’une prise en charge analgésique. Les animaux seront irradiés pour permettre la prise de greffe. L’irradiation non létale des souris n’est pas sensée provoquer de douleur ou d’altération majeur de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rare cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limité au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique durant 1 mois dans l’eau de boisson.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier, dans la moelle et dans le sang, la concentration de la molécule étudiée pour les études de pharmacocinétique ainsi que la proportion de CSH humaines présente dans la moelle des souris pour les expériences de transplantation.
Remplacement
La prise de la greffe au cours des transplantations de CSH est un phénomène complexe et il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de mimer ce processus in vitro. Le passage par une expérience de transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs à se loger au niveau de la moelle osseuse et ainsi d’identifier des molécules capables d’améliorer cette étape.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous déterminerons sur un petit nombre de souris les conditions expérimentales optimales de transplantation en fonction de chaque molécule testée. L’effet de cinq molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs sera évalué. Notre expérience ainsi que la littérature dans le domaine nous montrent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe et par expérience est de 6 animaux afin que nous puissions rendre des résultats statistiquement significatifs sur le plan hématologique. Nos expériences préliminaires par étapes successives nous permettront d’optimiser les paramètres expérimentaux et de vérifier que ce nombre d’animaux est valide lorsque l’on combine injection intra-fémorale d’une molécule à tester et injection intra-veineuse de cellules hématopoïétiques.
Raffinement
Pour limiter au maximum l’impact sur le bien-être des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Par ailleurs, une prise en charge analgésique sera effectuée si besoin au site de l’injection intra-fémorale. Enfin une surveillance accrue sera réalisée entre le moment de l’irradiation et l’euthanasie de l’animal afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'humain. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de CSHs. Souris jeunes adultes (10-12 semaines) afin d’être dans des conditions dans lesquelles la prise de greffe est optimale.
Caractérisation de l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules KP KO pour les protéines adaptatrices recrutées par les TLR et de l’IFNAR1 dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires puis une infection nasale par le virus Influenza sous anesthésie, avant des traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie, la croissance tumorale pouvant provoquer détresse respiratoire et perte de mobilité. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et justifie le choix de la souris parce que "toutes les études similaires sont menées chez cet animal". Les bénéfices avancés pour les patients atteints de cancer du poumon restent une meilleure connaissance des facteurs de résistance aux traitements.
Objectifs
Nous souhaitons caractériser l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules tumorales pulmonaires et comprendre les mécanismes mise en oeuvre lors de la reconnaissance virale. Pour ce faire, nous utiliserons des lignées cellulaires présentant ou non des adaptateurs moléculaires impliqués dans le processus de reconnaissance du virus respiratoire Influenza A. Nous nous interessons également à la réponse aux différents traitements.
Bénéfices attendus
Les traitements actuellement préconisées dans le cadre d'un cancer pulmonaire sont la radiothérapie ou la chimiothérapie et éventuellement en association avec l'immunothérapie ou thérapie ciblée. Cependant, il est nécessaire de poursuivre des recherches pour mieux connaître les facteurs pouvant impacter la progression tumorale et la résistance au traitements. C'est pourquoi, nous souhaiterions déterminer le rôle des adaptateurs ou récepteurs de la reconnaissance virale en combinaison avec de la chimiothérapie ou immunothérapie.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, la durée de l'expérience est de 1 mois. Les animaux recevront une injection de cellules tumorale (2250 animaux) par voie intraveineuse avec au préalable une anesthésie générale. La durée de l'acte est de quelques secondes à une minute. De plus, avant l'infection respiratoire, les souris sont anesthésiées à l'aide de cette même préparation puis l'infection par voie nasale (2250 animaux) peut avoir lieu. Le temps nécessaire une infection est de 20 minutes maximum. Nous testerons également la résistance aux médicaments et la voie d'administration du traitement (chimiothérapie ou anti-monoclonal) est une injection intra-veineuse (1800 animaux) et l'acte prend moins de 10 secondes. Les souris recevront une anesthesie gazause. Lors des traitements par chimiothérapie : deux à 5 injections sont prévues pour les sels de platine. Enfin, lors du traitement par immunothérapie, 5 injections d'anticorps seront réalisées. De plus, lors de l'imagerie du petit animal, nous utilisons un anesthesique gazeux pendant 10 min (2250 animaux).
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse peut causer une douleur ou un inconfort d’où l’utilisation d’une anesthésie injectable. Les souris peuvent souffrir de faim ou de soif lors d’une infection virale et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée, l’animal peut présenter des signes de souffrances, d’une détresse respiratoire et une diminution de la mobilité de l’animal. De plus, les effets indésirables liés à l’infection virale peuvent être multiples. Lorsque nous procédons à une infection virale par voie nasale, il est nécessaire d’endormir les souris à l’aide d’une anesthésie injectable pouvant entrainer une hypothermie. Enfin, l’administration de médicaments se fait par voie intra-veineuse Et, l’animal recevra une anesthésie gazeuse pour limiter toute souffrance, et ensuite, l’injection intra-veineuse peut être entrepris.
Devenir
Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les poumons dans le but d’analyser par des techniques multiparamétriques, l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral et la réponse virale.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et l’infiltrat immunitaire dans sa globalité
Réduction
Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 15 souris/groupe. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumoral aux cours du temps et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 2250. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.
Raffinement
Raffiner, la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites, si des signes de souffrances sont visibles. De plus, les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par les animaliers d’une part et nous assurons en plus une surveillance suivi d’un contrôle 3 fois par semaine dès que les souris ont été infectée par injection intra-nasale avec recherche de signes d’altération de l’état général (souris recroquevillée, amaigrissement (3 pesées hebdomadaires) et de difficultés respiratoires. Lors des injections de cellules tumorales pulmonaires et au moment de l’infection intra-nasale, les animaux seront sous anesthesie générale. Afin d'éviter que les animaux ne soient en hypothermie, nous les plaçons sur un tapis à 37°C. En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées. Nous utiliserons une anesthesie gazeuse afin d’observer l’apparition des tumeurs par une technique d’imagerie pour éviter d’euthanasier l’animale. Nous utiliserons également de l’anesthesie gazeuse lors des injections intra-veineuses.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences avec avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos qui est une lignée de souris dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.
Etude chez la souris de l’impact d’une inflammation lors des premiers jours de vie sur la prédisposition à l’obésité. 1/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
3 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les mères suivent un régime hypergras et chaque souriceau subit jusqu'à quatorze interventions, dont neuf injections d'une molécule inflammatoire dès le lendemain de la naissance, une ouverture du crâne sous anesthésie pour l'imagerie et des prélèvements sanguins répétés à la queue. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et prévoit l'euthanasie pour prélever cerveau, foie et pancréas. Il affirme qu'il est impossible de reproduire hors de l'organisme les connexions étudiées, les bénéfices pour l'humain étant renvoyés à un éventuel traitement de l'obésité.
Objectifs
La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut s’étendre au cerveau et y entraîner des lésions. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras des mères pendant la lactation. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.
Bénéfices attendus
Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.
Procédures
Les mères seront soumises jusqu’au sevrage des petits (21 jours) à un régime hypergras ou à un régime contrôle (croquettes plus ou moins riches en graisse). Chaque souriceau sera soumis à 14 interventions au plus. 1/ Ils recevront 2 injections intrapéritonéales (dans le ventre, au niveau de l’abdomen, dans la cavité où se trouvent les organes digestifs, l’injection est faite un peu au-dessus de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Il y aura donc au total 9 injections, de quelques secondes chacune. 2/ A 4 semaines, sous anesthésie générale, une ouverture de l’os du crâne sera réalisée sur un lot d’animaux pour des mesures d’imagerie, pendant lesquelles du glucose sera administré. Cette mesure dure de 1h à 1h30 en totalité. 3/ Pour savoir si les animaux développent un diabète, un autre lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Chaque prélèvement dure quelques secondes. Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose (une seule dose de chaque). L’efficacité d’un anti-diabétique sera testée sur un lot de souris spécifique (1 injection par jour pendant 3 jrs à partir de 4 semaines). Deux heures après la 3ème injection, un test d’insuline sera réalisé comme décrit précédemment. Le lendemain, un prélèvement de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sera réalisée sous anesthésie, avant euthanasie par dislocation cervicale. 4/ D’autres animaux seront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement dans des cages individuelles appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une habituation à l’isolement en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant. Au total les animaux resteront isolés pendant 2 semaines : 1 semaine d’habituation puis 1 semaine en cage métabolique. 5/ A 6 semaines, un autre lot d’animaux subira le test de « l’arêne » où les souris se déplaceront librement pendant 10 min sous une caméra pour évaluer leur comportement. 6/ A 4 et 6 semaines, une perfusion intracardiaque de liquide sera réalisée sur certains animaux, sous anesthésie générale et avec analgésie, pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem.
Impact sur les animaux
- L’injection intrapéritonéale peut créer une infection locale dans la zone d’injection - Chez les animaux inflammatoires, on peut observer un retard de croissance (taille et poids inférieurs à la normale) et des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...) et moteurs. - Un «graissage» du pelage peut être observé chez les animaux sous régime hypergras, car les miettes de croquettes qui tombent dans la cage lors de la prise alimentaire des animaux entraînent un dépôt lipidique dans la cage. - Une accélération du rythme de la respiration peut survenir chez les animaux à tous les stades. - La chirurgie crânienne peut entraîner dans de rare cas la mort de l’animal. Cela n’a pas d’impact sur le nombre d’animaux utilisé. - La récupération d’une goutte de sang à 10 reprises en 2h après administration d’insuline ou de glucose à 4 semaines peut engendrer un peu de stress chez les animaux, et parfois une hémorragie si la coagulation naturelle ne se fait pas normalement. - L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.
Raffinement
Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Une surveillance quotidienne règlementaire est respectée dans l’établissement. Une surveillance spécifique des animaux du projet est par ailleurs appliquée : - Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. - A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. - Après sevrage, les animaux sont surveillés toutes les semaines au moment du change des cages et les vendredis après-midi (avec prise de poids) avant le weekend. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique. Une anesthésie générale sera réalisée lors des mesure d’imagerie, et pour le prélèvement sanguin des souris ayant reçu le traitement anti-diabétique. Avant la perfusion intracardiaque de liquide, une analgésie et une anesthésie seront réalisées.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.
Mise en place d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïètiques murines dans des souris immunocompétentes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une irradiation totale du corps avant l'injection de cellules souches, avec des prélèvements sanguins toutes les deux semaines, puis pour certaines des immunisations répétées. Le porteur décrit un affaiblissement possible après l'irradiation, perte de poids, léthargie, diarrhées et suppurations oculaires liées aux injections rétro-orbitaires. Il affirme que les événements moléculaires du développement des lymphocytes B sont impossibles à reproduire in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable", l'euthanasie servant à prélever les organes de l'immunité.
Objectifs
Les lymphocytes B sont des cellules de l’immunité adaptative sécrétrices d’anticorps dirigés contre les agents étrangers au soi. Pour produire des anticorps, le lymphocyte B doit se différencier en une cellule sécrétrice d’anticorps, aussi appelée plasmocyte. Notre laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur les évènements moléculaires qui concourent à cette différenciation. Cette dernière induit dans la cellule d’importantes modifications qui sont sous le contrôle d’un grand nombre de facteurs clés agissant pour certains sur le stress cellulaire et sur des évènements qui pourraient conduire à un cancer. Nous avons très récemment montré que des enzymes ayant les capacités de phosphorylation des protéines et jouent un rôle primordial dans ce processus de différenciation en plasmocytes. Dérégulées, ces enzymes contribuent à la survenue et au maintien de cancers issus des lymphocytes B (lymphomes) et plasmocytes (myélome). Nous souhaitons confirmer in vivo chez la souris le rôle des ces enzymes dans ce processus de différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Ce projet comporte trois volets: 1) Le premier consiste à la mise en place technique d’une transplantation de cellules de la moelle osseuse en vue d’une production nouvelle de cellules sanguines chez la souris immunocompétentes ; 2) Dans un deuxième temps nous transplanterons des cellules de moelle issues de souris modifiées génétiquement et aptes à développer des cancers; 3) Enfin, nous transplanterons des cellules préalablement modifiées avec perte des capacités à produire les enzymes d'intérêt. Les animaux ainsi modifiés permettront l’étude précise des évènements moléculaires qui participent à la différenciation en cellule normale ou tumorale, selon le cas.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension du rôle des kinases PIM dans la biologie du lymphocyte B normal ainsi que dans le développement des tumeurs induites au cours de cette différenciation, les lymphomes et le myélome.
Procédures
Notre modèle de greffe dans des souris immunocompétentes implique au préalable une irradiation totale des souris avant l'injection des cellules. Les cellules seront injectées dans le sang après une anesthésie gazeuse des animaux. L'injection sera de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes. Des prélèvements sanguins itératifs (1 fois toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés pour tous les animaux. Le prélèvement sanguin ne nécessite aucune anesthésie et n'excèdera pas 1 minute. Enfin des immunisations seront appliquées sur certains animaux (aucune anesthésie requise) dès 3 mois post-greffe pour les animaux dont la reconstitution sanguine a été jugée optimale. L’immunisation sera soit unique ou itérative (2 ou 3 injections espacées de 1 semaines à 1 mois selon les modèles), avec des injections de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes.
Impact sur les animaux
L'irradiation des animaux peut engendrer un affaiblissement notable de leur vitalité, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées quotidiennement durant la phase post-irradiation (au moins 1 semaine) pour détecter une potentielle absence de prise de greffe et apparition de signes d’affaiblissement immunitaire (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Afin de lutter contre la perte de poids (en lien avec des diarrhées induite par l'irradiation), un apport gélose pourra être utiliser pour faciliter l'absorption des aliments et la réhydratation des souris. Enfin, le développement de suppurations des yeux peut aussi apparaitre suite aux injections rétro-orbitales. Une vigilance particulière au cours du suivi quotidien des animaux en post-greffe sera donc porté sur cet effet possible.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution de toutes les cellules du sang et sur développement de la réponse immunitaire et des tumeurs.
Remplacement
Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'importance des kinases PIM chez l’Homme dans la différenciation normale du lymphocyte B en plasmocytes et leur implication dans le développement des cancers. Les évènements moléculaires impliqués dans le développement des cellules du système immunitaire, et tout particulièrement des lymphocytes B sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro. Le recours à des animaux est donc indispensable pour cette étude.
Réduction
Afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (organes de l'immunité, moelle osseuse et sang) afin de réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes chez la souris, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal. Enfin, la taille des groupes de souris est choisie de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Le nombre de 10 souris par lot est choisi assez élevé pour pallier le fait que ces expérimentations ont une reproductibilité assez faible. En effet, l'irradiation totale et la greffe subséquente de cellules sont des procédures avec une forte variabilité, et un risque non négligeable de perte d'animaux en période post-irradiation.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel.
Choix des espèces
Les souris sont de bons modèles d'étude notamment pour caractériser des mécanismes physiologiques ainsi que comprendre les processus de cancérogénèse étant donné leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin est aussi le plus utilisé actuellement pour le développement tumoral et étudier la tumeur dans son microenvironnement. Enfin, de nombreux outils sont maintenant disponibles pour l’étude des structures anatomiques, cellules et gènes dans cette espèce (anticorps, séquence de référence) dans les modèles murins, facilitant alors l'analyse des données. Pour notre projet, les cellules de la moelle osseuse des souris donneuses seront greffées dans des souris receveuse de même fond génétique afin d’éviter le rejet de greffe. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 4 semaines d’âge et jusqu’à 3 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.
Impact d’un ARN circulaire issu de l’oncogène majeur d’un herpès virus aviaire chez la poule
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
96 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculées avec le virus de la maladie de Marek, elles subissent huit prélèvements de sang et trois prélèvements de plumes, et le porteur indique s'attendre à ce que la majorité développe la maladie, avec fièvre, paralysie, lymphome, perte de plumes ou mort subite. Les oiseaux sont hébergés en isolateurs qui restreignent leurs mouvements, et ceux présentant des symptômes graves sont euthanasiés après confirmation du diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'étudier la latence virale et qu'aucun autre modèle animal ne convient, ce virus n'infectant que les gallinacés.
Objectifs
Le virus de la maladie de Marek est un herpès virus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux dans un délai de quelques semaines. Ce virus est actuellement sous contrôle grâce à des protocoles de vaccination très stricts, bien que ceux-ci ont montré des failles dans les dernières années. Ce virus est également un outil en recherche biomédicale de par son côté modèle d’oncogenèse viro-induite. L’objectif de ce projet est d’approfondir les connaissances sur l’oncogenèse induite par ce virus. Alors que celle-ci a été longtemps réduite au résultat de l’expression d’un facteur de transcription viral dérégulant la biologie cellulaire des cellules infectées de manière latente, les découvertes successives d’acides ribonucléiques (ARN) non-codants impactant le cycle viral et l’oncogenèse viro-induite ont remis en cause ce modèle. Dans le cadre de ce projet, nous proposons qu’un ARN non-codant nouvellement découvert et encodé à partir du même gène permettant l’expression de l’oncogène majeur du virus puisse avoir un impact sur l’apparition de la lymphomagenèse. Pour répondre à cette question deux virus OGM ont été produits en laboratoire et testés in vitro avant cette approche in vivo. L’approche in vitro a montré ses limites car l’effet est suspecté de se produire durant la latence du virus, qui n’est pas observable dans les modèles cellulaires. Ce projet nécessitera au maximum l’utilisation de 96 poules.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’ARN circulaire étudié sur l’oncogenèse requiert un volet in vivo pour répondre à la question de recherche. Actuellement, et depuis leur première description en 2018, aucun ARN circulaire viral n’a été décrit pour ses rôles promouvant l’oncogenèse viro-induite in vivo. Le virus de la maladie de Marek est un modèle adéquat pour investiguer ce pan inexploré de l’oncogenèse viro-induite. Au travers de ce projet, nous espérons comprendre le rôle de l’ARN circulaire associé au locus de l’oncogène majeur du virus de la maladie de Marek. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : 1- Maladie de Marek : Meilleure compréhension du cycle viral et de la tumorigenèse viro-induite 2- Biologie moléculaire : Descriptions de nouvelles fonctions des ARN circulaires, notamment viraux 3- Virologie : Description d’un pan très récent de la virologie.
Procédures
une inoculation de virus sur animaux vigiles + 8 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 3 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute.
Impact sur les animaux
1/ L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. Ce type d’hébergement réduit également la liberté de mouvement des animaux. 2/ La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que la majorité des animaux de l’étude soient atteints de la maladie durant le temps de l’étude. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles : un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser ; l’injection intramusculaire peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection et les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Les prélèvements de plumes entrainent une douleur ponctuelle pour l’animal.
Devenir
En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.
Remplacement
Il est impossible de remplacer le modèle par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche limitée de la maladie. Notamment, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro la latence virale, responsable de la lymphomagenèse. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible, est également impossible car cet herpès virus n’infecte que les gallinacés.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque lot a été établi afin d’être en conformité avec le principe de réduction des règles de bien-être animal et de manipuler un nombre d’échantillons suffisants pour établir si les différences mesurées entre lots sont statistiquement significatives et donc non dus au hasard. Les meilleurs tests statistiques seront appliqués dans les comparaisons des différents groupes pour permettre un traitement optimal des données.
Raffinement
Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié afin de détecter l’apparition de symptômes de la maladie ou tout autre signe anormal lié à la santé et au bien-être des animaux. Les animaux présentant des symptômes graves de la maladie de Marek seront euthanasiés après confirmation du diagnostic par le responsable du projet. Les animaux présentant des symptômes légers feront l’objet d’une surveillance accrue pour détecter l’apparition de nouveaux symptômes. L’ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention est effectuée en douceur et les prélèvements sont le plus rapide possible. Les prélèvements de plumes et de sang sont réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements a été réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l’inoculation du virus, nous utiliserons des seringues avec des aiguilles fines et courtes. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l’entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux. des vers de farine seront testés comme aliment de récompense après les prélèvements. Des points limites adaptés ont été définis.
Choix des espèces
Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. L’utilisation de la race choisie permet d’obtenir des effets plus importants et donc, de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek malgré la vaccination. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront infectés à l’âge de 14 jours. Ils seront euthanasiés à maximum 75 jours d’âge. L’âge d’inoculation de 14 jours a été déterminé car il permet de commencer les prélèvements sanguins dès le début de l’expérience, tout en restant suffisamment sensible à la maladie pour obtenir des résultats robustes en un minimum de temps.