Oncologie

176 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'hypersensibilité à la douleur induite par une séparation maternelle précoce. La moitié des nouveau-nés est séparée de leur mère, puis soumise à des tests de douleur et à des injections dans la moelle épinière, l'autre moitié subit une chirurgie sans réveil avec ablation d'une vertèbre pour enregistrer la moelle jusqu'à huit heures. Le porteur indique aussi que toutes les mères sont mises à mort après le sevrage, au motif que la séparation altère leur système nerveux. Il affirme que la nociception est un processus intégré, impossible à étudier sans sujets vivants dotés d'un cortex développé.

Objectifs

Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) est un modèle reflétant la prématurité humaine et des études ont montré que les animaux exposés à la SMN présentent des déficit de comportements et une hypersensibilité douloureuse. Des études récentes suggèrent également un déréglement de l'expression de certaines molécules pouvant ainsi contribuer aux altérations comportementales observées suite à la SMN. Dans ce contexte, nous chercherons à évaluer le rôle de certaines de ces molécules exprimées par les neurones de la moelle épinière impliqués dans la transmission de l'information douloureuse. L’objectif du projet sera d’étudier l’effet du bumétanide (BTD), qui pourrait rétablir a) les seuils de douleur chez l’animal SMN adulte et b) la transmission de la douleur par des neurones dans la moelle épinière d'animaux SMN.

Bénéfices attendus

Le modèle de séparation maternelle a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre les voies et mécanismes impliqués dans la douleur qui sont altérés lors d’un stress néonatal non douloureux, et plus particulièrement une séparation précoce avec la mère. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique du bumétanide sur le comportement modifié des animaux séparés et sur les modifications moléculaires observées dans ce modèle.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis au protocole de séparation maternelle néonatale, tandis que l'autre moitié des nouveau-nés resteront avec leur mère. Des tests d'évaluation de la douleur (durée 10min/animal), n'induisant pas de stress accru chez les animaux seront effectués une fois chacun du jour 30 au jour 60 postnatal pour la moitié des animaux. Ceux-ci recevront un total de 4 injections sous anesthésie générale 30 minutes avant chaque test comportemental. Une chirurgie durant 45 minutes sera effectuée sur l'autre groupe d'animaux puis des enregistrements de la moelle épinière seront effectués. Ces enregistrements dureront 8 heures maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. Les nuisances possibles liées à l'injection intrathécale seront le stress lié à l’anesthésie ainsi qu'une inflammation ou infection potentielle du site d’injection. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress.

Devenir

Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expérience, tous les animaux seront aussi mis à mort. Pour la moitié des animaux, la chirurgie subie est sans réveil puisqu'une vertèbre est ôtée lors de celle-ci et que leur moelle épinière est manipulée. Les animaux y prenant part seront mis à mort par excès d'anesthésie.

Remplacement

La nociception étant un processus intégré, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action d’une molécule d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.

Réduction

Chaque groupe de rats requiert 2 portées différentes (comportant chacune minimum 10 animaux) pour une bonne analyse statistique et confirmation des tests comportementaux. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées. Les résultats obtenus sont alors statistiquement robustes et exploitables.

Raffinement

Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Leur prise de poids sera contrôlée 2 fois par semaine. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour décider de la procédure. Pour l’appréciation de la perte de poids, si lors d’une pesée hebdomadaire, il est observé qu’un animal ne prend pas de poids ou en perd par rapport à la pesée précédente, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Si l’un de ces changements persiste plus de trois jours et est observé par un zootechnicien ou l’expérimentateur, le vétérinaire sera contacté et l’animal sera retiré de l’étude. Les injections seront effectuée sous anesthésie générale profonde (isoflurane 3%) pour limiter le stress des animaux. Les tests comportementaux sont realisés après une semaine d’habituation (manipulation par l'expérimentateur 5 minutes par animal chaque jour) afin de réduire le stress.

Choix des espèces

Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat. Le protocole de SMN intervient au stade nouveau-né, entre le jour 2 et le jour 12 postnatal. Cependant, les conséquences de ce stress seront observées à l’âge adulte (45 jours postnatal).

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour tester une lignée porteuse d'une mutation proche de celle des patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires. Elles subissent des tests de force et de locomotion répétés chaque semaine, un test de saignement pour évaluer la coagulation et des injections de traitement, avant une mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur présente la plupart des tests comme non invasifs tout en décrivant du stress et des douleurs liées aux injections. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur un organisme entier, s'agissant d'une maladie multisystémique.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM), associée au syndrome de Stormorken (STRMK) est une maladie touchant notamment les muscles, la coagulation sanguine et la peau. Cette myopathie peut être causée par différentes mutations génétiques, et il manque encore des modèles adaptées pour étudier la maladie et la traiter. Ce projet vise donc à étudier une nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Si les principaux signes de patients sont trouvés chez les souris, cette lignée serait confirmée comme un modèle approprié pour le TAM/STRMK. Ce modèle permettra de mieux comprendre le syndrome TAM/STRMK, en fonction de la mutation. En plus, dans ce projet, nous mettrons également en œuvre une stratégie thérapeutique visant à prévenir et à inverser la maladie dans le modèle murin en ciblant un acteur clé de la cause de la maladie.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d’approfondir notre connaissance des causes et du fonctionnement de la maladie. De plus, avoir en notre possession des modèles TAM/STRMK nous permettra de trouver la thérapie la plus appropriée, en fonction de la cause génétique spécifique. Enfin, cette étude présente un intérêt pour un éventail plus large de maladies comme la dystrophie de Duchenne ou la pancréatite aiguë.

Procédures

Des tests de comportement seront réalisés une fois par semaine sur les souris vivantes, à partir de 1 mois (cohorte 1) ou 4 mois (cohorte 2) et jusqu'à 4 mois (cohorte 1) ou 8 mois (cohorte 2) d'âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test permettant de mesurer la force musculaire des pattes de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement, utilisé pour évaluer la coagulation sanguin, sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. Le test de production de force du muscle durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera euthanasié. Le test pour l'obtention du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections pour administrer le traitement prendront environ 2 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Le nouveau modèle peut avoir un impact indésirable sur l'animal. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. De plus, les injections administrées pour le traitement peuvent causer de la douleur à l'animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Dans le cadre de notre expérimentation, nous employons des tests phénotypiques non invasifs, ce qui signifie que nous n'occasionnons aucun préjudice aux animaux que nous étudions. Cette approche nous permet d'effectuer un suivi longitudinal en répétant les expériences sur les mêmes individus au fil du temps. En ce qui concerne les analyses moléculaires et histologiques, elles seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui évite de constituer un groupe d'animaux pour chaque point du suivi sur la durée. . Nous cherchons également à réduire au minimum le nombre d'animaux afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nos recherches antérieures ont montré que l'utilisation d'un maximum de 15 souris par groupe est nécessaire pour mener à bien une étude concluante. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysées avec des statistiques adaptés.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 h jour/nuit sera imposé. Les animaux recevront de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l’aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo ce qui limite le développement de la douleur. Afin de diminuer le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour le temps de saignement et les prélèvements sanguins, l'animal sera anesthésié. Ainsi, pour les mesures de force musculaire, l’animal sera anesthésié avec un mélange de produits anesthésiants et analgésiants permettant d’éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L’animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure afin de maintenir la température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de souffrance de l'animal, nous mettrons en place des mesures pour minimiser son inconfort et sa douleur. Nous utiliserons une grille de scoring pour évaluer le niveau de douleur observé chez l'animal. Si nous constatons un niveau de douleur élevé, nous prendrons les mesures appropriées pour soulager la douleur et assurer le bien-être de l'animal. La grille de scoring nous permettra de surveiller attentivement l'état de l'animal et d'adapter les interventions nécessaires pour réduire toute souffrance.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris afin de mieux comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes suite à une modification génétique, ainsi que pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Cette approche globale de l'organisme revêt une importance particulière dans le cadre de notre étude sur le TAM/STRMK, une maladie multisystémique. Ayant précédemment étudié le TAM/STRMK dans un autre modèle murin de la maladie, nous souhaitons approfondir nos connaissances en utilisant cette nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Les souris utilisées seront étudiées à l'âge adulte, après 4 semaines jusqu'à 8 mois (pour la caractérisation de l'animal), et après 4 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement).

820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'inflammation de l'hypothalamus provoquée par un régime riche en graisses. Une partie subit une ou deux chirurgies du crâne pour implanter une pompe et une canule assurant des perfusions dans le cerveau pendant quinze jours, une autre reçoit un régime gras puis des injections et des prélèvements de sang à la queue. Le porteur qualifie lui-même ces chirurgies stéréotaxiques de lourdes et douloureuses, et décrit des pertes de poids, de la prostration et des douleurs au crâne. Il affirme qu'il est impossible de reproduire in vitro les échanges entre organes et conclut que l'utilisation de modèles animaux est "nécessaire".

Objectifs

Dans le contexte de l’obésité nutritionnelle, il est actuellement reconnu que la consommation d’un régime riche en lipides (HFD) entraine une inflammation très rapide de l’hypothalamus, une région du cerveau qui joue un rôle crucial dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Les médiateurs et les mécanismes impliqués dans la mise en place de cette réponse inflammatoire aigue de l’hypothalamus et des perturbations métaboliques associées restent cependant à élucider. Récemment, nous avons mis en évidence que l’inflammation hypothalamique induite par 3 jours de régime HFD s’accompagne d’une forte augmentation de la production hypothalamique d’une hormone (X) connue pour ses propriétés pro-inflammatoires et favorisant le développement de l’insulino-résistnace, principal facteur de risque du diabète de type 2. Dans ce contexte, ce projet vise à démontrer in vivo l’implication de cette hormone hypothalamique dans la mise en place de l’inflammation précoce de l’hypothalamus et de déchiffrer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous tendant ses effets. Il n’existe à ce jour aucune méthode de substitution aux animaux de laboratoire pour étudier l’impact physiologique d’un dérèglement nutritionnel. Le modèle animal envisagé dans cette étude est un modèle souris (souche C57BL6) particulièrement bien documenté dans la littérature pour ce type d’étude. Le nombre d’animaux est minimalisé en vue d'appliquer les réglementations européennes en terme de réduction. L’objectif de Raffinement et d’enrichissement est pris en compte afin de s’assurer du bien-être des animaux (surveillance quotidienne). Le recours à l'anesthésie et analgésie sont prévus pour éviter toute souffrance des animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de caractériser plus précisément les mécanismes et les médiateurs jouant un rôle crucial dans l'apparition de la neuroinflammation hypothalamique et à l'origine de désordre métabolique. Identifier ces facteurs pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques permettant de prévenir les effets de l’obésité au niveau hypothalamique et ainsi éviter le développement du Diabète de type II.

Procédures

400 souris au total subiront une chirurgie stéréotaxique, et 160 souris au total subiront 2 chirurgies stéréotaxiques : une 1ère chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) afin d'injecter la tat cre, et une 2ème chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) une semaine plus tard pour poser le système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires (perfusion de 15j). 420 souris au total seront nourries avec pour moitié un régime normal et pour moitié un régime riche en graisse pendant 3 à 8 jours et toutes les souris seront soumises à des mesures de glycémie à différents temps ( 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min au plus) suite à une injection rapide en intraperitonéale (2-3 secondes) de glucose, d'insuline ou de pyruvate. Ceci implique plusieurs prélèvements à la queue d’une goutte de sang (6x5μl de sang au plus = 30μl). Une seule incision au niveau de la queue a lieu au début de l'expérience, elle est faite en une seconde.

Impact sur les animaux

Les procédures font intervenir des injections et perfusions et des chirurgies qui peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux tels qu’une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crâne. Toutes les précautions seront prises pour éviter au maximum ces effets.

Devenir

400 souris au total serviront à toutes les analyses immunohistochimiques et hybridation in situ pour étudier les ARN et protéines sur tissus et 420 souris serviront aux études de HITS CLIP pour l’identification des cibles, de PCR quantitative pour évaluer les niveaux d'expression des ARN et de western blot pour l'expression protéique. Tous les détails sont précisés dans chacune des procédures en réponse à des objectifs précis.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscle, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l’organisme des besoins énergétiques. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions, c’est pour cela que l’utilisation de modèles animaux est nécessaire pour ce projet. Cependant, veuillez noter que pour réduire le nombre d’animaux au maximum une partie des expériences sera réalisée in vitro, sur des lignées de cellules microgliales et neuronales hypothalamiques afin de déchiffrer les voies de signalisations sous tendant les effets proinflammatoires de l’ hormone X. Cependant, les expériences prévues sur les tanycytes seront réalisées sur des cultures primaires à partir d’hypothalamus de souris car il n’existe pas à ce jour de lignée de tanycytes commerciales. Ceci nécessite par conséquent l’utilisation de beaucoup d'animaux, et ne permet donc pas le remplacement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, tout ce qui est possible de faire in vitro a été planifié. De plus, des tests de puissance ont été réalisés au laboratoire pour chaque test planifié et notre expertise depuis plusieurs années sur ce type d'expérience nous permet vraiment d'évaluer à juste titre nos besoins expériementaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en cage individuelle puisqu’il est primordial pour notre étude de contrôler quotidiennement et individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Il est indispensable d'avoir un suivi personnalisé du poids corporel et de la prise alimentaire, en effet, si nous n'obtenons pas de résultats homogènes au sein d'un groupe expérimental, nous remonterons l'historique de l'animal en comparant sa prise alimentaire et son poids corporel notamment afin de vérifier s'il a plus ou moins mangé/pris de poids qu'un autre individu du même groupe expérimental, ce qui permettra d'expliquer certaines différences. Bien que les procédures chirurgicales soient lourdes et douloureuses, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. En effet, les chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous Isoflurane accompagnée d'une injection de Lidocaïne au niveau de site de l'incision avant en tant qu'anesthésique local. Durant toute la procédure chirurgicale, les animaux reposent sur un tapis chauffant et reçoivent une injection de solution saline en sous-cutanée pour prévenir leur déshydratation. Aussi, lors de la phase de réveil, les animaux, toujours sur un tapis chauffant, reçoive une injection intrapéritonéale de glucose. De plus, en période post-opératoire, dès la fin des sutures, un analgésique est injecté en sous-cutané, idem le jour suivant l'opération. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux. Elle se compose de scores et d'actions à réaliser selon le score. La grille de contrôle du poids est la suivante : normal : score = 0 ; perte de 5 à 10 % : score = 1 ; perte > 15 % : score =2. La grille de contrôle du comportement est la suivante : normal : score = 0 ; prostration, manque de toilettage : score = 1 ; hyperactivité lors de la manipulation, vocalisations sonores répétées : score = 2. Un score égal à 1 dans les deux grilles déclenche la sortie de l'animal de la procédure. Un score égal à 2 dans les deux grilles entraine la sortie de l'animal de la procédure et l'euthanasie si absence d'amélioration des scores.

Choix des espèces

Le modèle de souris est un outil complémentaire essentiel, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.

484 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur implante des fibres optiques ou des électrodes dans leur cerveau lors d'une chirurgie d'une heure et demie, puis les soumet à une restriction alimentaire les maintenant à 90-95 % de leur poids pendant jusqu'à quatre mois pour les motiver à une tâche comportementale. Il présente cette faim imposée comme n'affectant que "très peu" le bien-être des animaux non-humains, tout en la décrivant comme le ressort de leur motivation. Ce projet fondamental cartographie des circuits de la prise de décision, avec une "perspective translationnelle" vers les pathologies mentales, et le porteur affirme que seuls des "organismes entiers" permettent d'en étudier les bases neuronales.

Objectifs

La prise de décision est un processus essentiel du comportement humain. Ce processus complexe nécessite d’apprendre de son environnement afin d’emmagasiner des connaissances mais également de s’adapter aux changements. Une prise de décision adaptée nécessite ainsi un équilibre entre les comportements d’exploitation (utilisation des connaissances acquises) et d’exploration (recherche d’options plus favorables) qui peuvent être fidèlement modélisés chez le rat afin d’en établir les bases neurales. Le projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée dans un environnement changeant chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre ces différentes régions, puis nous testerons leur implication fonctionnelle en procédant à une déconnexion ou une activation réversible, afin de déterminer leur rôle précis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de préciser la connectivité des différentes régions impliquées dans la prise de décision ainsi que de préciser leur rôle . Une hypothèse majeure actuelle est que la prise de décision maladaptive qui caractérise un grand nombre de pathologies mentales est associée à un syndrôme de dysconnectivité de ces régions, ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure de fibre optique ou d’électrode d’enregistrement d’une durée maximale d’une heure et demie. Ils seront soumis également à une restriction légère d’accès à la nourriture (rationnement afin de conserver 90-95% de leur poids initial) qui durera maximum 4 mois ainsi qu'à une tâche comportementale dont les sessions durent entre 20mn et 1h15 par jour pour une durée maximale de 4 mois.

Impact sur les animaux

Les chirurgies d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation de fibres ou d’électrodes présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en restriction alimentaire légère (90-95% de poids corporel) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, l’approche neurocomputationnelle faisant appel à la modélisation est utile mais reste complémentaire des approches interventionnelles in vivo qui permettent de valider la véracité des modèles prédictifs.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques. Le recours à des méthodes réversibles permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. De plus, nous effectuerons les différentes procédures dans un ordre logique permettant de ne pas réaliser les expérimentations sur les voies n’ayant pas été validées par les procédures précédentes, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, tunnel et barre à ronger) et seront hébergés en cage collective, même après les chirurgies. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort.

Choix des espèces

D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille.

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur soumet une partie des souris à une irradiation du corps entier suivie d'une greffe de cellules, et l'ensemble à des injections intrapéritonéales répétées et à des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les quinze jours pendant trois mois, qu'il reconnaît pouvoir altérer leur vision. Ce travail vise à comprendre le rôle d'une molécule dans une forme agressive de mastocytose, un cancer du sang. Il cite un "dépôt de brevet" et des financements parmi les retombées attendues et affirme le modèle animal "indispensable", la complexité des interactions cellulaires n'étant selon lui pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les mastocytoses systémiques (MS) sont des formes incurables de maladies du sang particulièrement difficiles à traiter. Ces maladies très hétérogènes allant de formes indolentes à des leucémies fatales, sont caractérisées par l’accumulation et l’activation incontrôlée des cellules immunitaires appelées mastocytes dans la moelle osseuse. Plus de 30% des patients atteints de MS agressives ne répondent pas aux traitements administrés en clinique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le métabolisme des cellules est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses afin de répondre à leur besoin en énergie pour proliférer de façon aberrante. Nous avons donc identifié les altérations métaboliques dans les mastocytes de patients afin de tester le potentiel clinique de leur inhibition. Nous avons mesuré une forte concentration de kynurénine (L-Kyn), une petite molécule chimique, dans le plasma des patients atteints de formes agressives comparé aux indolentes et confirmé l’activité de la voie dont elle fait partie dans des mastocytes issus de la moelle osseuse de patients.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment la L-Kyn dont la concentration est élevée de façon physiologique dans le plasma des patients atteints de MS agressive, exacerbe les fonctions mastocytaires en régulant directement les fonctions des mastocytes ou leur microenvironnement (adipocytes médullaires). Ces analyses nous permettront d'une part de tester le potentiel de la voie de la kynurénine comme cible thérapeutique dans les MS agressives dans un contexte physiologique mais également d'identifier de nouvelles cibles en aval de la L-Kyn qui pourraient également être pertinentes. Cette étude est la première étape vers le développement de nouveaux médicaments ciblant ces régulations en combinaison ou non avec les traitements utilisés pour cette pathologie en routine clinique. Elle permettra également le dépôt de brevet et de financements indispensables pour la poursuite de ce projet. Ces pathologies agressives sont particulièrement invalidantes ; la médiane de survie des patients au diagnostic est de moins de 3 ans et de moins de 6 mois pour les formes les plus agressives. Cette étude est donc indispensable pour améliorer le devenir des patients et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de prévenir ou freiner le développement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux (procédures 1-2) recevront une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 3 fois par semaine pendant une semaine puis 5 fois par semaine pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins seront réalisés en rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à l’atteinte des points limites. Les animaux (procédures 3-5) recevront une irradiation sous-létale sur corps entier sur animaux vigiles. Une greffe intraveineuse en rétro-orbital unique sera réalisée. Une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 5 fois par semaine sera réalisée pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à atteinte des points limites.

Impact sur les animaux

La manipulation et la pesée pourraient entraîner du stress chez les animaux. Une mauvaise tolérance à l’irradiation sous-létale pourrait entraîner une inactivité et une mobilité réduite pendant quelques heures après l’irradiation (rare). Le même phénotype pourrait être observé après une greffe partielle des cellules injectées quelques jours après la transplantation. Une perte de poids pourra être observée et sera monitorée. Les prises de sang répétées dans le sinus rétro-orbital pourraient causer des problèmes de vision aux souris.

Devenir

La totalité des individus impliqués seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation de plusieurs modèles cellulaires in vitro seuls ne permet pas de rendre compte de la complexité des interactions cellulaires impliquées dans la maladie. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal afin de valider notre hypothèse. A cette étape du projet, il n’existe aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Le calcul d’effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul d'effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul statistique approprié. Cette approche nous permet de conserver une méthode scientifique rigoureuse tout en réduisant au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes contrôles. Afin de réduire à son minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes contrôles seront commun à plusieurs tests d'efficacité. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos expériences.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les expérimentateurs et le personnel qualifié de l'animalerie sont formés pour limiter au maximum le stress des animaux lors de leur manipulation. Les animaux utilisés dans ces expériences seront soumis à une surveillance quotidienne. Les objectifs de toute procédure étant de donner à l’animal la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute souffrance due aux procédures soit détectée et réduite. Pour ce faire, le suivi de la maladie se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs. Dès l’apparition des points limites, que nous avons choisis le plus précoce possible pour que l’animal reste asymptomatique, l’animal sera mis à mort. Par conséquent, cette mise à mort intervient avant l’apparition de symptômes et de nuisances dues à la pathologie. Nous optimiserons les conditions d'hébergement des animaux par la présence d'enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactes et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 4 ou 5 afin d'éviter le stress de l'isolement. Pour limiter au maximum la souffrance des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie, et une analgésie sera mise en place si nécessaire (voir points limites).

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici l'hématopoïèse). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. En effet, bien que des formes ancestrales de systèmes hématopoïétiques aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers parmi lesquels, le poisson zèbre et la souris, sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, les outils développés chez cette espèce et l’absence d’expertise sur le poisson zèbre au sein de l’institut satisfait aux exigences d’utilisation de la souris comme espèce la moins susceptible de ressentir de la souffrance ou de la douleur pour les expérimentations proposées. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ces types de modèle de MS et ce type d'injection de cellules néoplasiques mastocytaires en intraveineux, c'est à dire des souris "jeunes adultes" âgées de 6 à 10 semaines au moment de la transplantation et/ou des injections intra-péritonéale prévues.